Summary
O enriquecimento de lipoproteínas bacterianas usando uma fase de tensoativo não-iônico, método de particionamento é descrito para utilização directa em ensaios TLR ou outras aplicações. Novos passos são detalhados para preparar tryptic lipopeptides N-terminal para caracterização estrutural por espectrometria de massa.
Abstract
As lipoproteínas são importantes constituintes do envelope celular bacteriana e potentes ativadores da resposta imune inata dos mamíferos. Apesar de sua importância para a fisiologia celular e Imunologia, ainda muito para ser descoberto sobre formas de lipoproteína romance, como eles são sintetizados e o efeito das várias formas de imunidade do hospedeiro. Para habilitar estudos aprofundados sobre as lipoproteínas, este protocolo descreve um método para o enriquecimento de lipoproteína bacteriana e preparação do N-terminal tryptic lipopeptides de determinação estrutural por laser assistida por matriz desorção ionização-tempo de voo espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS). Expandindo-se em uma fase de Triton X-114 estabelecida particionamento método para extração de lipoproteína e enriquecimento da membrana da célula bacteriana, o protocolo inclui etapas adicionais para remover contaminantes não-lipoproteína, aumentando o rendimento de lipoproteína e pureza. Desde que lipoproteínas são comumente utilizadas em ensaios de receptores do tipo Toll (TLR), é fundamental para primeiro caracterizar a estrutura do N-terminal por aquiem MALDI-TOF MS., um método é apresentado para isolar peptídeos hidrofóbicos concentrados, enriquecidos no N-terminal lipopeptides adequados para análise direta por MALDI-TOF MS/MS. lipoproteínas que foram separados por sódio Dodecil sulfato de Poly-Acrylamide electroforese do Gel (SDS-PAGE) são transferidos para uma membrana de nitrocelulose, digerido em situ com tripsina, sequencialmente lavado para remover peptídeos tryptic polares e finalmente eluída com clorofórmio-metanol. Quando acoplado com MS dos peptides mais polares trypsinized de soluções de lavagem, este método fornece a capacidade para identificar a lipoproteína e caracterizar seu N-terminal em uma única experiência. Sódio intencional aduto formação também podem ser empregados como uma ferramenta para promover mais espectros de fragmentação estruturalmente informativo. Em última análise, enriquecimento de lipoproteínas e determinação das suas estruturas de N-terminal permitirá estudos mais aprofundados sobre esta classe onipresente de proteínas bacterianas.
Introduction
Lipoproteínas bacterianas são caracterizadas por uma cisteína conservada de lipídios-modificado N-terminal que ancora o domínio de proteínas globulares na superfície da membrana celular. Eles são universalmente distribuídos em bactérias, constituindo 2 a 5% de todos os genes celulares dentro de um genoma típico1. Lipoproteínas desempenham um papel crítico em uma ampla variedade de processos celulares, incluindo a absorção de nutrientes, transdução de sinal, montagem de complexos de proteínas, bem como na manutenção celular envelope integridade estrutural2. Em bactérias patogênicas, lipoproteínas servem como fatores de virulência3,4. Durante uma infecção, o reconhecimento do N-terminal lipopeptides pelos receptores do tipo Toll (TLR) 2 incita a uma resposta imune inata para remover patógenos invasores. Dependendo do estado de acilação do N-terminal, lipoproteínas são geralmente reconhecidas pelo alternativo TLR2 heterodimérica complexos. TLR2-TLR1 reconhece lipopeptides N-acylated, enquanto TLR2-TLR6 liga livre lipopeptide α-amino termini. Uma vez acoplado, as vias de sinalização convergem para induzir a secreção de proinflammatory cytokines3,4.
Anteriormente, pensava-se que as lipoproteínas de bactérias gram-positivas eram diacylated e os de bactérias Gram-negativas foram triacylated, diferenciando-se na ausência ou presença de um ácido graxo Amida-lig sobre os resíduos de cisteína conservados N-terminal. Esta hipótese foi apoiada pela falta de sequência orthologs em Gram-positivas genomas de Lnt, o transferase N-acil Gram-negativas que forma de lipoproteínas triacylated5. No entanto, estudos recentes têm revelado lipoproteína triacylation em Gram-positivas Firmicutes essa falta de lnt, bem como três estruturas romance de lipoproteína de N-terminal, denominadas o peptidyl, super e N -acetil formas6,7 ,8. Estas descobertas levantam questões sobre formas de lipoproteína possível para ser descoberto, ao lado de questões fundamentais sobre como estas lipoproteínas romance são feitas e que finalidade fisiológica ou vantagem das diversas formas transmitir. Além disso, eles demonstram claramente a incapacidade atual de genômica para prever a estrutura de lipoproteína. Com efeito, recentemente identificamos uma classe nova de transferases N-acil de lipoproteína, chamado Lit, de Enterococcus faecalis e Bacillus cereus que faz superformulário lipoproteínas9. Isto indica a necessidade de verificar experimentalmente a estrutura de lipoproteína, que pode ser um desafio devido à sua natureza extremamente hidrofóbica e limitados métodos disponíveis para caracterizar sua estrutura molecular.
Para facilitar estudos na indução de lipoproteína da resposta imune do hospedeiro, bem como a determinação estrutural N-terminal, adaptámos vários protocolos descritas anteriormente, a fim de purificar as lipoproteínas bacterianas e preparar o N-terminal tryptic lipopeptides para análise por MALDI-TOF MS6,10,11,12. As lipoproteínas são enriquecidas usando uma fase estabelecida de Triton X-114 (doravante referido como surfactante ou TX-114) método, com otimização para remover contaminantes não-lipoproteínas e aumentar o rendimento de lipoproteína de particionamento. Estas lipoproteínas são adequadas para uso direto em ensaios TLR ou mais purificação por SDS-PAGE. Para MALDI-TOF MS, transferência das lipoproteínas para membrana de nitrocelulose prevê um andaime eficiente em situ digestão do trypsin, lavagem e eluição subsequente da superfície da membrana, resultando no altamente purificado lipopeptides N-terminal. Nitrocelulose foi mostrado para facilitar o manuseio de amostras e melhorar a cobertura de sequência para peptídeos altamente hidrofóbicos das proteínas de membrana integrais13,14, bem como as lipoproteínas9,10 . O método tem a vantagem adicional de fracionamento peptídeos baseados na polaridade, para que soluções de lavagem intermediária podem ser analisadas para identificação de proteínas de alta confiança simultaneamente com determinação estrutural N-terminal em uma única experiência . Este protocolo exclusivamente intencional sódio características aduto formação para promover a fragmentação de íon de pai para dehydroalanyl íons durante MS/MS, auxiliando na atribuição estrutural do estado de - acilação N. N-terminal é ambos a característica mais variável e chave relacionada ao reconhecimento TLR de lipoproteínas. Tomados em conjunto, este protocolo tem permitido estudos intensivos e reprodutíveis sobre as lipoproteínas, com diferentes etapas de purificação e determinação estrutural por MALDI-TOF MS facilmente adaptado dependendo o objetivo geral do experimento.
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Protocol
1. crescimento e Lysis da pilha
- Cresce bactérias em 15 mL de caldo de tryptic soy (TSB) ou mídia similar ao final da fase exponencial (OD600 de 1.0-1.5). Colheita de células por centrifugação, lave uma vez com solução tampão salino/EDTA (TBSE) e continuar com protocolo ou congelar até o uso.
Nota: TBSE: 20 mM Tris-cloridrato (HCl), pH 8.0, 130 mM de cloreto de sódio (NaCl) e 5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)). Modificação e expressão de lipoproteína podem ser influenciadas por condições de crescimento (por exemplo, acidez, salinidade, meios de crescimento) e fase de crescimento15. Crescimento da pilha pode ser escalado como desejado, mas 15 mL de células é recomendado para uma única preparação de lipoproteínas como biomassa em excesso pode diminuir o rendimento de lipoproteína. Uma preparação de 15 mL geralmente produz suficiente amostra para carregamento ideal de ~ 2-4 pistas em um padrão mini gel de SDS-PAGE. - Ressuspender as células em 800 μL TBSE com fluoreto de sulfonila fenilmetil 1mm (PMSF) e lisozima 0,5 mg/mL. Transferir a solução para um tubo de rosca microcentrifuga 2,0 mL com tampa de rosca e o-Ring e incube por 20 min a 37 ° C.
Nota: Certas espécies não são suscetíveis à Lise por lisozima. Uma enzima lítica apropriada deve ser substituída para auxiliar na Lise. - Adicionar contas de zircônia/sílica ~ 800 μL 0,1 mm para o tubo e rompa as celulas agitando a velocidade máxima (7.000 rpm) em um homogeneizador de 5 ciclos de 30 s cada, com 2 min descansar no gelo entre cada ciclo.
- Amostra de centrífuga a 3000 x g por 5 min a 4 ° C (a pelota grânulos e ininterrupta de células). Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 2,0 mL microcentrifuga e manter no gelo.
- Adicionar 200 μL TBSE a remanescente e retornar para o homogeneizador para um ciclo adicional. Centrifugar (como acima) e combinar o sobrenadante com o sobrenadante anterior (deve ser o volume total de 800-1000 μL).
2. enriquecimento de lipoproteínas Particionando fase TX-114
- Complementar o sobrenadante com surfactante TX-114 para uma concentração final de 2% (vol/vol) adicionando um volume igual de 4% (vol/vol) o surfactante em TBSE gelada e incubar no gelo por 1h, misturar por inversão cada ~ 15 min.
Nota: Quando refrigerados, o sobrenadante e surfactante será miscíveis. - Transferir o tubo para banho maria a 37 ° C e incubar durante 10 min induzir a separação de fases. Centrifugar a amostra a 10.000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente para manter a separação entre bi-fásicos.
- Delicadamente, pipetar fora a fase aquosa superior e descarte. Adicionar TBSE gelada para a fase inferior do surfactante para encher o tubo ao seu volume original e inverter para misturar. Incube no gelo por 10 min.
- Transferir o tubo para banho maria a 37 ° C e incubar durante 10 min induzir a separação de fases e, em seguida, centrifugar a 10.000 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Repita etapas 2.3-2.4 mais uma vez, para um total de 3 separações. Retire a fase aquosa superior e descarte.
- Retire o chumbo das proteínas precipitados que se formou durante o curso de extracções (visíveis na parte inferior do tubo), adicionando-se 1 volume de TBSE gelada para a fase de surfactante. Centrifugar a 4 ° C a 16.000 x g por 2 min para proteína insolúvel de Pelotas.
Nota: A amostra deve manter uma única fase. Se ocorrer separação de fases, re-calma amostra e centrifugar novamente. A pelota é geralmente composta de contaminantes não-lipoproteína, mas pode ser retida para posterior análise. - Imediatamente transferi o sobrenadante para um tubo de fresco microcentrifuga de 2,0 mL contendo 1250 μL de acetona 100%. Pipete acima e para baixo completamente para lavar a amostra da ponta, que vai ser viscoso. Misturar por inversão e incubar durante uma noite a-20 ° C para precipitar proteínas.
- Centrifugar a amostra a 16.000 x g por 20 min em temperatura ambiente para lipoproteínas com atenção para a orientação do tubo de Pelotas. Lipoproteínas irão formar uma película fina, branca ao longo da parede exterior do tubo.
- Pellet de lavar duas vezes com 100% de acetona. Decantar a acetona e deixar secar a amostra ao ar.
- Adicionar 20 a 40 μL de 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ou um padrão de tampão de amostra Laemmli SDS-PAGE16 e completamente Resuspenda pipetando para cima e para baixo contra a parede com as precipitado lipoproteínas. Raspe a lateral do tubo com a ponta da pipeta para desalojar as lipoproteínas.
Nota: As lipoproteínas não se dissolverá em tampão Tris, mas prefiro formam uma suspensão.- Armazenar as lipoproteínas a-20 º C até o uso.
3. SDS-PAGE, eletroblotting e coloração com Ponceau S
- Lipoproteínas separadas por SDS-PAGE usando métodos padrão16.
Nota: A percentagem de acrilamida gel apropriado pode variar dependendo de seu uso pretendido e tamanho de lipoproteínas. Aqui, lipoproteínas E. faecalis foram separadas mais um 10% gel de Tris-glicina, enquanto um gel Tris-tricine de 16,5% foi usado para a lipoproteína de e. coli menor Lpp17. - Transferi as lipoproteínas para uma membrana de nitrocelulose transferência usando um procedimento padrão eletroblotting.
Nota: Uma transferência semi seca usando Bjerrum Schafer-Nielsen buffer mais 0,1% SDS foi realizada a 25 V, 1.3 mA para min 1518. Alternadamente, polivinilideno (PVDF) de difluoreto membrana pode ser usada, no entanto, como é mais hidrofóbica de nitrocelulose, pode reduzir eficiente eluição de lipopeptides hidrofóbico da membrana em etapas posteriores. - Transferi a membrana de nitrocelulose para um recipiente e cubra com a solução de Ponceau S (0,2% (p/v) Ponceau S em ácido acético a 5%). Rocha suavemente durante 5 minutos, ou até vermelho-rosa bandas são visíveis.
- Decantar a solução de Ponceau S e Enxagúe cuidadosamente a membrana de nitrocelulose com dH2O para remover o excesso de manchar.
Nota: Bandas Ponceau manchada serão destain rapidamente. Se desaparecerem, bandas, repita o processo de coloração. - Com uma lâmina de barbear limpa, excisar a banda desejada e a transferência para um tubo de microcentrifugadora. Lavar três vezes com 1 mL de dH2O para destain completamente a banda.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Loja a seção extirpada coberto com água a-20 ° C até o uso. - A seção de transferência para uma superfície limpa e com uma lâmina de barbear limpa, a tira de nitrocelulose com dados em pequenos pedaços de aproximadamente 1 mm x 1 mm. coletar os pedaços em um tubo de microcentrifuga de ligação baixa proteína de 0,5 mL.
- Lave as peças duas vezes com 0,5 mL de 50mm recém-preparado bicarbonato de amónio (NH4HCO3), 7,8 de pH em água de grau de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).
4. tryptic digestão, Lipopeptide extração de membrana de nitrocelulose, deposição em destino MALDI e aquisição de dados
- Resuspenda pedaços de nitrocelulose em 20 μL de solução de tripsina em 50mm NH4HCO3, pH 7,8 em água de grau HPLC 20 μg/mL. Vórtice de misturar, em seguida girar brevemente para assegurar que todas as peças são totalmente cobertas pela solução tripsina. Cobrir a tampa do tubo usando a película de parafina para evitar a evaporação e incubar a digerir durante a noite a 37 ° C.
- Girar a amostra a 16.000 x g, durante 30 s e remover o líquido por pipetagem.
Nota: Isto remove trypsinized hidrofílicos peptídeos que podem ser examinados mais tarde por MALDI-TOF MS para identificação de proteínas. - Adicione 50 μL de 0,5% o ácido trifluoroacético (TFA) em água de grau HPLC. Vórtice para misturar e, em seguida, girar a amostra brevemente para assegurar que todas as peças são cobertas pela solução. Incube durante 10 minutos à temperatura ambiente. Remova o líquido por pipetagem.
Atenção: TFA é prejudicial se inalado. Manipular com cuidado e use na coifa química. Evite o contacto com a pele. - Repita a etapa 4.3 com 50 μL de acetonitrilo de 10% em água de grau HPLC.
Atenção: Acetonitrilo é prejudicial se inalado. Manipular com cuidado e use na coifa química. Evite o contacto com a pele. - Repita a etapa 4.3 com 50 μL de acetonitrilo de 20% em água de grau HPLC.
Observação: Isso remove qualquer peptídeos hidrofóbicos moderadamente frouxamente ligados a nitrocelulose. - Eluir o lipopeptides firmemente ligados, adicionar 15 μL de 10 mg/mL acabadas α-cyano-4-hidroxicinâmicos ácido (CHCA) matriz dissolvido no clorofórmio-metanol (2:1, v/v) e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente com utilização do Vortex intermitente.
- Alternadamente, adicione 15 μL de clorofórmio-metanol para eluir lipopeptides e misture com a matriz em um momento posterior. Outras matrizes, tais como o ácido benzoico-2,5 (DHB), devem ser testados como alternativas a CHCA se obtêm-se resultados satisfatórios para uma composição específica lipopeptide.
Atenção: Tanto clorofórmio e metanol são prejudiciais se inalado. Manipular com cuidado e use na coifa química. Evite o contacto com a pele. - Opcional: Para promover o sódio aduto de formação, complementar a solução de CHCA em clorofórmio-metanol com aquosa de bicarbonato de sódio (NaHCO3) a uma concentração final de 1 mM.
- Alternadamente, adicione 15 μL de clorofórmio-metanol para eluir lipopeptides e misture com a matriz em um momento posterior. Outras matrizes, tais como o ácido benzoico-2,5 (DHB), devem ser testados como alternativas a CHCA se obtêm-se resultados satisfatórios para uma composição específica lipopeptide.
- Gire a amostra brevemente. Com uma pipeta, transferi cuidadosamente o líquido para um novo tubo de microcentrifuga de ligação de baixa proteína. Esta solução irá conter a maior parte do N-terminal lipopeptides.
Nota: A nitrocelulose pode parcialmente ou totalmente dissolver na solução de clorofórmio-metanol. Isto não afetará negativamente os resultados do MS e pode ser usado como um método alternativo para aumentar o retorno de lipopeptide. Membrana PVDF não se dissolverá na mesma maneira. - Deposite 1 μL do lipopeptides eluted com CHCA em um alvo MALDI aço polido.
Nota: O clorofórmio-metanol evaporará rapidamente, deixando para trás cristalizado CHCA e lipopeptides. Um opcional segundo 1 μL alíquota pode ser depositado no mesmo local para aumentar a concentração da amostra. Clorofórmio-metanol pode propagar-se significativamente após a deposição sobre o alvo, e como tal, deve ter cuidado para evitar a mistura de amostra no alvo. É recomendável para depositar e atirar em vários pontos de cada amostra. - Seguir para a espectrometria de massa. Varredura de todas as áreas da mancha para lipopeptide sinal, especialmente se o local contém duas camadas de amostra, como a segunda camada pode empurrar o lipopeptides a orla exterior do local.
Nota: A intensidade de laser partida recomendada é 25%, embora pode ser necessário aumentar a intensidade para adquirir o sinal e soma vários espectros (varreduras de 20 ou mais) para alcançar a relação sinal-ruído adequada. Aqui, os espectros foram adquiridos em um instrumento de MALDI-TOF-TOF (consulte a Tabela de materiais) usando um método de instrumento configurado de fábrica para a deteção de iões positivos do refletor na gama de m/z 700-3500. O instrumento foi calibrado com uma mistura de peptídeo tryptic albumina de soro bovino (BSA).
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Representative Results
Um esquema do protocolo é fornecido na Figura 1. A fração de lipoproteína enriquecido extraída de Enterococcus faecalis ATCC 19433 por TX-114 é mostrada na Figura 2. Para comparação, o padrão de bandas da fração proteína precipitado também é mostrado. Proteínas dessa fração foram confirmadas por MALDI-MS para ser altamente abundante contaminando as proteínas além de lipoproteínas (tabela 1). Os espectros de massa na Figura 3 demonstram o perfil de íon tryptic do peptide de lipoproteína a E. faecalis PnrA que ocorre com lavagens subsequentes de nitrocelulose-limite PnrA com solventes de crescente polaridade (atribuições de pico listadas em Tabela 2). A Figura 4 mostra o N-terminal caracterização estrutural de PnrA conforme determinado por MALDI-TOF MS/MS, revelando diagnóstico N- acylated dehydroalanyl picos consistente com a forma de superlipoproteína. A Figura 5 ilustra o efeito de sódio aduto formação na fragmentação, com o íon do pai sodiated fragmentando-se preferencialmente em favor do N- acylated dehydroalanyl íon.
Figura 1: esquemático do protocolo. As lipoproteínas são enriquecidas por TX-114 fase particionamento e podem ser usadas diretamente, mais comumente em ensaios TLR ou ainda mais purificadas por SDS-PAGE para determinação estrutural. As lipoproteínas são transferidas para nitrocelulose, digerido com tripsina, lavada gradual e o resultante lipopeptides eluída com clorofórmio-metanol para análise estrutural por MALDI-MS. As soluções de lavagem de tripsina e nitrocelulose podem ser salvos para identificação de proteínas e análise de MS. w: com; TFA: o ácido trifluoroacético; ACN: acetonitrilo; CHCA: α-cyano-4-hidroxicinâmicos ácido; OPT: opcional; MALDI: ionização de dessorção laser assistida por matriz; MS: espectrometria de massa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Perfil de TX-114 enriquecida de proteínas de E. faecalis. Um gel de SDS-PAGE de Tris-glicina 10% corado com Coomassie azul (A) e a membrana de nitrocelulose correspondentes manchados de Ponceau S (B) revelam uma borda diferente padrão entre a fração de proteína precipitado ("PPT") e o purificado lipoproteínas ("LP"). As bandas manchadas de Coomassie indicadas foram extirpadas e identificadas como não-lipoproteínas por MALDI-MS de tryptic peptídeos (ver tabela 1). PnrA foi identificado e analisado pelo protocolo descrito neste documento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: alterações de perfil e abundância de íon com polaridade de nitrocelulose lavagem soluções. (A) a fração de tripsina mostra vários fragmentos de peptídeo interno correspondente a lipoproteína de E. faecalis que pnra indicado na Figura 2. A 10% (B) e 20% (C) acetonitrila lavar frações Mostrar alterações na intensidade de sinal e uma diminuição do número total dos picos individuais. (D) a fração de eluição final é altamente enriquecida com o N-terminal lipopeptide em m /z 997, indicado por um asterisco (*). Intensidade de cada espectro é normalizada para o (A) para comparação da intensidade do sinal. Massas de picos e sequências atribuídas estão listadas na tabela 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Banda | ID de proteína | N º de adesão | Peso Molecular de est. | Contagem de peptídeo | |
| 1 | factor de alongamento Tu | GB | EOL37301.1 | | 43.387 | 15 | |
| 2 | Peroxidase de NADH | GB | EOL34572.1 | | 49.520 | 9 | |
| 3 | piruvato desidrogenase E1component, subunidade alfa | GB | EOL34709.1 | | 41.358 | 12 | |
| 4 | componente de piruvato desidrogenase E1, beta de subunidade | GB | EOL34710.1 | | 35.373 | 19 | |
| 5 | 30s ribosomal proteína S2 | GB | EOL33066.1 | | 29.444 | 16 | |
| 6 | 30s ribosomal proteína S3 | GB | EOL37312.1 | | 24.355 | 14 | |
Tabela 1: precipitado de proteínas é contaminantes não-lipoproteína. As proteínas foram identificadas pelo tryptic digest e MALDI-MS usando padrão em gel digestão protocolos19 e estão listados de cima para baixo, na mesma ordem em que aparecem no gel Coomassie na Figura 2. Cada proteína foi identificada com um intervalo de confiança (IC) maior que 95%.
| Número de pico | Massa teórica | Posição de proteína | Não. dos locais do corte não atendidas | Sequência do peptide | |
| 1 | 631.3409 | 170-176 | 0 | GVADAAK | |
| 2 | 675.4035 | 316-321 | 1 | TKEAVK | |
| 3 | 826.4093 | 163-169 | 0 | FQAGFEK | |
| 4 | 893.4839 | 121-128 | 0 | NVVSATFR | |
| 5 | 943.5359 | 240-247 | 0 | VWVIGVDR | |
| 6 | 1040.5047 | 188-197 | 0 | YAASFADPAK | |
| 7 | 1200.6331 | 273-284 | 0 | GVGTAVQDIANR | |
| 8 | 1316.6997 | 290-301 | 0 | FPGGEHLVYGLK | |
| 9 | 1385.7827 | 83-94 | 0 | FNTIFGIGYLLK | |
| 10 | 1432.743 | 149-162 | 0 | VGFVGGEEGVVIDR | |
| 11 | 1568.7802 | 259-272 | 1 | DGKEDNFTLTSTLK | |
| 12 | 1672.8289 | 240-254 | 1 | VWVIGVDRDQDADGK | |
| 13 | 1707.8184 | 129-145 | 0 | DNEAAYLAGVAAANETK | |
| 14 | 1724.8027 | 35-49 | 0 | SFNQSSWEGLQAWGK | |
| 15 | 1797.9228 | 257-272 | 2 | TKDGKEDNFTLTSTLK | |
| 16 | 1872.9854 | 285-301 | 1 | ALEDKFPGGEHLVYGLK | |
| 17 | 1945.9613 | 230-247 | 1 | DLNESGSGDKVWVIGVDR | |
| 18 | 2240.1345 | 149-169 | 1 | VGFVGGEEGVVIDRFQAGFEK | |
| 19 | 2675.2543 | 230-254 | 2 | DLNESGSGDKVWVIGVDRDQDADGK | |
Tabela 2: observadas as massas e os peptídeos tryptic correspondentes. In silico digestão do trypsin de E. faecalis PnrA (GenBank: EOL37280.1) foi realizada utilizando PeptideMass20,21, permitir até dois falta corta sites. Estão listadas as massas teóricas dos picos observados sobre os espectros na Figura 3 , juntamente com as sequências de peptídeo correspondente.
Figura 4: MALDI-TOF MS de lipoproteína a E. faecalis PnrA. (A) pai MS espectro da m /região z 997 correspondente a lipopeptide N-terminal de E. faecalis PnrA. (B) MS/MS do pico do lipopeptide revela que é a forma de super, com o diagnóstico N- acylated dehydroalanyl peptídeo fragmento íon pico indicada por um asterisco (*). A estrutura elucidada é mostrada (C). Esta figura foi modificada de uma anterior publicação9. R.I.: intensidade relativa por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: sódio aduto formação promove a fragmentação do íon pai para íons de lipopeptide dehydroalanyl. Espectros de MALDI-TOF (A) do peptide Escherichia coli lipoproteína Lpp N-terminal sem (traços turquesas) e com (traços azuis) a adição de bicarbonato de sódio. Adição de bicarbonato de sódio para a fração de eluted final resulta em um aumento Da 22 da massa calculada de lipopeptide o pai. Quando comparado com o espectro de MS/MS do íon protonados (B), o espectro de MS/MS do íon sodiated correspondente (C) mostra significativa fragmentação preferencial em direção a N-acil-dehydroalanyl íon através do neutro eliminação da fracção diacylthioglyceryl, indicada por um asterisco (*). A estrutura do peptide tryptic pai triacylated Lpp N-terminal (D) e a N-acil-íon de fragmento de peptídeo de dehydroalanyl (E) são retratados. Esta figura foi modificada de uma anterior publicação9. R.I.: intensidade relativa por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo neste documento descreve dois estágios distintos de caracterização de lipoproteína: determinação estrutural e particionamento por MALDI-TOF MS de fase de enriquecimento por TX-114. Durante a extração de TX-114, centrifugação adicional remove proteínas contaminantes que precipitar durante este processo, seguido por precipitação de acetona para produzir altamente enriquecido de lipoproteínas. Limitando-se a escala de cada preparação para 15 mL no valor de células, várias amostras podem ser facilmente transformadas em paralelo e se desejado, agrupadas no final do protocolo.
Para análise estrutural por MS, transferência das lipoproteínas de nitrocelulose facilita a digestão do trypsin, lavagem e eluição subsequente da membrana. Em nossas mãos, esta abordagem tem provado para ser preferível mediada por detergente extração de plugues do gel de polyacrylamide tradicionais, como as lipoproteínas são associadas com a superfície da membrana de nitrocelulose e não incorporadas em poliacrilamida. Associação de lipoproteína com a superfície de nitrocelulose também em grande parte previne o problema comum de adsorção não específica para superfícies de contêiner por peptídeos hidrofóbicos. Eluição gradual das peças nitrocelulose remove mais hidrofílicos, internos tryptic peptídeos que podem ser analisados por MALDI-TOF MS para alcançar as atribuições de identificação de proteínas alta confiança, enquanto a etapa de eluição final reproducibly produz lipopeptides concentrada em um pequeno volume que é em grande parte livre de sais interferentes e íon suprimindo contaminantes.
Análise de MS bem sucedida de uma lipoproteína está sujeita a sua abundância, e como tal, as bandas mais sombrias da membrana manchadas de Ponceau S são susceptíveis de dar os melhores resultados. No entanto, é possível que várias lipoproteínas podem migrar em uma única banda durante a separação de página, complicando o espectro resultante. Portanto, é altamente recomendável primeiro identificar a proteína em massa do peptide fingerprinting (PMF), que pode ser realizado através da coleta de espectros de MS na fração de tripsina total ou fração de lavagem ou acetonitrilo e introduzindo os picos resultantes em um software como mascote22. Uma vez que a sequência de proteínas foi determinada, calculando a massa da lipopeptide N-terminal tryptic significativamente auxilia na escolha de qual íon fragmento por MS/MS.
Heterogeneidade da amostra adicional pode resultar de diferentes comprimentos de cadeia acil sobre as lipoproteínas dentro de uma população e suas modificações do N-terminal, ambos, dependendo da fonte de bactérias6. Enquanto a variação no comprimento chain faz para clusters de pico característico em espectros de pai, caracterizados por 14 Da incrementos correspondente aos grupos metileno (- CH2-), ele pode dividir o sinal de lipopeptide geral e diminuir a sensibilidade. Também é provável que as formas diferentes de lipoproteína influenciam enriquecimento e fragmentação, embora nós identificamos com sucesso triacylated, diacylated e lipoproteínas de superformulário usando o protocolo descrito. Da mesma forma, as diferentes partes de peptídeo de lipoproteínas adicionam um outro nível de complexidade para análises, independentemente de sua estrutura do N-terminal, como uma composição de aminoácidos muito hidrofílicas pode prevenir lipopeptide particionamento para a fase de clorofórmio orgânico usando outros métodos de extração8. Transferência da lipoproteína a nitrocelulose auxiliariam em estudar tais lipopeptides, como todas as frações de eluição podem ser analisadas neste método.
Desenho da literatura anterior, envolvendo triacylglycerides e fosfolipídios23, sódio intencional aduto formação pode ser usado para promover mais informativa fragmentação através da formação da (N-acil)-dehydroalanyl íon de peptídeo. Estes íons característicos são a chave para atribuir a estrutura, desde que o estado de acilação do N-terminal é isolado das substituições de acila sobre a fracção de gliceril. Sódio aduto formação fornece uma opção alternativa conveniente para enxofre oxidação com peróxido de hidrogênio, que tem sido mostrado para promover também N-acil-dehydroalanyl peptídeo fragmentação6,8. Apesar de sódio adutos pode mostrar uma supressão total do sinal de íon do pai, o aumento específico da fragmentação no sentido dehydroalanyl íons compensa a intensidade do íon de pai diminuída. Pode valer a pena explorar outras matrizes e fragmentação de adicionais adutos para eliciar os espectros mais informativos.
Este protocolo melhora na fase de TX-114 tradicional particionamento método para o enriquecimento de lipoproteína, enquanto transferência de lipoproteínas página separada para membrana de nitrocelulose facilita a digestão de tripsina e eluição de lipopeptides. MALDI-TOF MS análise sobre as frações tryptic ou lavagem totais permite a identificação de proteínas em tandem com determinação estrutural N-terminal por MS/MS em uma única experiência. Sódio opcional aduto diferenças de destaques de formação na lipopeptide N-terminal, promovendo mais informativa fragmentação do íon. A capacidade de rotineiramente lipoproteínas de purificar e caracterizar seus N-termini permitirá Estudos extensivos na novela como lipoproteína formas são feitas, seu papel fisiológico dentro do envelope de célula bacteriana, e como eles são detectados pelo imunológico de mamíferos sistema.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Pesquisa no laboratório de Meredith foi apoiada por fundos de inicialização fornecidos pela faculdade Eberly da ciência (Pennsylvania State University). Agradecemos o Dr. Tatiana Laremore para aconselhamento técnico e acesso aos equipamentos da proteômica do estado de Penn e massa espectrometria Core Facility, University Park, PA, onde realizaram-se análises de espectrometria de massa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 0.01 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 110791012 | |
| Acetic acid | EMD | AX0073-9 | |
| Acetone | EMD | AX0116-6 | |
| Acetonitrile | EMD | AX0142-6 | |
| Ammonium bicarbonate | Fluka Analytical | 09830 | |
| BioTrace NT Nitrocellulose | PALL Life Sciences | 66485 | |
| Bovine serum albumin (BSA) digest standard | Protea | PS-204-1 | |
| Chloroform | Acros Organics | 423550025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP118 | |
| HPLC Grade water | EMD | WX0008-1 | |
| Lysozyme | Fisher Scientific | BP535-1 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) | Amresco | 0754 | |
| Pierce trypsin protease | Thermo Scientific | 90057 | |
| Ponceau S | Acros Organics | 161470100 | |
| Protein LoBind Tube 0.5mL | Eppendorf | 022431064 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Sodium chloride | Macron Fine Chemicals | 7581-06 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 299537 | |
| Tris-hydrochloride (HCl) | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | 93422 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | BD | 211822 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MagNALyser | Roche | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
| Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF | Bruker Daltonics | Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser |
References
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