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Immunology and Infection

बैक्टीरियल लिपो के संवर्धन और जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा संरचनात्मक निर्धारण के लिए एन टर्मिनल Lipopeptides की तैयारी

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/56842
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Pennsylvania State University

Summary

बैक्टीरियल लिपो का संवर्धन एक गैर ईओण surfactant चरण विभाजन विधि का उपयोग TLR परख या अंय अनुप्रयोगों में प्रत्यक्ष उपयोग के लिए वर्णित है । आगे कदम जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए एन टर्मिनल tryptic lipopeptides तैयार करने के लिए विस्तृत रहे हैं ।

Abstract

लिपो बैक्टीरियल कोशिका लिफाफा और स्तनधारी सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रबल उत्प्रेरक के महत्वपूर्ण घटक हैं । दोनों कोशिका शरीर विज्ञान और इम्यूनोलॉजी के लिए उनके महत्व के बावजूद, बहुत उपंयास लिपोप्रोटीन रूपों के बारे में पता चला, कैसे वे संश्लेषित कर रहे हैं, और मेजबान उन्मुक्ति पर विभिंन रूपों का प्रभाव रहता है । लिपो पर गहन अध्ययन को सक्षम करने के लिए, इस प्रोटोकॉल का वर्णन बैक्टीरियल लिपोप्रोटीन संवर्धन के लिए एक विधि और एन के लिए तैयार-टर्मिनल tryptic lipopeptides संरचनात्मक निर्धारण के लिए मैट्रिक्स द्वारा असिस्टेड लेजर desorption ionization-उड़ान के समय मास स्पेक्ट्रोमेट्री (मालदी-तोफ MS). बैक्टीरियल कोशिका झिल्ली से लिपोप्रोटीन निष्कर्षण और संवर्धन के लिए एक स्थापित ट्राइटन एक्स-११४ चरण विभाजन विधि पर विस्तार, प्रोटोकॉल गैर-लिपोप्रोटीन संदूषणों को दूर करने के लिए अतिरिक्त कदम शामिल है, लिपोप्रोटीन उपज में वृद्धि और शुद्धता. के बाद से लिपो सामांयतः टोल में उपयोग किया जाता है जैसे रिसेप्टर (TLR) परख, यह महत्वपूर्ण है कि पहले n-टर्मिनल संरचना की विशेषता मालदी-तोफ सुश्री के साथ साथ, एक विधि को अलग करने के लिए प्रस्तुत किया गया है ध्यान केंद्रित hydrophobic एन में समृद्ध पेप्टाइड्स-टर्मिनल मालदी द्वारा प्रत्यक्ष विश्लेषण के लिए उपयुक्त lipopeptides-तोफ ms/ms. लिपो कि सोडियम Dodecyl सल्फेट पाली से अलग किया गया है-Acrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-PAGE) एक nitrocellulose झिल्ली को हस्तांतरित कर रहे हैं, के साथ सीटू में पचा trypsin, क्रमिक रूप से ध्रुवीय tryptic पेप्टाइड्स हटाने के लिए धोया, और अंत में क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल के साथ eluted. जब धोने के समाधान से अधिक ध्रुवीय trypsinized पेप्टाइड्स के एमएस के साथ युग्मित, इस विधि दोनों लिपोप्रोटीन की पहचान करने की क्षमता प्रदान करता है और एक ही प्रयोग में अपने N-टर्मिनस की विशेषता । जानबूझकर सोडियम adduct गठन भी एक उपकरण के रूप में नियोजित किया जा सकता है और अधिक संरचनात्मक जानकारीपूर्ण विखंडन स्पेक्ट्रा को बढ़ावा देने के । अंततः, लिपो और उनके एन के निर्धारण के संवर्धन-टर्मिनल संरचनाओं बैक्टीरिया प्रोटीन के इस सर्वव्यापी वर्ग पर और अधिक व्यापक अध्ययन की अनुमति होगी ।

Introduction

बैक्टीरियल लिपो एक संरक्षित एन-टर्मिनल लिपिड संशोधित cysteine है कि गोलाकार प्रोटीन डोमेन कोशिका झिल्ली सतह के लिए लंगर की विशेषता है । वे सार्वभौमिक बैक्टीरिया में वितरित कर रहे हैं, एक ठेठ जीनोम1के भीतर सभी सेलुलर जीन के 2 से 5% का गठन । लिपो सेलुलर प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, पोषक तत्वों की देखभाल, संकेत transduction, प्रोटीन परिसरों के विधानसभा, और सेल लिफाफा संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने में2. रोगजनक बैक्टीरिया में, लिपो डाह कारकों3,4के रूप में सेवा करते हैं । एक संक्रमण के दौरान, एन टर्मिनल lipopeptides की मांयता टोल की तरह रिसेप्टर (TLR) 2 एक सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए हमलावर रोगजनकों को हटाने के लिए । एन टर्मिनल acylation राज्य के आधार पर, लिपो आम तौर पर वैकल्पिक TLR2 heterodimeric परिसरों द्वारा मांयता प्राप्त कर रहे हैं । TLR2-TLR1 पहचानता N-acylated lipopeptides, जबकि TLR2-TLR6 बाँधता इव lipopeptide α-एमिनो टर्मिनी. एक बार बाध्य, संकेतन रास्ते में भड़काऊ साइटोकिंस3,4के स्राव प्रेरित करने के लिए एकाग्र ।

यह पहले सोचा था कि ग्राम से लिपो-सकारात्मक बैक्टीरिया diacylated थे और ग्राम से उन नकारात्मक बैक्टीरिया triacylated थे, के अभाव या संरक्षण एन टर्मिनल cysteine अवशेषों पर एक के बीच जुड़े फैटी एसिड की उपस्थिति में भिंन । यह धारणा Lnt को ग्राम-धनात्मक जीनोम में अनुक्रम orthologs की कमी का समर्थन कर रही थी, चना-निगेटिव एन-acyl ट्रांस्फ़्रेज़ कि रूपों triacylated लिपो५. हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है ग्राम में लिपोप्रोटीन triacylation-सकारात्मक Firmicutes कि कमी lnt, साथ ही साथ तीन उपंयास एन टर्मिनल लिपोप्रोटीन संरचनाओं, peptidyl, lyso, और N-एसिटाइल फार्म6,7 ,8. इन निष्कर्षों संभव अभी तक के बारे में सवाल उठाने के लिए-होना-लिपोप्रोटीन रूपों की खोज की, कैसे इन उपंयास लिपो बना रहे है और क्या शारीरिक प्रयोजन या लाभ विभिंन रूपों प्रदान के बारे में बुनियादी सवालों के साथ । इसके अलावा, वे स्पष्ट रूप से जीनोमिक्स की वर्तमान अक्षमता को प्रदर्शित करने के लिए लिपोप्रोटीन संरचना की भविष्यवाणी । दरअसल, हम हाल ही में लिपोप्रोटीन एन के एक उपंयास वर्ग की पहचान-acyl transferases, बुलाया जलाया, से Enterococcus faecalis और बैसिलस cereus कि बनाता है lyso-form लिपो9। यह प्रयोग लिपोप्रोटीन संरचना, जो उनके अत्यंत hydrophobic प्रकृति और सीमित करने के लिए अपने आणविक संरचना विशेषताएं उपलब्ध तरीकों के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है सत्यापित करने की आवश्यकता इंगित करता है ।

के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिपोप्रोटीन प्रेरण पर अध्ययन की सुविधा, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एन टर्मिनल संरचनात्मक दृढ़ संकल्प, हम कई पहले अनुकूलित किया है क्रम में जीवाणु लिपो को शुद्ध और एन-टर्मिनल तैयार करने के लिए tryptic lipopeptides विश्लेषण के लिए मालदी-तोफ MS6,10,11,12. लिपो एक की स्थापना की ट्राइटन X-११४ का उपयोग कर समृद्ध कर रहे है (इसके बाद surfactant या TX-११४) चरण विभाजन विधि, अनुकूलन के साथ के रूप में संदर्भित करने के लिए दूषित गैर लिपो और वृद्धि लिपोप्रोटीन उपज को दूर । इन लिपो TLR परख में प्रत्यक्ष उपयोग के लिए या एसडीएस द्वारा आगे की शुद्धि के लिए उपयुक्त है-पृष्ठ । मालदी के लिए-तोफ एमएस, nitrocellulose झिल्ली को लिपो के हस्तांतरण सीटू trypsin पाचन में कुशल के लिए एक पाड़ प्रदान करता है, धोने, और झिल्ली की सतह से बाद के रेफरेंस, अत्यधिक शुद्ध एन टर्मिनल lipopeptides में जिसके परिणामस्वरूप. Nitrocellulose नमूना हैंडलिंग की सुविधा के लिए दिखाया गया है और अभिंन झिल्ली प्रोटीन से अत्यधिक hydrophobic पेप्टाइड्स के लिए अनुक्रम कवरेज में सुधार13,14, साथ ही लिपो9,10 . विधि फ्रैक् पेप्टाइड्स के ध्रुवीकरण के आधार पर अतिरिक्त लाभ है, तो यह है कि मध्यवर्ती धोने समाधान उच्च विश्वास प्रोटीन पहचान के लिए एक साथ एन टर्मिनल संरचनात्मक दृढ़ संकल्प के साथ एक एकल प्रयोग में विश्लेषण किया जा सकता . इस प्रोटोकॉल विशिष्ट जानबूझकर सोडियम adduct गठन सुविधाएं एमएस के दौरान dehydroalanyl आयनों की ओर जनक आयन विखंडन को बढ़ावा देने के लिए/ms, N-acylation राज्य के संरचनात्मक असाइनमेंट में सहायता । N-टर्मिनस दोनों लिपो की TLR मान्यता से संबंधित सबसे चर और प्रमुख विशेषता है । एक साथ ले लिया, इस प्रोटोकॉल लिपो पर गहन और reproducible अध्ययन की अनुमति दी है, मालदी द्वारा शुद्धि और संरचनात्मक संकल्प के व्यक्तिगत चरणों के साथ-तोफ एमएस आसानी से प्रयोग के समग्र लक्ष्य के आधार पर अनुकूलित.

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Protocol

1. सेल ग्रोथ और Lysis

  1. 15 मिलीलीटर tryptic सोया शोरबा (TSB) या देर घातीय चरण के लिए इसी तरह के अमीर मीडिया (ओडी६०० में बढ़ने बैक्टीरिया १.०-१.५) । केंद्रापसारक द्वारा फसल कोशिकाओं, Tris-बफर खारा/EDTA (TBSE) के साथ एक बार धोने और प्रोटोकॉल या उपयोग जब तक फ्रीज के साथ जारी है ।
    नोट: TBSE: 20 मिमी Tris-हाइडरोक्लॉराइड (एचसीएल), पीएच ८.०, १३० मिमी सोडियम क्लोराइड (NaCl), और 5 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA)) । लिपोप्रोटीन अभिव्यक्ति और संशोधन विकास की स्थिति (जैसे अंलता, लवणता, विकास मीडिया) और विकास के चरण15से प्रभावित किया जा सकता है । कोशिका वृद्धि वांछित के रूप में बढ़ाया जा सकता है, लेकिन कोशिकाओं के 15 मिलीलीटर लिपो के एक एकल तैयारी के लिए सिफारिश की है के रूप में अतिरिक्त बायोमास लिपोप्रोटीन उपज कम कर सकते हैं । १ १५-एमएल तैयारी आम तौर पर एक मानक एसडीएस-पृष्ठ मिनी जेल पर ~ 2-4 लेन के इष्टतम लदान के लिए पर्याप्त नमूना पैदावार ।
  2. ८०० μL TBSE में 1 मिमी phenylmethyl sulfonyl फ्लोराइड (PMSF) और ०.५ मिलीग्राम/एमएल lysozyme के साथ कोशिकाओं को पुनर्निलंबित । एक २.०-एमएल के लिए स्थानांतरण समाधान पेंच टोपी और O-अंगूठी के साथ लड़ी पिरोया microcentrifuge ट्यूब और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए मशीन ।
    नोट: कुछ प्रजातियों lysozyme द्वारा lysis के लिए अतिसंवेदनशील नहीं हैं । एक उपयुक्त lytic एंजाइम lysis में सहायता करने के लिए प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए ।
  3. जोड़ें ~ ८०० μL ०.१ mm zirconia/सिलिका मोती ट्यूब करने के लिए और एक homogenizer पर अधिकतम गति (७,००० rpm) 30 एस प्रत्येक के 5 चक्र के लिए, प्रत्येक चक्र के बीच बर्फ पर 2 मिनट आराम के साथ मिलाते हुए कोशिकाओं को बाधित ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३००० x g पर नमूना केंद्रापसारक (गोली मोती और अटूट कोशिकाओं के लिए) । supernatant को एक नए २.०-एमएल microcentrifuge ट्यूब पर ट्रांसफर करें और बर्फ पर रखें ।
  5. शेष गोली के लिए २०० μL TBSE जोड़ें और एक अतिरिक्त चक्र के लिए homogenizer के लिए वापस । केंद्रापसारक (के रूप में ऊपर) और पिछले supernatant के साथ supernatant गठबंधन (~ 800-1000 μL कुल मात्रा होना चाहिए) ।

2. TX द्वारा लिपो के संवर्धन-११४ चरण विभाजन

  1. 4% की एक बराबर मात्रा जोड़कर (vol/2% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए TX-११४ surfactant के साथ supernatant पूरक) बर्फ में surfactant-शीत TBSE और 1 एच के लिए बर्फ पर मशीन, उलटा द्वारा मिश्रण हर ~ 15 मिनट ।
    नोट: ठंडा होने पर supernatant और surfactant की मिश्रणीय होगी ।
  2. एक ३७ ° c जल स्नान के लिए ट्यूब स्थानांतरण और 10 मिनट के लिए गर्मी चरण जुदाई पैदा करने के लिए । कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए १०,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक द्वि-चरणबद्ध जुदाई बनाए रखने के लिए ।
  3. धीरे ऊपरी जलीय चरण बंद पिपेट और त्यागें । निचली surfactant चरण में आइस-कोल्ड TBSE को अपने मूल वॉल्यूम पर ट्यूब से फिर से भरना और मिश्रण को पलटने के लिए जोड़ें । 10 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
  4. एक ३७ ° c जल स्नान के लिए ट्यूब स्थानांतरण और 10 मिनट के लिए गर्मी चरण जुदाई प्रेरित, तो कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए १०,००० x g पर केंद्रापसारक ।
  5. दोहराएं चरण 2.3-2.4 एक बार 3 जुदाई की कुल के लिए और अधिक । ऊपरी जलीय चरण निकालें और छोड़ें ।
  6. surfactant चरण के लिए बर्फ ठंड TBSE की 1 मात्रा जोड़कर, (ट्यूब के तल पर दिखाई) निकालने के दौरान का गठन किया है कि उपजी प्रोटीन की गोली निकालें । 4 ° c पर १६,००० x g पर 2 मिनट के लिए अघुलनशील प्रोटीन गोली के लिए केंद्रापसारक ।
    नोट: सैंपल सिंगल फेज रहना चाहिए । यदि चरण जुदाई होता है, फिर से सर्द नमूना और फिर से केंद्रापसारक । गोली आम तौर पर गैर लिपोप्रोटीन दूषित पदार्थों से बना है, लेकिन आगे के विश्लेषण के लिए रखा जा सकता है ।
  7. तुरंत supernatant एक ताजा २.० एमएल microcentrifuge ट्यूब १००% एसीटोन के १२५० μL युक्त करने के लिए स्थानांतरण । पिपेट ऊपर और नीचे अच्छी तरह से टिप से नमूना धोने के रूप में यह चिपचिपा हो जाएगा । मिश्रण और रात भर में-20 डिग्री सेल्सियस के लिए प्रोटीन हाला ।
  8. १६,००० एक्स जी पर 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूना ट्यूब के उन्मुखीकरण के लिए ध्यान के साथ गोली लिपो के लिए केंद्रापसारक । लिपो ट्यूब के बाहर की दीवार के साथ एक पतली, सफेद फिल्म बनेगी ।
  9. धो दो बार १००% एसीटोन के साथ गोली । खिचड़ी भाषा एसीटोन और सूखी हवा के लिए नमूना अनुमति देते हैं ।
  10. 10 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच ८.० या एक मानक Laemmli एसडीएस-पृष्ठ नमूना बफर के 20-40 μL जोड़ें16 और अच्छी तरह से ऊपर और नीचे की pipetting के साथ दीवार के खिलाफ नीचे से reसस्पेंड । लिपो को उखाड़ फेंकने के लिए पिपेट टिप के साथ ट्यूब के पक्ष परिमार्जन ।
    नोट: लिपो Tris बफर में भंग नहीं होगा, बल्कि एक निलंबन के रूप में ।
    1. लिपो पर स्टोर-20 ° c उपयोग तक ।

3. एसडीएस-पृष्ठ, Electroblotting, और Ponceau एस के साथ धुंधला

  1. मानक तरीकों का उपयोग कर एसडीएस-PAGE द्वारा पृथक लिपो16।
    नोट: उचित जेल acrylamide प्रतिशत इसके उद्देश्य से उपयोग और लिपो के आकार के आधार पर भिंन होगा । यहां, ई. faecalis लिपो एक 10% Tris-glycine जेल पर अलग किया गया है, जबकि एक १६.५% Tris-tricine जेल छोटे ई. कोलाई लिपोप्रोटीन Lpp17के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
  2. एक मानक electroblotting प्रक्रिया का उपयोग कर एक nitrocellulose स्थानांतरण झिल्ली को लिपो स्थानांतरण ।
    नोट: एक अर्द्ध शुष्क स्थानांतरण Bjerrum शेफर-नीलसन बफर प्लस ०.१% एसडीएस का उपयोग कर 25 V, १.३ mA में 15 मिनट के लिए किया गया था18। एकांतर से, polyvinylidene difluoride (PVDF) झिल्ली इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन के रूप में यह nitrocellulose से अधिक hydrophobic है, यह बाद में कदम पर झिल्ली से hydrophobic lipopeptides के कुशल रेफरेंस को कम कर सकते हैं ।
  3. एक कंटेनर के लिए nitrocellulose झिल्ली स्थानांतरण और Ponceau s समाधान के साथ कवर (०.२% (डब्ल्यू/वी) Ponceau एस 5% एसिटिक एसिड में) । 5 मिनट या जब तक लाल-गुलाबी बैंड दिखाई दे रहे है के लिए धीरे से रॉक ।
  4. Ponceau एस समाधान डालो और ध्यान से डीएच के साथ nitrocellulose झिल्ली कुल्ला2O अतिरिक्त दाग को हटाने के लिए ।
    नोट: Ponceau-सना बैंड तेजी से दाग होगा । यदि बैंड गायब हो, दोहराने धुंधला प्रक्रिया ।
  5. एक साफ उस्तरा ब्लेड के साथ, उत्पाद वांछित बैंड और एक microcentrifuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण । बैंड को पूरी तरह से दाग लगाने के लिए डीएच2O की 1 मिलीलीटर के साथ तीन बार धोएं ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । उपयोग होने तक-20 डिग्री सेल्सियस पर पानी के साथ कवर किए गए एक्साइज सेक्शन को स्टोर करें ।
  6. एक साफ सतह के लिए और एक साफ उस्तरा ब्लेड के साथ अनुभाग स्थानांतरण, पासा लगभग 1 मिमी x 1 मिमी के छोटे टुकड़ों में nitrocellulose पट्टी । एक ०.५ मिलीलीटर कम प्रोटीन बाध्यकारी microcentrifuge ट्यूब में टुकड़े ले लीजिए ।
  7. ताजा-तैयार ५० मिमी अमोनियम बिकारबोनिट (NH4HCO3) के ०.५ मिलीलीटर के साथ दो बार टुकड़ों को धो लें, उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) ग्रेड पानी में पीएच ७.८ ।

4. Tryptic पाचन, Nitrocellulose झिल्ली से Lipopeptide निष्कर्षण, मालदी लक्ष्य पर जमाव, और डेटा अधिग्रहण

  1. ५० मिमी एनएच4HCO3में trypsin के 20 μg/एमएल सॉल्यूशन के 20 μL में nitrocellulose टुकड़ों को पुनर्स्थगित, HPLC ग्रेड वाटर में पीएच ७.८ । भंवर मिश्रण है, तो संक्षेप में यह सुनिश्चित करने के लिए स्पिन कि सभी टुकड़ों को पूरी तरह से trypsin समाधान द्वारा कवर कर रहे हैं । तेल फिल्म का उपयोग कर वाष्पीकरण को रोकने और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर पचाने के लिए ट्यूब ढक्कन कवर ।
  2. 30 एस के लिए १६,००० x g पर नमूना स्पिन और pipetting द्वारा तरल हटा दें ।
    नोट: यह trypsinized हाइड्रोफिलिक पेप्टाइड्स कि प्रोटीन पहचान के लिए मालदी-तोफ MS द्वारा बाद में जांच की जा सकती है निकालता है ।
  3. HPLC ग्रेड के पानी में ०.५% trifluoroacetic एसिड (TFA) की ५० μL जोड़ें । भंवर मिश्रण करने के लिए, तो नमूना संक्षेप में स्पिन सुनिश्चित करने के लिए सभी टुकड़ों समाधान द्वारा कवर कर रहे हैं । कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन । pipetting द्वारा तरल निकालें ।
    सावधानी: TFA अगर साँस लेना हानिकारक है । सावधानी और रासायनिक धुएं हुड में उपयोग के साथ संभाल । त्वचा के साथ संपर्क से बचें ।
  4. दोहराएँ चरण ४.३ के साथ ५० μL के 10% acetonitrile में HPLC ग्रेड पानी.
    सावधानी: Acetonitrile अगर साँस लेना हानिकारक है । सावधानी और रासायनिक धुएं हुड में उपयोग के साथ संभाल । त्वचा के साथ संपर्क से बचें ।
  5. HPLC ग्रेड पानी में 20% acetonitrile की ५० μL के साथ दोहराएँ चरण ४.३.
    नोट: यह ढीला nitrocellulose करने के लिए बाध्य किसी भी मामूली hydrophobic पेप्टाइड्स निकालता है ।
  6. elute के लिए कसकर बंधे lipopeptides, 15 μL हौसले से बनाया 10 मिलीग्राम/एमएल α-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड (CHCA) मैट्रिक्स क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल में भंग (2:1, v/) और आंतरायिक भंवर के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
    1. वैकल्पिक रूप से, जोड़ें 15 μL क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल करने के लिए elute lipopeptides और मिश्रण मैट्रिक्स के साथ बाद में समय । अंय मैट्रिक्स, जैसे 2, 5-dihydroxybenzoic एसिड (DHB), CHCA के लिए विकल्प के रूप में परीक्षण किया जाना चाहिए यदि असंतोषजनक परिणाम एक विशेष lipopeptide संरचना के लिए प्राप्त कर रहे हैं ।
      सावधानी: क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल दोनों ही हानिकारक हैं तो साँस लेना. सावधानी और रासायनिक धुएं हुड में उपयोग के साथ संभाल । त्वचा के साथ संपर्क से बचें ।
    2. वैकल्पिक: सोडियम adduct गठन को बढ़ावा देने के लिए, जलीय सोडियम बिकारबोनिट के साथ क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल में CHCA के समाधान के पूरक (NaHCO3) 1 मिमी की अंतिम एकाग्रता के लिए ।
  7. नमूना संक्षेप में स्पिन । एक पिपेट के साथ, ध्यान से एक नया कम प्रोटीन बाध्यकारी microcentrifuge ट्यूब के लिए तरल स्थानांतरण । इस समाधान में N-टर्मिनल lipopeptides के थोक शामिल होंगे ।
    नोट: nitrocellulose आंशिक रूप से या पूरी तरह से भंग क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल समाधान में हो सकता है । यह नकारात्मक एमएस परिणामों को प्रभावित नहीं करेगा, और lipopeptide वापसी को बढ़ाने के लिए एक वैकल्पिक पद्धति के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । PVDF झिल्ली में भंग नहीं होगा ।
  8. एक पॉलिश्ड स्टील मालदी टारगेट पर CHCA के साथ eluted lipopeptides की 1 μL जमा कर दें ।
    नोट: क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल जल्दी से लुप्त हो जाना, सघन CHCA और lipopeptides के पीछे जा रहा होगा । एक वैकल्पिक दूसरे 1 μL aliquot नमूना एकाग्रता बढ़ाने के लिए एक ही स्थान पर जमा किया जा सकता है । क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल लक्ष्य पर जमाव के बाद काफी फैल सकता है और जैसे, देखभाल के लिए लक्ष्य पर मिश्रण नमूना से बचने के लिए लिया जाना चाहिए । यह जमा और प्रत्येक नमूने के कई स्थानों को गोली मार करने के लिए सिफारिश की है ।
  9. तुरंत मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए आगे बढ़ें । lipopeptide संकेत के लिए मौके के सभी क्षेत्रों स्कैन, विशेष रूप से अगर इस मौके नमूना के दो परतों में शामिल है, के रूप में दूसरी परत जगह बाहरी रिम करने के लिए lipopeptides धक्का हो सकता है ।
    नोट: सिफारिश शुरू लेजर तीव्रता 25% है, हालांकि यह करने के लिए पर्याप्त संकेत करने के लिए शोर अनुपात को प्राप्त करने के लिए संकेत और राशि एकाधिक स्पेक्ट्रा (20 या अधिक स्कैन) प्राप्त करने के लिए तीव्रता बढ़ाने के लिए आवश्यक हो सकता है. यहां, स्पेक्ट्रा एक मालदी पर अधिग्रहीत किया गया-तोफ-तोफ साधन ( सामग्री की तालिकादेखें) 700-3500 एम/जेड सीमा से अधिक चिंतनशील सकारात्मक आयन का पता लगाने के लिए एक कारखाना विन्यस्त साधन विधि का उपयोग कर. साधन एक गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) tryptic पेप्टाइड मिश्रण के साथ तुले थे ।

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Representative Results

प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चित्र 1में प्रदान किया गया है । TX-११४ द्वारा Enterococcus faecalis ATCC १९४३३ से निकाले गए लिपोप्रोटीन-समृद्ध अंश चित्रा 2में दिखाया गया है । तुलना के लिए, हाला प्रोटीन अंश के बैंडिंग पैटर्न भी दिखाया गया है । इस अंश से प्रोटीन मालदी-MS द्वारा लिपो (Table 1) के अलावा अत्यधिक प्रचुर मात्रा में दूषित प्रोटीन होने की पुष्टि की गई । चित्रा 3 में मास स्पेक्ट्रा ई. faecalis लिपोप्रोटीन PnrA की tryptic पेप्टाइड आयन प्रोफ़ाइल प्रदर्शित करता है कि nitrocellulose के बाद बहाकर के साथ होता है (पीक में सूचीबद्ध कार्य बढ़ती के सॉल्वैंट्स के साथ PnrA-बाउंड) तालिका 2) । चित्रा 4 से पता चलता है एनटर्मिनल PnrA के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के रूप में मालदी द्वारा निर्धारित-तोफ एमएस/एमएस, निदान एन-acylated dehydroalanyl lyso-लिपोप्रोटीन फार्म के अनुरूप चोटियों का खुलासा । चित्रा 5 विखंडन पर सोडियम adduct गठन के प्रभाव को दिखाता है, sodiated माता पिता को तरजीह के एन-acylated dehydroalanyl आयन के पक्ष में खंडित आयन के साथ ।

Figure 1
चित्र 1: प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध. लिपो TX-११४ चरण विभाजन से समृद्ध कर रहे है और सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है, सबसे अधिक TLR परख, या आगे एसडीएस द्वारा शुद्ध संरचनात्मक निर्धारण के लिए पृष्ठ में । लिपो nitrocellulose को हस्तांतरित कर रहे हैं, trypsin के साथ पच, धोया stepwise, और परिणामस्वरूप lipopeptides eluted के साथ क्लोरोफॉर्म संरचनात्मक विश्लेषण के लिए मेथनॉल-MS । trypsin और nitrocellulose वाश समाधान प्रोटीन की पहचान और एमएस विश्लेषण के लिए सहेजा जा सकता है । w/: with; TFA: trifluoroacetic अम्ल; ACN: acetonitrile; CHCA: α-cyano-4-hydroxycinnamic अम्ल; ऑप्ट: वैकल्पिक; मालदी: मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर desorption ionization; एमएस: मास स्पेक्ट्रोमेट्री । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: TX के प्रोफाइल-११४ ई. faecalisसे समृद्ध प्रोटीन । एक 10% Tris-glycine एसडीएस-पृष्ठ जेल Coomassie नीले रंग के साथ सना हुआ (क) और इसी nitrocellulose झिल्ली Ponceau एस के साथ सना हुआ (ख) उपजी प्रोटीन अंश ("PPT") और शुद्ध के बीच एक अलग बैंडिंग पैटर्न प्रकट लिपो ("LP") । संकेत Coomassie-सना हुआ बैंड उत्पाद और गैर के रूप में पहचाने गए थे मालदी-tryptic पेप्टाइड्स के एमएस द्वारा लिपो ( तालिका 1देखें). PnrA की पहचान की और यहां वर्णित प्रोटोकॉल द्वारा विश्लेषण किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: आयन प्रोफ़ाइल और बहुतायत nitrocellulose धोने के समाधान के ध्रुवीकरण के साथ परिवर्तन । (क) trypsin अंश चित्रा 2में इंगित ई. faecalis लिपोप्रोटीन PnrA करने के लिए इसी के अनुरूप कई आंतरिक पेप्टाइड टुकड़े दिखाता है । 10% (ख) और 20% (ग) acetonitrile धो अंश संकेत तीव्रता में परिवर्तन और व्यक्तिगत चोटियों की कुल संख्या में कमी दिखा । (घ) अंतिम रेफरेंस अंश अत्यधिक एम/जेड ९९७ पर एन टर्मिनल lipopeptide से समृद्ध है, एक तारांकन (*) द्वारा दर्शाया गया है । प्रत्येक स्पेक्ट्रा की तीव्रता सिग्नल तीव्रता की तुलना के लिए (A) के लिए सामान्यीकृत है । चोटियों जनता और सौंपा अनुक्रम तालिका 2में सूचीबद्ध हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

बैंड प्रोटीन आईडी सेस नं. स्था. आणविक भार पेप्टाइड गणना
1 बढ़ाव फैक्टर टू gb | eol 37301.1 | ४३,३८७ 15
2 नध peroxidase gb | eol 34572.1 | ४९,५२० 9
3 पाइरूवेट डिहाइड्रोजनेज E1component, अल्फा उपइकाई gb | eol 34709.1 | ४१,३५८ 12
4 पाइरूवेट डिहाइड्रोजनेज E1 घटक, उपइकाई बीटा gb | eol 34710.1 | ३५,३७३ 19
5 30 राइबोसोमल प्रोटीन S2 gb | eol 33066.1 | २९,४४४ 16
6 30 राइबोसोमल प्रोटीन S3 gb | eol 37312.1 | २४,३५५ 14

तालिका 1: उपजी प्रोटीन गैर-लिपोप्रोटीन संदूषण हैं । प्रोटीन tryptic डाइजेस्ट और मालदी द्वारा की पहचान की गई-एमएस जेल पाचन में मानक का उपयोग कर19 और वे चित्रा 2में Coomassie जेल पर दिखाई देते है उसी क्रम में ऊपर से नीचे सूचीबद्ध हैं । प्रत्येक प्रोटीन ९५% से अधिक एक विश्वास अंतराल (C.I.) के साथ की पहचान की थी ।

पीक संख्या सैद्धांतिक मास प्रोटीन पोजीशन नहीं. छूटी कट साइट्स की पेप्टाइड अनुक्रम
1 ६३१.३४०९ 170-176 0 GVADAAK
2 ६७५.४०३५ 316-321 1 TKEAVK
3 ८२६.४०९३ 163-169 0 FQAGFEK
4 ८९३.४८३९ 121-128 0 NVVSATFR
5 ९४३.५३५९ 240-247 0 VWVIGVDR
6 १०४०.५०४७ 188-197 0 YAASFADPAK
7 १२००.६३३१ 273-284 0 GVGTAVQDIANR
8 १३१६.६९९७ 290-301 0 FPGGEHLVYGLK
9 १३८५.७८२७ 83-94 0 FNTIFGIGYLLK
10 १४३२.७४३ 149-162 0 VGFVGGEEGVVIDR
11 १५६८.७८०२ 259-272 1 DGKEDNFTLTSTLK
12 १६७२.८२८९ 240-254 1 VWVIGVDRDQDADGK
13 १७०७.८१८४ 129-145 0 DNEAAYLAGVAAANETK
14 १७२४.८०२७ 35-49 0 SFNQSSWEGLQAWGK
15 १७९७.९२२८ 257-272 2 TKDGKEDNFTLTSTLK
16 १८७२.९८५४ 285-301 1 ALEDKFPGGEHLVYGLK
17 १९४५.९६१३ 230-247 1 DLNESGSGDKVWVIGVDR
18 २२४०.१३४५ 149-169 1 VGFVGGEEGVVIDRFQAGFEK
19 २६७५.२५४३ 230-254 2 DLNESGSGDKVWVIGVDRDQDADGK

तालिका 2: मनाया जनता और इसी tryptic पेप्टाइड्स । ई. faecalis PnrA (GenBank: eol 37280.1) के silico trypsin पाचन में PeptideMass20,21का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था, दो कट साइटों को अनुमति दी । चित्रा 3 में स्पेक्ट्रा पर मनाया चोटियों की सैद्धांतिक जनता सूचीबद्ध हैं, इसी पेप्टाइड दृश्यों के साथ.

Figure 4
चित्रा ४: मालदी-तोफ MS च्या ई. faecalis लिपोप्रोटीन PnrA. (क) m/z ९९७ क्षेत्र के जनक एमएस स्पेक्ट्रम ई. faecalis PnrA के एन टर्मिनल lipopeptide के अनुरूप । (ख) सुश्री/lipopeptide चोटी के ms/पता चलता है कि यह lyso रूप है, नैदानिक N-acylated dehydroalanyl पेप्टाइड टुकड़ा आयन चोटी के साथ एक तारे (*) द्वारा संकेत दिया । आविर्भाव संरचना को दिखाया गया है (C). यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन9से संशोधित किया गया है । R.I.: सापेक्ष तीव्रता कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: सोडियम adduct गठन dehydroalanyl lipopeptide आयनों के प्रति जनक आयन विखंडन को बढ़ावा देता है । (क) मालदी-तोफ स्पेक्ट्रा के ई. कोलाई लिपोप्रोटीन Lpp एन टर्मिनल पेप्टाइड (फ़िरोज़ा अंश) के बिना और के साथ (नीले निशान) सोडियम बिकारबोनिट के अलावा. सोडियम बिकारबोनिट के अतिरिक्त अंतिम eluted अंश परिणाम के लिए एक 22 डीए वृद्धि में जनक lipopeptide की गणना द्रव्यमान से । जब protonated आयन के एमएस/एमएस स्पेक्ट्रम के साथ तुलना में (ख), एमएस/एमएस स्पेक्ट्रम इसी sodiated आयन की (ग) तटस्थ के माध्यम से एन-acyl-dehydroalanyl आयन की ओर महत्वपूर्ण अधिमानी विखंडन दिखाता है diacylthioglyceryl moiety का उन्मूलन, तारांकन चिह्न (*) द्वारा दर्शाया गया. जनक triacylated Lpp एन टर्मिनल tryptic पेप्टाइड (डी) की संरचना और एन-acyl-dehydroalanyl पेप्टाइड टुकड़ा आयन (ई) चित्रित कर रहे हैं । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन9से संशोधित किया गया है । R.I.: सापेक्ष तीव्रता कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस के साथ साथ प्रोटोकॉल लिपोप्रोटीन लक्षण वर्णन के दो अलग चरणों: TX द्वारा संवर्धन-११४ चरण विभाजन और संरचनात्मक संकल्प द्वारा मालदी-तोफ MS. TX-११४ निष्कर्षण के दौरान, अतिरिक्त केंद्रापसारक इस प्रक्रिया के दौरान वेग, एसीटोन वर्षण के बाद अत्यधिक समृद्ध लिपो उपज को दूषित प्रोटीन निकालता है । कोशिकाओं के 15 मिलीलीटर मूल्य के लिए प्रत्येक तैयारी के पैमाने को सीमित करके, कई नमूनों को आसानी से समानांतर में संसाधित किया जा सकता है, और यदि वांछित, प्रोटोकॉल के अंत में परित ।

एमएस द्वारा संरचनात्मक विश्लेषण के लिए, लिपो के हस्तांतरण nitrocellulose trypsin पाचन की सुविधा, धोने, और बाद में झिल्ली से रेफरेंस । हमारे हाथ में, इस दृष्टिकोण को पारंपरिक polyacrylamide जेल प्लग से डिटर्जेंट मध्यस्थता निष्कर्षण के लिए बेहतर साबित हो गया है, के रूप में लिपो nitrocellulose झिल्ली की सतह और polyacrylamide में एंबेडेड नहीं के साथ जुड़े रहे हैं । nitrocellulose सतह के साथ लिपोप्रोटीन एसोसिएशन भी काफी हद तक hydrophobic पेप्टाइड्स द्वारा कंटेनर सतहों के लिए विशिष्ट सोखना की आम समस्या को रोकता है । nitrocellulose टुकड़ों के Stepwise रेफरेंस से अधिक हाइड्रोफिलिक, इंटरनल tryptic पेप्टाइड्स को निकाला जाता है जिसका विश्लेषण मालदी-तोफ एमएस द्वारा हाई कॉन्फिडेंस प्रोटीन पहचान असाइनमेंट हासिल करने के लिए किया जा सकता है, जबकि अंतिम रेफरेंस स्टेप reproducibly पैदावार एक छोटी सी मात्रा में केंद्रित lipopeptides है कि मोटे तौर पर नमक और आयन दबा दूषित पदार्थों के हस्तक्षेप से मुक्त है ।

एक लिपोप्रोटीन के सफल एमएस विश्लेषण अपनी बहुतायत के अधीन है, और जैसे, Ponceau एस से अंधेरे बैंड-दाग झिल्ली को सबसे अच्छा परिणाम देने की संभावना है । हालांकि, यह संभव है कि कई लिपो एक एकल बैंड में पृष्ठ जुदाई के दौरान विस्थापित, जिसके परिणामस्वरूप स्पेक्ट्रा उलझी हो सकता है । इसलिए, यह अत्यधिक पहले पेप्टाइड मास फिंगरप्रिंटिंग (PMF) है, जो कुल trypsin अंश पर एमएस स्पेक्ट्रा इकट्ठा करके पूरा किया जा सकता है या या तो acetonitrile धो अंश और आने वाली चोटियों में एक में डालने के द्वारा प्रोटीन की पहचान की सिफारिश की है शुभंकर22जैसे सॉफ्टवेयर । एक बार प्रोटीन अनुक्रम निर्धारित किया गया है, tryptic एन टर्मिनल lipopeptide के द्रव्यमान की गणना काफी चुनने में एड्स जो एमएस द्वारा टुकड़ा करने के लिए आयन/

अतिरिक्त नमूना विविधता एक जनसंख्या और उनके N-टर्मिनल संशोधनों के भीतर लिपो पर acyl श्रृंखला लंबाई अलग से परिणाम कर सकते हैं, दोनों स्रोत बैक्टीरिया पर निर्भर करता है6. श्रृंखला की लंबाई में भिन्नता के जनक स्पेक्ट्रा पर विशिष्ट पीक क्लस्टर के लिए बनाता है, जबकि 14 दा methylene समूहों के लिए इसी वृद्धि की विशेषता (-CH2-), यह समग्र lipopeptide संकेत विभाजित कर सकते हैं और संवेदनशीलता में कमी. यह भी संभावना है कि विभिंन लिपोप्रोटीन रूपों संवर्धन और विखंडन प्रभावित है, हालांकि हम सफलतापूर्वक triacylated, diacylated की पहचान की है, और lyso-फार्म लिपो वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर । इसी तरह, लिपो के अलग पेप्टाइड moieties जटिलता का एक और स्तर विश्लेषण करने के लिए जोड़ने के लिए, उनके N-टर्मिनल संरचना की परवाह किए बिना, एक बहुत हाइड्रोफिलिक एमिनो एसिड संरचना के रूप में कार्बनिक क्लोरोफॉर्म चरण में lipopeptide विभाजन को रोकने सकता है अंय निष्कर्षण विधियों का उपयोग करना8। लिपोप्रोटीन के हस्तांतरण के लिए nitrocellulose इस तरह के lipopeptides का अध्ययन करने में सहायता करेगा, के रूप में सभी रेफरेंस अंश इस पद्धति में विश्लेषण किया जा सकता है ।

पिछले triacylglycerides और फॉस्फोलिपिड23शामिल साहित्य से ड्राइंग, जानबूझकर सोडियम adduct गठन (एनacyl)-dehydroalanyl पेप्टाइड आयन के गठन के माध्यम से अधिक जानकारीपूर्ण विखंडन को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इन विशेषता आयनों संरचना निर्दिष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, N के acylation राज्य के बाद से-टर्मिनस glyceryl moiety पर acyl प्रतिस्थापन से अलग है । सोडियम adduct गठन हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ सल्फर ऑक्सीकरण के लिए एक सुविधाजनक वैकल्पिक विकल्प प्रदान करता है, जो भी एन-acyl-dehydroalanyl पेप्टाइड विखंडन6,8को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है । हालांकि सोडियम adducts जनक आयन संकेत का एक समग्र दमन दिखा सकते हैं, dehydroalanyl आयनों की दिशा में विखंडन में विशिष्ट वृद्धि कम जनक आयन तीव्रता के लिए क्षतिपूर्ति । यह अन्य मैट्रिक्स और अतिरिक्त adducts के विखंडन की खोज के लिए सबसे जानकारीपूर्ण स्पेक्ट्रा के रूप में लाना लायक हो सकता है ।

इस प्रोटोकॉल लिपोप्रोटीन संवर्धन के लिए पारंपरिक TX-११४ चरण विभाजन विधि पर सुधार, जबकि पृष्ठ के हस्तांतरण-अलग लिपो nitrocellulose झिल्ली को trypsin पाचन और lipopeptides के रेफरेंस की सुविधा । मालदी-तोफ एमएस विश्लेषण पर कुल tryptic या धो अंशों एन के साथ मिलकर में प्रोटीन पहचान के लिए अनुमति देता है टर्मिनल संरचनात्मक दृढ़ संकल्प एमएस द्वारा एक ही प्रयोग में/ वैकल्पिक सोडियम adduct गठन और अधिक जानकारीपूर्ण आयन विखंडन को बढ़ावा देने के द्वारा lipopeptide N-टर्मिनस में मतभेद पर प्रकाश डाला गया । लिपो को नियमित रूप से शुद्ध करने की क्षमता और उनके N विशेषताएं-टर्मिनी कैसे उपंयास लिपोप्रोटीन रूपों पर व्यापक अध्ययन कर रहे हैं, बैक्टीरियल सेल लिफाफे के भीतर उनकी शारीरिक भूमिका, और कैसे वे स्तनधारी प्रतिरक्षा द्वारा पता लगाया जाता है सक्षम हो जाएगा सिस्टम.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

मेरेडिथ लैब में अनुसंधान स्टार्टअप Eberly विज्ञान कॉलेज (पेंसिल्वेनिया राज्य विश्वविद्यालय) द्वारा प्रदान की निधियों द्वारा समर्थित किया गया था । हम पेन स्टेट प्रोटियोमिक् और मास स्पेक्ट्रोमेट्री कोर सुविधा, यूनिवर्सिटी पार्क, फिलीस्तीनी अथॉरिटी, जहां जन spectrometric विश्लेषण प्रदर्शन किया गया में उपकरणों के लिए विशेषज्ञ तकनीकी सलाह और उपयोग के लिए Dr. तातियाना Laremore धन्यवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
0.01 mm Zirconia/silica beads BioSpec Products 110791012
Acetic acid EMD AX0073-9
Acetone EMD AX0116-6
Acetonitrile EMD AX0142-6
Ammonium bicarbonate Fluka Analytical 09830
BioTrace NT Nitrocellulose PALL Life Sciences 66485
Bovine serum albumin (BSA) digest standard Protea PS-204-1
Chloroform Acros Organics 423550025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP118
HPLC Grade water EMD WX0008-1
Lysozyme Fisher Scientific BP535-1
Methanol Sigma-Aldrich 34860
Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) Amresco 0754
Pierce trypsin protease Thermo Scientific 90057
Ponceau S Acros Organics 161470100
Protein LoBind Tube 0.5mL Eppendorf 022431064
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich 792519
Sodium chloride Macron Fine Chemicals 7581-06
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma-Aldrich 299537
Tris-hydrochloride (HCl) Fisher Scientific BP152
Triton X-114 Sigma-Aldrich 93422
Tryptic soy broth (TSB) BD 211822
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) Sigma-Aldrich C8982
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
MagNALyser Roche
Trans-Blot Turbo Transfer System Bio-Rad
MALDI-TOF target Bruker Daltonics
Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF Bruker Daltonics Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser

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References

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बैक्टीरियल लिपो के संवर्धन और जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा संरचनात्मक निर्धारण के लिए एन टर्मिनल Lipopeptides की तैयारी
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Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (135), e56842, doi:10.3791/56842 (2018).

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