Summary
Hier presenteren we een protocol dat kan worden gebruikt om microscopisch visualiseren en kwantificeren van de activiteit van dehydrogenases in cellen en weefsels en kinetiek, functie en subcellular localisatie.
Abstract
Gewijzigde cellulaire metabolisme is een kenmerk van veel ziekten, waaronder kanker, cardiovasculaire ziekten en infecties. De metabole motor eenheden van cellen zijn enzymen en hun activiteit is sterk gereguleerd op vele niveaus, met inbegrip van de transcriptionele, mRNA stabiliteit, translationeel, posttranslationele en functioneel niveau. Deze ingewikkelde verordening betekent dat de conventionele kwantitatieve of imaging tests, zoals kwantitatieve mRNA experimenten, Western vlekken en immunohistochemistry, onvolledige informatie met betrekking tot de uiteindelijke activiteit van enzymen, hun functie opbrengst en/of hun subcellular localisatie. Kwantitatieve enzym cytochemie en histochemie (dat wil zeggen, metabole toewijzing) Toon gedetailleerde informatie op in situ enzymatische activiteit en kinetiek, functie en subcellular localisatie in een situatie van bijna waar-te-natuur.
Beschrijven we een protocol voor het detecteren van de activiteit van dehydrogenases, die enzymen die redoxreacties zijn Verklein cofactoren zoals NAD(P)+ en FAD uitvoeren. Cellen en weefselsecties worden geïncubeerd in een medium dat specifiek is voor de enzymatische activiteit van één dehydrogenase. Vervolgens voert de dehydrogenase, dat is het onderwerp van onderzoek zijn enzymatische activiteit in haar subcellular site. In een chemische reactie met het reactie-medium genereert dit uiteindelijk blauw gekleurde formazan op de site van de dehydrogenase van activiteit. Van de formazan absorptie is dus een directe maat voor de dehydrogenase van activiteit en kan worden gekwantificeerd aan de hand van monochromatisch licht microscopie en beeld-analyse. Het kwantitatieve aspect van dit protocol kan onderzoekers statistische conclusies te trekken uit deze testen.
Naast observatiestudies, kan deze techniek worden gebruikt voor studies van de inhibitie van specifieke enzymen. In dit verband, studies profiteren van de voordelen van de waar-te-natuur van metabole toewijzing, kan in situ resultaten geven dat fysiologisch relevanter dan in vitro de studies van de remming van het enzym zijn. In alle is metabole toewijzing een onmisbare techniek om te studeren metabolisme op het cellulaire of weefsel niveau. De techniek is gemakkelijk aan te nemen, biedt gedetailleerde, uitgebreide en geïntegreerde metabole informatie en maakt een snelle kwantitatieve analyse.
Introduction
Een essentiële hoeksteen van de cellulaire fysiologie is metabolisme. Metabolisme cellen voorziet van de energie die nodig is voor alle fysiologische processen, levert de bouwstenen voor macromoleculaire biosynthese en regelt cellulaire homeostase met betrekking tot afval producten, toxische moleculen en de demontage en recycling van geen onnodige of disfunctionele cellulaire componenten. Enzymen katalyseren van bijna alle belangrijke cellulaire chemische reacties en daarom zijn de motorische eenheden in de Fysiologie van de cellen. 1 , 2
De activiteit van enzymen is strak geregeld op vele niveaus en daarom kwantitatieve enzym histochemie en cytochemie (ook wel metabole toewijzing genoemd) is de aanbevolen methode om te studeren enzym activiteit in situ. Op het transcriptional niveau, wordt genexpressie in mRNA geregeld. Het effect van de regulering van de transcriptie kan worden bepaald met behulp van kwantitatieve mRNA testen, zoals microarrays of directe RNA sequencing of kwalitatieve mRNA testen, zoals in-situ hybridisatie die informatie over de mobiele (sub geeft) lokalisatie van mRNA moleculen. Dit maakt het mogelijk om te waarderen relatieve verschillen in transcriptionele activiteit tussen cellen. De interpretatie en de geldigheid van deze mRNA tests met betrekking tot metabole activiteit is echter gecompliceerd omdat verordening vindt ook plaats op het niveau van mRNA, waar volgorde en stabiliteit van mRNA moleculen zijn bewerkt nadat het is transcriptie van DNA. Deze bewerken regelt eiwit isovorm vertaling en eiwit vertaling hoeveelheid op de ribosomen. Bovendien, het proces van eiwit vertaling wordt gecontroleerd en uiteindelijk invloed op enzym expressie en daarom activiteit. Het gecombineerde effect van de bovengenoemde regelgevende stappen kunnen worden gewaardeerd met behulp van kwantitatieve eiwit expressie testen, zoals het westelijke bevlekken omgekeerde fase eiwit lysate microarrays en/of kwalitatieve eiwit expressie testen, zoals immunocytochemie en immunohistochemistry, maar deze technieken niet stroomafwaarts regelgevende effecten zoals posttranslationele wijziging van eiwitten en de functionele regeling van enzymen in hun drukke communicatie opneemt. Bovendien kan de uitdrukking van een enzym slecht correleren met haar activiteit, zodat activiteit metingen van een gezuiverde enzym in de cel of het weefsel homogenates of in verdunde oplossingen veel voor enzym activiteit studies gebruikt worden. Echter deze experimenten niet om te repliceren de invloed van een overvolle verzuilde cytoplasma of organel op de activiteit van het enzym. Bovendien, alle genoemde technieken bepalen de hoeveelheid of de lokalisatie van mRNA of enzym expressie, maar zijn niet in staat om uitgebreide informatie over beide aspecten van expressie van het enzym, laat staan de integratie van dit informatie met enzym activiteit vaststellingen. 2 , 3 , 4
Metabole toewijzing kunt de appreciatie van alle bovengenoemde variabelen die bepalend zijn voor de activiteit van het enzym. Wat meer is, is metabole toewijzing een vorm van levende cel of weefsel imaging met cellen en weefsels die zijn bewaard gebleven tijdens de analyse voor het genereren van een bijna waar-te-natuur situatie voor het genereren van gegevens van de activiteit van enzymen. Het produceert beelden die beide de gedetailleerde waardering van de locatie van de enzymactiviteit evenals robuuste kwantificering van enzymactiviteit binnen een cel of een weefsel compartiment te vergemakkelijken. 3 , 4 de protocollen die hier beschreven voor het omzetten van de metabole activiteit van dehydrogenases zijn gebaseerd op de handleiding van de laboratorium van alle beschikbare enzym histochemische methoden,5 op de beginselen van kwantitatieve enzym histochemie,6 op beeldanalyse van kwantitatieve metabole toewijzing. 4
Dehydrogenases zijn enzymen die redoxreacties om canonieke cofactoren zoals+NAD en NADP+ FAD NADH en NADPH FADH2, respectievelijk uit te voeren. Onbeschadigde cellen of cryostaat weefselsecties die zijn niet chemisch vast worden geïncubeerd in een medium van de reactie die onder andere reagentia, het substraat en cofactoren van een specifieke dehydrogenase en een tetrazolium zout bevat. Vervolgens dat dehydrogenase voert haar katalytische activiteit en vermindert, bijvoorbeeld NADP+ te NADPH. Via een elektron vliegdekschip vermindering van 2 moleculen van NADPH uiteindelijk 1 in water oplosbare semi-kleurloos tetrazolium zout molecuul in 1 water onoplosbare blauwe formazan molecule die onmiddellijk op de site van de dehydrogenase precipitaten. Daarom de extinctie van geprecipiteerde formazan is een directe maat voor de lokale activiteit van een dehydrogenase en kan worden waargenomen met behulp van de lichte microscopie van of gekwantificeerd aan de hand van monochromatisch licht microscopie en beeld-analyse. Het kwantitatieve aspect van dit protocol kan onderzoekers statistische conclusies te trekken uit deze testen. Deze kwantificering vergemakkelijkt bovendien de bepaling van de in situ kinetische enzym parameters, zoals de maximale enzymactiviteit (Vmax) en affiniteit van een substraat voor een enzym (Km). 3 , 4 , 5 , 6
Bij het plannen van een metabole toewijzing experiment, is het belangrijk om te beseffen dat een maximum van vijftig glas dia's met de daaraan vastzittende cel preparaten of weefselsecties per experiment, worden geadviseerd om te minimaliseren van vertragingen tijdens de incubatie teneinde overeenstemming resultaten. Het is mogelijk voor het verwerken van meer dia's en/of middellange composities als volgt protocol coöperatief worden uitgevoerd door meer dan één experimentator. Bovendien, sommige variabiliteit bestaat tussen experimenten. Daarom identiek experimenten ten minste 3 keer te worden herhaald met cytospins van de voorbereiding van elke cel of secties van elk monster weefsel en passende controles in elk experiment moeten worden opgenomen. Altijd bereiden een controle incubatie medium in de afwezigheid van substraat maar in aanwezigheid van cofactoren aan besturingselement voor niet-specifieke enzym activiteit kleuring. De meest representatieve resultaten worden verkregen in experimenten waar verschillende substraat/cofactor concentraties worden toegepast op weefselsecties of cel preparaten van hetzelfde monster, zodat de experimentator kan het uitvoeren van analyses van het gebruik van enzym-kinetiek dosis-activiteit curven.
Protocol
Dit protocol volgt de richtsnoeren inzake het gebruik van menselijk materiaal van de medisch-ethische Review Board van het academisch medisch centrum.
1. bereiding van cellen of in weefselsecties
- Cellen
- Trypsinize cellen uit cultuur gerechten, gebruikmakend van 1 mL van 0,25% trypsine-EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ° C in een 10 mm petrischaal en brengen van cellen in een suspensie van 37 ° C van 50.000-200.000 cellen/mL, afhankelijk van de grootte van de cellen.
- Hechten 200 µL van de celsuspensie in microscopie dia's met behulp van cytospin trechters in een cytocentrifuge bij 20 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- De cytospins gedurende 24 uur bij kamertemperatuur drogen. Dit heeft geen invloed op dehydrogenase activiteit. 5
- Weefselsecties
- Uittreksel weefsel van patiënten of van dieren volgens ethische vergunningen. 10 mm3 van weefsel is voldoende voor meerdere experimenten.
- Zet de stukken van weefsel in kleine ontlucht 2 mL kunststof flesjes en module-freeze de flesjes met het stukje weefsel in vloeibare stikstof.
- Bewaar de flesjes met weefsel stuks op −80 ° C totdat zij worden verwerkt.
- Gebruik een medium van de gel-achtige genaamd optimale scherpe temperatuur (OCT) om te koppelen van het monster weefsel op een chuck dat tot-20 ° C tot-25 ° C, snel bevriest, zodat water kan zich geen kristallen vormen.
- Gebruik een cryostaat voor snijden en eerste trim het blok naar het gewenste niveau (idealiter de helft van de breedte van een microscopie glas dia, bijvoorbeeld 5 x 5 mm).
- Gebruik bij het segmenteren, borstels en een anti-roll plaat om te voorkomen dat de secties curling naar boven.
- Snijd weefselmonsters in 6-10 µm dik secties met een langzame maar constante snelheid (1 s per sectie). Wanneer een sectie correct wordt gesneden, blijft het plat op de microtoom mes onder de anti-roll-plaat.
- Neem 1-3 secties op microscopische glas dia's en op −80 ° C bewaren tot gebruik. Het aantal secties bereid is afhankelijk van de grootte van de steekproef van het weefsel en de gewenste dikte van de secties.
2. enzym Histo/cytochemie voor oplosbare Dehydrogenases
- Voorbereiding reactie Buffer.
- 100 mL fosfaatbuffer van de juiste pH voor te bereiden (Zie tabel 1; elk enzym heeft een optimale pH waartegen de activiteit het hoogst is). Meng bijvoorbeeld oplossingen van 0,1 M KH2PO4 (zure) en 0,1 M NA2HPO4 (basis) tot een buffer met de juiste pH is gemaakt.
- Weeg 18 g van polyvinylalcohol (PVA) in de fosfaatbuffer onder een zuurkast zoals PVA stoffig en giftig is.
- Los van de 18% w/v PVA in de fosfaatbuffer bij 100 ° C door het opwarmen van de buffer au bain marie (zet de fles in kokend water) en roeren totdat het PVA volledig is opgelost. De oplossing zal zijn transparante vervolgens met kleine luchtbellen die worden veroorzaakt door de roeren. Het vereist meestal ~ 15 min voor het PVA te ontbinden.
Opmerking: De 18% w/v PVA in fosfaatbuffer is viskeuze en 15 mL reactie buffer buizen met behulp van een precisiepipet breed kan worden overgedragen. Op korte termijn opslag van 18% w/v PVA in fosfaatbuffer plaatsvinden bij ≥40 ° C en langdurige opslag (maximaal 2 weken) op ≥ 60 ° C. 250 µL van 18% w/v PVA in fosfaatbuffer is doorgaans vereist voor een cytospin preparaat, terwijl 500 µL vereist voor een weefselsectie is.
- Los van de 18% w/v PVA in de fosfaatbuffer bij 100 ° C door het opwarmen van de buffer au bain marie (zet de fles in kokend water) en roeren totdat het PVA volledig is opgelost. De oplossing zal zijn transparante vervolgens met kleine luchtbellen die worden veroorzaakt door de roeren. Het vereist meestal ~ 15 min voor het PVA te ontbinden.
- Bereid tetrazolium zout (nitroBT) oplossing. Voor elke 1 mL van incubatie medium, 40 µL van nitroBT oplossing vereist is, bestaande uit 5 mg nitroBT (een gele poeder) opgelost in een mix van 20 µL dimethylformamide (DMF) en 20 µL van ethanol, die een licht geel transparante oplossing zal zijn.
Opmerking: Omdat de stabiliteit van nitroBT de laagste van alle nodige reagentia is, is het aanbevolen te bereiden de stockoplossing nitroBT laatst en los van de nitroBT in het medium reactie eerst.- Los nitroBT in DMF en ethanol door verwarming van het in een glazen ampul gedurende een korte periode van tijd (~ 10 s) met behulp van een bunsenbrander. Schud de flacon tijdens verwarming en laat niet de flacon te lang in de vlam ter voorkoming van verdamping.
- Maken van 10% extra nitroBT oplossing voor de verdamping van DMF en ethanol tijdens het oplossen.
- Schild van de elektron vervoerders fenazine methosulfate (PMS) of (1-methoxy)-fenazine methosulfate (mPMS) en incubatie media met m(PMS) van direct licht door inwikkeling zilverpapier rond de glazen ampul voor opslag.
- Reagens oplossingen volgens tabel 1 voor te bereiden door hen in gedestilleerd H2O. Sommige reagentia vergaan snel, dus voor hen zo kort voor het experiment mogelijk te bereiden. Reagens oplossingen op ijs of bij 4 ° C houden tot gebruik.
- Bereiden van incubatie media zoals aangegeven in tabel 1 en meng de oplossing na elke stap door zachte roeren. Vermijd de generatie van luchtbellen in het incubatie-medium door onder voortdurend roeren en het houden van de spatel onder het oppervlak van het medium van de incubatie tijdens het roeren.
- Incubatie Medium toepassen weefselsecties
- Vooraf warm microscopie dia's met cytospins of weefselsecties aangesloten bij 37 ° C in een immunohistochemistry incubatie zaal voor 15 min. onderdompelen de bodem van de kamer van de incubatie immunohistochemistry met warm water te handhaven van een constante temperatuur in de Incubator.
- Zorgvuldig breken of zag uit Pasteur pipetten op de overgang van de smalle naar het brede deel. Regelmatige Pasteur pipetten zijn te smal om te gecombineerd het visceuze incubatie medium, dus deze stap is nodig om Pasteur pipetten breed genoeg voor het streven van de incubatie-medium.
- 250-500 µL van het passende incubatie medium toepassen op elk preparaat van de cel of weefselsectie op microscopie dia's met behulp van het brede deel van een pipet van Pasteur.
- Gebruik de pipet tip om het incubatie-medium gelijkmatig verdeeld. Negeer kleine luchtbellen in het incubatie-medium, omdat deze een werkbalk naar de oppervlakte zwevende wordt en niet met de enzymatische reactie in de cel voorbereiding weefsel sectie of op de dia microscopie interfereren zal.
- Incubeer de cel preparaten of weefselsecties op de microscopie dia's in een 37 ° C incubator (bijvoorbeeld een incubator weefselkweek) gedurende een vooraf opgegeven, afhankelijk van de enzymkinetiek en haar expressie in een bepaalde cel preparaat of weefsel (tabel 1). Houd het deksel van de immunohistochemistry incubatie kamer gesloten te houden van een vochtige omgeving om te voorkomen dat de buffer reactie tegen het uitdrogen.
- Wassen van de microscopie dia 's
- Tik uit overtollige incubatie medium op een weefsel.
- Mechanisch spoel naar het medium van de incubatie van de microscopie dia's in 60 ° C fosfaatbuffer, pH 5.3, door de microscopie dia's in de buffer op en neer te bewegen. Hiermee stopt u de enzymatische reactie.
- De microscopie dia's wassen door ze te houden in 60 ° C fosfaatbuffer, pH 5.3 voor 20 min.
- Mechanisch de microscopie dia's in het water van de kraan van 60 ° C wassen.
- De microscopie dia's wassen door ze te houden in het water van de kraan van de 60 ° C gedurende 20 minuten.
- Laat het water en dia's koelen door het langzaam mengen van kamertemperatuur leidingwater met water uit de kraan 60 ° C in de loop van 1 minuut.
- Een definitieve mechanische wassen stap uitvoeren in kamertemperatuur gedistilleerd water.
- Omsluiten de gekleurde Cytospins of weefselsecties op microscopie dia 's
- Vooraf warm een dia warmer bij 50-60 ° C.
- Zorgvuldig droog van de achterkant van de microscopie dia's met behulp van een papieren handdoek en leg ze op de dia warmer te drogen van de bovenzijde van de dia. microscopie.
- Als de dia's droog zijn, moet u de cel preparaten of weefselsecties op microscopie dia's met behulp van glycerol gelei montage medium en coverslips.
- De voorbereidingen van de cel of het weefsel secties microscopie dia's opslaan in het donker in een koelkast bij 4 ° C of direct doorgaan met Beeldacquisitie.
3. de Beeldacquisitie
- Beelden van de record met een wetenschappelijke monochroom CCD camera met voldoende dynamisch bereik (ten minste 8-bit maar liefst 10-bit of 12-bits), vaste winst en een lineaire respons.
- Selecteer een eigenlijke doel (20 X-63 X voor cytospins) en 10-63 X voor weefselsecties.
- Verminder schittering door vernauwing van het veld middenrif zodat het is iets groter dan het gezichtsveld.
- Gebruik monochromatisch licht door een 10 nm breed bandpass gevolgtrekking filter in de buurt van de golflengte van de isobestic van de formazan overhaaste7 in combinatie met een infrarood blocking filteren (Zie Materialen tabel).
Nota: De extinctie van de maximale isobestic van nitroBT is bij 585 nm. - Optimaliseren van verlichting om ervoor te zorgen dat het hele grijze niveau bereik van de camera wordt gebruikt (dat wil zeggen, het niveau van de verlichting zo ingesteld dat maximum verlichtingssterkte wordt bereikt zonder teveel bloot bij het opnemen van een lege microscoopglaasje).
- Kalibreren gemeten grijze niveaus aan bekende extinctie (of optische dichtheid [OD]) waarden. Te dien einde vastleggen grijsschaal beelden van ten minste 10 verschillende stappen van een kalibratie dia of stap tablet met bekende OD-waarden (zie stap 4.1.1), ofwel verkrijgbare (Zie Materialen tabel) of meten van een op maat gemaakte grijsschaal wig stap tablet door een densitophotometer en gebruik de resultaten om te kalibreren gemeten grijs waarden naar bekende extinctie waarden.
- Photomicrographs van cellen of in weefselsecties van belang vastleggen.
4. de beeldanalyse
- Kalibreren voor beeldanalyse, de ImageJ software voor extinctie metingen.
- Meet de extinctie (OD) van photomicrographs van ten minste 10 kalibratie gebieden met bekende extinctie parameters in de kalibratie dia of stap tablet met bekende OD-waarden. In ImageJ, analyseren → maatregel menu of hotkey Ctrl + M om te meten van een geselecteerd gebied te gebruiken.
- Start de kalibratieprocedure absorptie door te gaan analyseren → kalibratie. Kies functie "Rodbard (NIH afbeelding)". In de linkerkolom van het venster dat opent, zijn de resultaten van grijze niveaumetingen van elke stap van de kalibratie dia/stap tablet uitgevoerd in 4.1.1 al aanwezig. Als dat niet het geval is, hen te kopiëren van het scherm ImageJ resultaten. In de rechterkolom Geef elke overeenkomstige waarde van de bekende extinctie zoals afgedrukt op het certificaat dat u met de geijkte stap tablet ontvangen. Vink vakken "Global kalibratie" en "Show plot" en druk op "OK".
- Voor kwaliteitscontrole, zorg ervoor dat de R2 van de Rodbard functie is > 0.99. Als het < 0,99, controleren of de kalibratie dia's werden gefotografeerd en correct gemeten en of de bekende extinctie parameters correct werden opgenomen.
- ImageJ is nu gekalibreerd totdat u het programma sluit (vandaar "Global kalibratie"). Voor extinctie metingen, een gekalibreerde ImageJ sessie altijd converteert die de waargenomen extinctie betekent naar waarden tussen 0 en 1, waarbij 0 en 1 zijn de asymptoten van nul en volledige absorptie, respectievelijk.
- Voor cytospins, selecteert u > 100 afzonderlijke cellen in een willekeurige manier. Voor weefselsecties, selecteert u een of meer velden van belang van een vaste lengte en breedte in alle secties.
- Project een raster over de photomicrographs bij onbevooroordeelde cel selecties. Project in ImageJ, een rooster boven een afbeelding via het menu → raster van Plugins → analyseren.
- In ImageJ, het elliptisch gereedschap gebruiken om enkele cellen te selecteren en gebruik het gereedschap rechthoek om te selecteren van de regio's van weefsel.
- Het meten van de absorptie en de oppervlakte van de geselecteerde cellen of weefsel regio's. De optische dichtheid en gebied heten "Mean" en "Ruimte" in de ImageJ resultaten werkblad, respectievelijk.
Opmerking: De totale extinctie van een cel of een weefsel regio (als u meerdere weefsel regio's met verschillende formaten hebt geselecteerd) is gelijk aan de som van alle gescheiden pixel verticaal absorptie. Als een cel is beeld door 1000 pixels, dan de totale extinctie wordt gegeven door de som van 1000 verticaal absorptie en de gemiddelde absorptie wordt gegeven door totale absorptie/1000. Deze procedure ook vermeden verdeling fout. - Bepalen van de gemiddelde totale extinctie van > 30 cellen of weefsel regio's van de dia('s) control, waarin een monster dat werd blootgesteld aan de controle van incubatie medium in de afwezigheid van substraat maar in aanwezigheid van cofactoren. De extinctie van deze controle is gebruikt om te controleren voor niet-specifieke enzym activiteit kleuring en absorptie artefacten geïnduceerd door de gebruikte microscopie dia's, montage medium, cover slip of Microscoop.
- Aftrekken van de extinctie van de controle van de gemiddelde van alle metingen van de totale extinctie van monsters die werden blootgesteld aan incubatie medium met dezelfde concentratie van cofactor (maar verschillende concentraties substraat of remmer). Dit geeft de gecorrigeerde totale extinctie van een cel of een weefsel regio.
- Statistisch vergelijken verticaal de gemiddelde gecorrigeerde totale absorptie met behulp van de Student T-test of one-way ANOVA, afhankelijk van uw experimentele ontwerp.
- Formazan absorptie kan worden omgezet in de enzym activiteit (µmol geconverteerd substraat per mL / min) via de wet van Lambert-Beer: c=A/(є×d), indien c is de concentratie van formazan in het reactie-medium, A is de gemeten extinctie in ImageJ na kalibratie; Є is de coëfficiënt uitsterven van formazan (16.000 op 585 nm)8 en d is het licht reizen afstand, die gelijk aan de gemiddelde cel dikte of nominale sectie snijdikte (6-10 µm in dit protocol is).
Opmerking: Na het drogen wordt de dikte van de sectie weefsel vermindert ~ 50% van de nominale sectie snijdikte, maar dit wordt niet weerspiegeld in de berekening hierboven omdat de nominale sectie snijdikte biologisch het meest relevant zijn is. De gemiddelde cel dikte en de sfeer afmetingen van cel preparaten nageleefd microscopie glas dia's kunnen worden bepaald met behulp van de confocal microscopie of breed-gebied microscopie, waarvoor protocollen kunnen elders worden gevonden. 9 , 10
Representative Results
Verschillende protocollen te bereiden incubatie medium staan de activiteiten van een bepaalde dehydrogenase te onderzoeken. Voor elke dehydrogenase, Los de beursgenoteerde reagentia in het PVA-oplossing met behoud van een temperatuur van ten minste 37 ° C. De reagentia moeten worden opgelost in de volgorde in de tabel, d.w.z. nitroBT is altijd eerst ontbonden en (m) PMS is altijd laatst ontbonden. Elke 5 mg nitroBT opgelost in 40 µL mix (20 µL ethanol + 20 µL dimethylformamide). Alle volumes zijn per 1 mL van 18% PVA-oplossing, die kan worden gebruikt om vlek ~ 2 weefselsecties of ~ 4 cel preparaten op glas dia's. NitroBT, NAD+, NADP+, ADP en substraat oplossingen moeten vers worden gemaakt. NaN3en MgCl2 (m) PMS oplossingen kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C voor een maand. 18% PVA opgelost in fosfaat buffer kan worden achtergelaten bij 60 ° C voor 2 weken. De pH van de oplossing van 18% PVA kan worden ingesteld met behulp van verschillende composities van de 0,1 M kalium Natriumdiwaterstoffosfaat fosfaat (KH2PO4) en 0,1 M Dinatrium waterstof fosfaat (nb2HPO4) buffers. De periodes aangegeven incubatie bieden een goed uitgangspunt, maar de optimale incubatie perioden is afhankelijk van de soort, het weefseltype en het behoud van het weefsel. Cel preparaten moeten in het algemeen, langer dan weefselsecties te verkrijgen van een vergelijkbaar niveau van formazan productie worden geïncubeerd.
Wild-type isocitrate dehydrogenase 1 en 2 (IDH1/2) katalyseren de conversie van isocitrate naar α-ketoglutarate (αKG) met gelijktijdige vermindering van NADP+ te NADPH in het cytoplasma- en mitochondriën, respectievelijk. Deze enzymen hebben onlangs belangstelling omdat IDH1/2 mutaties in diverse soorten menselijke kanker optreden, met inbegrip van primaire hersenenkanker (glioblastoma) en colorectale kanker, en bieden een unieke kans om aan te tonen de mogelijkheden van metabole toewijzing. IDH1 mutaties uitschakelen IDH1 wild-type enzymactiviteit en ook het opwekken van een neo-enzymatische activiteit die tot de productie en de daaropvolgende accumulatie van de oncometabolite D-2 leidt-hydroxyglutarate (D-2 HG),11 die is elders besproken in detail. 12 metabole toewijzing experimenten bleek dat NADP+-afhankelijke IDH1/2 activiteit was beduidend lager in colorectal carcinoom cellen met een klopte-in heterozygoot IDH1 mutatie dan in colorectal carcinoom cellen die waren IDH1 wild-type (figuur 1A). Dit verschil werd gekwantificeerd door beeldanalyse van monochromatisch licht photomicrographs (figuur 1B). 12
Een ander ter illustratie voorbeeld van metabole toewijzing experimenten wordt weergegeven in Figuur 2is een afbeelding van een deel van de cryostaat van muis hersenen die werd ingespoten met menselijke glioblastoma cellen. IDH1/2 is de belangrijkste leverancier van NADPH in menselijke hersenen en haar activiteit is upregulated in wild-type IDH1/2 glioblastoma, terwijl de productiecapaciteit van NADPH voor IDH1/2 veel lager in de hersenen van knaagdieren is. 11 Figuur 2A toont het verschil tussen de hoge NADP+-afhankelijke IDH1/2 activiteit in menselijke glioblastoma cellen en de lage NADP+-afhankelijke IDH1/2 activiteit in de hersenen van de gezonde muis. IDH1/2 activiteit wordt gekwantificeerd als µmol NADPH productie per mL van weefsel per minuut in figuur 2B.
De enzymatische reactie van IDH1/2 is relatief eenvoudig, maar lactaat dehydrogenase (LDH) is een ingewikkelder enzym complex. LDH converteert de reversibele conversie van lactaat naar pyruvaat met gelijktijdige vermindering van NAD+ naar NADH of vice versa. De beschikbaarheid van lactaat en pyruvaat en de samenstelling van het LDH-enzym complex dicteert of lactaat is voornamelijk geconverteerd naar pyruvaat (die wordt gekatalyseerd door LDH-B en levert NADH) of of pyruvaat wordt voornamelijk omgezet in lactaat (die is gekatalyseerd door LDH-A en verbruikt NADH). 13 metabole toewijzing experimenten zijn kunnen visualiseren van de activiteit van de reactie van LDH-B, maar zij zijn "blind" tot de activiteit van de LDH-A reactie omdat NADH productie niet gebeurt en als gevolg daarvan nitroBT niet wordt gereduceerd tot formazan. Figuur 3 toont de NAD+-afhankelijke LDH-activiteit (dat wil zeggen de omzetting van lactaat in pyruvaat) in menselijke hersenen secties in de afwezigheid van substraat (figuur 3A), in aanwezigheid van een hoge concentratie van lactaat (figuur 3B ), in aanwezigheid van 6 mM lactaat (Figuur 3 c) en in aanwezigheid van een lage concentratie van lactaat en geen hogere concentratie van pyruvaat (figuur 3D). De resultaten van deze experimenten illustreren metabole die toewijzing adequaat vangt de NAD+-afhankelijke LDH activiteit in weefselsecties hangt af van de beschikbaarheid van lactaat en pyruvaat in het medium van de reactie.
Figuur 1 . NADP+-afhankelijke IDH1/2 activiteit van menselijke colorectaal carcinoom cellen. (A) representatieve monochromatisch licht photomicrographs HCT116 menselijke colorectaal carcinoom cellen na kleuring voor NADP+-afhankelijke IDH1/2 activiteit tegen 1-10 mM isocitrate en 0,8 mM NADP+. Schaal bars = 50 µm. (B) een kwantificering van de absorptie van blauwe formazan geproduceerde nitroBT door NADP+-afhankelijke IDH1/2 activiteit per cel wordt weergegeven met het gebruik van monochromatisch licht in (A) en beeldanalyse. Afkortingen: IDH1WT/WT, isocitrate dehydrogenase 1 wild-type zijn; IDH1WT/MUT, isocitrate dehydrogenase 1 gemuteerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . NADP+-afhankelijke IDH1/2 activiteit van menselijke glioblastoma monsters. (A) representatieve gekleurd voor een muis hersenen sectie waarin gezonde muis hersenen (h) en een menselijke glioblastoma tumor xenograft (t) na kleuring voor NADP+-afhankelijke IDH1/2 activiteit in aanwezigheid van 0,8 mM NADP+ en 2 mM isocitrate. Schaal bar = 200 µm (B) enzym activiteit kwantificering van gebieden van de hersenen van de muis (h) en menselijke glioblastoma xenograft (t) weergegeven in het (A) het gebruik van de wet van Lambert-Beer. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . NAD+-afhankelijke lactaat dehydrogenase (LDH) activiteit van menselijke hersenen monsters. Representatieve photomicrographs van seriële delen van menselijke hersenen monsters na kleuring voor NAD+-afhankelijke LDH activiteit (A) tegen controlevoorwaarden (in de afwezigheid substraat en pyruvaat, 3 mM NAD+ alleen) (B) lactaat in de afwezigheid van pyruvaat en (D) tegen 6 mM lactaat in aanwezigheid van 18 mM pyruvaat, het vergelijkend productonderzoek remmer van de lactaat-naar-pyruvaat reactie tegen 150 mM lactaat in de afwezigheid van pyruvaat (C) tegen 6 mM. Schaal bar = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Enzym: | G6PDH | LDH | SDH | MDH | IDH1 | IDH2 | IDH3 | 6PGD | GDH |
| PVA 18% in 100 mM fosfaatbuffer | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 8.0 | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 8.0 | 1 mL; pH = 8.0 |
| 5 mM NitroBT | 5 mg/40 µL mix | 5 mg/40 µL mix | 5 mg/40 µL mix | 5 mg/40 µL mix | 5 mg/40 µL mix | 5 mg/40 µL mix | 5 mg/40 µL mix | 5 mg/40 µL mix | 5 mg/40 µL mix |
| 5 mM NaN3 | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | |
| 5 mM MgCl2 | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | |||
| 3 mM NAD+ | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | ||||||
| 0,8 mM NADP | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | ||||
| 2 mM ADP | 10 ΜL | ||||||||
| substraat | 10 mM glucose-6-fosfaat | 150 mM lactaat | 50 mM-succinaat | 100 mM appelzuur | 2 mM isocitrate | 2 mM isocitrate | 2 mM isocitrate | 10 mM 6-phospho-galactonate | 10 mM glutaminezuur |
| 0.32 mM mPMS | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | ||||
| 0.2 mM PMS | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | |||||
| Duur van incubatie | 5 min | 30 min | 60 min | 60 min | 30 min | 30 min | 30 min | 10 min | 30 min |
Tabel 1. Schematisch overzicht van de metabole mapping protocol voor dehydrogenases. Afkortingen: ADP, adenosinedifosfaat; (m) PMS (methoxy) -5-methyl-sulfaat methylphenazinium; nitroBT, nitro tetrazolium blauwe chloride; G6PDH, glucose-6-fosfaat dehydrogenase; LDH, lactaat dehydrogenase; SDH, succinaat dehydrogenase; MDH, malaat dehydrogenase; IDH, isocitrate dehydrogenase; 6PGD, 6-fosfogluconaat dehydrogenase; GDH, Glutamaat dehydrogenase.
Discussion
Onderzoek naar cellulaire metabolisme is een renaissance doormaakt omdat onderzoekers beseffen nu dat metabole effecten cruciaal voor de pathogenese en behandeling van vele ziekten zijn. 1 voorts, metabole onderzoek is gebaat bij een toenemende beschikbaarheid van technieken waarmee dit veld van onderzoek met meer gereedschappen dan ooit, met inbegrip van massaspectrometrie, radioisotopic labeling en nucleaire magnetische resonantie spectrometrie. Metabole toewijzing is in geen geval een nieuwe techniek, maar haar capaciteit te geven van geïntegreerde informatie over de activiteit van enzymen in de situatie van een bijna waar-te-natuur maakt deze techniek relevanter dan ooit. 2
De cofactoren+ NAD en NADP+ zijn te vinden in alle levende cellen, waarmee wordt aangegeven dat de dehydrogenases ontstond heel vroeg tijdens de evolutie en spelen een belangrijke rol hebben in het cellulaire metabolisme. 14 , Momenteel 15 zijn er 523 enzym-gekatalyseerde reacties die worden geclassificeerd als dehydrogenases en optreden in alle soorten. 16 theoretisch, de activiteit van alle verschillende dehydrogenase reacties kan worden afzonderlijk onderzocht door tweaken van het protocol van de metabole toewijzing beschreven hier. Elke enzymatische reactie is uniek door middel van het substraat en cofactoren die nodig zijn voor de activiteit. Dus, de activiteit van elke enzymatische reactie kan worden bepaald met behulp van een metabole toewijzing experiment met de passende substraat en cofactoren in het medium van de reactie. Echter, sommige enzym isoforms verschillen in hun subcellular localisatie, bv een isovorm katalyseert een reactie in het cytoplasma terwijl een ander isovorm functioneert in de mitochondriën. Een opmerkelijk voorbeeld is IDH1 en IDH2, waarvan de eerste cytoplasmatische is en de laatste is mitochondriale en die twee verschillende eiwitten door twee verschillende genen gecodeerd. 11 1-methoxy-5-methylphenazinium methylsulfaat (methoxy-PMS) en 5-methylphenazinium methylsulfaat (PMS) kunnen zowel worden gebruikt als dragers van het elektron voor deze experimenten. De voormalige doorgegeven mitochondriale membranen, de laatste doet niet. Daarom moeten onderzoek naar mitochondriale enzymen (bv IDH2) PMS gebruiken overwegende dat onderzoek naar cytosolische enzymen (bv IDH1) moeten mPMS gebruiken.
Zoals met veel technieken, variaties van dit protocol, zoals het gebruik van verschillende soorten tetrazolium zouten, met uitzondering van de toevoeging van PMS en natriumazide, met behulp van een waterige montage medium, en variëren van incubatie- en spoelmiddelen tijden, bestaan en net zo goed kan werken. De toepassing van metabole mapping met tetrazolium zouten is niet beperkt tot dehydrogenases. Met kleine wijzigingen in het protocol, het kan ook worden gebruikt voor de beoordeling van de activiteit van enzymen die direct functioneren voorafgaand aan een dehydrogenase in een metabolische weg. Wij hebben dit beginsel voor het glutaminase enzym,17 die direct functioneert eerder beschreven stroomopwaarts van Glutamaat dehydrogenase in de glutaminolysis-pathway. 18 in theorie, hetzelfde principe kan worden toegepast op andere enzymen die functie direct downstream- of voorafgaand aan een dehydrogenase bv aconitase, die direct voorafgaand aan de IDH2 en IDH3 in de tricarboxylic acid (TCA ligt) cyclus. Een andere eenvoudige variant van de concentraties die zijn beschreven in tabel 1 is door middel van het maken van incubatie middellange flesjes met verschillende concentraties van substraat, cofactor en/of remmer. Hierdoor is de generatie van de dosis-activiteit bochten als een functie van substraat, cofactor en/of remming concentratie.
Technisch gezien, metabole toewijzing experimenten doen niet vergemakkelijken onbevooroordeelde waarnemingen van in situ enzymactiviteit, omdat onderzoekers hebben om te kiezen van een substraat en cofactor concentratie die niet met de niveaus van het substraat en cofactor overeen mogelijk dat zijn aanwezig in situ. Bovendien, het gebruik van viskeuze 18% PVA in het reactie-medium dient intact te houden macromoleculen, in de plaats en bevestiging maar verbiedt effectieve verspreiding van lage moleculaire gewicht reagentia via de reactie-medium. 3 , 5 daarom, de vastberaden enzym-activiteiten in de hier beschreven experimenten die gebruikmaken van supraphysiological substraat concentraties komen niet overeen met de in vivo situatie op een bepaald substraat concentratie maar zijn geschikt voor intra experimentele vergelijkingen. Dus is het resultaat van metabole toewijzing experimenten de productiecapaciteit (maximale activiteit) van een enzymatische reactie in het kader van het substraat en cofactor niveaus die aanwezig in situ. Bovendien, het gebruik van verschillende concentraties van substraat en/of cofactoren en meerdere monsters kunt objectieve vergelijking van de maximale productiecapaciteit (Vmax) en affiniteit (Km) van een enzym voor een substraat/cofactor in cel preparaten , weefsels of weefsel regio's. Deze parameters zijn het resultaat van de som van enzym eiwit expressie, posttranslationele modificaties en het effect van een overvolle communicatie op de activiteit van enzymen. Daarom, metabole toewijzing is nog steeds een betere weerspiegeling van de enzymactiviteit dan experimenten die bepalen eiwit expressie of gezuiverd enzym activiteit in vitro.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
R.J.M. wordt ondersteund door een AMC PhD Scholarship. Dit onderzoek werd gesteund door de Nederlandse Cancer Society (KWF grant UVA 2014-6839). Dr. A. Jonker de auteurs bedanken voor zijn hulp met het schrijven van het protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| D-Glucose 6-phosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | G7879 | |
| Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4) | Merck Millipore | 106559 | |
| di-Sodium succinate | Sigma-Aldrich | W327700 | |
| DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | I1252 | |
| D-Malic acid | Sigma-Aldrich | 2300 | |
| Glycerol Gelatin | Sigma-Aldrich | GG1 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| Lithium 6-phospho-D-galactonate | Sigma-Aldrich | 55962 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| methoxy-Phenazine methosulfate | Serva | 28966.01 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N0505 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | NADP-RO | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Phenazine methosulfate | Serva | 32030.01 | |
| Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed | Sigma-Aldrich | P1763 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck Millipore | 104873 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Bandpass filter | Edmund optics | https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/ | |
| Grey-step wedge | Stouffer Industries | http://www.stouffer.net/TransPage.htm |
References
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metab. 23 (1), 27-47 (2016).
- Van Noorden, C. J. Imaging enzymes at work: metabolic mapping by enzyme histochemistry. J Histochem Cytochem. 58 (6), 481-497 (2010).
- Mcmanus, L. M., Mitchell, R. N. Pathobiology of Human Disease. , Elsevier. 3760-3774 (2014).
- Chieco, P., Jonker, A., De Boer, B. A., Ruijter, J. M., Van Noorden, C. J. Image cytometry: protocols for 2D and 3D quantification in microscopic images. Prog Histochem Cytochem. 47 (4), 211-333 (2013).
- Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. Enzyme histochemistry : a laboratory manual of current methods. , Oxford University Press, Royal Microscopical Society. (1992).
- Van Noorden, C. J. F., Butcher, R. G. Histochemistry, theoretical and applied. Vol 3.: enzyme histochemistry. Stoward, P. J., Pearse, A. G. E. , Churchill Livingstone. 355-432 (1991).
- Van Noorden, C. J., Tas, J., Vogels, I. M. Cytophotometry of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual cells. Histochem J. 15 (6), 583-599 (1983).
- Butcher, R. G. The measurement in tissue sections of the two formazans derived from nitroblue tetrazolium in dehydrogenase reactions. Histochem J. 10 (6), 739-744 (1978).
- Matsumoto, B. Cell biological applications of confocal microscopy. , Elsevier. (2002).
- Errington, R. J., White, N. S. Measuring dynamic cell volume in situ by confocal microscopy. Methods Mol Biol. 122, 315-340 (1999).
- Molenaar, R. J., Radivoyevitch, T., Maciejewski, J. P., van Noorden, C. J., Bleeker, F. E. The driver and passenger effects of isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations in oncogenesis and survival prolongation. Biochim Biophys Acta. 1846 (2), 326-341 (2014).
- Molenaar, R. J., et al. Radioprotection of IDH1-Mutated Cancer Cells by the IDH1-Mutant Inhibitor AGI-5198. Cancer Res. 75 (22), 4790-4802 (2015).
- Khurshed, M., Molenaar, R. J., Lenting, K., Leenders, W. P., van Noorden, C. J. F. In silico gene expression analysis reveals glycolysis and acetate anaplerosis in IDH1 wild-type glioma and lactate and glutamate anaplerosis in IDH1-mutated glioma. Oncotarget. 8 (30), 49165-49177 (2017).
- Alberts, B. Molecular biology of the cell. , Sixth, Garland Science, Taylor and Francis Group. (2015).
- Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, G. J., Stryer, L. Biochemistry. , Eighth edition, W.HFreeman & Company, a Macmillan Education Imprint. (2015).
- Webb, E. C. International Union of Biochemistry and Molecular Biology. Enzyme nomenclature 1992 : recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes. , Published for the International Union of Biochemistry and Molecular Biology by Academic Press (1992).
- Botman, D., Tigchelaar, W., Van Noorden, C. J. Determination of Phosphate-activated Glutaminase Activity and Its Kinetics in Mouse Tissues using Metabolic Mapping (Quantitative Enzyme Histochemistry). J Histochem Cytochem. 62 (11), 813-826 (2014).
- van Lith, S. A., et al. Glutamate as chemotactic fuel for diffuse glioma cells: are they glutamate suckers? Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 66-74 (2014).
