Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, das verwendet werden kann, zu mikroskopisch visualisieren und Aktivität des Dehydrogenases in Zellen und Geweben und die Kinetik, Funktion und subzelluläre Lokalisation zu quantifizieren.
Abstract
Veränderten zellulären Stoffwechsel ist ein Markenzeichen von vielen Krankheiten, einschließlich Krebs, Herz-Kreislauf-Krankheiten und Infektionen. Die metabolische Motoreinheiten der Zellen sind Enzyme und deren Aktivität ist stark reguliert, auf vielen Ebenen, einschließlich der transkriptionellen, mRNA Stabilität, translationale, Post-translationalen und funktionalen Ebene. Diese komplexe Verordnung bedeutet, dass herkömmliche quantitative oder bildgebenden Assays, wie quantitative mRNA Experimente, Western Blots und Immunohistochemistry, unvollständigen Informationen über die ultimative Aktivität der Enzyme, deren Funktion ergeben und/oder Ihre subzelluläre Lokalisation. Quantitative Enzym Cytochemistry und Histochemie (z. B. metabolische Mapping) Aufschluss eingehenden darüber, in Situ enzymatische Aktivität und die Kinetik, Funktion und subzelluläre Lokalisation in einer fast True-to-Nature-Situation.
Wir beschreiben ein Protokoll, um die Aktivität der Dehydrogenases, zu erkennen, die Enzyme sind, die Redox-Reaktionen zur Reduzierung von Co-Faktoren wie NAD(P)+ und FAD durchführen. Zellen und Gewebe Abschnitte werden in einem Medium inkubiert, die spezifisch für die enzymatische Aktivität eine Dehydrogenase ist. Anschließend führt der Dehydrogenase, die Gegenstand der Untersuchung ist, seine enzymatische Aktivität in seinem subzelluläre Aufstellungsort. In einer chemischen Reaktion mit dem Reaktionsmedium erzeugt dies letztlich blau gefärbten Formazan am Standort der Dehydrogenase-Aktivität. Die Formazan Extinktion ist somit ein direktes Maß für die Dehydrogenase-Aktivität und mit monochromatisches Licht Mikroskopie und Bildanalyse quantifiziert werden kann. Der quantitative Aspekt dieses Protokolls ermöglicht Forschern aus diesen Tests statistische Schlüsse zu ziehen.
Neben Beobachtungsstudien kann diese Technik für Studien der Hemmung von bestimmten Enzymen verwendet werden. In diesem Zusammenhang Studien profitieren von den True-to-Nature-Vorteilen des metabolischen Mapping kann in Situ Ergebnisse geben, die physiologisch relevanter als in-vitro- Enzym Hemmung Studien sein. Alles in allem ist metabolische Zuordnung eine unverzichtbare Technik, Stoffwechsel Ebene der zellulären oder Gewebe zu studieren. Die Technik ist einfach zu verabschieden, fundierte, umfassende und integrierte metabolische informiert und ermöglicht schnelle Quantitative Analyse.
Introduction
Stoffwechsel ist ein wesentlicher Eckpfeiler der Zellphysiologie. Stoffwechsel versorgt die Zellen mit Energie für alle physiologischen Prozesse, liefert die Bausteine für Makromolekulare Biosynthese und regelt die zelluläre Homöostase in Bezug auf Abfallprodukte, toxische Moleküle und die Demontage und Recycling von unnötig oder dysfunktionalen Zellkomponenten. Enzyme fast alle wichtige zelluläre Chemische Reaktionen katalysieren und daher sind die motorischen Einheiten in der Physiologie der Zellen. 1 , 2
Die Aktivität von Enzymen ist streng reguliert, auf vielen Ebenen und quantitative Enzym Histochemie und Cytochemistry (auch metabolische Mapping genannt) ist daher die bevorzugte Methode, Enzym-Aktivität in Situzu studieren. Auf transkriptioneller Ebene wird die Genexpression in mRNA geregelt. Die Wirkung der Regulierung der Transkription kann durch quantitative mRNA-Assays, wie qualitative mRNA-Assays, z. B. in-Situ -Hybridisierung, die Informationen über die (Teil-) zelluläre Microarrays oder direkte RNA Sequenzierung bestimmt werden Lokalisierung von mRNA-Moleküle. Dies macht es möglich, relative Unterschiede in transkriptionelle Aktivität zwischen den Zellen zu schätzen. Jedoch ist die Auslegung und Gültigkeit dieser mRNA-Assays in Bezug auf die Stoffwechselaktivität kompliziert, weil Verordnung tritt auch auf der mRNA-Ebene, wo Sequenz und die Stabilität der mRNA-Moleküle bearbeitet werden, nachdem es von der DNA transkribiert wird. Diese Bearbeitung regelt Protein Isoform Übersetzung und Protein Übersetzung Menge an den Ribosomen. Darüber hinaus der Prozess der Protein-Übersetzung wird kontrolliert und schließlich betrifft enzymexpression und damit Aktivität. Die kombinierte Wirkung der oben genannten rechtlichen Schritte können geschätzt werden, mithilfe von quantitativen Protein Ausdruck Assays, wie Western Blot oder umgekehrter Phase Protein lysate Microarrays oder qualitative Protein Ausdruck Assays, wie Immunocytochemistry und Immunohistochemistry, aber diese Techniken nicht nachgelagerten regulatorische Effekte wie z. B. Post-translationale Modifikation von Proteinen und der funktionelle Regulation der Enzyme in den überfüllten Mikroumgebung zu integrieren. Darüber hinaus kann der Ausdruck eines Enzyms schlecht mit seiner Aktivität korrelieren, so dass Messungen der Aktivität eines gereinigten Enzyms in Zelle oder eines Gewebes Homogenates oder in verdünnten Lösungen für Enzym-Aktivität Studien am meisten benutzt sind. Aber nicht diese Experimente, den Einfluss eines überfüllten Abteilen Zytoplasma oder Organellen auf die Aktivität eines Enzyms zu replizieren. Darüber hinaus alle oben genannten Techniken die Menge oder die Lokalisierung von mRNA oder Enzym Ausdruck festlegen, aber sind nicht in der Lage, umfassende Informationen über diese beiden Aspekte von enzymexpression, geschweige denn die Integration dieser zu geben Informationen mit Enzym-Aktivität-Bestimmungen. 2 , 3 , 4
Metabolische Mapping erlaubt es, die Wertschätzung aller von den oben genannten Variablen, die die Aktivität eines Enzyms zu ermitteln. Darüber hinaus ist metabolische Zuordnung eine Form von lebenden Zellen oder Gewebe Bildgebung mit Zellen und Geweben, die während der Analyse eine fast True-to-Nature-Situation um Daten der Aktivität von Enzymen zu generieren generieren intakt gehalten werden. Es produziert Bilder, die sowohl die detaillierte Aufwertung des Standortes der Enzym-Aktivität sowie robuste Quantifizierung der Enzym-Aktivität innerhalb einer Zelle oder eines Gewebes Fach zu erleichtern. 3 , 4 die Protokolle, die hier beschriebenen für metabolische Zuordnung der Tätigkeit des Dehydrogenases basieren auf den Labor-Handbuch aller verfügbaren Enzym histochemische Methoden,5 auf den Grundsätzen der quantitativen Enzym Histochemie,6 und auf Bildanalyse von quantitativen metabolische Zuordnung. 4
Dehydrogenases sind Enzyme, die Redox-Reaktionen bzw. Verringerung des kanonische Cofaktoren wie+NAD, NADP+ und FAD, NADPH, NADH und FADH2, durchzuführen. Intakte Zellen oder Gewebeschnitten Kryostat, die chemisch nicht behoben werden werden in einem Reaktionsmedium inkubiert enthält unter anderen Reagenzien, Substrat und Cofaktoren eine spezifische Dehydrogenase und eine Tetrazolium-Salz. Anschließend die Dehydrogenase führt seine katalytische Aktivität und zum Beispiel+ NADP zu NADPH reduziert. Über ein Elektron Träger reduzieren 2 NADPH Moleküle letztlich 1 wasserlösliche Semi-farblose tetrazoliumsalz Salz Molekül in 1 wasserunlöslichen blauen Formazan-Molekül, das sofort auf der Website der Dehydrogenase ausfällt. Daher die Extinktion der ausgefällten Formazan ist ein direktes Maß für die lokale Aktivität eine Dehydrogenase und kann Lichtmikroskopie beobachtet werden oder quantifiziert mit monochromatisches Licht Mikroskopie und Bildanalyse. Der quantitative Aspekt dieses Protokolls ermöglicht Forschern aus diesen Tests statistische Schlüsse zu ziehen. Diese Quantifizierung erleichtert darüber hinaus die Bestimmung der in Situ kinetische Enzym Parameter, wie z. B. die maximale Enzymaktivität (Vmax) und Affinität eines Substrats für ein Enzym (Km). 3 , 4 , 5 , 6
Wenn Sie eine metabolische Mapping Experiment planen, ist es wichtig zu erkennen, dass pro Versuch, maximal 50 Objektträger mit anhaftenden Zelle Vorbereitungen oder Gewebeschnitte werden empfohlen, um zeitliche Verzögerungen während der Inkubation zu minimieren, um konsistent zu erhalten Ergebnisse. Es ist möglich, weitere Dias bzw. mittlere Kompositionen zu verarbeiten, wenn diese Protokoll-Schritte durch mehr als ein Experimentator kooperativ durchgeführt werden. Darüber hinaus besteht eine Variabilität zwischen Experimente. Daher identische Experimente sollten mindestens 3 Mal mit Cytospins von jeder Zelle Vorbereitung oder Abschnitte aus jede Gewebeprobe wiederholt werden und entsprechende Kontrollen in jedem Experiment aufgenommen werden sollten. Bereiten Sie immer eine Inkubation Steuermedium in Abwesenheit des Substrats aber im Beisein von Cofaktoren zu steuern für unspezifische Enzym Aktivität Färbung. Die repräsentativsten Ergebnisse in Experimenten wo verschiedene Substrat/Cofaktor Konzentrationen Gewebeschnitte oder Zelle Zubereitungen aus der gleichen Probe gelten damit der Experimentator Enzym Kinetik mit Analysen durchführen können Dosis-Aktivität Kurven.
Protocol
Dieses Protokoll folgt den Richtlinien über die Verwendung von menschlichem Material des medizinisch-ethische Review Board of Academic Medical Center.
1. Vorbereitung der Zellen oder Gewebeschnitten
- Zellen
- Trypsinize Zellen von Kultur Gerichte mit 1 mL Trypsin-EDTA 0,25 % für 5 min bei 37 ° C in einem 10 mm Petrischale und Zellen in einer 37 ° C Suspension von 50.000-200.000 Zellen/mL, abhängig von der Größe der Zellen zu bringen.
- Fügen Sie 200 µL Zellsuspension auf Mikroskopie Folien mit Cytospin Trichter in einem Cytocentrifuge bei 20 X g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Trocknen Sie die Cytospins für 24 h bei Raumtemperatur an der Luft. Dies betrifft keine Dehydrogenase-Aktivität. 5
- Gewebeschnitte
- Gewebe von Patienten oder Tiere nach ethischen Genehmigungen zu extrahieren. 10 mm3 des Gewebes reicht für mehrere Experimente.
- Legen Sie die Teile des Gewebes in kleinen belüftete 2 mL Kunststoff Flaschen und Snap-Freeze die Fläschchen mit dem Stück des Gewebes in flüssigem Stickstoff.
- Speichern Sie die Fläschchen mit Gewebe Stücke bei −80 ° C bis zu Weiterverarbeitung.
- Verwenden Sie eine Gel-artige Datenträger mit der Bezeichnung optimale Arbeitstemperatur (OCT), um die Gewebeprobe auf ein Futter, das schnell bis zu-20 ° C bis-25 ° C gefriert zu montieren, so dass Wasser Kristalle bilden kann.
- Verwenden Sie einen Kryostaten für Schneid- und zuerst den Block auf das gewünschte Niveau Trimmen (idealerweise halb so breit wie eine Mikroskopie Glas-Folie, z.B. 5 x 5 mm).
- Verwenden Sie beim Schneiden Pinsel und eine Anti-Roll-Platte um zu verhindern, dass die Abschnitte Eisstockschießen nach oben.
- Gewebeproben in 6 bis 10 µm Dicke Abschnitte eine langsame, aber stetige Geschwindigkeit schneiden (1 s pro Abschnitt). Wenn ein Abschnitt richtig geschnitten wird, bleibt es flach auf dem Mikrotom Messer unter der Anti-Roll-Platte.
- Nehmen Sie 1-3 Abschnitte auf mikroskopischen Objektträger und bis zur Verwendung bei −80 ° C lagern. Die Anzahl der Abschnitte vorbereitet richtet sich nach der Größe der Gewebeprobe und die gewünschte Dicke der Abschnitte.
(2) Enzym Histo/Cytochemistry für lösliche Dehydrogenases
- Vorbereitung Reaktion Puffer.
- 100 mL Phosphatpuffer von den korrekten pH-Wert vorzubereiten (siehe Tabelle 1; jedes Enzym hat einen optimalen pH, an dem ihre Tätigkeit die höchste ist). Z. B. Mischen Sie Lösungen von 0,1 M KH2PO4 (sauer) und 0,1 M NA2HPO4 (unverwässert), bis ein Puffer mit den korrekten pH-Wert erfolgt.
- Wiegen Sie 18 g von Polyvinylalkohol (PVA) in den Phosphatpuffer unter einem Abzug, wie PVA staubig und giftig ist.
- Auflösen der 18 % w/V PVA in Phosphatpuffer bei 100 ° C durch die Erwärmung des Puffers au Bain Marie (die Glasflasche in kochendes Wasser legen) und rühren, bis die PVA vollständig gelöst ist. Die Lösung wird dann mit kleinen Luftblasen transparent, die durch das Rühren entstehen. Es erfordert in der Regel ca. 15 min für die PVA aufzulösen.
Hinweis: Die 18 % w/V PVA in Phosphatpuffer ist zähflüssig und lässt sich auf 15 mL Puffer Reaktionsgefäßen mit einer breiten Pipette übertragen. Kurzfristiger Lagerung von 18 % w/V PVA in Phosphatpuffer tritt bei ≥40 ° C und langfristige Lagerung (bis zu 2 Wochen) bei ≥ 60 ° C. 250 µL von 18 % w/V PVA in Phosphatpuffer ist in der Regel für eine Cytospin Vorbereitung erforderlich, während 500 µL für eine Gewebe-Abschnitt erforderlich ist.
- Auflösen der 18 % w/V PVA in Phosphatpuffer bei 100 ° C durch die Erwärmung des Puffers au Bain Marie (die Glasflasche in kochendes Wasser legen) und rühren, bis die PVA vollständig gelöst ist. Die Lösung wird dann mit kleinen Luftblasen transparent, die durch das Rühren entstehen. Es erfordert in der Regel ca. 15 min für die PVA aufzulösen.
- Bereiten Sie tetrazoliumsalz Salz (NitroBT) Lösung. Für jeden 1 mL der Inkubation Medium 40 µL NitroBT Lösung ist erforderlich, bestehend aus 5 mg NitroBT (ein hellgelbes Pulver) aufgelöst in einer Mischung aus 20 µL Dimethylformamid (DMF) und 20 µL Ethanol, die eine leichte gelbe transparente Lösung sein wird.
Hinweis: Da die Stabilität des NitroBT die niedrigste von allen notwendigen Reagenzien ist, empfiehlt es NitroBT Vorratslösung letzten vorzubereiten und die NitroBT zuerst in dem Reaktionsmedium auflösen.- NitroBT in DMF und Ethanol durch Erhitzen in einer Glasflasche in kurzer Zeit auflösen (~ 10 s) mit dem Bunsenbrenner. Schütteln Sie das Fläschchen beim Heizen und lassen Sie die Durchstechflasche zu lange in der Flamme um Verdunstung zu verhindern.
- Machen 10 % zusätzliche NitroBT Lösung, um die Verdunstung von DMF und Ethanol bei der Auflösung zu ermöglichen.
- Schild der Elektronen Träger phenazinderivat Methosulfate (PMS) oder (1-Methoxy)-phenazinderivat Methosulfate (Komponenten) und Inkubation Medien mit m(PMS) von direktem Lichteinfall durch Alufolie umwickeln, um Speicher glasphiole.
- Bereiten Sie Reagenzlösungen gemäß Tabelle 1 vor , indem man sie in destilliertem H2O. Einige Reagenzien schnell untergehen, so bereiten sie so kurz vor dem Experiment wie möglich. Halten Reagenzlösungen auf Eis oder bei 4 ° C bis zur Verwendung.
- Bereiten Sie Inkubation Medien vor, wie in Tabelle 1 dargestellt und homogenisieren Sie die Lösung nach jedem Schritt durch sanftes rühren zu. Vermeiden Sie die Generierung von Luftblasen in der Inkubation Medium durch Rühren und halten den Spatel unter der Oberfläche des Mediums Inkubation unter Rühren.
- Gewebeschnitte Inkubation Medium zuweisen
- Pre-warme Mikroskopie gleitet mit Cytospins oder Gewebeschnitte angebracht bei 37 ° C in einer Immunohistochemistry Inkubation Kammer für 15 min. Tauchen der Boden der Kammer Immunohistochemistry Inkubation mit warmem Wasser weiterhin eine Konstante Temperatur in der Inkubator.
- Sorgfältig zu brechen Sie oder Sägen Sie Pasteur Pipetten am Übergang von der schmalen, der Breite Teil ab. Regelmäßige Pasteur Pipetten sind zu schmal, um das zähflüssige Inkubation Medium Aspirieren, so dass dieser Schritt erforderlich ist, zu Pasteur Pipetten breit genug für die Aspiration des Mediums Inkubation.
- Wenden Sie 250-500 µL des Mediums entsprechende Bebrütung auf jeder Zelle Vorbereitung oder Gewebe Abschnitt auf Mikroskopie-Folien mit dem breiten Teil des einer Pasteurpipette an.
- Verwenden Sie die PIPETTENSPITZE um die Inkubation Medium gleichmäßig zu verteilen. Ignorieren Sie kleine Luftblasen in der Inkubation Medium, weil diese an die Oberfläche schwimmen und nicht die enzymatische Reaktion in der Zelle Vorbereitung oder Gewebe-Sektion auf der Mikroskopie-Folie beeinträchtigt.
- Einer vorgegebenen Dauer, je nach der Enzym-Kinetik und ihren Ausdruck in einer bestimmten Zelle Zubereitung der Zelle Vorbereitungen oder Gewebeschnitte auf die Mikroskopie-Folien im Inkubator (z. B. einer Gewebekultur Inkubator) 37 ° C inkubieren oder Gewebe (Tabelle 1). Halten Sie den Deckel der Immunhistochemie Inkubation Kammer geschlossen, um eine feuchte Umgebung um zu verhindern, dass die Reaktion Puffer Austrocknen zu pflegen.
- Waschen Sie die Mikroskopie-Folien
- Tippen Sie auf überschüssige Inkubation Medium auf Gewebe.
- Mechanisch abspülen der Inkubation Medium aus der Mikroskopie-Folien in 60 ° C Phosphatpuffer pH 5,3, durch Verschieben der Mikroskopie-Folien nach oben und unten in den Puffer. Dadurch wird verhindert, die enzymatische Reaktion.
- Waschen Sie die Mikroskopie-Folien, indem man sie in 60 ° C Phosphatpuffer pH 5,3 für 20 min.
- Mechanisch waschen Sie die Mikroskopie-Folien in Leitungswasser 60 ° C.
- Waschen Sie die Mikroskopie-Folien, indem man sie in Leitungswasser 60 ° C für 20 min.
- Lassen Sie das Wasser und Folien durch das Mischen von Wasser aus dem Wasserhahn mit Wasser aus dem Wasserhahn 60 ° C Raumtemperatur langsam im Laufe von 1 Minute abkühlen.
- Führen Sie eine abschließende mechanische Waschschritt in Raumtemperatur destilliertes Wasser.
- Schließen Sie den gefärbten Cytospins oder Gewebeschnitte auf Mikroskopie Folien
- Eine Folie wärmer bei 50-60 ° c Vorwärmen
- Vorsichtig trocknen Sie die Rückseite der Mikroskopie Folien mit einem Papiertuch und legen Sie sie auf der Folie wärmer an die Oberseite der Mikroskopie Folie trocknen.
- Wenn Sie die Folien trocken sind, fügen Sie Zelle Vorbereitungen oder Gewebeschnitte auf Mikroskopie Folien mit Glycerin Gelee Eindeckmittel und Deckgläsern.
- Speichern Sie die Zelle Vorbereitungen oder Gewebe Abschnitte Mikroskopie Folien im Dunkeln im Kühlschrank bei 4 ° C oder gehen Sie sofort mit Bildaufnahme.
3. die Bildaufnahme
- Aufnahme von Bildern mit einer wissenschaftlichen monochrome CCD-Kamera mit genügend Dynamikumfang (mindestens 8-Bit aber vorzugsweise 10-Bit oder 12 Bit), festen Gewinn und eine lineare Reaktion.
- Wählen Sie eine richtige Ziel (20 X-63 X für Cytospins) und 10-63 X für Gewebeschnitten.
- Blendung durch die Verengung der Leuchtfeldblende, so dass es etwas größer als das Sichtfeld.
- Monochromatisches Licht durch die Anwendung einer 10 nm breite Inferenz Bandpassfilter in der Nähe der Isobestic Wellenlänge der Formazan Niederschlag7 in Kombination mit einer Infrarot-Blockierung Filtern (siehe Materialtabelle) Verwendung.
Hinweis: Die maximale Isobestic-Absorption des NitroBT befindet sich in 585 nm. - Optimierung der Beleuchtung um sicherzustellen, dass die gesamte graue Pegelbereich der Kamera verwendet wird (d. h. die Beleuchtungsstärke so eingestellt, dass maximale Ausleuchtung erreicht ist, ohne übermäßig auszusetzen, wenn Sie einen leeren Objektträger aufnehmen).
- Gemessenen Graustufen zu bekannten Extinktion (oder optische Dichte [OD]) Werte zu kalibrieren. Zu diesem Zweck erfassen Graustufen-Bilder von mindestens 10 verschiedenen Schritten einer Kalibrierungs-Dias oder Schritt tablet mit bekannten OD-Werte (siehe Punkt 4.1.1), entweder im Handel erhältlich (siehe Materialtabelle) oder Messen einen maßgeschneiderte Grauskala Keil Schritt Tablet durch einen Densitophotometer und verwenden Sie die Ergebnisse zur Kalibrierung gemessen grau auf bekannten Absorption Werte.
- Mikrofotos von Zellen oder Gewebe Abschnitte von Interesse zu erfassen.
(4) Bildanalyse
- Kalibrieren Sie vor der Bildanalyse die ImageJ-Software zur Messung der Extinktion.
- Die Extinktion (OD) der Mikrofotos von mindestens 10 Kalibrierung Gebieten mit bekannten Extinktion Parameter in die Kalibrierung Folie oder Schritt-Tablette mit bekannten OD-Werte zu messen. Verwenden Sie in ImageJ die Analyze → Maßnahme Menü oder Hotkey STRG + M um einen ausgewählten Bereich zu messen.
- Starten die Extinktion Kalibrierung zu analysieren → Kalibrierung. Wählen Sie die Funktion "Rodbard (NIH Image)". In der linken Spalte des Fensters, das geöffnet wird, sind die Ergebnisse der grauen Messungen von jedem Schritt der Kalibrierung Folie/Schritt Tablette in 4.1.1 durchgeführt bereits vorhanden. Wenn dies nicht der Fall ist, kopieren Sie sie aus dem Ergebnisbildschirm ImageJ. Geben Sie in der rechten Spalte jeder entsprechenden bekannten Extinktion Wert gedruckt auf dem Zertifikat erhalten Sie mit dem kalibrierten Schritt Tablet. Kreuzen Sie Boxen "globale Kalibrierung" und "Show-Plot" und drücken Sie "OK".
- Für die Qualitätskontrolle, stellen Sie sicher, die R-2 der Rodbard Funktion ist > 0,99. Wenn es ist < 0,99, überprüfen Sie, ob die Kalibrierung Dias fotografiert und richtig gemessen wurden und ob die bekannten Extinktion Parameter richtig eingegeben wurden.
- ImageJ ist nun kalibriert, bis Sie das Programm schließen (daher "Global-Kalibrierung"). Für Absorption Messungen einer kalibrierten ImageJ-Sitzung immer wandelt, die beobachteten Extinktion auf Werte zwischen 0 und 1, wobei 0 bedeutet, 1 sind die Asymptoten von NULL und vollständige Absorption, bzw..
- Wählen Sie für Cytospins, > 100 Einzelzellen in zufälliger Weise. Wählen Sie für Gewebekapitel ein oder mehrere Felder des Interesses der eine feste Länge und Breite in allen Bereichen.
- Projekt ein Raster über die Vergößerung, unvoreingenommene Zelle Auswahl zu unterstützen. In ImageJ Projekt ein Raster über ein Bild über die Plugins → analysieren → Raster Menü.
- Verwenden Sie in ImageJ elliptischen Werkzeug, um einzelne Zellen auswählen und verwenden Sie das Rechteck-Werkzeug um Gewebe Regionen auswählen.
- Messen Sie die Absorption und Bereich der ausgewählten Zellen oder Gewebe Regionen. Die optische Dichte und Bereich nennt man "Bedeuten" und "Area" in der ImageJ Ergebnisse Tabelle bzw..
Hinweis: Die totale Absorption einer Zelle oder eines Gewebes Region (wenn Sie mehrere Gewebe Regionen mit unterschiedlichen Größen ausgewählt haben) ist gleich der Summe aller getrennt Pixel Absorptionswerte. Wenn eine Zelle von 1000 Pixel abgebildet ist, dann die totale Absorption ergibt sich aus der Summe von 1000 Absorptionswerte und die mittlere Absorption wird durch totale Absorption/1000 gegeben. Dieses Verfahren wird auch Verteilungswirkungen Fehler vermieden. - Bestimmen Sie die durchschnittliche totale Absorption von > 30 Zellen oder Gewebe Regionen von Kontrolle Foliennummer, enthält eine Probe, die ausgesetzt wurde, um Inkubation Medium in Abwesenheit des Substrats aber im Beisein von Cofaktoren zu kontrollieren. Diese Kontrolle Extinktion dient zur Kontrolle für unspezifische Enzym Aktivität Färbung und Extinktion Artefakte durch die verwendeten Mikroskopie Folien, Montage, Medium, Deckglas oder Mikroskop induziert.
- Subtrahieren Sie die durchschnittliche Kontrolle Absorption von allen total Absorption Messungen von Proben, die Inkubation Medium mit der gleichen Konzentration der Cofaktor (aber unterschiedlichen Konzentrationen von Substrat und/oder Inhibitor) ausgesetzt waren. Dadurch werden die korrigierten totale Absorption einer Zelle oder eines Gewebes Region.
- Vergleichen Sie statistisch die durchschnittliche korrigierte total Absorptionswerte mit der Student T-Test oder One-Way ANOVA-Test, je nach Ihrem experimentellen Design.
- Formazan Absorption kann umgebaut werden Enzym-Aktivität (umgerechnet µmol Substrat pro mL / min.) verwenden das Gesetz von Lambert-Beerschen: c=A/(є×d), wo c ist die Konzentration von Formazan in dem Reaktionsmedium, A ist die gemessene Extinktion in ImageJ nach der Kalibrierung; Є ist vom Aussterben bedroht-Koeffizient von Formazan (16.000 auf 585 nm)8 und d ist das Licht Reisen Distanz, die die durchschnittliche Zelle Dicke oder nominale Abschnitt Schnittstärke (6 bis 10 µm in diesem Protokoll) entspricht.
Hinweis: Nach dem Trocknen verringert Gewebe Schnittdicke ca. 50 % von der nominalen Abschnitt Schnittstärke, aber dies spiegelt sich nicht in die Berechnung oben weil die nominalen Abschnitt Schnittstärke biologisch am relevantesten ist. Die durchschnittliche Zelle Dicke und Kugel Dimensionen der Zelle, die Mikroskopie-Glas-Objektträger Präparaten eingehalten können bestimmt werden, mit der konfokalen Mikroskopie oder Weitfeld-Mikroskopie, für die Protokolle an anderer Stelle gefunden werden können. 9 , 10
Representative Results
Mehrere Protokolle Inkubation Medium vorbereiten werden angezeigt, um die Aktivität einer bestimmten Dehydrogenase zu untersuchen. Für jede Dehydrogenase Auflösen der gelisteten Reagenzien in der PVA-Lösung unter Beibehaltung einer Temperatur von mindestens 37 ° C. Die Reagenzien in der Reihenfolge in der Tabelle aufgeführten aufgelöst werden sollte, d.h. NitroBT wird immer zuerst aufgelöst und (m) PMS ist immer zuletzt aufgelöst. Jeweils 5 mg NitroBT ist in 40 µL-Mischung (20 µL Ethanol + 20 µL Dimethylformamid) aufgelöst. Alle Bände sind pro 1 mL 18 % PVA-Lösung, die zum Fleck ~ 2 Gewebeschnitte oder ~ 4 Zelle Vorbereitungen auf Objektträgern verwendet werden kann. NitroBT, NAD+, NADP+, ADP und Substrat Lösungen sollten frisch gemacht werden. NaN3, MgCl2 und (m) PMS Lösungen können für einen Monat bei 4 ° C gelagert werden. 18 % PVA aufgelöst in Phosphat Puffer kann bei 60 ° C für 2 Wochen gelagert werden. Der pH-Wert der Lösung 18 % PVA kann über unterschiedliche Zusammensetzungen von 0,1 M Kalium Dihydrogen Phosphat (KH2PO4) und 0,1 M binatrium Wasserstoff Phosphat (NA2HPO4) Puffer eingestellt werden. Die gezeigten Inkubationszeiten bieten gute Ansatzpunkte, aber die optimale Inkubationszeiten hängen von den Arten, den Gewebetyp und den Erhalt des Gewebes. Zelle Vorbereitungen sollten in der Regel länger als Gewebeschnitte auf ein ähnliches Niveau der Formazan Produktion zu erhalten inkubiert werden.
Wildtyp Isocitrate Dehydrogenase 1 und 2 (IDH1/2) katalysieren die Umwandlung von Isocitrate in α-Ketoglutarate (αKG) mit gleichzeitiger Reduzierung der+ NADP zu NADPH im Zytoplasma und Mitochondrien, beziehungsweise. Diese Enzyme haben vor kurzem erregte, weil IDH1/2 in verschiedenen Arten von Krebserkrankungen Mutationen, einschließlich primäre Hirntumoren (Glioblastom) und kolorektales Karzinom, und bieten eine einzigartige Gelegenheit, die Möglichkeiten des metabolische Zuordnung. IDH1 -Mutationen IDH1-Wildtyp Enzym-Aktivität zu deaktivieren und auch induzieren eine Neo-Enzymaktivität, das führt zu die Produktion und anschließende Akkumulation von Oncometabolite D-2-Hydroxyglutarate (D-2-HG),11 , an anderer Stelle erläutert ausführlich. 12 metabolische Zuordnung Experimente zeigten, dass NADP+-abhängige IDH1/2 Aktivität war signifikant niedriger in kolorektalen Karzinomzellen mit einer klopfte in heterozygoten IDH1 Mutation als in kolorektalen Karzinomzellen, die IDH1 Wildtyp (Abbildung 1A). Dieser Unterschied wurde durch die Bildanalyse von monochromatisches Licht oberflächenmustern (Abbildung 1 b) quantifiziert. 12
Ein weiteres Beispiel zur Veranschaulichung metabolische Zuordnung Experimente zeigt Abbildung 2, die ein Bild von einem Kryostat Abschnitt des Gehirn der Maus, die mit menschlichen Glioblastom-Zellen injiziert wurde. IDH1/2 ist der wichtigste Anbieter von NADPH im menschlichen Gehirn und seine Tätigkeit hochreguliert in Wildtyp IDH1/2 Glioblastom, während die NADPH-Produktionskapazität von IDH1/2 in den Gehirnen von Nagetieren viel niedriger ist. 11 Abbildung 2A zeigt die Differenz zwischen den hohen NADP+-abhängige IDH1/2-Aktivität in menschlichen Glioblastom-Zellen und die niedrigen NADP+-abhängige IDH1/2-Aktivität im Gehirn gesunde Maus. IDH1/2 Aktivität wird als µmol NADPH Produktion pro mL Gewebe pro Minute in Abbildung 2 bquantifiziert.
Die enzymatische Reaktion des IDH1/2 ist relativ einfach, aber Laktat-Dehydrogenase (LDH) ist ein komplizierter Enzymkomplex. LDH wandelt die reversible Umwandlung von Laktat in Pyruvat mit gleichzeitigen Reduktion von NAD+ , NADH oder umgekehrt. Die Verfügbarkeit von Laktat und Pyruvat und die Zusammensetzung der LDH Enzymkomplex bestimmt, ob Laktat in erster Linie zu Pyruvat umgewandelt wird (das ist katalysiert durch LDH-B und liefert NADH) oder ob Pyruvat in erster Linie um Laktat umgewandelt wird (das ist katalysiert durch LDH-A und NADH verbraucht). 13 metabolische Zuordnung Experimente sind in der Lage, die Aktivität der LDH-B Reaktion zu visualisieren, aber sie sind "blind" auf die Aktivität der LDH-A-Reaktion, denn NADH Produktion tritt nicht auf, und folglich ist NitroBT nicht auf Formazan reduziert. Abbildung 3 zeigt die NAD+-abhängige LDH-Aktivität (d. h. die Umwandlung von Laktat in Pyruvat) im menschlichen Gehirn Abschnitte in der Abwesenheit des Substrats (Abbildung 3A), in der Gegenwart eine hohe Konzentration von Laktat (Abbildung 3 b ), in Anwesenheit von 6 mM Laktat (Abbildung 3) und in der Gegenwart eine niedrige Konzentration von Laktat und eine höhere Konzentration von Pyruvat (Abbildung 3D). Die Ergebnisse dieser Experimente veranschaulichen metabolische Zuordnung ausreichend erfasst, die die NAD+-abhängige LDH-Aktivität in Gewebeschnitten hängt von der Verfügbarkeit von Laktat und Pyruvat in dem Reaktionsmedium.
Abbildung 1 . +NADP-abhängige IDH1/2 Aktivität des menschlichen kolorektalen Karzinomzellen. (A) repräsentative monochromatisches Licht Mikrofotos HCT116 menschlichen kolorektalen Karzinoms Zellen nach der Färbung für NADP+-abhängige IDH1/2 Aktivität gegen 1-10 mM Isocitrate und 0,8 mM NADP+. Skalieren Sie Bars = 50 µm. (B) eine Quantifizierung der Absorption des blauen Formazan produziert von NitroBT von+NADP-abhängige IDH1/2 Aktivität pro Zelle ist mit dem Einsatz von monochromatischem Licht in (A) und Bildanalyse gezeigt. Abkürzungen: IDH1WT/WT, Isocitrate Dehydrogenase 1 Wildtyp; IDH1WT/MUT, Isocitrate Dehydrogenase 1 mutiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . +NADP-abhängige IDH1/2 Aktivität des menschlichen Glioblastom Proben. (A) repräsentative Mikrophotographie eines Maus-Gehirn-Abschnitts mit gesunden Mäusegehirn (h) und einem menschlichen Glioblastom Tumor Xenograft (t) nach der Färbung für NADP+-abhängige IDH1/2 Aktivität im Beisein von 0,8 mM NADP+ und 2 mM Isocitrate. Maßstabsleiste = 200 µm (B) Enzym-Aktivität Quantifizierung Mäusegehirn (h) und menschlichen Glioblastom Xenograft (t) in (A) mit dem Gesetz von Lambert-Beerschen gezeigt. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . NAD+-abhängige Laktat-Dehydrogenase (LDH) Aktivität des menschlichen Gehirns Proben. Repräsentative Mikrofotos von Schnittserien des menschlichen Gehirns Proben nach der Färbung für NAD+-abhängige LDH-Aktivität (A) gegen Kontrolle Bedingungen (in Abwesenheit Substrat und Pyruvat, 3 mM NAD+ nur) (B) gegen 150 mM Laktat in Pyruvat (C) gegen 6 mM ohne Laktat in der Abwesenheit von Pyruvat und (D) gegen 6 mM Laktat in Anwesenheit von 18 mM Pyruvat, konkurrenzfähiges Produkt Inhibitor der Laktat, Pyruvat Reaktion. Maßstabsleiste = 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Enzym: | G6PDH | LDH | SDH | MDH | IDH1 | IDH2 | IDH3 | 6PGD | GDH |
| PVA 18 % in 100 mM Phosphat-Puffer | 1 mL; pH = 7,4 | 1 mL; pH = 7,4 | 1 mL; pH = 8,0 | 1 mL; pH = 7,4 | 1 mL; pH = 7,4 | 1 mL; pH = 7,4 | 1 mL; pH = 7,4 | 1 mL; pH = 8,0 | 1 mL; pH = 8,0 |
| 5 mM NitroBT | 5 mg/40 µL Mischung | 5 mg/40 µL Mischung | 5 mg/40 µL Mischung | 5 mg/40 µL Mischung | 5 mg/40 µL Mischung | 5 mg/40 µL Mischung | 5 mg/40 µL Mischung | 5 mg/40 µL Mischung | 5 mg/40 µL Mischung |
| 5 mM NaN3 | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | |
| 5 mM MgCl2 | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | |||
| 3 mM NAD+ | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | ||||||
| 0,8 mM NADP | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | ||||
| 2 mM ADP | 10 ΜL | ||||||||
| Substrat | 10 mM Glukose-6-Phosphat | 150 mM Laktat | 50 mM Succinat | 100 mM-Apfelsäure | 2 mM isocitrate | 2 mM isocitrate | 2 mM isocitrate | 10 mM 6-Phospho-galactonate | 10 mM Glutaminsäure |
| 0,32 mM Komponenten | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | ||||
| 0,2 mM PMS | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | |||||
| Dauer der Inkubation | 5 min | 30 min | 60 min. | 60 min. | 30 min | 30 min | 30 min | 10 min | 30 min |
Tabelle 1. Schematische Übersicht des metabolischen Mapping-Protokolls für Dehydrogenases. Abkürzungen: ADP Adenosin Diphosphat; (m) PMS (Methoxy)-5-Methylphenazinium-Methyl-Sulfat; NitroBT, Nitro tetrazoliumsalz blau Chlorid; G6PDH, Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase; LDH, Laktat-Dehydrogenase; SDH, Succinat-Dehydrogenase; MDH, Malat-Dehydrogenase; IDH, Isocitrate Dehydrogenase; 6PGD, 6-Phosphogluconate-Dehydrogenase; GDH, Glutamat-Dehydrogenase.
Discussion
Forschung am Zellstoffwechsel erlebt derzeit eine Renaissance, weil Forscher erkennen jetzt, dass metabolische Effekte entscheidend für die Pathogenese und Behandlung vieler Krankheiten sind. 1 im übrigen metabolischen Forschung wird durch eine steigende Verfügbarkeit von Techniken unterstützt, die diesem Forschungsfeld mit mehr Werkzeuge als je zuvor, einschließlich der Massenspektrometrie, Radioisotopen Kennzeichnung und Kernmagnetische Resonanz-Spektrometrie zur Verfügung zu stellen. Metabolische Mapping ist keine neuartige Technik, aber ihre Fähigkeit, integrierte Informationen über die Aktivität der Enzyme in einer fast True-to-Nature-Situation geben macht diese Technik aktueller denn je. 2
Die Cofaktoren NAD+ und NADP+ finden sich in allen lebenden Zellen, was darauf hindeutet, dass Dehydrogenases sehr früh im Laufe der Evolution entstanden und haben wichtige Rolle im Zellstoffwechsel. 14 , 15 es derzeit 523 Enzym-katalysierten Reaktionen, die als Dehydrogenases eingestuft und über alle Arten auftreten. 16 theoretisch kann die Aktivität aller verschiedenen Dehydrogenase Reaktionen getrennt untersucht werden durch die Feinabstimmung der metabolischen Zuordnung Protokolls hier beschrieben. Jede Enzymreaktion ist einzigartig durch das Substrat und Co-Faktoren, die für ihre Tätigkeit erforderlich sind. Daher kann die Aktivität der einzelnen enzymatischen Reaktion mit einem metabolischen Mapping Experiment mit ausreichend Substrat und Cofaktoren in dem Reaktionsmedium ermittelt werden. Jedoch einige Enzym-Isoformen unterscheiden sich in ihrer subzelluläre Lokalisation, z.B. eine Isoform katalysiert eine Reaktion im Zytoplasma, während ein anderes Isoform in den Mitochondrien Funktionen. Ein bemerkenswertes Beispiel ist IDH1 und IDH2, von denen erstere zytoplasmatischen ist und Letzteres ist mitochondriale und das sind zwei verschiedene Proteine, die von zwei verschiedenen Genen kodiert. 11 1-Methoxy-5-Methylphenazinium Methylsulfate (Methoxy-PMS) und 5-Methylphenazinium Methylsulfate (PMS) können sowohl als Elektron Träger für diese Experimente verwendet werden. Die ehemalige übergibt keine mitochondriale Membranen, die letztere tut. Daher sollten Untersuchungen zur mitochondrialen Enzyme (z.B. IDH2) PMS verwenden, während Untersuchungen zur zytosolischen Enzyme (z.B. IDH1) Komponenten verwenden sollten.
Wie bei vielen Techniken, Variationen dieses Protokolls, wie z. B. die Verwendung unterschiedlicher Arten von tetrazoliumsalz Salze, ausgenommen die Zugabe von PMS und Natriumazid, mit einer wässrigen Eindeckmittel und unterschiedliche Inkubationszeit und spülen Zeiten existieren und funktionieren genauso gut. Die Anwendung der metabolischen Mapping mit tetrazoliumsalz Salze beschränkt sich nicht auf Dehydrogenases. Mit kleinen Änderungen des Protokolls, kann es auch verwendet werden, für die Beurteilung der Aktivität von Enzymen, die funktionieren, direkt oberhalb der Dehydrogenase in einem Stoffwechselweg. Haben wir zuvor beschrieben, dieses Prinzip für die Glutaminase Enzym,17 die Funktionen direkt oberhalb des Glutamat-Dehydrogenase in den Glutaminolysis Weg. 18 in der Theorie, kann das gleiche Prinzip angewendet werden um andere Enzyme, die Funktion direkt nachgeschalteten oder oberhalb des eine Dehydrogenase z.B. Aconitase, liegt direkt oberhalb des IDH2 und IDH3 in der tricarboxylic Säure (TCA) Zyklus. Eine weitere einfache Variante der Konzentrationen in Tabelle 1 beschrieben ist durch Inkubation mittlere Fläschchen mit verschiedenen Konzentrationen von Substrat, Cofaktor und/oder Inhibitor zu machen. Dies ermöglicht die Erzeugung von Dosis-Aktivität Kurven in Abhängigkeit von Substrat, Cofaktor und/oder Hemmung Konzentration.
Technisch gesehen, metabolische Zuordnung Experimente erleichtern nicht unvoreingenommene Beobachtungen von in Situ Enzymaktivität, weil Forscher haben eine Konzentration von Substrat und Cofaktor wählen, die nicht das Substrat und Cofaktor Ebene reflektieren kann Das sind vorhanden in Situ. Darüber hinaus die Verwendung von Viskose 18 % PVA in dem Reaktionsmedium dient um Makromoleküle, im Ort und in der Konformation intakt aber effektive Verbreitung der niedrigen Molekulargewicht Reagenzien durch das Reaktionsmedium verbietet. 3 , 5 daher entschlossen Enzymaktivitäten in die hier beschriebenen Experimente, mit denen Supraphysiological Substrat Konzentrationen spiegeln nicht die in-Vivo -Situation bei einer bestimmten Substratkonzentration aber eignen sich für Intra experimentelle Vergleiche. So ist das Ergebnis metabolische Zuordnung Versuchsreihe die Produktionskapazität (maximale Aktivität) einer enzymatischen Reaktion im Zusammenhang mit der Substrat- und Cofaktor Ebenen, die Gegenwart in Situ. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von verschiedenen Konzentrationen von Substrat und/oder Cofaktoren und mehrere Proben unvoreingenommenen Vergleich der maximale Produktionskapazität (Vmax) und (Km) Affinität eines Enzyms zum Substrat/Cofaktor in Zelle Vorbereitungen , Gewebe oder Gewebe Regionen. Diese Parameter sind das Ergebnis der Summe der Enzym-Protein-Expression, Post-translationalen Modifikationen und die Wirkung von einem überfüllten Mikroumgebung auf die Aktivität von Enzymen. Daher ist metabolische Zuordnung noch eine bessere Reflexion der Enzym-Aktivität als Experimente, die Protein-Expression zu bestimmen oder Enzym-Aktivität in Vitrogereinigt.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
R.J.M. wird unterstützt durch ein Promotionsstipendium der AMC. Diese Forschung wurde von der niederländischen Krebsgesellschaft (KWF Grant UVA 2014-6839) unterstützt. Die Autoren danken Dr. A. Jonker für seine Hilfe bei der Erstellung des Protokolls.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| D-Glucose 6-phosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | G7879 | |
| Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4) | Merck Millipore | 106559 | |
| di-Sodium succinate | Sigma-Aldrich | W327700 | |
| DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | I1252 | |
| D-Malic acid | Sigma-Aldrich | 2300 | |
| Glycerol Gelatin | Sigma-Aldrich | GG1 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| Lithium 6-phospho-D-galactonate | Sigma-Aldrich | 55962 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| methoxy-Phenazine methosulfate | Serva | 28966.01 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N0505 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | NADP-RO | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Phenazine methosulfate | Serva | 32030.01 | |
| Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed | Sigma-Aldrich | P1763 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck Millipore | 104873 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Bandpass filter | Edmund optics | https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/ | |
| Grey-step wedge | Stouffer Industries | http://www.stouffer.net/TransPage.htm |
References
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