Summary
Qui, presentiamo un protocollo che può essere utilizzato per microscopicamente visualizzare e quantificare le attività della deidrogenasi in cellule e tessuti e sua cinetica, funzione e localizzazione subcellulare.
Abstract
Alterato metabolismo cellulare è una caratteristica di molte malattie, compreso il cancro, malattie cardiovascolari e l'infezione. Le unità di motore metaboliche delle cellule sono enzimi e la loro attività è fortemente regolamentato a molti livelli, compreso il trascrizionale, livello funzionale, post-traduzionale e post-traduzionali, stabilità del mRNA. Presente regolamento complesso significa che analisi quantitative o imaging convenzionale, quali quantitativi esperimenti mRNA, i Western Blots e immunohistochemistry, producono informazioni incomplete per quanto riguarda l'attività finale degli enzimi, la loro funzione e/o loro localizzazione subcellulare. Quantitativa degli enzimi citochimica e istochimica (cioè, mappatura metabolica) Visualizza informazioni approfondite in situ l'attività enzimatica e sua cinetica, funzione e localizzazione subcellulare in una situazione di quasi allineare--natura.
Descriviamo un protocollo per rilevare l'attività della deidrogenasi, che sono enzimi che svolgono le reazioni redox per ridurre cofattori quali NAD (p)+ e FAD. Cellule e sezioni di tessuto sono incubate in un medium che è specifico per l'attività enzimatica di una deidrogenasi. Successivamente, la deidrogenasi che sono oggetto di indagine svolge la sua attività enzimatica nel suo sito subcellulare. In una reazione chimica con il mezzo di reazione, questo genera infine colore blu formazan al luogo dell'attività della deidrogenasi. Assorbanza di formazan è quindi una misura diretta di attività della deidrogenasi e può essere quantificata utilizzando analisi di microscopia e immagine luce monocromatica. L'aspetto quantitativo di questo protocollo consente ai ricercatori di trarre conclusioni statistiche da queste analisi.
Oltre a studi osservazionali, questa tecnica può essere utilizzata per gli studi di inibizione degli enzimi specifici. In questo contesto, gli studi beneficiare dei vantaggi di allineare--natura di mappatura metabolica, dando risultati in situ che potrebbe essere fisiologicamente più rilevante di studi di inibizione in vitro degli enzimi. In tutto, metabolica mapping è una tecnica indispensabile per studiare il metabolismo a livello cellulare o tessutale. La tecnica è facile da adottare, fornisce approfondite, globale e integrate di informazioni metaboliche e consente l'analisi quantitativa rapida.
Introduction
Un fondamento essenziale della fisiologia cellulare è metabolismo. Metabolismo fornisce le cellule con l'energia necessaria per tutti i processi fisiologici, trasporta i blocchi di costruzione per la biosintesi macromolecolari e regola l'omeostasi cellulare per quanto riguarda i prodotti di scarto, molecole tossiche e lo smontaggio e riciclaggio delle componenti cellulari inutili o disfunzionali. Gli enzimi catalizzano le reazioni chimiche cellulari vitali quasi tutti e pertanto sono le unità di motore nella fisiologia delle cellule. 1 , 2
L'attività degli enzimi è strettamente regolata a molti livelli e quindi quantitativi enzima istochimica e citochimica (anche chiamata mappatura metabolica) è il metodo preferito per lo studio di attività enzimatica in situ. A livello trascrizionale, espressione genica in mRNA è regolata. L'effetto della regolazione della trascrizione può essere determinato mediante analisi quantitative di mRNA, quali microarrays o sequenziamento diretto di RNA qualitativa analisi del mRNA, come l'ibridazione in situ che dà informazioni su cellulare (sub) localizzazione delle molecole di mRNA. Questo rende possibile apprezzare differenze relative di attività trascrizionale tra le celle. Tuttavia, l'interpretazione e la validità di questi saggi di mRNA rispetto alla attività metabolica è complicato perché il regolamento si verifica anche a livello di mRNA, dove la sequenza e la stabilità delle molecole di mRNA vengono modificati dopo esso è trascritto da DNA. Questa modifica regola traduzione isoforma della proteina e la quantità di traduzione di proteina presso i ribosomi. Inoltre, il processo di traduzione della proteina è controllato ed infine interessa attività e pertanto l'espressione degli enzimi. Gli effetti combinati dei suddetti passaggi normativi possono essere apprezzati usando analisi di espressione quantitativa della proteina, come il Western Blotting microarrays della proteina di fase inversa lisato o analisi di espressione di proteina qualitativa, come immunocitochimica e immunoistochimica, ma queste tecniche non incorporare effetti regolatori a valle come modificazione post-traduzionale delle proteine e la regolazione funzionale degli enzimi nel loro microambiente affollata. Inoltre, l'espressione di un enzima mal può correlare con la sua attività, affinché le misure di attività di un enzima purificato in omogeneati delle cellule o del tessuto o in soluzioni diluite sono ampiamente usate per studi di attività enzimatica. Tuttavia, questi esperimenti non replicare l'influenza di un affollato citoplasma suddiviso in compartimenti o organello sull'attività di un enzima. Inoltre, tutte le tecniche di cui sopra determinano la quantità o la localizzazione di espressione di mRNA o degli enzimi, ma sono in grado di fornire informazioni complete su entrambi questi aspetti dell'espressione degli enzimi, figuriamoci l'integrazione di questo informazioni con le determinazioni di attività enzimatica. 2 , 3 , 4
Mappatura metabolica permette l'apprezzamento di tutte le suddette variabili che determinano l'attività di un enzima. Per di più, mappatura metabolica è una forma di cellula vivente o imaging dei tessuti con le cellule e i tessuti che rimangano intatti durante l'analisi per generare una situazione di quasi allineare--natura per generare dati di attività degli enzimi. Produce immagini che facilitano sia l'apprezzamento dettagliata della posizione dell'attività enzimatica come pure robusto quantificazione dell'attività enzimatica all'interno di un compartimento delle cellule o del tessuto. 3 , 4 i protocolli descritti qui per mappatura metabolica dell'attività della deidrogenasi sono basati sul manuale di laboratorio di tutti i metodi istochimici enzima disponibile,5 sui principi di istochimica di enzima quantitativa,6 e su analisi dell'immagine di mappatura metabolica quantitativa. 4
Deidrogenasi sono enzimi che svolgono le reazioni redox per ridurre canonici cofattori quali NAD+, NADP+ e FAD di NADH, NADPH e FADH2, rispettivamente. Cellule intatte o sezioni di tessuto criostato che chimicamente non sono fissi sono incubate in un medium di reazione che contiene, tra gli altri reagenti, il substrato e cofattori di una deidrogenasi specifica e un sale di tetrazolio. Successivamente, tale deidrogenasi svolge la propria attività catalitica e riduce, ad esempio, NADP+ a NADPH. Tramite un vettore di elettroni, 2 molecole di NADPH in ultima analisi, riducono 1 molecola di sale di tetrazolio semi-incolore solubile in acqua in molecola 1 formazan blu insolubile in acqua che precipita immediatamente presso il sito della deidrogenasi. Di conseguenza, l'assorbanza di formazano precipitato è una misura diretta dell'attività locale di una deidrogenasi e può essere osservato mediante microscopia chiara o quantificati tramite analisi di microscopia e immagine luce monocromatica. L'aspetto quantitativo di questo protocollo consente ai ricercatori di trarre conclusioni statistiche da queste analisi. Inoltre, questa quantificazione facilita la determinazione di in situ parametri cinetici degli enzimi, come l'attività enzimatica massima (Vmax) e l'affinità di un substrato per un enzima (Km). 3 , 4 , 5 , 6
Quando si pianifica un esperimento di mappatura metabolica, è importante rendersi conto che ogni esperimento, un massimo di cinquanta vetrini con preparati di cellule aderenti o sezioni di tessuto sono raccomandati per ridurre al minimo ritardi durante l'incubazione per ottenere coerente risultati. È possibile elaborare più diapositive e/o composizioni medie quando questi passaggi di protocollo sono svolti in cooperazione da più di uno sperimentatore. Inoltre, alcuni variabilità esiste tra esperimenti. Di conseguenza, esperimenti identici dovrebbero essere ripetuti almeno 3 volte con cytospins da ogni preparazione di cellule o sezioni da ogni campione di tessuto e controlli appropriati dovrebbero essere incluso in ogni esperimento. Sempre preparare un medium di incubazione di controllo in assenza del substrato, ma in presenza di cofattori a controllo non specifico enzima attività di colorazione. I risultati più rappresentativi sono ottenuti in esperimenti dove le concentrazioni differenti di substrato/cofattore vengono applicate a sezioni di tessuto o cellula preparati dallo stesso campione, così che lo sperimentatore può eseguire analisi dell'utilizzo di cinetica enzimatica curve dose-attività.
Protocol
Questo protocollo segue le linee guida sull'uso di materiale umano del Comitato di revisione di Medical-etico di Academic Medical Center.
1. preparazione di cellule o sezioni di tessuto
- Cellule
- Tripsinizzano cellule da piastre di coltura con 1 mL di tripsina-EDTA 0.25% per 5 min a 37 ° C in una capsula di Petri da 10 mm e portare le cellule in una sospensione di 37 ° C di 50.000-200.000 cellule/mL, a seconda delle dimensioni delle cellule.
- Allegare 200 µ l di sospensione cellulare sui vetrini microscopia utilizzando cytospin imbuti in una citocentrifuga a 20 x g per 5 min a temperatura ambiente.
- Asciugare all'aria i cytospins per 24 h a temperatura ambiente. Non influisce sulla attività della deidrogenasi. 5
- Sezioni di tessuto
- Estratto di tessuto da pazienti o animali secondo etici permessi. 10 mm3 del tessuto è sufficiente per esperimenti multipli.
- Mettere i pezzi di tessuto in fiale di plastica piccolo ventilato 2 mL e snap-congelare le fiale contenenti il pezzo di tessuto in azoto liquido.
- Conservare i flaconcini contenenti pezzi di tessuto a − 80 ° C fino a ulteriore elaborazione.
- Usare un mezzo di simil-gel denominato temperatura di taglio ottimale (OCT) per montare il campione di tessuto su un mandrino che congela rapidamente, fino a-20 ° C a-25 ° C, in modo che acqua non può formare cristalli.
- Utilizzare un criostato per taglio e prima tagliare il blocco al livello desiderato (idealmente la metà della larghezza di una microscopia vetro diapositiva, ad esempio 5 x 5 mm).
- Al momento di sezionamento, utilizzare spazzole e una piastra stendi per impedire le sezioni di arricciatura verso l'alto.
- Tagliate 6-10 µm di spessore sezioni ad una velocità lenta ma costante di campioni di tessuto (1 s per ogni sezione). Quando una sezione è tagliata correttamente, rimane piatta sul coltello microtomo sotto la piastra stendi-fetta.
- Prendere 1-3 sezioni su vetrini microscopici e conservare a − 80 ° C fino all'utilizzo. Il numero di sezioni preparate dipende la dimensione del campione di tessuto e lo spessore desiderato della sezione.
2. enzima Histo/citochimica per deidrogenasi solubili
- Preparare il tampone di reazione.
- Preparare 100 mL di tampone fosfato del pH corretto (vedere tabella 1; ogni enzima ha un pH ottimale a cui la sua attività è la più alta). Per esempio, mescolare soluzioni di 0.1 M KH2PO4 (acida) e 0,1 M NA2HPO4 (base) fino a quando un buffer con il pH corretto è fatto.
- Peso 18 g di alcol polivinilico (PVA) nel buffer fosfato sotto cappa aspirante come PVA è polverosa e tossici.
- Sciogliere il 18% w/v PVA nel tampone fosfato a 100 ° C, riscaldando il tampone au bain marie (mettere la bottiglia di vetro in acqua bollente) e mescolare fino a quando il PVA è completamente sciolto. La soluzione sarà quindi, trasparente con piccole bolle d'aria che sono causate dall'agitazione. Richiede tipicamente ~ 15 min per il PVA sciogliere.
Nota: Il 18% w/v PVA in tampone fosfato è viscoso e possono essere trasferito su tubi di buffer di reazione 15 mL utilizzando una pipetta ampia. Deposito a breve termine di 18% w/v PVA in tampone fosfato deve essere eseguita a ≥ 40 ° C e archiviazione a lungo termine (fino a 2 settimane) a ≥ 60 ° C. 250 µ l di 18% w/v PVA in tampone fosfato è in genere necessaria per una preparazione di cytospin, mentre 500 µ l è necessario per una sezione di tessuto.
- Sciogliere il 18% w/v PVA nel tampone fosfato a 100 ° C, riscaldando il tampone au bain marie (mettere la bottiglia di vetro in acqua bollente) e mescolare fino a quando il PVA è completamente sciolto. La soluzione sarà quindi, trasparente con piccole bolle d'aria che sono causate dall'agitazione. Richiede tipicamente ~ 15 min per il PVA sciogliere.
- Preparare la soluzione di sale (nitroBT) di tetrazolium. Per ogni 1 mL di medium di incubazione, 40 µ l di soluzione di nitroBT è richiesto, che consiste di 5 mg di nitroBT (una polvere gialla) disciolto in un mix di 20 µ l dimetilformammide (DMF) e 20 µ l di etanolo, che sarà una soluzione trasparente gialla chiaro.
Nota: Poiché la stabilità del nitroBT è il più basso di tutti i reagenti necessari, si consiglia di preparare la soluzione di riserva nitroBT Ultima e sciogliere il nitroBT nel mezzo di reazione prima.- Sciogliere nitroBT in DMF ed etanolo riscaldando in un flaconcino di vetro durante un breve periodo di tempo (~ 10 s) utilizzando un bruciatore di Bunsen. Agitare il flaconcino durante il riscaldamento e non lasciare la fiala troppo a lungo nella fiamma per evitare l'evaporazione.
- Fare 10% supplementare nitroBT soluzione per consentire l'evaporazione del DMF ed etanolo durante il processo di dissoluzione.
- Schermare l'elettrone vettori fenazina methosulfate (PMS) o (1-metossi)-fenazina methosulfate (mPMS) e incubazione media contenenti m(PMS) dalla luce diretta in carta stagnola avvolgendo la fiala in vetro deposito.
- Preparare soluzioni reagenti secondo la tabella 1 di loro dissoluzione in acqua distillata H2O. Alcuni reagenti perisca rapidamente, così prepararli come poco prima dell'esperimento come possibile. Mantenere soluzioni reagenti in ghiaccio o a 4 ° C fino all'utilizzo.
- Preparare il supporto di incubazione come mostrato in tabella 1 e omogeneizzare la soluzione dopo ogni passaggio mediante agitazione delicata. Evitare la generazione di bolle d'aria nel medium di incubazione mescolando continuamente e tenendo la spatola sotto la superficie del medium di incubazione continuando a mescolare.
- L'applicazione di Medium di incubazione a sezioni di tessuto
- Microscopia di pre-riscaldare le diapositive con cytospins o sezioni di tessuto fissate a 37 ° C in una camera di incubazione di immunohistochemistry per 15 min. Immergere il fondo della camera di incubazione immunohistochemistry con acqua tiepida per mantenere una temperatura costante nella incubatrice.
- Attentamente rompere o segare pipette Pasteur nel passaggio dalla stretta per la parte larga. Pipette Pasteur regolari sono troppo strette per aspirare il medium di incubazione viscoso, quindi questo passaggio è necessario per rendere Pasteur pipette sufficientemente ampia per l'aspirazione di medium di incubazione.
- Applicare 250-500 µ l di medium di incubazione appropriato a ogni preparazione delle cellule o la sezione di tessuto su vetrini microscopia utilizzando la parte larga di una pipetta di Pasteur.
- Utilizzare la punta della pipetta per stendere uniformemente il medium di incubazione. Ignorare piccole bolle d'aria nel medium di incubazione, perché questi verranno a galla e non interferirà con la reazione enzimatica nella sezione preparazione o tessuto delle cellule nella diapositiva di microscopia.
- Incubare le preparazioni di cellule o sezioni di tessuto sui vetrini microscopia in un incubatore a 37 ° C (ad es. un incubatore di coltura del tessuto) per una durata pre-specificata, a seconda la cinetica enzimatica e la sua espressione in una preparazione particolare cella o tessuto (tabella 1). Tenere il coperchio della camera di incubazione immunohistochemistry chiusa per mantenere un ambiente umido per evitare che il tampone di reazione dall'asciugarsi.
- Lavare i vetrini microscopia
- Toccare i medium di incubazione in eccesso su un tessuto.
- Risciacquare meccanicamente il medium di incubazione dalle diapositive di microscopia in tampone fosfato di 60 ° C, pH 5.3, spostando su e giù le diapositive di microscopia nel buffer. Questo interrompe la reazione enzimatica.
- Lavare i vetrini microscopia tenendole in tampone fosfato di 60 ° C, pH 5.3 per 20 min.
- Meccanicamente, lavare i vetrini microscopia a 60 ° C l'acqua del rubinetto.
- Lavare i vetrini microscopia tenendole in acqua di rubinetto di 60 ° C per 20 min.
- Lasciare che l'acqua e scivoli raffreddino mescolando lentamente la temperatura acqua di rubinetto con l'acqua del rubinetto di 60 ° C nell'arco di 1 minuto.
- Eseguire un passaggio finale lavaggio meccanico in acqua a temperatura ambiente acqua distillata.
- Racchiudere i Cytospins macchiato o sezioni di tessuto su vetrini microscopia
- Pre-riscaldare una diapositiva più calda a 50-60 ° C.
- Attentamente a secco il lato posteriore delle diapositive microscopia utilizzando un tovagliolo di carta e metterli sulla diapositiva più caldo ad asciugare il lato superiore della diapositiva microscopia.
- Quando le diapositive sono asciutte, racchiudere preparazioni di cellule o sezioni di tessuto su vetrini microscopia usando coprioggetti e mezzo di montaggio gelatina glicerolo.
- Salvare le preparazioni delle cellule o del tessuto sezioni microscopia diapositive al buio in frigorifero a 4 ° C o procedere immediatamente con l'acquisizione di immagini.
3. acquisizione immagini
- Guadagno di registrare immagini con una telecamera CCD monocromatica scientifica con gamma dinamica sufficiente (almeno 8 bit ma preferibilmente 10 bit o 12 bit), fissate e una risposta lineare.
- Selezionare un obiettivo adeguato (20 X X-63 per cytospins) e 10-63 X per sezioni di tessuto.
- Ridurre l'abbagliamento restringendo il diaframma di campo in modo che è leggermente più grande del campo visivo.
- Uso di luce monocromatica applicando un filtro di inferenza di passa-banda larga nm 10 vicino alla lunghezza d'onda di isobestic di formazano precipitato7 in combinazione con un blocco a infrarossi filtro (Vedi Materiali tavolo).
Nota: L'assorbanza massima isobestic di nitroBT è a 585 nm. - Ottimizzare illuminazione per garantire che venga utilizzata l'intera gamma di livello grigio della fotocamera (ad esempio, impostare il livello di illuminazione affinché illuminamento massimo è raggiunto senza sovraesporre quando si registra un vetrino da microscopio in bianco).
- Calibrare i valori misurati livelli di grigio a noto assorbanza (o densità ottica [OD]). A tal fine, catturare immagini di scala di grigi di almeno 10 diversi passi di un vetrino di calibrazione o di passaggio per tablet con valori OD noti (Vedi punto 4.1.1), entrambi disponibili in commercio (Vedi Materiali tavolo) o misurare una tavoletta di passaggio zeppa di scala di grigi su misura da un densitophotometer e utilizzare i risultati per calibrare misurati grigio valori ai valori di assorbanza noto.
- Catturare le microfotografie di cellule o sezioni di tessuto di interesse.
4. image Analysis
- Prima dell'analisi di immagine, calibrare il software ImageJ per misure di assorbanza.
- Misurare l'assorbanza (OD) di microfotografie di almeno 10 aree di calibrazione con i parametri noti assorbanza della compressa di diapositiva o passaggio di calibrazione con valori noti OD. In ImageJ, utilizzare il menu Analizza → misura o tasto di scelta rapida Ctrl + M per misurare un'area selezionata.
- Avviare la procedura di calibrazione di assorbanza andando a Analyze → calibrazione. Scegliere la funzione "Rodbard (NIH Image)". Nella colonna sinistra della finestra che si apre, i risultati delle misurazioni di livello grigi da ogni passo della tavoletta diapositiva/passo calibrazione eseguita in 4.1.1 sono già presenti. In caso contrario, copiarli dalla schermata di risultati di ImageJ. Nella colonna di destra, è necessario immettere ciascun valore di assorbanza noto corrispondente come stampato sul certificato ricevuto con la tavoletta di passaggio calibrato. Barrare le caselle "calibrazione globale" e la "Trama Show" e premere "OK".
- Per il controllo qualità, assicurarsi che il R2 della funzione Rodbard è > 0,99. Se è < 0,99, verifica se le diapositive di taratura sono state fotografate e misurate correttamente e se i parametri di assorbanza noti sono stati immessi correttamente.
- ImageJ è ora calibrato finché non si chiude il programma (quindi "Calibrazione globale"). Per le misure di assorbanza, una sessione di ImageJ calibrata sempre converte che l'assorbanza osservato significa per valori compresi tra 0 e 1, dove 0 e 1 sono gli asintoti pari a zero e pieno assorbanza, rispettivamente.
- Per cytospins, selezionare > 100 singole cellule in modo casuale. Per sezioni di tessuto, selezionare uno o più campi di interesse di una lunghezza fissa e la larghezza in tutte le sezioni.
- Progetto un raster sopra le microfotografie per facilitare le selezioni di cella imparziali. In ImageJ, proiettare una griglia su un'immagine tramite il menu Plugins → analizza → griglia.
- In ImageJ, utilizzare lo strumento ellittica per selezionare singole cellule e utilizzare lo strumento rettangolo per selezionare aree di tessuto.
- Misurare l'assorbanza e l'area di celle selezionate o regioni di tessuto. La densità ottica e la zona sono chiamati "Significa" e "Area" nella ImageJ risultati foglio di calcolo, rispettivamente.
Nota: L'assorbanza totale di una regione delle cellule o del tessuto (se è stato selezionato parecchie regioni di tessuto con diverse dimensioni) è uguale alla somma di tutti i pixel separati assorbanze. Se una cella è ripreso da 1000 pixel, quindi l'assorbanza totale è data dalla somma delle assorbanze 1000 e l'assorbanza media è data dal totale assorbanza/1000. Questa procedura evita anche errore distribuzionali. - Determinare l'assorbanza media totale di > 30 celle o regioni di tessuto dalle diapositive di controllo, che contiene un esempio che è stato esposto per controllare medium di incubazione in assenza del substrato, ma in presenza di cofattori. Questa assorbanza di controllo utilizzato per controllo di non specifico enzima attività di colorazione e manufatti di assorbanza indotta dalle diapositive utilizzate microscopia, montaggio medio, vetrini coprioggetto o microscopio.
- Sottrarre l'assorbanza media controllo da tutte le misure di assorbanza totale dei campioni che sono state esposte al mezzo di incubazione con la stessa concentrazione di cofattore (ma diverse concentrazioni di substrato e/o inibitore). Questo dà l'assorbanza totale corretta di una regione delle cellule o del tessuto.
- Confronta statisticamente gli assorbimenti totali corretti medio utilizzando lo studente T-test o test ANOVA unidirezionale, a seconda della progettazione sperimentale.
- Formazano assorbanza può essere convertito in enzima attività (substrato convertito µmol / mL / min) tramite la legge di Lambert-Beer: c=A/(є×d), dove c è la concentrazione di formazan nel mezzo di reazione, A è l'assorbanza misurata in ImageJ dopo la calibrazione; Є è il coefficiente di estinzione di formazan (16.000 a 585 nm)8 e d è la luce che viaggia di distanza, che è uguale a spessore medio della cella o spessore di taglio di sezione nominale (6-10 µm in questo protocollo).
Nota: Dopo l'essiccazione, dello spessore di sezione del tessuto diminuisce ~ 50% dallo spessore nominale di sezione taglio, ma questo non si riflette nel calcolo sopra perché lo spessore di taglio di sezione nominale è biologicamente più rilevanti. Lo spessore medio delle cellule e la sfera dimensioni della cella preparates aderito a vetrini di microscopia possono essere determinati mediante microscopia confocale o grandangolari microscopia, per i quali protocolli possono essere reperiti altrove. 9 , 10
Representative Results
Diversi protocolli per preparare medium di incubazione sono indicati per studiare l'attività di una particolare deidrogenasi. Per ogni deidrogenasi, sciogliere i reagenti elencati nella soluzione di PVA, mantenendo una temperatura di almeno 37 ° C. I reagenti devono essere dissolto nell'ordine elencato nella tabella, vale a dire nitroBT sempre è dissolto in primo luogo e (m) PMS è dissolto sempre ultima. Ogni 5 mg di nitroBT è sciolto nel 40 µ l mescolare (20 µ l etanolo + 20 µ l dimetilformammide). Tutti i volumi sono per 1 mL di soluzione di PVA 18%, che può essere utilizzato per ~ 2 sezioni di tessuto o di ~ 4 preparazioni di cellule sulle lastre di vetro della macchia. NitroBT, NAD+, NADP+, soluzioni ADP e substrato dovrebbero essere fatto appena. NaN3e MgCl2 (m) PMS soluzioni possono essere conservati a 4 ° C per un mese. 18% PVA disciolto in fosfato tampone può essere conservato a 60 ° C per 2 settimane. Il pH della soluzione PVA 18% può essere impostato utilizzando diverse composizioni del 0,1 M potassio fosfato monobasico (KH2PO4) e buffer di 0.1 M disodio idrogeno fosfato (NA2HPO4). I periodi di incubazione mostrato forniscono buoni punti di partenza, ma i periodi di incubazione ottimali dipendono la specie, il tipo di tessuto e la conservazione del tessuto. In generale, vanno incubati più a lungo le sezioni di tessuto per ottenere un simile livello di produzione di formazano preparazioni delle cellule.
Selvaggio-tipo Isocitrato deidrogenasi 1 e 2 (IDH1/2) catalizzano la conversione dell'isocitrato ad α-chetoglutarato (αKG) con concomitante riduzione del NADP+ a NADPH il citoplasma e nei mitocondri, rispettivamente. Questi enzimi hanno recentemente attirato l'interesse perché IDH1/2 mutazioni si verificano in vari tipi di cancro umano, compreso il cancro primario del cervello (glioblastoma) e cancro del colon-retto e offrono un'occasione unica per dimostrare le possibilità di mappatura metabolica. Mutazioni di IDH1 disattivare il selvaggio-tipo enzima IDH1 e anche indurre un'attività neo-enzimatica che porta alla produzione e conseguente accumulo di oncometabolite D-2-idrossiglutarato (D-2 HG),11 che è discussi altrove in dettaglio. 12 mappatura metabolica esperimenti hanno mostrato che NADP+-dipendente attività di IDH1/2 era significativamente più basso in cellule di carcinoma del colon-retto con una bussato in IDH1 mutazione eterozigotica che in cellule di carcinoma del colon-retto che erano IDH1 selvaggio-tipo (Figura 1A). Questa differenza è stata quantificata dall'analisi dell'immagine di microfotografie di luce monocromatiche (Figura 1B). 12
Un altro esempio che illustrano degli esperimenti di mappatura metabolica è mostrato in Figura 2, che è un'immagine di una sezione di criostato di cervello di topo che è stato iniettato con le cellule di glioblastoma umano. IDH1/2 è il più importante fornitore di NADPH in cervello umano e la sua attività è upregulated in glioblastoma di IDH1/2 del selvaggio-tipo, considerando che la capacità di produzione di NADPH di IDH1/2 è molto più bassa nei cervelli dei roditori. 11 La Figura 2A Mostra la differenza tra il NADP alta+-dipendente attività di IDH1/2 in cellule di glioblastoma umano e il NADP basso+-dipendente IDH1/2 attività nel cervello di topo sano. Attività di IDH1/2 è quantificata come produzione di NADPH µmol / mL di tessuto al minuto nella Figura 2B.
La reazione enzimatica di IDH1/2 è relativamente semplice, ma del lattato deidrogenasi (LDH) è un complesso enzimatico più complicato. LDH converte la conversione reversibile da lattato a piruvato con concomitante riduzione del NAD+ al NADH o viceversa. La disponibilità di lattato e piruvato e la composizione dell'enzima LDH complesso determina se lattato principalmente viene convertito in piruvato (che è catalizzato da LDH-B e produce NADH) o se piruvato principalmente è convertito in lattato (che è catalizzata da LDH-A e consuma NADH). Esperimenti di mappatura metabolica 13 sono in grado di visualizzare l'attività della reazione LDH-B, ma sono "ciechi" per l'attività della LDH-A reazione perché non si verifica produzione di NADH e di conseguenza nitroBT non viene ridotta a formazano. La figura 3 Mostra il NAD+-dipendente attività LDH (cioè la conversione del lattato in piruvato) nel cervello umano sezioni in assenza del substrato (Figura 3A), in presenza di un'alta concentrazione di lattato (Figura 3B ), in presenza di lattato 6 mM (Figura 3) e in presenza di una bassa concentrazione di lattato e una maggiore concentrazione di piruvato (Figura 3D). I risultati di questi esperimenti illustrano metabolica mappatura adeguatamente che cattura il NAD+-dipendente attività LDH in sezioni di tessuto dipende dalla disponibilità del lattato e del piruvato nel mezzo di reazione.
Figura 1 . +NADP-dipendente IDH1/2 attività di cellule umane di carcinoma del colon-retto. (A) rappresentante microfotografie di luce monocromatiche delle cellule umane di carcinoma del colon-retto HCT116 dopo la macchiatura per il NADP+-dipendente attività di IDH1/2 contro 1-10mm NADP isocitrato e 0,8 mM+. Scala bar = 50 µm. (B) una quantificazione dell'assorbanza del formazan blu prodotta da nitroBT da+NADP-dipendente IDH1/2 attività per ogni cella è indicata con l'uso di luce monocromatica in (A) e analisi delle immagini. Abbreviazioni: IDH1WT/WT, Isocitrato deidrogenasi 1 selvaggio-tipo; Mutazione di IDH1WT/MUT, Isocitrato deidrogenasi 1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . +NADP-dipendente IDH1/2 attività di campioni di glioblastoma umano. (A) Fotomicrografo rappresentativo di una sezione del cervello del mouse contenente il cervello di topo sano (h) e un xenotrapianto di tumore glioblastoma umano (t) dopo la macchiatura per il NADP+-dipendente IDH1/2 attività in presenza di 0,8 NADP mM+ e 2 mM isocitrato. Barra della scala = 200 µm (B) quantificazione di attività enzimatica delle aree del cervello di topo (h) e glioblastoma umano dello xenotrapianto (t) mostrato in (A) utilizzando la legge di Lambert-Beer. Barre di errore rappresentano deviazioni standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . +NAD-dipendente del lattato deidrogenasi (LDH) attività di campioni di cervello umano. Rappresentante microfotografie di sezioni di serie di campioni di cervello umano dopo la macchiatura per NAD+-attività LDH dipendente (A) contro le condizioni di controllo (in assenza di substrato e piruvato, 3mm NAD+ solo) (B) contro 150 mM lattato in assenza di piruvato (C) contro 6 mM del lattato in assenza di piruvato e (D) contro 6 mM lattato in presenza di piruvato di 18mm, l'inibitore competitivo prodotto della reazione del lattato a piruvato. Barra della scala = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Enzima: | G6PDH | LDH | SDH | MDH | IDH1 | IDH2 | IDH3 | 6PGD | GDH |
| PVA 18% in tampone fosfato 100mm | 1 mL; pH = 7,4 | 1 mL; pH = 7,4 | 1 mL; pH = 8.0 | 1 mL; pH = 7,4 | 1 mL; pH = 7,4 | 1 mL; pH = 7,4 | 1 mL; pH = 7,4 | 1 mL; pH = 8.0 | 1 mL; pH = 8.0 |
| 5 mM NitroBT | mix di 5 mg/40 µ l | mix di 5 mg/40 µ l | mix di 5 mg/40 µ l | mix di 5 mg/40 µ l | mix di 5 mg/40 µ l | mix di 5 mg/40 µ l | mix di 5 mg/40 µ l | mix di 5 mg/40 µ l | mix di 5 mg/40 µ l |
| 5 mM NaN3 | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | |
| 5 mM MgCl2 | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | |||
| 3 mM NAD+ | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | ||||||
| 0,8 mM NADP | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | ||||
| 2 mM ADP | 10 Μ l | ||||||||
| substrato | 10 mM glucosio-6-fosfato | lattato di 150 mM | succinato di 50 mM | acido malico 100 mM | Isocitrato 2 mM | Isocitrato 2 mM | Isocitrato 2 mM | 10 mM 6-fosfo-galactonate | acido glutammico 10 mM |
| mPMS 0,32 mM | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | ||||
| 0,2 mM PMS | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | |||||
| Durata di incubazione | 5 min | 30 min | 60 min | 60 min | 30 min | 30 min | 30 min | 10 min | 30 min |
Tabella 1. Descrizione schematica del protocollo mappatura metabolica per deidrogenasi. Abbreviazioni: ADP, adenosina difosfato; (m) PMS (metossi) -5-methylphenazinium solfato di metile; nitroBT, nitro blu di tetrazolio cloruro; G6PDH, glucosio-6-fosfato deidrogenasi; LDH, lattato deidrogenasi; SDH, succinato deidrogenasi; MDH, malato deidrogenasi; IDH, Isocitrato deidrogenasi; 6PGD, 6-fosfogluconato deidrogenasi; GDH, glutammato deidrogenasi.
Discussion
Ricerca sul metabolismo cellulare attualmente sta vivendo una rinascita, perché i ricercatori rendo conto ora che effetti metabolici sono fondamentali per la patogenesi ed il trattamento di molte malattie. 1 inoltre, ricerca metabolica è aiutata da una crescente disponibilità di tecniche che forniscono questo campo di ricerca con strumenti più che mai, tra cui la spettrometria di massa, l'etichettatura radioisotopica e spettrometria di risonanza magnetica nucleare. Mappatura metabolica non è affatto una tecnica novella, ma la sua capacità di dare informazioni integrate sull'attività degli enzimi in una situazione di quasi allineare--natura rende questa tecnica più attuale che mai. 2
I cofattori+ NAD e NADP+ si trovano in tutte le cellule viventi, che indica che la deidrogenasi si alzò molto presto nel corso dell'evoluzione e giocano un ruolo importante nel metabolismo cellulare. 14 , 15 attualmente, ci sono 523 reazioni enzima-catalizzate che sono classificate come deidrogenasi e si verificano in tutte le specie. 16 teoricamente, l'attività di tutte le reazioni di deidrogenasi differenti possa essere separatamente studiata modificando il protocollo di mappatura metabolica descritto qui. Ogni reazione enzimatica è unico mediante il substrato e cofattori che sono necessari per la sua attività. Di conseguenza, l'attività di ogni reazione enzimatica può essere determinata utilizzando un esperimento di mappatura metabolica con il substrato adeguato e cofattori in mezzo di reazione. Tuttavia, alcune isoforme dell'enzima differiscono nella loro localizzazione subcellulare, ad es. una isoforma catalizza una reazione nel citoplasma, mentre un'altra isoforma funzioni nei mitocondri. Un esempio notevole è IDH1 e IDH2, di cui il primo è citoplasmatico e quest'ultimo è mitocondriale e che sono due differenti proteine codificate da due geni differenti. 11 1-metossi-5-methylphenazinium methylsulfate (metossi-PMS) e 5-methylphenazinium methylsulfate (PMS) può essere utilizzati come trasportatori di elettroni per questi esperimenti. L'ex non passa le membrane mitocondriali, il non quest'ultimo. Pertanto, indagini su enzimi mitocondriali (ad es. IDH2) dovrebbero utilizzare PMS mentre le indagini su enzimi citosolici (ad es. IDH1) dovrebbero utilizzare mPMS.
Come con molte tecniche, variazioni del presente protocollo, ad esempio utilizzando diversi tipi di sali di tetrazolio, escluse l'aggiunta di PMS e sodio azide, utilizzando un mezzo di montaggio acquoso e variando incubazione e risciacquo volte, esiste e può funzionare altrettanto bene. L'applicazione di mappatura metabolica con sali di tetrazolio non è limitato a deidrogenasi. Con piccole modifiche al protocollo, può anche essere utilizzato per la valutazione dell'attività di enzimi che funzionano direttamente a Monte di una deidrogenasi in una via metabolica. Precedentemente abbiamo descritto questo principio per l'enzima di glutaminase,17 che funziona direttamente a Monte del glutammato deidrogenasi nella via glutaminolysis. 18 in teoria, lo stesso principio può essere applicato ad altri enzimi che funzione direttamente a valle o a Monte di una deidrogenasi ad esempio aconitasi, che si trova direttamente a Monte di IDH2 e IDH3 nell'acido tricarbossilico (TCA) ciclo. Un altro semplice variazione delle concentrazioni indicate nella tabella 1 è per mezzo di fare flaconi di incubazione con varie concentrazioni di substrato, cofattore e/o inibitore. Questo consente la generazione di curve dose-attività in funzione della concentrazione di substrato, cofattore e/o inibizione.
Tecnicamente parlando, metabolica esperimenti di mappatura non facilitano imparziali osservazioni di in situ attività enzimatica, perché i ricercatori devono scegliere una concentrazione di substrato e cofattore che potrebbe non riflettere i livelli di substrato e cofattore che sono presenti in situ. Inoltre, l'uso di viscosa 18% PVA nel mezzo di reazione serve a mantenere intatto, macromolecole nel luogo e nella conformazione, ma vieta la diffusione efficace di bassi peso molecolare reagenti attraverso il mezzo di reazione. 3 , 5 di conseguenza, le attività di determinati enzimi negli esperimenti descritti qui che utilizzano concentrazioni di substrato supraphysiological non riflettono la situazione in vivo ad una concentrazione di substrato dato ma sono adatti per confronti intra-sperimentali. Così, il risultato degli esperimenti di mappatura metabolica è la capacità di produzione (attività massima) di una reazione enzimatica nel contesto dei livelli di substrato e cofattore che sono presenti in situ. Inoltre, l'utilizzo di varie concentrazioni di substrato e/o cofattori e campioni multipli permette confronto imparziale della capacità di produzione massima (Vmax) e affinità (Km) di un enzima per un substrato/cofattore in preparazioni di cellule , tessuti o regioni di tessuto. Questi parametri sono il risultato della somma di espressione della proteina enzimatica, modificazioni post-traduzionali e l'effetto di un microambiente affollato sull'attività degli enzimi. Pertanto, mappatura metabolica è ancora una migliore riflessione di attività enzimatica di esperimenti che determinano l'espressione della proteina o purificata attività enzimatica in vitro.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
R.J.M è supportato da una borsa di studio di dottorato AMC. Questa ricerca è stata sostenuta dall'olandese Cancer Society (grant KWF UVA 2014-6839). Gli autori ringraziano il Dr. A. Jonker per il suo aiuto con la scrittura del protocollo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| D-Glucose 6-phosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | G7879 | |
| Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4) | Merck Millipore | 106559 | |
| di-Sodium succinate | Sigma-Aldrich | W327700 | |
| DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | I1252 | |
| D-Malic acid | Sigma-Aldrich | 2300 | |
| Glycerol Gelatin | Sigma-Aldrich | GG1 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| Lithium 6-phospho-D-galactonate | Sigma-Aldrich | 55962 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| methoxy-Phenazine methosulfate | Serva | 28966.01 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N0505 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | NADP-RO | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Phenazine methosulfate | Serva | 32030.01 | |
| Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed | Sigma-Aldrich | P1763 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck Millipore | 104873 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Bandpass filter | Edmund optics | https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/ | |
| Grey-step wedge | Stouffer Industries | http://www.stouffer.net/TransPage.htm |
References
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