Summary
De verrijking van bacteriële lipoproteins met behulp van een fase van de niet-ionogene oppervlakteactieve stof partitioneren methode wordt beschreven voor direct gebruik in TLR testen of andere toepassingen. Verdere stappen zijn gedetailleerd voor te bereiden al lipopeptides van N-terminale structurele karakterisering door massaspectrometrie.
Abstract
Lipoproteïnen zijn belangrijke bestanddelen van de bacteriële celenvelop en krachtige activators van de zoogdieren aangeboren immuunrespons. Ondanks hun belang voor zowel celfysiologie en immunologie, moet nog veel worden ontdekt over roman lipoproteïne formulieren, hoe ze worden gesynthetiseerd en het effect van de verschillende vormen op de immuniteit van de gastheer. Opdat de grondige studies over lipoproteïnen, dit protocol beschrijft een methode voor bacteriële lipoproteïne verrijking en voorbereiding van N-terminale al lipopeptides voor structurele bepaling door laser matrix-bijgewoonde desorptie ionisatie-tijd van de vlucht massaspectrometrie (MALDI-TOF MS). Uitbreiding op een gevestigde Triton X-114 fase partitioneren methode voor lipoproteïne winning en de verrijking van de bacteriële cel membraan, het protocol bevat aanvullende stappen om te verwijderen van niet-lipoproteïne contaminanten, lipoproteïne rendement verhogen en zuiverheid. Aangezien lipoproteïnen worden vaak gebruikt in Toll-like receptor (TLR) testen, is het essentieel om eerst het karakteriseren van de structuur van de N-terminal door MALDI-TOF MS. Herein, een methode is bedoeld om te isoleren van geconcentreerde hydrofobe peptiden verrijkt met N-terminal lipopeptides geschikt voor een directe analyse door Lipoproteins van de MALDI-TOF-MS/MS. die zijn gescheiden door Poly-Acrylamide gelelektroforese (SDS-pagina) voor natrium Dodecyl Sulfaat worden overgedragen aan een membraan van het nitrocellulose, verteerd in situ met Trypsine, opeenvolgend gewassen om te verwijderen van polar al peptiden, en ten slotte met chloroform-methanol geëlueerd. Wanneer gekoppeld aan MS van de meer polar trypsinized peptiden van wassen oplossingen, biedt deze methode de mogelijkheid om zowel het lipoproteïne te identificeren en te karakteriseren zijn N-terminus in een enkele experiment. Opzettelijke natrium adduct vorming kan ook worden gebruikt als een instrument ter bevordering van meer structureel informatieve fragmentatie spectra. Uiteindelijk, verrijking van lipoproteins en bepaling van hun structuren van N-terminale toestaat meer uitgebreide studies op deze alomtegenwoordige klasse van bacteriële eiwitten.
Introduction
Lipoproteins van de bacteriële worden gekenmerkt door een geconserveerde N-terminale lipide gemodificeerde cysteïne die ankers van het domein van de bolvormige eiwit op het oppervlak van de celmembraan. Ze zijn universeel verspreid in bacteriën, die 2 tot 5% van alle cellulaire genen binnen een typisch genoom1. Lipoproteins van de spelen een kritieke rol in een grote verscheidenheid van cellulaire processen, waaronder de opname van de voedingsstoffen, signaaltransductie, vergadering van eiwitcomplexen, en ter handhaving cel envelop structurele integriteit2. Pathogene bacteriën dienen lipoproteïnen als virulentie factoren3,4. Erkenning van N-terminal lipopeptides door Toll-like receptor (TLR) 2 aanzet tijdens een infectie, een aangeboren immune reactie op het verwijderen van de invasie ziekteverwekkers. Afhankelijk van de N-terminale acylering staat, zijn de lipoproteïnen algemeen erkend door alternatieve TLR2 heterodimeric complexen. TLR2-TLR1 herkent N-GEACYLEERDE lipopeptides, terwijl TLR2-TLR6 bindt gratis lipopeptide α-amino termini. Eenmaal gebonden, samenkomen de signaalroutes om te induceren secretie van proinflammatoire cytokines3,4.
Eerder werd gedacht dat lipoproteins van gram-positieve bacteriën waren diacylated en die van gram-negatieve bacteriën triacylated, die verschillen in de afwezigheid of de aanwezigheid van een vetzuur amide-linked op het geconserveerde N-terminale cysteine residu. Deze veronderstelling werd gesteund door het ontbreken van reeks orthologs in gram-positieve genoom te Lnt, de gram-negatieve N-acyl-transferase die triacylated lipoproteïnen5vormt. Echter, recente studies is gebleken dat lipoproteïne triacylation in gram-positieve Firmicutes die ontbreken lnt, evenals drie nieuwe N-terminale lipoproteïne structuren, genoemd de peptide, lyso en N -acetyl vormen6,7 ,8. Deze bevindingen stellen vragen over mogelijk nog-te-worden-ontdekt lipoproteïne vormen, naast het fundamentele vragen over de manier waarop deze roman lipoproteins worden gemaakt en welke fysiologische doel of voordeel de verschillende vormen geven. Bovendien tonen zij duidelijk aan het huidige onvermogen van de genomica te voorspellen lipoproteïne structuur. Inderdaad, we onlangs geïdentificeerd een nieuwe klasse van lipoproteïne N-acyl enzym, genaamd Lit, van Enterococcus faecalis en Bacillus cereus , dat lyso-formulier lipoproteïnen9 maakt. Dit wijst op de noodzaak om het experimenteel verifiëren lipoproteïne structuur, die uitdagend vanwege hun zeer hydrofobe aard en de beperkte methoden beschikbaar worden kan voor het karakteriseren van hun moleculaire structuur.
Ter vergemakkelijking van studies over lipoproteïne inductie van de immuunrespons van de gastheer, alsook de structurele vaststelling van N-terminale, hebben we verschillende eerder beschreven protocollen om te zuiveren lipoproteins van de bacteriële en de voorbereiding van de N-terminale al aangepast lipopeptides voor analyse door MALDI-TOF MS6,10,11,12. Lipoproteïnen zijn verrijkt met behulp van een gevestigde Triton X-114 (voortaan aangeduid als oppervlakteactieve stof of TX-114) fase partitioneren methode, met optimalisatie lipoproteïne opbrengst te verwijderen van contaminerende niet-lipoproteïnen. Deze lipoproteins zijn geschikt voor direct gebruik in TLR testen of voor verdere zuivering door SDS-PAGE. Voor MALDI-TOF MS, overdracht van de lipoproteïnen aan het membraan van het nitrocellulose voorziet een steiger efficiënt in situ de spijsvertering van de trypsine, wassen en latere elutie van het oppervlak van de membraan, resulterend in sterk gezuiverd N-terminal lipopeptides. Nitrocellulose is aangetoond dat het oog op het hanteren van de steekproef en verbetering van de reeks dekking voor zeer hydrofobe peptides van integraal membraan eiwitten13,14, evenals lipoproteïnen9,10 . De methode heeft als extra voordeel van peptiden op basis van polariteit, zodat de tussenliggende wassen oplossingen kunnen worden geanalyseerd voor hoge vertrouwen eiwit identificatie gelijktijdig met N-terminale structurele bepaling in een enkele experiment . Dit protocol een unieke functies opzettelijke natrium adduct vorming te bevorderen van bovenliggende ion fragmentatie naar dehydroalanyl ionen tijdens MS/MS, helpend in structurele toewijzing van de N- acylering staat. De N-terminus is zowel de meest variabele en belangrijke functie gerelateerde TLR erkenning van lipoproteïnen. Tezamen, hebben dit protocol intensieve en reproduceerbare studies op lipoproteïnen, met de afzonderlijke fasen van zuivering en bepaling van de structurele door MALDI-TOF MS gemakkelijk aangepast afhankelijk van het algemene doel van het experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. groei en Lysis van de cel
- Groeien bacteriën in 15 mL al soja broth (TSB) of soortgelijke rijke media tot laat-exponentiële groeifase (OD600 van 1.0-1.5). Oogsten van cellen door middel van centrifugeren, een keer wassen met Tris-gebufferde zoutoplossing/EDTA (TBSE) en blijven met protocol of bevriezen tot gebruik.
Opmerking: TBSE: 20 mM Tris-waterstofchloride (HCl), pH 8,0 130 mM natriumchloride (NaCl), en 5 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA)). Lipoproteïne expressie en wijziging kunnen worden beïnvloed door groei omstandigheden (bijvoorbeeld zuurtegraad, zoutgehalte, groei media) en de groei fase15. Celgroei kan worden geschaald als gewenste, maar 15 mL van cellen wordt aanbevolen voor een één preparaat van lipoproteins aangezien overtollige biomassa lipoproteïne opbrengst kan verminderen. Één 15-mL preparaat levert over het algemeen genoeg monster voor optimaal laden van ~ 2-4 rijstroken op een standaard SDS-pagina mini gel. - Resuspendeer de cellen in 800 μL TBSE met 1 mM phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) en 0,5 mg/mL lysozym. Breng de oplossing aan de buis van een schroefdraad microcentrifuge 2.0-mL met schroefdop en O-ring en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C.
Opmerking: Sommige soorten zijn niet gevoelig voor lysis door lysozym. Een passende lytische enzym zouden moeten worden vervangen om steun in cellysis. - ~ 800 μL 0.1 mm Zirkonia/kiezelzuur kralen toevoegen aan de buis en breek cellen door schudden bij maximale snelheid (7000 rpm) op een homogenizer voor 5 cycli van 30 s elk, met 2 min rusten op ijs tussen elke cyclus.
- Centrifuge monster bij 3000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C (tot pellet kralen en ongebroken cellen). Het supernatant overbrengen in een nieuwe 2.0-mL microcentrifuge buis en houd op ijs.
- 200 μl TBSE toevoegen aan de resterende pellet en terugkeren naar de homogenizer voor een extra cyclus. Centrifugeer (zoals hierboven) en combineren van supernatant met het vorige supernatant (moet 800-1000 μL totale volume).
2. de verrijking van Lipoproteins door TX-114 fase partitioneren
- Aanvulling van het supernatant met TX-114 oppervlakteactieve stof aan een definitieve concentratie van 2% (vol/vol) door een gelijk volume van 4% (vol/vol) de oppervlakteactieve stof in ijskoude TBSE toe te voegen en uit te broeden op ijs voor 1 h, mengen door inversie elke ~ 15 min.
Opmerking: Wanneer gekoeld, de bovendrijvende substantie en oppervlakteactieve stof zullen mengbaar. - De buis overbrengen in een waterbad 37 ° C en incubeer gedurende 10 min voor het opwekken van fase-separatie zichtbaar. Centrifugeer het monster bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te handhaven bi-phasic scheiding.
- Voorzichtig uit de bovenste waterfase Pipetteer en gooi deze weg. Ijskoude TBSE toevoegen aan de onderste fase van de oppervlakteactieve stof te vullen van de buis naar het oorspronkelijke volume en omkeren als u wilt mengen. Incubeer op ijs gedurende 10 minuten.
- De buis overbrengen in een waterbad 37 ° C en incubeer gedurende 10 min voor het opwekken van fase-separatie zichtbaar, dan Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Herhaal stap 2.3-2.4 nogmaals voor een totaal van 3 scheidingen. Verwijder de bovenste waterfase en negeren.
- Pellet van neergeslagen eiwitten die in de loop van extracties (zichtbaar aan de onderkant van de buis), gevormd door toevoeging van 1 deel ijskoude TBSE aan de fase van de oppervlakteactieve stof verwijderen. Centrifugeer bij 4 ° C bij 16.000 x g gedurende 2 min naar de pellet onoplosbare eiwitten.
Opmerking: Monster moet een enkele fase blijven. Als fasescheiding optreedt, opnieuw chill monster en Centrifugeer nogmaals. De pellet is over het algemeen samengesteld uit niet-lipoproteïne verontreinigingen, maar voor verdere analyse kan worden gehandhaafd. - Onmiddellijk overdracht het supernatant tot een koker van de verse 2.0-mL microcentrifuge met 1250 μL van 100% aceton. Pipetteer omhoog en omlaag grondig te wassen van het monster van de tip als het visceuze zal zijn. Meng door inversie en na een nacht bebroeden bij-20 ° C te precipiteren eiwit.
- Centrifugeer het monster bij 16.000 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur te pellet lipoproteïnen met aandacht voor de oriëntatie van de buis. Lipoproteins van de vormen een dunne, witte film langs de buitenmuur van de buis.
- Wassen pellet tweemaal met 100% aceton. Decanteren van aceton en laat monster aan de lucht droog.
- Voeg 20-40 μL van 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 of een standaard Laemmli SDS-PAGE monster buffer16 en grondig resuspendeer door pipetteren op en neer tegen de muur met de neergeslagen lipoproteïnen. Schrapen van de kant van de buis met het uiteinde van de pipet te verjagen lipoproteïnen.
Opmerking: Lipoproteins zal niet oplossen in de Tris buffer, maar veeleer vormen een schorsing.- Lipoproteins van de bij-20 ° C bewaren tot gebruik.
3. SDS-PAGE, Electroblotting en kleuring met Ponceau S
- Lipoproteins van de afzonderlijke door SDS-PAGE met behulp van standaardmethoden16.
Opmerking: Het juiste gel acrylamide percentage zal variëren afhankelijk van de beoogde gebruik en de grootte van de lipoproteïnen. Hier, werden E. faecalis lipoproteïnen gescheiden over een 10% Tris-glycine gel, terwijl een 16,5% Tris-tricine gel werd gebruikt voor de kleinere E. coli lipoproteïne Lpp17. - De lipoproteïnen overbrengen in een nitrocellulose overdracht membraan met behulp van een standaard electroblotting procedure.
Opmerking: Een semi-droge overdracht met behulp van Bjerrum Schafer-Nielsen buffer plus 0,1% SDS werd uitgevoerd bij 25 V, 1,3 mA voor 15 min18. Afwisselend, Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride membraan kan worden gebruikt, maar aangezien er meer hydrofobe dan nitrocellulose, het efficiënt elutie van hydrofobe lipopeptides van het membraan bij latere stappen verminderen kan. - Het membraan van het nitrocellulose overbrengen in een container en bedek met Ponceau S oplossing (0,2% (m/v) Ponceau S in 5% azijnzuur). Rock zacht gedurende 5 minuten of totdat de rood-roze bands zijn zichtbaar.
- Giet af oplossing Ponceau S en spoel zorgvuldig het membraan van het nitrocellulose met dH2O te verwijderen overtollige vlek.
Opmerking: Ponceau gebeitste banden zal snel destain. Als bands verdwijnen, herhaal kleuring proces. - Accijnzen met een schone scheermesje, de gewenste band en overdracht aan een microcentrifuge buis. Was driemaal uit met 1 mL van dH2O van volledig destain van de band.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Opslaan van de verwijderde sectie bedekt met water bij-20 ° C tot gebruik. - Overdracht van de sectie op een schoon oppervlak en met een schone scheermesje, dobbelstenen de nitrocellulose-strip in kleine stukjes van ongeveer 1 mm x 1 mm. Verzamel de stukken in een laag eiwitgehalte van 0,5 mL bindende microcentrifuge buis.
- Wassen van de stukken twee keer met 0,5 mL van vers bereide 50 mM Ammoniumbicarbonaat (NH4HCO3), pH 7,8 in krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) rang water.
4. al spijsvertering, Lipopeptide extractie van het membraan van het Nitrocellulose, afzetting op MALDI Target, en Data-acquisitie
- Resuspendeer nitrocellulose stukken in 20 μL van een 20 μg/mL oplossing van trypsine in 50 mM NH4HCO3, pH 7,8 in HPLC rang water. Vortex te mengen, draai vervolgens kort om ervoor te zorgen dat alle stukken volledig gedekt zijn door de trypsine-oplossing. Betrekking hebben op het deksel van de buis met behulp van paraffine film ter voorkoming van verdamping en incubeer digest's nachts bij 37 ° C.
- Draai het monster bij 16.000 x g gedurende 30 s en verwijder de vloeistof door pipetteren.
Opmerking: Dit verwijdert trypsinized hydrofiele peptiden die kunnen later worden onderzocht door de MALDI-TOF MS voor eiwit identificatie. - 50 μl van 0,5% trifluorazijnzuur (TFA) in HPLC rang water toevoegen. Vortex te mengen, draai vervolgens aan het monster kort ervoor te zorgen dat alle stukken vallen door de oplossing. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. De vloeistof afzuigen door pipetteren.
Let op: TFA is schadelijk bij inademing. Omgaan met de nodige voorzichtigheid en gebruik in de chemische zuurkast. Aanraking met de huid vermijden. - Herhaal stap 4.3 met 50 μl van 10% acetonitril in HPLC rang water.
Let op: Acetonitril is schadelijk bij inademing. Omgaan met de nodige voorzichtigheid en gebruik in de chemische zuurkast. Aanraking met de huid vermijden. - Herhaal stap 4.3 met 50 μl van 20% acetonitril in HPLC rang water.
Opmerking: Dit verwijdert elk matig hydrofobe peptiden losjes gebonden aan de nitrocellulose. - Elueer de strak-gebonden lipopeptides, toevoegen van 15 μl van 10 mg/mL vers-en-klare α-cyano-4-hydroxycinnamic zuur (CHCA) matrix opgelost in chloroform-methanol (2:1, v/v) en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met intermitterende vortexing.
- Afwisselend, voeg 15 μL chloroform-methanol om Elueer lipopeptides en vermeng ze met matrix op een later tijdstip. Andere matrices, zoals 2,5-dihydroxybenzoic zuur (DHB), moeten worden getest als alternatieven voor CHCA als onbevredigende resultaten worden verkregen voor de samenstelling van een bepaalde lipopeptide.
Let op: Zowel de chloroform en de methanol zijn schadelijk inademing. Omgaan met de nodige voorzichtigheid en gebruik in de chemische zuurkast. Aanraking met de huid vermijden. - Optioneel: Ter bevordering van natrium adduct van vorming, de oplossing van CHCA in chloroform-methanol met waterige natriumbicarbonaat (NaHCO3) aanvulling op een eindconcentratie van 1 mM.
- Afwisselend, voeg 15 μL chloroform-methanol om Elueer lipopeptides en vermeng ze met matrix op een later tijdstip. Andere matrices, zoals 2,5-dihydroxybenzoic zuur (DHB), moeten worden getest als alternatieven voor CHCA als onbevredigende resultaten worden verkregen voor de samenstelling van een bepaalde lipopeptide.
- Het monster kort draaien. Met een pipet, moet u de vloeistof zorgvuldig overbrengen in een nieuwe laag eiwitgehalte bindende microcentrifuge buis. Deze oplossing zal het grootste deel van de N-terminal lipopeptides bevatten.
Opmerking: De nitrocellulose mag geheel of gedeeltelijk los in de chloroform-methanol-oplossing. Dit MS resultaat niet negatief zal beïnvloeden, en kan worden gebruikt als een alternatieve methode om lipopeptide rendement verhogen. PVDF membraan zal niet op dezelfde manier oplossen. - Stort 1 μL van de eluted lipopeptides met CHCA op een gepolijst stalen MALDI doel.
Opmerking: De chloroform-methanol zal verdampen snel, achterlating van gekristalliseerde CHCA en lipopeptides. Een optionele tweede 1 μL aliquoot kan worden gestort op dezelfde plek te monster concentratie verhogen. Chloroform-methanol kan aanzienlijk worden verspreid na afzetting op het doel en als zodanig moet worden gezorgd om te voorkomen dat het monster mengen op de doelgroep. Het wordt aanbevolen te deponeren en schieten meerdere plekken van elk monster. - Onmiddellijk overgaan tot massaspectrometrie. Scan alle gebieden van de plek voor lipopeptide signaal, vooral als de spot twee lagen van monster, bevat zoals de tweede laag de lipopeptides aan de buitenste rand van de plek duwen kan.
Opmerking: Aanbevolen startende laser intensiteit is 25%, al is het mogelijk om meerdere spectra (20 of meer scans) om voldoende signaal-/ ruisverhouding som te verwerven signaal intensiteit te verhogen. Hier, spectra werden verworven over een MALDI-TOF-TOF instrument (Zie de Tabel van materialen) met behulp van een fabriek geconfigureerde instrument-methode voor de detectie van de positieve-ion reflector over het bereik van de m/z 700-3500. Het instrument was gekalibreerd met een mengsel van de al peptide bovien serumalbumine (BSA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schematische voorstelling van het protocol wordt gegeven in Figuur 1. Het lipoproteïne-verrijkt breuk Enterococcus faecalis ATCC 19433 onttrokken door TX-114 is afgebeeld in Figuur 2. Ter vergelijking: de banding patroon van de neergeslagen eiwitoplossing blijkt ook. Eiwitten uit dit gedeelte werden bevestigd door MALDI-MS te zijn zeer overvloedig besmetten van eiwitten dan lipoproteïnen (tabel 1). De massaspectra in Figuur 3 tonen het al peptide ion-Profiel van de E. faecalis lipoproteïne PnrA dat zich voordoet met alle vervolgwasbeurten kunt van nitrocellulose-gebonden PnrA met oplosmiddelen met een verhoging van de polariteit (piek toewijzingen in Tabel 2). Figuur 4 toont de N-terminal structurele karakterisering van PnrA zoals bepaald door MALDI-TOF MS/MS, onthullend diagnostische N- GEACYLEERDE dehydroalanyl pieken overeen met het lyso-lipoproteïne-formulier. Figuur 5 illustreert het effect van natrium adduct vorming op fragmentatie, met de sodiated ouder ion netcongestieproblemen fragmenteren in het voordeel van de N- GEACYLEERDE dehydroalanyl ion.
Figuur 1: schematische van het protocol. Lipoproteïnen kunnen worden verrijkt door het partitioneren van TX-114-fase en worden gebruikt direct, meestal TLR testen, of verder gezuiverd door SDS-PAGE voor structurele bepaling. Lipoproteïnen zijn overgedragen aan nitrocellulose, verteerd met trypsine, stapsgewijze, gewassen en de resulterende lipopeptides geëlueerd met chloroform-methanol voor structurele analyse door MALDI-MS. De trypsine en nitrocellulose wassen-oplossingen kunnen worden opgeslagen voor eiwit identificatie en analyse van MS. w /:; TFA: trifluorazijnzuur; ACN: acetonitril; CHCA: α-cyano-4-hydroxycinnamic zuur; kiezen: facultatief; MALDI: laser matrix-bijgewoonde desorptie ionisatie; MS: massaspectrometrie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Profiel van TX-114 verrijkt eiwitten uit E. faecalis. Een 10% Tris-glycine SDS-pagina gel bevlekt met Coomassie blue (A) en het bijbehorende membraan van het nitrocellulose gekleurd met Ponceau S (B) onthullen een verschillende "banding" patroon tussen de geprecipiteerde eiwitoplossing ("PPT") en de gezuiverde lipoproteins ("LP"). De aangegeven Coomassie gebeitste bands waren weggesneden en aangemerkt als niet-lipoproteïnen door MALDI-MS van al peptides (Zie tabel 1). PnrA werd geïdentificeerd en geanalyseerd door het protocol hierin beschreven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Ion profiel en overvloed veranderingen met polariteit cellulosemengsels wassen oplossingen. (A) de trypsine fractie toont verschillende interne peptide fragmenten overeenkomt met de E. faecalis lipoproteïne die pnra in Figuur 2 aangegeven. De 10% B en 20% (C) acetonitril wassen breuken Toon veranderingen in signaalsterkte en een daling van het totale aantal individuele pieken. (D) de definitieve elutie breuk is sterk verrijkt met de N-terminal lipopeptide op m /z 997, aangeduid met een sterretje (*). Intensiteit van elke spectra is genormaliseerd naar (A) voor vergelijking van signaalsterkte. Pieken massa's en toegewezen sequenties zijn vermeld in tabel 2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Band | Eiwit-ID | Toetreding nr. | EST. moleculair gewicht | Peptide graaf | |
| 1 | elongatiefactor Tu | GB | EOL37301.1 | | 43,387 | 15 | |
| 2 | NADH peroxidase | GB | EOL34572.1 | | 49,520 | 9 | |
| 3 | pyruvaat dehydrogenase E1component, Alfa subeenheid | GB | EOL34709.1 | | 41,358 | 12 | |
| 4 | pyruvaat dehydrogenase E1 component, subeenheid bèta | GB | EOL34710.1 | | 35,373 | 19 | |
| 5 | 30s ribosomal eiwit S2 | GB | EOL33066.1 | | 29,444 | 16 | |
| 6 | 30s ribosomal eiwit S3 | GB | EOL37312.1 | | 24,355 | 14 | |
Tabel 1: neergeslagen eiwitten zijn niet-lipoproteïne contaminanten. Eiwitten door al digest en MALDI-MS onderscheiden werden met behulp van standaard in gel spijsvertering protocollen19 en staan van boven naar beneden in de dezelfde volgorde waarin deze op de gel Coomassie in Figuur 2. Elke proteïne werd geïdentificeerd met een betrouwbaarheidsinterval (C.I.) meer dan 95%.
| Piek nummer | Theoretische massa | Eiwit positie | Nr. van gemiste gesneden Sites | Peptide volgorde | |
| 1 | 631.3409 | 170-176 | 0 | GVADAAK | |
| 2 | 675.4035 | 316-321 | 1 | TKEAVK | |
| 3 | 826.4093 | 163-169 | 0 | FQAGFEK | |
| 4 | 893.4839 | 121-128 | 0 | NVVSATFR | |
| 5 | 943.5359 | 240-247 | 0 | VWVIGVDR | |
| 6 | 1040.5047 | 188-197 | 0 | YAASFADPAK | |
| 7 | 1200.6331 | 273-284 | 0 | GVGTAVQDIANR | |
| 8 | 1316.6997 | 290-301 | 0 | FPGGEHLVYGLK | |
| 9 | 1385.7827 | 83-94 | 0 | FNTIFGIGYLLK | |
| 10 | 1432.743 | 149-162 | 0 | VGFVGGEEGVVIDR | |
| 11 | 1568.7802 | 259-272 | 1 | DGKEDNFTLTSTLK | |
| 12 | 1672.8289 | 240-254 | 1 | VWVIGVDRDQDADGK | |
| 13 | 1707.8184 | 129-145 | 0 | DNEAAYLAGVAAANETK | |
| 14 | 1724.8027 | 35-49 | 0 | SFNQSSWEGLQAWGK | |
| 15 | 1797.9228 | 257-272 | 2 | TKDGKEDNFTLTSTLK | |
| 16 | 1872.9854 | 285-301 | 1 | ALEDKFPGGEHLVYGLK | |
| 17 | 1945.9613 | 230-247 | 1 | DLNESGSGDKVWVIGVDR | |
| 18 | 2240.1345 | 149-169 | 1 | VGFVGGEEGVVIDRFQAGFEK | |
| 19 | 2675.2543 | 230-254 | 2 | DLNESGSGDKVWVIGVDRDQDADGK | |
Tabel 2: waargenomen massa's en de bijbehorende al peptiden. In silico de spijsvertering van de Trypsine van E. faecalis PnrA (GenBank: EOL37280.1) werd uitgevoerd met behulp van PeptideMass20,21, waardoor maximaal twee gemist gesneden sites. De theoretische massa's van de pieken waargenomen op de spectra in Figuur 3 staan, samen met de bijbehorende peptide reeksen.
Figuur 4: MALDI-TOF MS van de E. faecalis lipoproteïne PnrA. (A) bovenliggende MS spectrum van de m /z 997 regio overeenkomt met de N-terminal lipopeptide van E. faecalis PnrA. (B) MS/MS van de piek van de lipopeptide blijkt dat het is de lyso vorm, met de diagnostische N- GEACYLEERDE dehydroalanyl peptide fragment ion piek aangeduid met een sterretje (*). De opgehelderd structuur is (C)weergegeven. Dit cijfer is gewijzigd van een eerdere publicatie9. R.I.: de relatieve intensiteit Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: natrium adduct vorming bevordert bovenliggende ion fragmentatie naar dehydroalanyl lipopeptide ionen. (A) MALDI-TOF spectra van de E. coli lipoproteïne Lpp N-terminale peptide zonder (turquoise sporen) en met (blauwe sporen) de toevoeging van natriumbicarbonaat. Toevoeging van natriumbicarbonaat aan de resultaten van de laatste geëlueerd breuk in een 22 Da-verhoging van de berekende massa van de bovenliggende lipopeptide. In vergelijking met het MS/MS-spectrum van de geprotoneerd ion (B), de MS/MS-spectrum van de overeenkomstige sodiated ion (C) toont significante preferentiële fragmentatie naar de N-acyl-dehydroalanyl ion via neutraal afschaffing van de diacylthioglyceryl groep, aangeduid met een sterretje (*). De structuur van de bovenliggende triacylated Lpp N-terminale al peptide (D) en de N-acyl-dehydroalanyl peptide fragment ion (E) worden afgebeeld. Dit cijfer is gewijzigd van een eerdere publicatie9. R.I.: de relatieve intensiteit Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hierin beschrijft twee verschillende fasen van de karakterisering van het lipoproteïne: verrijking door TX-114 fase partitionering en structurele bepaling door MALDI-TOF MS. Tijdens de extractie van de TX-114 verwijdert extra centrifugeren contaminerende eiwitten die tijdens dit proces precipiteren, gevolgd door aceton neerslag hoogverrijkt lipoproteïnen opleveren. Door de omvang van elk preparaat aan 15 mL waarde van cellen te beperken, kunnen verschillende monsters worden gemakkelijk verwerkt parallel en indien gewenst, gebundeld aan het einde van het protocol.
Voor structurele analyse door MS vergemakkelijkt overdracht van de lipoproteïnen aan nitrocellulose de spijsvertering van de trypsine, wassen en latere elutie van het membraan. In onze handen, heeft deze aanpak bewezen beter wasmiddel-gemedieerde extractie van traditionele polyacrylamidegel stekkers, zoals de lipoproteïnen zijn gekoppeld aan de oppervlakte van het membraan van het nitrocellulose en niet in polyacrylamide ingesloten. Lipoproteïne vereniging met het oppervlak van de nitrocellulose voorkomt het gemeenschappelijk probleem van de niet-specifieke adsorptie ook grotendeels tot container oppervlakken door hydrofobe peptiden. Stapsgewijze elutie van de nitrocellulose stukken verwijdert meer hydrofiele, interne al peptiden die kunnen worden geanalyseerd door MALDI-TOF MS te bereiken hoog vertrouwen eiwit identificatie toewijzingen, terwijl de definitieve elutie stap reproducibly levert geconcentreerd lipopeptides in een klein volume dat is grotendeels vrij van storende zouten en ion onderdrukken van verontreinigingen.
Succesvolle MS analyse van een lipoproteïne is onderworpen aan haar overvloed, en als zodanig de donkerste bands van het membraan Ponceau S gebeitste zijn kans te geven de beste resultaten. Het is echter mogelijk dat verschillende lipoproteïnen in een enkele band tijdens de scheiding van de pagina migreren kunnen, de resulterende spectra complicerende. Dus, het is sterk aanbevolen om eerst identificeren het eiwit peptide massaprocent vingerafdrukken (PMF), die kan worden bereikt door het verzamelen van MS-spectra op de totale trypsine breuk of beide acetonitril wassen breuk en invoeren van de resulterende pieken in een software zoals mascotte22. Zodra het eiwit sequentie heeft vastgesteld, helpt berekening van de massa van de al N-terminal lipopeptide aanzienlijk bij het kiezen van welke ion om het fragment door MS/MS.
Extra monster heterogeniteit kan voortvloeien uit verschillende acyl keten lengtes op lipoproteïnen binnen een bevolking en hun N-terminale wijzigingen, zowel afhankelijk van de bron bacteriën6. Terwijl variatie in ketenlengte zorgt voor onderscheidend hoogtepunt clusters op bovenliggende spectra, gekenmerkt door 14 Da stappen overeenkomt met methyleenblauw groepen (- CH2-), kan het splitsen van het algehele lipopeptide signaal en verlagen van de gevoeligheid. Het is ook waarschijnlijk dat de verschillende lipoproteïne vormen verrijking en fragmentatie beïnvloeden, al hebben we met succes vastgesteld, triacylated, diacylated en lipoproteins van de lyso-formulier met behulp van het protocol beschreven. Ook de verschillende peptide wordt van lipoproteins toevoegen een ander niveau van complexiteit aan analyses, ongeacht hun N-terminale structuur, zoals een zeer hydrofiele aminozuursamenstelling kan voorkomen lipopeptide partitioneren in de organische chloroformfase met behulp van andere methoden van extractie8. Overdracht van het lipoproteïne aan nitrocellulose zou helpen bij het bestuderen van dergelijke lipopeptides, alle elutie breuken kunnen worden geanalyseerd in deze methode.
Tekening uit de vorige literatuur met betrekking tot triacylglycerides en fosfolipiden23, opzettelijke natrium adduct vorming kan worden gebruikt ter bevordering van meer informatieve fragmentatie via de vorming van de (N-acyl)-dehydroalanyl peptide ion. Deze karakteristieke ionen vormen de sleutel tot het toewijzen van structuur, aangezien de acylering staat voor de N-terminus geïsoleerd van de acyl substituties op de glyceryl deel daarvan is. Natrium adduct vorming biedt een handige alternatieve optie aan zwavel oxidatie met waterstofperoxide, die heeft aangetoond dat ook bevordering van N-acyl-dehydroalanyl peptide fragmentatie6,8. Hoewel natrium adducten kan Toon een algehele afschaffing van het bovenliggende ion signaal, de specifieke stijging van fragmentatie naar dehydroalanyl ionen compenseert verminderde bovenliggende ion intensiteit. Het kan waard andere matrices en versnippering van extra adducten om te ontlokken de meest informatieve spectra.
Dit protocol verbetert op de traditionele TX-114 fase partitioneren methode voor lipoproteïne verrijking, terwijl de overdracht van pagina-gescheiden lipoproteins aan membraan van het nitrocellulose vergemakkelijkt de spijsvertering van de trypsine en de elutie van lipopeptides. MALDI-TOF MS analyse op de totale al of wassen breuken maakt eiwit identificatie in tandem met N-terminale structurele vastberadenheid door MS/MS in een enkele experiment. Optionele natrium adduct vorming hoogtepunten verschillen bij de lipopeptide N-terminus door bevordering van meer informatieve ion fragmentatie. De mogelijkheid om routinematig lipoproteïnen zuiveren en karakteriseren van hun N-termini zal uitgebreide studies over hoe roman lipoproteïne formulieren zijn gemaakt, hun fysiologische rol in de bacteriële celenvelop en hoe ze worden gedetecteerd door de zoogdieren immuun inschakelen systeem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Onderzoek in het laboratorium van Meredith werd gesteund door opstarten middelen die door de Eberly College of Science (Pennsylvania State University). Wij danken Dr. Tatiana Laremore voor deskundig technisch advies en toegang tot de apparatuur op de Penn State Proteomics en massaspectrometrie Core faciliteit, University Park, PA, waar de massaspectrometrische analyses werden uitgevoerd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 0.01 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 110791012 | |
| Acetic acid | EMD | AX0073-9 | |
| Acetone | EMD | AX0116-6 | |
| Acetonitrile | EMD | AX0142-6 | |
| Ammonium bicarbonate | Fluka Analytical | 09830 | |
| BioTrace NT Nitrocellulose | PALL Life Sciences | 66485 | |
| Bovine serum albumin (BSA) digest standard | Protea | PS-204-1 | |
| Chloroform | Acros Organics | 423550025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP118 | |
| HPLC Grade water | EMD | WX0008-1 | |
| Lysozyme | Fisher Scientific | BP535-1 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) | Amresco | 0754 | |
| Pierce trypsin protease | Thermo Scientific | 90057 | |
| Ponceau S | Acros Organics | 161470100 | |
| Protein LoBind Tube 0.5mL | Eppendorf | 022431064 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Sodium chloride | Macron Fine Chemicals | 7581-06 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 299537 | |
| Tris-hydrochloride (HCl) | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | 93422 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | BD | 211822 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MagNALyser | Roche | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
| Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF | Bruker Daltonics | Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser |
References
- Babu, M. M., et al. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins. J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).
- Narita, S., Tokuda, H. Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control. Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infect Immun. 79 (2), 548-561 (2011).
- Nguyen, M. T., Götz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).
- Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways. FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).
- Kurokawa, K., et al. Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2. J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).
- Kurokawa, K., et al. The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2. J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).
- Asanuma, M., et al. Structural evidence of α-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus. FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).
- Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes. J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).
- Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii. J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans. Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1. Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -T., Neubert, T. A. Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -T., Neubert, T. A. Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).
- Kurokawa, K., et al. Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schӓgger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).
- Gravel, P. Protein Blotting by the Semidry Method. The Protein Protocols Handbook. , Spring Protocols. 321-334 (2002).
- Webster, J., Oxley, D. Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry. The Protein Protocols Handbook. , Springer Protocols. 1117-1129 (2009).
- Wilkins, M. R., et al. Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS - a World-Wide-Web-accessible tool. Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. , Springer Protocols. 571-607 (2005).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
- Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).
