Summary
Anriking av bakteriell lipoproteiner bruker en ikke-ioniske surfactant fase partisjonering metoden er beskrevet for direkte bruk i TLR analyser og andre programmer. Videre skritt er detaljert forberede N-terminal tryptic lipopeptides strukturelle karakterisering av massespektrometri.
Abstract
Lipoproteiner er viktige bestanddeler av bakteriell celle konvolutten og potent aktivator av pattedyr medfødte immunforsvaret. Til tross for betydningen av både celle fysiologi og immunologi gjenstår mye å bli oppdaget om romanen lipoprotein skjemaer, hvordan de er synthesized og effekten av ulike former på verten immunitet. For å aktivere grundige studier på lipoproteiner, denne protokollen beskriver en metode for bakteriell lipoprotein berikelse og utarbeidelse av N-terminal tryptic lipopeptides for strukturelle fastsettelse av matrix-assistert laser desorption ionization-tiden for flygningen massespektrometri (MALDI-TOF MS). Utvide på en etablert Triton X-114 fase partisjonering for lipoprotein utvinning og berikelse fra bakteriell cellemembranen, protokollen inneholder flere trinn for å fjerne ikke-lipoprotein forurensninger, øke lipoprotein avkastning og renhet. Siden lipoproteiner er vanlige i Toll-like reseptor (TLR) analyser, er det viktig å først karakterisere N-terminal strukturen av MALDI-TOF MS. Herein, en metode er presentert for å isolere konsentrert hydrofobe peptider anriket på N-terminal lipopeptides egnet for direkte analyse av MALDI-TOF MS/MS. lipoproteiner som har blitt atskilt av natrium Dodecyl Sulfate Poly-akrylamid Gel geleelektroforese (SDS-side) overføres til en nitrocellulose membran, fordøyd i situ med Trypsin, vasket sekvensielt for å fjerne polar tryptic peptider og endelig elut med kloroform-metanol. Når kombinert med MS av mer polar trypsinized peptider fra vask løsninger, gir denne metoden både identifisere lipoprotein og karakteriserer sin N-terminus i et enkelt eksperiment. Forsettlig natrium adduct formasjon kan også brukes som et verktøy for å fremme mer strukturelt informativ fragmentering spectra. Til slutt, anriking av lipoproteiner og fastsetting av deres N-terminal strukturer vil tillate mer omfattende studier på denne allestedsnærværende klassen av bakteriell proteiner.
Introduction
Bakteriell lipoproteiner er preget av en bevart N-terminal lipid-endret cystein som forankrer globular protein domenet cellemembranen overflaten. De er universelt fordelt i bakterier, utgjør 2 til 5% av alle cellulære gener i en typisk genomet1. Lipoproteiner spille viktige roller i en rekke cellulære prosesser, inkludert nærings-opptak, signaltransduksjon, montering av protein komplekser, og opprettholde celle konvolutt konstruksjonssikkerhet2. I patogene bakterier tjene lipoproteiner som virulens faktorer3,4. Under en infeksjon oppfordrer anerkjennelse av N-terminal lipopeptides av Toll-like reseptor (TLR) 2 en medfødte immunforsvaret fjerne invaderende patogener. Avhengig av N-terminal acylation staten, er lipoproteiner generelt anerkjent av alternative TLR2 heterodimeric komplekser. TLR2-TLR1 gjenkjenner N-acylated lipopeptides, mens TLR2-TLR6 binder gratis lipopeptide α-amino termini. Når bundet, konvergere signalveier for å indusere utskillelsen av proinflammatory cytokiner3,4.
Tidligere var det antatt at lipoproteiner fra Gram-positive bakteriene var diacylated og de fra Gram-negative bakterier var triacylated, ulike i fravær eller tilstedeværelse av en amid knyttet fettsyrer på bevarte N-terminal cystein rester. Denne antagelsen ble støttet av mangel på sekvens orthologs i Gram-positive genomer til Lnt, Gram-negative N-acyl-transferase som danner triacylated lipoproteiner5. Men har studier nylig avdekket lipoprotein triacylation i Gram-positive Firmicutes at mangel lnt, samt tre nye N-terminal lipoprotein strukturer, kalte den peptidyl, lyso og N -acetylen skjemaer6,7 ,8. Disse funnene heve spørsmål om mulig ennå-å-være-oppdaget lipoprotein former, sammen med grunnleggende spørsmål om hvordan disse romanen lipoproteiner er gjort og hva fysiologiske formål eller fordel ulike former formidle. Videre vise de tydelig gjeldende russernes genomics å forutsi lipoprotein struktur. Faktisk identifisert vi nylig en roman klasse av lipoprotein N-acyl transferases, kalt Lit, Enterococcus faecalis og Bacillus cereus som gjør lyso-form lipoproteiner9. Dette angir behovet for å kontrollere eksperimentelt lipoprotein struktur, som kan være utfordrende deres ekstremt hydrofobe natur og begrenset metoder tilgjengelig som karakteriserer sin molekylære struktur.
For å lette studier på lipoprotein induksjon av immunrespons i verten, samt N-terminal strukturelle besluttsomhet, har vi tilpasset flere beskrevet tidligere protokoller for å rense bakteriell lipoproteiner og forberede N-terminal tryptic lipopeptides for analyse av MALDI-TOF MS6,10,11,12. Lipoproteiner er beriket med en etablert Triton X-114 (heretter referert til som surfactant eller TX-114) fase partisjonering metoden, med optimalisering fjerne forurensende ikke-lipoproteiner og øke lipoprotein utbytte. Disse lipoproteiner er egnet for direkte bruk i TLR analyser eller ytterligere rensing av SDS-side. MALDI-TOF MS, overføring av lipoproteiner til nitrocellulose membran gir et stillas for effektiv i situ trypsin fordøyelsen, vasking og påfølgende elueringsrør fra membranen overflaten, noe som resulterer i svært renset N-terminal lipopeptides. Nitrocellulose har vist seg å lette eksempel håndtering og forbedre sekvens dekning for svært hydrofobe peptider fra integrert membran proteiner13,14, samt lipoproteiner9,10 . Metoden har fordelen av fractionating peptider basert på polaritet, slik at mellomliggende vask løsninger kan bli analysert for høy visshet protein identifikasjon med N-terminal strukturelle bestemmelse i et enkelt eksperiment . Denne protokollen unikt funksjoner tilsiktet natrium adduct formasjon å fremme overordnede ion fragmentering mot dehydroalanyl ioner under MS-/ MS, hjelpe strukturelle tildeling av N- acylation. N-terminus ligger begge mest variabel og viktige funksjonen gjelder TLR anerkjennelse av lipoproteiner. Samlet har denne protokollen tillatt intensiv og reproduserbar studier på lipoproteiner, med de individuelle etappene rensing og strukturelle vilje av MALDI-TOF MS lett tilpasses avhengig av det overordnede målet med forsøket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celle vekst og lyse
- Vokse bakterier i 15 mL tryptic soya kjøttkraft (TSB) eller lignende medierik til sent eksponentiell fase (OD600 på 1.0-1,5). Høste celler med sentrifugering, vask en gang med Tris-bufret saline/EDTA (TBSE) og fortsette med protokollen eller fryse til bruk.
Merk: TBSE: 20 mM Tris-hydrochloride (HCl), pH 8.0, 130 mM natriumklorid (NaCl), og 5 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA)). Lipoprotein uttrykk og endring kan være påvirket av vekst forhold (f.eks Surhet, saltholdighet, vekst medier) og vekst fase15. Cellevekst kan skaleres som ønsket, men 15-mL av celler er anbefalt for en enkelt forberedelse av lipoproteiner som overflødig biomasse kan redusere lipoprotein avkastning. En 15-mL forberedelse generelt gir nok utvalg for optimal lasting av ~ 2-4 kjørefelt på en standard SDS-siders mini gel. - Resuspend celler i 800 μL TBSE med 1 mM phenylmethyl sulfonyl fluor (PMSF) og 0,5 mg/mL lysozyme. Overføre løsning til en 2.0-mL gjengede microcentrifuge rør med skrukork og O-ring og ruge etter 20 min på 37 ° C.
Merk: Enkelte arter er ikke utsatt for lysis av lysozyme. Et passende lytisk enzym som skal erstatte til hjelp i lysis. - Legg ~ 800 μL 0,1 mm zirconia/silica perler til røret og forstyrre celler ved å riste med maksimal hastighet (7.000 rpm) på en homogenizer for 5 sykluser av 30 s hver, med 2 min hvile på is mellom hver syklus.
- Sentrifuger eksempel 3000 x g i 5 min på 4 ° C (pellets perler og ubrutt celler). Overføre nedbryting til en ny 2.0-mL microcentrifuge tube og holde på isen.
- Tilsett 200 μL TBSE det gjenværende pellet og gå tilbake til homogenizer for en ekstra syklus. Sentrifuge (som over) og kombinere nedbryting med foregående nedbryting (skal være 800-1000 μL totalt volum).
2. anriking av lipoproteiner av TX-114 fase partisjonering
- Supplere nedbryting med TX-114 surfactant til en siste konsentrasjon på 2% (vol/vol) ved å legge til en lik mengde 4% (vol/vol) surfactant i iskalde TBSE og ruge på is 1t, miksing av inversjon hvert ~ 15 min.
Merk: Når kjølte, nedbryting og surfactant være blandbar. - Overføre røret til en 37 ° C vannbad og ruge i 10 min å indusere fase separasjon. Sentrifuge prøven på 10.000 x g i 10 min ved romtemperatur å opprettholde bi-phasic separasjon.
- Forsiktig Pipetter av den øvre vandige fasen og kast. Legg iskalde TBSE til lavere surfactant fase fylle røret til sin opprinnelige volum og Inverter for å blande. Ruge på is 10 min.
- Overføre røret til en 37 ° C vannbad ruge i 10 min å indusere fase separasjon, og sentrifuge 10.000 x g i 10 min ved romtemperatur.
- Gjenta trinn 2.3-2,4 igjen for totalt 3 separasjoner. Fjerne den øvre vandige fasen og kast.
- Fjerne pellet utfelt proteiner som formet løpet av utdrag (synlig nederst på røret), ved å legge 1 volumet av iskalde TBSE til surfactant fase. Sentrifuge på 4 ° C 16.000 x g i 2 minutter til pellets uløselig protein.
Merk: Utvalg bør være én fase. Hvis fase separasjon, nytt chill utvalg og sentrifuge igjen. Pellet er vanligvis består av ikke-lipoprotein forurensninger, men kan beholdes for videre analyse. - Øyeblikkelig overføre nedbryting til en frisk 2.0-mL microcentrifuge rør som inneholder 1250 μL 100% aceton. Pipetter opp og ned grundig vaske prøven fra spissen som det vil være tyktflytende. Bland ved inversjon og ruge over natten på 20 ° C til å fremkalle protein.
- Sentrifuge prøven 16.000 x g for 20 min ved romtemperatur å pellets lipoproteiner med hensyn til retningen på røret. Lipoproteiner vil danne en tynn, hvit film langs utsiden av røret.
- Vask pellet to ganger med 100% aceton. Dekanter aceton og tillate å luften tørr.
- Legge til 20-40 μL 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 eller en standard Laemmli SDS-PAGE eksempel buffer16 og grundig resuspend av pipettering opp og ned mot veggen med utfelt lipoproteiner. Skrape siden av røret med Pipetter spissen å dislodge lipoproteiner.
Merk: Lipoproteiner løses ikke i Tris buffer, men heller danne en suspensjon.- Lagre lipoproteiner på 20 ° C før bruk.
3. SDS-side, Electroblotting og flekker med Ponceau S
- Separat lipoproteiner SDS-side ved hjelp av standardmetodene16.
Merk: Aktuelle gel akrylamid prosenten vil variere avhengig av sin tiltenkte bruk og størrelsen på lipoproteiner. Her, ble E. faecalis lipoproteiner skilt over 10% Tris-glycine gel, mens en 16,5% Tris-tricine gel ble brukt for den mindre E. coli lipoprotein Lpp17. - Overføre lipoproteiner til en nitrocellulose overføring membran med en standard electroblotting-prosedyre.
Merk: En semi-tørr overføring ved hjelp av Bjerrum Schafer-Nielsen buffer pluss 0,1% SDS ble utført på 25 V, 1.3 mA 15 min18. Eventuelt kan polyvinylidene difluoride (PVDF) membranen brukes, men som det er mer hydrofobe enn nitrocellulose, kan det redusere effektiv elueringsrør av hydrofobe lipopeptides fra membranen i senere trinn. - Overføre nitrocellulose membranen til en beholder og dekk med Ponceau S løsning (0,2% (w/v) Ponceau S i 5% eddiksyre). Rock forsiktig i 5 minutter eller til rød-rosa band er synlig.
- Hell av Ponceau S løsning og nøye skyll nitrocellulose membranen med dH2O for å fjerne overflødig flekken.
Merk: Ponceau-farget band vil destain raskt. Hvis band forsvinner, gjenta Fargeprosess. - Med en ren barberblad, avgiftsdirektoratet det ønskede båndet og overføre til et microcentrifuge rør. Vask tre ganger med 1 mL av dH2O til helt destain bandet.
Merk: Protokollen kan pauses her. Lageret forbrukeravgift delen dekket med vann på 20 ° C før bruk. - Overføre delen til en ren overflate og med en ren barberblad, terninger nitrocellulose stripen i små biter av ca 1 mm x 1 mm. samle bitene i en 0,5 mL lav protein bindende microcentrifuge tube.
- Vask bitene to ganger med 0,5 mL av nylagde 50 mM ammonium bikarbonat (NH4HCO3), pH 7,8 i høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) klasse vann.
4. tryptic fordøyelsen, Lipopeptide utvinning fra Nitrocellulose membran, deponering på MALDI mål, og datainnsamling
- Resuspend nitrocellulose stykker i 20 μL av en 20 μg/mL løsning av trypsin i 50 mM NH4HCO3pH 7,8 i HPLC klasse vann. Vortex å blande, deretter spinne kort for å sikre at alle brikkene er fullstendig dekket av trypsin løsningen. Dekke tube lokket med parafin film å hindre fordampning og ruge digest overnatting på 37 ° C.
- Spin prøven 16.000 x g for 30 s og fjern væsken av pipettering.
Merk: Dette fjerner trypsinized hydrofile peptider som kan undersøkes senere av MALDI-TOF MS for protein identifikasjon. - Tilsett 50 μL av 0,5% trifluoroacetic acid (TFA) i HPLC klasse vann. Vortex å blande, store prøven kort for å sikre alle brikkene er dekket av løsningen. Inkuber i 10 min ved romtemperatur. Fjern væsken av pipettering.
Forsiktig: TFA er skadelig ved innånding. Behandle med forsiktighet og bruk i kjemiske avtrekksvifte. Unngå hudkontakt. - Gjenta trinn 4.3 med 50 μL av 10% acetonitrile i HPLC klasse vann.
Forsiktig: Acetonitrile er skadelig ved innånding. Behandle med forsiktighet og bruk i kjemiske avtrekksvifte. Unngå hudkontakt. - Gjenta trinn 4.3 med 50 μL av 20% acetonitrile i HPLC klasse vann.
Merk: Dette fjerner eventuelle moderat hydrofobe peptider løst bundet til nitrocellulose. - Elute tett bundet lipopeptides, legge til 15 μL nylaget 10 mg/mL α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) matrix oppløst i kloroform-metanol (2:1, v/v) og ruge i 10 min ved romtemperatur med intermitterende vortexing.
- Alternativt legge 15 μL kloroform-metanol elute lipopeptides og bland med matrix senere. Andre matriser, som 2,5-dihydroxybenzoic syre (DHB), bør testes som alternativer til CHCA hvis du får tilfredsstillende resultater for en bestemt lipopeptide komposisjon.
Forsiktig: Både kloroform og metanol er skadelig ved innånding. Behandle med forsiktighet og bruk i kjemiske avtrekksvifte. Unngå hudkontakt. - Tilleggsutstyr: Å fremme natrium adduct formasjon, supplement løsning av CHCA i kloroform-metanol med vandig natriumbikarbonat (NaHCO3) til en siste konsentrasjon av 1 mM.
- Alternativt legge 15 μL kloroform-metanol elute lipopeptides og bland med matrix senere. Andre matriser, som 2,5-dihydroxybenzoic syre (DHB), bør testes som alternativer til CHCA hvis du får tilfredsstillende resultater for en bestemt lipopeptide komposisjon.
- Spinne prøven kort. Med en pipette, nøye overføre væske til en ny lav protein bindende microcentrifuge tube. Denne løsningen inneholder mesteparten av N-terminal lipopeptides.
Merk: Nitrocellulose kan helt eller delvis løses i kloroform-metanol løsningen. Dette vil ikke negativt påvirke MS resultater og kan brukes som en alternativ metode for å øke lipopeptide tilbake. PVDF membran løses ikke på samme måte. - Innskudd 1 μL eluted lipopeptides med CHCA på et polert stål MALDI mål.
Merk: Kloroform-metanol vil fordampe raskt, etterlot krystallisert CHCA og lipopeptides. En valgfri andre 1 μL aliquot kan settes til samme sted å øke eksempel konsentrasjon. Kloroform-metanol kan spre betydelig etter avsetning på målet og som sådan, bekymre burde være tatt å unngå eksempel blande på målet. Det anbefales å sette og skyte flere stedene i hver prøve. - Gå rett massespektrometri. Skanne alle områder i stedet for lipopeptide-signal, spesielt hvis stedet inneholder to lag av prøven, som det andre laget kan presse lipopeptides til stedets ytre felgen.
Merk: Anbefalt Start laser intensitet er 25%, selv om det kan være nødvendig å øke intensiteten for å skaffe signal og summere flere spectra (20 eller flere skanner) for å oppnå tilstrekkelig signal-til-støy-forhold. Her spectra anskaffet på et MALDI-TOF-TOF instrument (se Tabell for materiale) med en fabrikk-konfigurert instrument metode for reflektor positive-ion påvisning over 700-3500 m/z området. Instrumentet ble kalibrert med en storfe serum albumin (BSA) tryptic peptid blanding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skjematisk av protokollen tilbys i figur 1. Lipoprotein-beriket brøken Hentet fra Enterococcus faecalis ATCC 19433 av TX-114 er vist i figur 2. Til sammenligning vises også stripemønster av utfelt protein fraksjon. Proteiner fra denne fraksjonen ble bekreftet av MALDI-MULTIPLE Sclerosis å være svært rikelig forurensende proteiner enn lipoproteiner (tabell 1). Til masse spectra i Figur 3 viser tryptic peptid ion profilen av E. faecalis lipoprotein PnrA som oppstår med påfølgende vasker av nitrocellulose-bundet PnrA med løsemidler av økende polaritet (topp tildelingene opplistet i Tabell 2). Figur 4 viser N-terminal strukturelle karakterisering av PnrA som bestemmes av MALDI-TOF MS-/ MS, avslørende diagnostiske N- acylated dehydroalanyl topper tråd med skjemaet lyso-lipoprotein. Figur 5 viser effekten av natrium adduct formasjon på fragmentering, med sodiated overordnede ion fortrinnsvis fragmentering for N- acylated dehydroalanyl ion.
Figur 1: skjematisk av protokollen. Lipoproteiner kan er beriket med TX-114 fase partisjonering og brukes direkte, oftest i TLR analyser, eller videre renset ved SDS side for strukturelle vilje. Lipoproteiner overføres til nitrocellulose, fordøyd med trypsin, vasket gradvis, og den resulterende lipopeptides elut med kloroform-metanol for strukturell analyse av MALDI-MULTIPLE Sclerosis. Trypsin og nitrocellulose vask løsningene kan lagres for protein identifikasjon og MS analyse. med: med; TFA: trifluoroacetic syre; ACN: acetonitrile; CHCA: α-cyano-4-hydroxycinnamic syre; velge: valgfritt. MALDI: matrise-assistert laser desorpsjon ionization; MS: massespektrometri. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Profilen til TX-114 beriket proteiner fra E. faecalis. En 10% Tris-glycine SDS side gel farget med Coomassie blå (A) og tilsvarende nitrocellulose membranen farget med Ponceau S (B) avslører en annen striper mønster mellom utfelt protein fraksjon ("PPT") og den renset lipoproteiner ("LP"). De angitte Coomassie-farget bandene ble excised og identifisert som ikke-lipoproteiner av MALDI-MULTIPLE Sclerosis av tryptic peptider (se tabell 1). PnrA ble identifisert og analyseres av protokollen beskrevet her. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Ion profil og overflod endringer med polaritet nitrocellulose vaske løsninger. (A) trypsin brøken viser flere interne peptid fragmenter tilsvarer E. faecalis lipoprotein PnrA angitt i figur 2. 10% (B) og 20% (C) acetonitrile vask fraksjoner Vis endringer i signal intensitet og en nedgang i det totale antallet personlige topper. (D) siste elueringsrør brøkdel er svært beriket med N-terminal lipopeptide på m /z 997, angitt med en stjerne (*). Intensiteten av hver spectra er normalisert til (A) for sammenligning av signalet. Topper massene og tildelte sekvenser er oppført i tabell 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Bandet | Protein-ID | Tiltredelse nr. | EST. molekylvekt | Peptid teller | |
| 1 | forlengelse faktor Tu | GB | EOL37301.1 | | 43,387 | 15 | |
| 2 | NADH peroxidase | GB | EOL34572.1 | | 49,520 | 9 | |
| 3 | pyruvate dehydrogenase E1component, alfa delenhet | GB | EOL34709.1 | | 41,358 | 12 | |
| 4 | pyruvate dehydrogenase E1 komponent, delenhet beta | GB | EOL34710.1 | | 35,373 | 19 | |
| 5 | 30s ribosomal protein S2 | GB | EOL33066.1 | | 29,444 | 16 | |
| 6 | 30s ribosomal protein S3 | GB | EOL37312.1 | | 24,355 | 14 | |
Tabell 1: utfelt proteiner er ikke-lipoprotein forurensninger. Proteiner ble identifisert ved tryptic fordøye og MALDI-MULTIPLE Sclerosis med standarden i gel fordøyelsen protokoller19 og vises fra topp til bunn i den samme rekkefølgen som de vises på Coomassie gel i figur 2. Hver protein ble identifisert med et konfidensintervall (bakgrunnsstøyreduksjon) mer enn 95%.
| Toppen antall | Teoretisk Mass | Protein posisjon | nei. Tapte kuttet nettsteder | Peptid sekvens | |
| 1 | 631.3409 | 170-176 | 0 | GVADAAK | |
| 2 | 675.4035 | 316-321 | 1 | TKEAVK | |
| 3 | 826.4093 | 163-169 | 0 | FQAGFEK | |
| 4 | 893.4839 | 121-128 | 0 | NVVSATFR | |
| 5 | 943.5359 | 240-247 | 0 | VWVIGVDR | |
| 6 | 1040.5047 | 188-197 | 0 | YAASFADPAK | |
| 7 | 1200.6331 | 273-284 | 0 | GVGTAVQDIANR | |
| 8 | 1316.6997 | 290-301 | 0 | FPGGEHLVYGLK | |
| 9 | 1385.7827 | 83-94 | 0 | FNTIFGIGYLLK | |
| 10 | 1432.743 | 149-162 | 0 | VGFVGGEEGVVIDR | |
| 11 | 1568.7802 | 259-272 | 1 | DGKEDNFTLTSTLK | |
| 12 | 1672.8289 | 240-254 | 1 | VWVIGVDRDQDADGK | |
| 13 | 1707.8184 | 129-145 | 0 | DNEAAYLAGVAAANETK | |
| 14 | 1724.8027 | 35-49 | 0 | SFNQSSWEGLQAWGK | |
| 15 | 1797.9228 | 257-272 | 2 | TKDGKEDNFTLTSTLK | |
| 16 | 1872.9854 | 285-301 | 1 | ALEDKFPGGEHLVYGLK | |
| 17 | 1945.9613 | 230-247 | 1 | DLNESGSGDKVWVIGVDR | |
| 18 | 2240.1345 | 149-169 | 1 | VGFVGGEEGVVIDRFQAGFEK | |
| 19 | 2675.2543 | 230-254 | 2 | DLNESGSGDKVWVIGVDRDQDADGK | |
Tabell 2: observert massene og tilsvarende tryptic peptidene. I sili trypsin fordøyelsen av E. faecalis PnrA (GenBank: EOL37280.1) ble utført ved hjelp av PeptideMass20,21, tillater opptil to savnet kutte områder. Teoretisk massene av toppene observert på spectra i Figur 3 vises sammen med tilsvarende peptid sekvenser.
Figur 4: MALDI-TOF MS av E. faecalis lipoprotein PnrA. (A) overordnede MS spekteret av den m /z 997 regionen tilsvarer N-terminal lipopeptide av E. faecalis PnrA. (B) MS-/ MS av lipopeptide fjellet avslører at det er den lyso formen, med diagnostiske N- acylated dehydroalanyl peptid fragment ion toppen indikeres med et stjernetegn (*). Belyst strukturen vises (C). Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon9. R.I.: relative intensiteten Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: natrium adduct formasjon fremmer overordnede ion fragmentering mot dehydroalanyl lipopeptide ioner. (A) MALDI-TOF spektra av E. coli lipoprotein Lpp N-terminal peptid uten (turkis spor) og med (blå spor) tillegg av natrium bikarbonat. Tillegg av natrium bikarbonat til siste elut brøkdel resultatene i en 22 Da økning beregnet masse den overordnede lipopeptide. Sammenliknet med MS-/ MS spekteret av protonerte ion (B), MS-/ MS spekteret av tilsvarende sodiated ion (C) viser betydelig fortrinnsrett fragmentering mot N-acyl-dehydroalanyl ion gjennom nøytral eliminering av diacylthioglyceryl moiety, angitt med en stjerne (*). Strukturen for den overordnede triacylated Lpp N-terminal tryptic peptid (D) og N-acyl-dehydroalanyl peptid fragment ion (E) vises. Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon9. R.I.: relative intensiteten Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen her beskriver to forskjellige stadier av lipoprotein karakterisering: berikelse av TX-114 fase partisjonering og strukturelle fastsettelse av MALDI-TOF MS. Under TX-114 utvinning fjerner ekstra sentrifugering skadelige proteiner som bunnfall under denne prosessen, etterfulgt av aceton nedbør å gi høyanriket lipoproteiner. Begrenser omfanget av hvert preparat til 15-mL verdi av celler, kan flere prøver lett behandles parallelt, og eventuelt samlet på slutten av protokollen.
For strukturell analyse av MS muliggjør overføring av lipoproteiner til nitrocellulose trypsin fordøyelsen, vasking og påfølgende elueringsrør fra membranen. I våre hender denne tilnærmingen har vist seg for å være best å vaskemiddel-mediert utvinning fra tradisjonelle polyakrylamid gel plugger, som lipoproteiner er forbundet med overflaten av nitrocellulose membranen og ikke innebygd i polyakrylamid. Lipoprotein tilknytning nitrocellulose overflaten forhindrer også i stor grad de vanlige problemet med uspesifikke adsorpsjon beholder overflater av hydrofobe peptider. Gradvis elueringsrør nitrocellulose stykker fjerner mer hydrofile, interne tryptic peptider som kan analyseres av MALDI-TOF MS å oppnå høy visshet protein identifikasjon oppdrag, mens det siste elueringsrør trinnet reproduserbar gir konsentrert lipopeptides i et lite volum som stort sett uten forstyrrende salter og ion undertrykke forurensninger.
Vellykket MS analyse av en lipoprotein er underlagt sin overflod, og som sådan, de mørkeste bandene fra Ponceau S-farget membranen er sannsynlig å gi de beste resultatene. Det er imidlertid mulig at flere lipoproteiner kan migrere i et enkelt band under siden separasjon, kompliserer de resulterende spectra. Derfor anbefales å først identifisere protein av peptid masse fingeravtrykk (PMF), som kan oppnås ved å samle MS spectra på totalt trypsin brøken eller enten acetonitrile vask brøk og legge inn de resulterende toppene i en programvare som maskot22. Når protein sekvensen er fastsatt, hjelpemidler beregne massen av tryptic N-terminal lipopeptide betydelig i å velge hvilke ion fragmentere av MS-/ MS.
Flere eksempler heterogenitet skyldes varierende acyl kjeden lengder på lipoproteiner innbyggere og deres N-terminal modifikasjoner, begge avhengig av kilden bakterier6. Mens variasjon i kjedelengde gjør karakteristiske peak sektorgrupper på overordnede spectra, preget av 14 Da trinn tilsvarer methylene grupper (- CH2-), kan dele samlet lipopeptide signalet og redusere følsomheten. Det er også sannsynlig at skjemaene forskjellige lipoprotein innflytelse berikelse og fragmentering, men vi har identifisert triacylated, diacylated og lyso-form lipoproteiner bruker beskrevet protokollen. Tilsvarende legge de varierende peptid moieties av lipoproteiner en annen grad av kompleksitet til analyser, uansett deres N-terminal struktur, som en veldig hydrofile aminosyre komposisjon kan hindre lipopeptide partisjonering i organisk kloroform fasen bruke andre utvinning metoder8. Overføring av lipoprotein til nitrocellulose ville hjelpe i å studere slike lipopeptides, som alle elueringsrør fraksjoner kan analyseres i denne metoden.
Tegning fra forrige litteratur som involverer triacylglycerides og fosfolipider23, forsettlig natrium adduct formasjon kan brukes til å fremme mer informative fragmentering via dannelsen av den (N-acyl)-dehydroalanyl peptid ion. Disse karakteristiske ioner er nøkkelen til å tilordne struktur, siden acylation N-terminus er isolert fra acyl erstatninger på glyceryl moiety. Natrium adduct formasjon gir en praktisk annen alternativ til svovel oksidasjon med hydrogen peroxide, som har vist seg å også fremme N-acyl-dehydroalanyl peptid fragmentering6,8. Selv om natrium addukter kan vise en total undertrykkelse av overordnede ion signalet, bestemte økningen i fragmentering mot dehydroalanyl ioner kompenserer for redusert overordnede ion intensitet. Det kan være verdt å utforske andre matriser og fragmentering av ekstra addukter for å lokke fram til mest informative spectra.
Denne protokollen forbedrer på den tradisjonelle TX-114 fasen partisjonering metode for lipoprotein berikelse, mens overføring av siden atskilt lipoproteiner til nitrocellulose membran forenkler trypsin fordøyelsen og elueringsrør av lipopeptides. MALDI-TOF MS analyse på totale tryptic eller vask fraksjoner gir protein identifikasjon i tandem med N-terminal strukturelle fastsettelse av MS-/ MS i ett enkelt eksperiment. Valgfri natrium adduct formasjon høydepunkter forskjeller i lipopeptide N-terminus ved å fremme mer informative ion fragmentering. Rutinemessig rense lipoproteiner og karakterisere deres N-termini vil aktivere omfattende studier på hvordan romanen lipoprotein skjemaer er laget, deres fysiologiske rolle innen bakteriell celle konvolutten og hvordan de er oppdaget av pattedyr immunforsvaret system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forskning i Meredith lab ble støttet av oppstart midler gitt av Eberly College of Science (Pennsylvania State University). Vi takker Dr. Tatiana Laremore for tekniske råd og tilgang til utstyr ved Penn State Proteomikk og masse massespektrometri Core anlegget, University Park, PA, hvor masse spectrometric analyser ble utført.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 0.01 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 110791012 | |
| Acetic acid | EMD | AX0073-9 | |
| Acetone | EMD | AX0116-6 | |
| Acetonitrile | EMD | AX0142-6 | |
| Ammonium bicarbonate | Fluka Analytical | 09830 | |
| BioTrace NT Nitrocellulose | PALL Life Sciences | 66485 | |
| Bovine serum albumin (BSA) digest standard | Protea | PS-204-1 | |
| Chloroform | Acros Organics | 423550025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP118 | |
| HPLC Grade water | EMD | WX0008-1 | |
| Lysozyme | Fisher Scientific | BP535-1 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) | Amresco | 0754 | |
| Pierce trypsin protease | Thermo Scientific | 90057 | |
| Ponceau S | Acros Organics | 161470100 | |
| Protein LoBind Tube 0.5mL | Eppendorf | 022431064 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Sodium chloride | Macron Fine Chemicals | 7581-06 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 299537 | |
| Tris-hydrochloride (HCl) | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | 93422 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | BD | 211822 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MagNALyser | Roche | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
| Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF | Bruker Daltonics | Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser |
References
- Babu, M. M., et al. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins. J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).
- Narita, S., Tokuda, H. Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control. Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infect Immun. 79 (2), 548-561 (2011).
- Nguyen, M. T., Götz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).
- Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways. FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).
- Kurokawa, K., et al. Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2. J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).
- Kurokawa, K., et al. The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2. J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).
- Asanuma, M., et al. Structural evidence of α-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus. FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).
- Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes. J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).
- Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii. J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans. Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1. Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -T., Neubert, T. A. Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -T., Neubert, T. A. Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).
- Kurokawa, K., et al. Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schӓgger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).
- Gravel, P. Protein Blotting by the Semidry Method. The Protein Protocols Handbook. , Spring Protocols. 321-334 (2002).
- Webster, J., Oxley, D. Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry. The Protein Protocols Handbook. , Springer Protocols. 1117-1129 (2009).
- Wilkins, M. R., et al. Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS - a World-Wide-Web-accessible tool. Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. , Springer Protocols. 571-607 (2005).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
- Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).
