Summary
여기, 우리는 현미경으로 시각화 하 고 세포와 조직 활동, 기능 및 subcellular 지 방화에 dehydrogenases의 활동을 계량 하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 제시.
Abstract
변경 된 세포질 물질 대사 많은 질병, 암, 감염, 심혈 관 질환 등의 특징 이다. 세포의 대사 모터 단위는 효소 그리고 그들의 활동은 많은 수준에 transcriptional 포함, mRNA 안정성, 변환, 포스트 번역 상 및 기능 수준에서 심하게 규제. 이 복잡 한 규제 의미 기존의 양적 또는 이미징 분석, 정량적 mRNA 실험, 등 서양 몰아내고 immunohistochemistry, 효소, 그들의 기능은의 궁극적인 활동에 대 한 불완전 한 정보를 얻을 하거나 그들의 subcellular 지 방화입니다. 양적 효소 cytochemistry 및 histochemistry (즉, 대사 매핑) 제자리에서 효소 활동 속도 론, 함수 및 거의 사실에 자연 상황에서 subcellular 지 방화에 자세한 정보가 표시 됩니다.
우리는 효소 공동 인자 NAD(P)+ , 유행 등을 줄이기 위해 산화 환 원 반응을 수행 하는 dehydrogenases의 활동을 감지 하는 프로토콜을 설명 합니다. 세포 및 조직 단면도 특정 한 효소의 효소 활동은 매체에 알을 품는. 그 후, 수 사의 주제 이다 효소의 subcellular 사이트에 그것의 효소 활동을 수행 합니다. 화학 반응에서 반응 매체와,이 궁극적으로 블루 색 formazan 효소의 활동의 사이트에 생성합니다. Formazan의 흡 광도 따라서 효소의 활동의 직접적인 측정 이며, 단색 가벼운 현미경 검사 법 및 이미지 분석을 사용 하 여 측정할 수 있습니다. 이 프로토콜의 양적 측면 연구원은 이러한 분석에서 통계적 결론을 수 있습니다.
관측 연구, 게다가이 기술은 특정 효소의 저해 연구에 사용할 수 있습니다. 이러한 맥락에서 신진 대사 매핑의 진정한 자연 장점에서 연구 혜택 현장에서 결과 주는 효소 저해 연구 생체 외에서 보다 순수 관련성이 있을 수 있습니다. 모두 있음, 대사 매핑은 휴대 또는 조직 수준에서 물질 대사를 공부 하는 필수적인 기술입니다. 기술은 쉽게 채택, 깊이, 포괄적이 고 통합 된 변화 정보를 제공 합니다 이며 급속 한 정량 분석을 가능 하 게.
Introduction
세포질 생리학의 필수적인 초석은 물질 대사. 신진 대사 셀 모든 생리 적 프로세스에 필요한 에너지, 고분자의 생 합성에 대 한 빌딩 블록을 제공 하며 폐기물, 독성 분자 및 분해 세포 항상성 조절 및 불필요 한 또는 역 기능 세포 구성 성분의 재활용. 효소 거의 모든 중요 한 세포 화학 반응 촉매 되며 따라서 세포의 생리학에서 모터 유닛. 1 , 2
효소의 활동은 여러 수준에서 밀접 하 게 통제 되 고 따라서 양적 효소 histochemistry 및 cytochemistry (대사 매핑이 라고도 함)은 효소 활동 현장공부를 선호 하는 방법. Transcriptional 수준에서 mRNA에 유전자 발현 통제 된다. Microarrays 또는 직접 RNA 시퀀싱 (하위) 세포에 대 한 정보를 제공 하는 에서 제자리 교 잡 등 질적 mRNA 분석, 정량적 mRNA 분석 실험을 사용 하 여 녹음의 레 귤 레이 션의 효과 확인할 수 있습니다. mRNA 분자 지역화 이 셀 사이의 transcriptional 활동에 상대적 차이 감사를 가능 하 게. 그러나, 해석 및 신진 대사 활동에 관하여 이러한 mRNA 분석 실험의 타당성은 복잡 한 규제도 어디 mRNA 분자의 보안과 시퀀스 편집 후 DNA에서 복사할는 mRNA 수준에서 발생 하기 때문에. 이 편집 하는 것은 단백질 isoform 번역과 리보솜에서 단백질 번역 수량을 통제 한다. 또한, 단백질 번역 과정 제어 하 고 궁극적으로 효소 식 및 그러므로 활동에 영향을 줍니다. 같은 서양 Blotting 역 위상 단백질 lysate microarrays, 또는 질적 단백질 표정 분석, 정량적 단백질 식 분석 실험을 사용 하 여 상기 규제 단계의 결합된 효과 감상할 수 있습니다. immunocytochemistry 및 immunohistochemistry, 하지만 이러한 기술을 통합 포스트 번역 상 수정 단백질의 그들의 붐비는 microenvironment에 효소의 기능 규정 등 다운스트림 규제 효과를 실패 합니다. 또한, 효소의 표현 수 있습니다 제대로 상관 활동, 활동 측정 셀 또는 조직 homogenates 또는 희석된 솔루션 정화 효소의 효소 활동 연구에 대 한 널리 사용. 그러나, 이러한 실험 실패 복제 효소의 활동에는 붐비는 compartmentalized 세포질 이나 세포 기관이의 영향. 또한, 모든 전술 된 기법 수량 또는 mRNA 또는 효소 식, 지역화 결정 하지만이 통합 커녕 효소 식의 이러한 측면에 포괄적인 정보를 줄 수 없습니다. 효소 활동 결정 된 정보입니다. 2 , 3 , 4
신진 대사 매핑 모든 효소의 활동을 결정 하는 상기 변수의 감사 수 있습니다. 무엇 보다, 대사 매핑 살아있는 세포 또는 세포와 조직을 생성 하는 효소의 활동의 데이터를 생성 하는 거의 사실에 자연 상황을 분석 하는 동안 그대로 유지 됩니다 조직 이미징의 형태입니다. 그것은 모두 효소 활동의 위치 뿐만 아니라 셀 또는 조직 구획 내에서 효소 활동의 강력한 정량화의 자세한 감사를 용이 하 게 하는 이미지를 생성 합니다. 3 , 4 dehydrogenases의 활동의 대사 매핑을 위해 여기에 설명 된 프로토콜 기반5 에 양적 효소 histochemistry,6 의 원리에 모든 사용 가능한 효소 조직화 학적인 방법의 실험실 설명서 양적 변화 매핑 이미지 분석입니다. 4
Dehydrogenases는 각각 NADH, NADPH와 FADH2,+NAD, NADP+ 유행 등 정식 공동 인자를 줄이기 위해 산화 환 원 반응을 수행 하는 효소. 그대로 셀 또는 화학적으로 고정 하지 cryostat 조직 섹션 중 다른 시 약, 기판 및 tetrazolium 소금과 특정 효소의 공동 인자를 포함 하는 반응 매체에 알을 품는. 그 후, 그 효소의 촉매 활동을 수행 하 고 감소 시킨다, 예를 들어 NADP에 NADPH+ . 전자 이동 통신사를 통해 2 NADPH 분자 궁극적으로 효소의 사이트에서 즉시 침전 물 1 물 불용 성 블루 formazan 분자에 1 수용 성 반 무색 tetrazolium 소금 분자 줄일 수 있습니다. 그러므로, 침전 된 formazan의 흡 광도 효소의 지역 활동의 직접 측정은 가벼운 현미경 검사 법을 사용 하 여 관찰 될 수 있다 또는 단색 가벼운 현미경 검사 법 및 이미지 분석을 사용 하 여 계량. 이 프로토콜의 양적 측면 연구원은 이러한 분석에서 통계적 결론을 수 있습니다. 또한,이 정량화 제자리에서 운동 효소 매개 변수, 최대한 효소 활동 (V최대), 효소 (Km)에 대 한 기판의 선호도 등의 결정을 촉진 한다. 3 , 4 , 5 , 6
그것은 실험, 당 고집 셀 준비 또는 조직 단면도 유리 슬라이드 50의 최대가 일관성을 얻기 위하여 부 화 하는 동안 시간 지연을 최소화 하기 위해 권장 됩니다 실현 하는 중요 한 대사 매핑 실험을 계획할 때 결과입니다. 그것은 더 슬라이드 또는 중간 구성 프로토콜 단계 수행 하는 협력 하나 이상의 실험에 의해 처리할 수 있습니다. 또한, 일부 변화 실험 사이 존재합니다. 따라서, 동일한 실험 각 셀 준비에서 cytospins와 각 조직 샘플에서 섹션 3 번 이상 반복 해야 하 고 각 실험에 적절 한 컨트롤을 포함 합니다. 항상 일반적인 효소 활동 얼룩에 대 한 제어 cofactors 존재 하지만 기판의 부재에서 제어 인큐베이션 매체를 준비 합니다. 가장 대표적인 결과 얻은 실험에 어디 다른 기판/공동 인자 농도 동일한 샘플에서 조직 섹션 또는 셀 준비에 적용 되는 실험 효소 반응 속도 론을 사용 하 여 분석을 수행할 수 있도록 복용량-활동 곡선입니다.
Protocol
이 프로토콜은 학문적 인 의료 센터의 의료 윤리 검토 위원회의 인간 자료의 사용에 지침을 따릅니다.
1입니다. 세포 또는 조직 단면도의 준비
- 셀
- 문화에서 10 mm 페 트리 접시에서에서 37 ° C에서 5 분 동안 0.25 %trypsin-EDTA의 1 mL를 사용 하 여 셀을 trypsinize와 50, 000-200, 000 셀/ml, 셀의 크기에 따라는 37 ° C에에서 셀.
- 실 온에서 5 분 동안 20 x g에서 cytocentrifuge에 cytospin 퍼 널을 사용 하 여 현미경 슬라이드에 세포 현 탁 액의 200 µ L를 연결 합니다.
- 실 온에서 24 h cytospins 건조 이 효소 활동을 영향을 주지 않습니다. 5
- 조직 단면도
- 환자 또는 윤리적인 허가 따라 동물에서 조직 추출. 조직의 10 m m3 는 여러 실험에 대 한 충분 합니다.
- 직물의 조각을 작은 발명된 2 mL 플라스틱 튜브에 넣고 스냅-동결 액체 질소에 조직의 조각을 포함 하는 튜브.
- −80 ° C에서 조직 조각을 추가 처리까지 포함 된 튜브를 저장 합니다.
- 사용 하 여 최적의 절삭 온도 (10 월) 라고 하는 젤 같은 매체 물 결정을 형성할 수 없습니다 있도록 조직 샘플-20 ° c-25 ° C를 급속 하 게, 정지 척에 탑재.
- 절단 및 처음 트림 원하는 수준으로 블록을 cryostat 사용 (이상적으로 현미경의 절반 폭 유리 슬라이드, 예를 들면 5 x 5 mm).
- 단면, 시 브러시와 안티 롤 접시 위쪽으로 컬에서 섹션을 사용 합니다.
- 느리지만 지속적인 속도로 6-10 µ m 두께 섹션으로 조직 샘플을 잘라 (1 섹션 당 s). 섹션은 제대로 잘라, 안티 롤 접시 아래 톰 칼에 남아 있다.
- 마이크로 유리 슬라이드에 1-3 섹션을 선택 하 고 사용까지 −80 ° C에 저장. 준비 섹션의 수는 조직 샘플의 크기와 섹션의 원하는 두께에 따라 달라 집니다.
2. 효소 조직/Cytochemistry 성 Dehydrogenases
- 반응 버퍼를 준비.
- 올바른 pH의 인산 염 버퍼의 100 mL를 준비 ( 표 1; 참조 모든 효소는에서 그것의 활동은 최고 최적의 pH). 예를 들어 올바른 ph 버퍼 때까지 0.1 m M KH2포4 (산 성)과 0.1 m M 나2HPO4 (기본)의 솔루션을 혼합.
- PVA는 먼지와 독성 증기 두건에서 인산 염 버퍼에 폴 리 비닐 알코올 (PVA)의 18 g를 무게.
- 18 %w / v PVA 100 ° C에서 인산 염 버퍼에서 버퍼 온난 하 여 분해 au 베인 마리 (끓는 물에 넣어 유리 병)과 PVA 완전히 녹아 때까지 저 어. 솔루션은 교 반에 의해 발생 하는 작은 기포와 함께 다음, 투명 한 될 것입니다. 그것은 일반적으로 ~ 15 분 해산 PVA에 대 한 필요 합니다.
참고: 18 %w / v PVA 인산 염 버퍼에 점성 이며 15 mL 반응 버퍼 튜브 넓은 피 펫을 사용 하 여 전송할 수 있습니다. 18 %w / v PVA 인산 염 버퍼에서의 단기 저장 ≥ ≥40 ° C 및 장기 저장 (최대 2 주)에서 발생 한다 60 ° c. 18 %w / v PVA 인산 염 버퍼에서의 250 µ L는 500 µ L은 조직 섹션 필요한 cytospin 준비에 대 한 일반적으로 필요 합니다.
- 18 %w / v PVA 100 ° C에서 인산 염 버퍼에서 버퍼 온난 하 여 분해 au 베인 마리 (끓는 물에 넣어 유리 병)과 PVA 완전히 녹아 때까지 저 어. 솔루션은 교 반에 의해 발생 하는 작은 기포와 함께 다음, 투명 한 될 것입니다. 그것은 일반적으로 ~ 15 분 해산 PVA에 대 한 필요 합니다.
- Tetrazolium 소금 (nitroBT) 솔루션을 준비 합니다. 인큐베이션 매체의 모든 1 mL, nitroBT 솔루션의 40 µ L가 필요, 20 µ L dimethylformamide (DMF)의 혼합에 녹아 있는 nitroBT (노란 분말)의 5 밀리 그램의 구성 및 20 µ L의 에탄올, 밝은 노란색 투명 한 솔루션 것입니다.
참고: nitroBT의 안정성은 모든 필요한 시 약의 가장 낮은, 그것 것이 좋습니다 마지막 nitroBT 재고 솔루션을 준비 하 여 먼저 반응 매체에 있는 nitroBT를 분해.- DMF에 에탄올 nitroBT 유리 유리병에 시간의 짧은 기간 동안 그것을 열 하 여 분해 (~ 10 s) 분 젠 버너를 사용 하 여. 가 열 하는 동안 유리병을 흔들어 하 고 증발을 방지 하기 위해 불꽃에 너무 오래 유리병을 두지 마십시오.
- 10% 추가 nitroBT 솔루션 녹이는 과정 DMF와 에탄올의 증발 수 있도록.
- 방패 전자 캐리어 phenazine methosulfate (PMS) 또는 (1-methoxy)-유리 저장 병 주위 은박지 포장 하 여 직접적인 빛에서 m(PMS)를 포함 하는 phenazine methosulfate (Mpm), 및 부 화 미디어.
- 증 류 된 H2o.에서에서 그들을 용 해 하 여 표 1 에 따라 시 약 솔루션을 준비 일부 시 약 빠르게 멸망, 그래서 가능한 실험 직전으로 그들을 준비 합니다. 까지 사용 시 솔루션 또는 얼음에 4 ° C에서 유지.
- 표 1 에서 같이 부 화 미디어를 준비 하 고 부드러운 교 반으로 각 단계 후 솔루션을 균질. 지속적으로 교 반 하 고 교 반 하면서 인큐베이션 매체의 표면 아래 주걱을 유지 하 여 인큐베이션 매체에 있는 기포의 생성을 하지 마십시오.
- 조직 섹션에 인큐베이션 매체 적용
- 미리 따뜻한 현미경 cytospins와 슬라이드 또는 조직 단면도 15 분 대 한 immunohistochemistry 보육 실에서 37 ° C에 연결 된 잠수함에서 일정 한 온도 유지 하기 위해 따뜻한 물으로 immunohistochemistry 인큐베이션 챔버의 하단은 인큐베이터입니다.
- 조심 스럽게 나 넓은 부분에는 좁은에서 전환에서 파스퇴르 펫을 보았다. 정기적인 파스퇴르 펫 너무 좁은 게 파스퇴르 인큐베이션 매체의 열망에 대 한 충분히 넓은 펫이이 단계 필요 그래서 점성 인큐베이션 매체를 발음 하는.
- 250-500 µ L 적절 한 인큐베이션 매체의 각 셀 준비 또는 조직 섹션 파스퇴르 피 펫의 넓은 부분을 사용 하 여 현미경 슬라이드에 적용 됩니다.
- 피 펫 팁을 사용 하 여 외피 중간에 밖으로 균등 하 게 확산. 이러한 표면에 플 로트 것입니다 때문에 현미경 슬라이드에 세포 준비 또는 조직 섹션에서 효소 반응 간섭 하지 것입니다 인큐베이션 매체에 작은 기포를 무시.
- 효소 반응 속도 론 및 특정 셀 준비에 그 표현에 따라 미리 지정 된 기간에 대 한 셀 준비 또는 조직 섹션 (예: 조직 문화 인큐베이터)는 37 ° C 배양 기에서 현미경 슬라이드에 품 어 또는 조직 (표 1)입니다. 밖으로 건조에서 반응 버퍼를 방지 하기 위해 습 한 환경을 유지 하기 위하여 폐쇄 immunohistochemistry 보육 실의 뚜껑을 유지.
- 현미경 슬라이드를 세척
- 조직에 초과 인큐베이션 매체에서 누릅니다.
- 기계적으로 60 ° C 인산 염 버퍼, 버퍼에 현미경 슬라이드를 아래로 이동 하 여 pH 5.3, 현미경 슬라이드에서 인큐베이션 매체에서 씻어. 이 효소 반응을 중지합니다.
- 60 ° C 인산 염 버퍼, pH 5.3 20 분에에서 그들을 유지 하 여 현미경 슬라이드를 씻어.
- 60 ° C 수돗물에 현미경 슬라이드를 기계적으로 세척.
- 20 분 동안 60 ° C 수돗물에 그들을 유지 하 여 현미경 슬라이드를 씻어.
- 물 하 고 슬라이드 아래로 천천히 1 분 동안 60 ° C 수돗물으로 상 온 수돗물을 혼합 하 여 냉각.
- 실 온 소 주 물에는 최종 기계적 세척 단계를 수행 합니다.
- 얼룩진된 Cytospins 또는 조직 단면도 현미경 슬라이드에 포함
- 전 슬라이드 50-60 ° c.에서 따뜻한 따뜻한
- 신중 하 게 종이 타월을 사용 하 여 현미경 슬라이드의 뒷면을 건조 하 고 따뜻한 현미경 슬라이드의 상단 측면을 건조 하는 슬라이드에 배치.
- 슬라이드는 건조, 셀 준비 또는 글리세롤 젤리 장착 매체 및 coverslips를 사용 하 여 현미경 슬라이드에 조직 단면도 묶습니다.
- 4 ° C에서 냉장고에 어둠 속에서 셀 준비 또는 조직 섹션 현미경 슬라이드를 저장 하거나 즉시 이미지 수집을 진행 합니다.
3. 이미지 수집
- 이미지를 기록 (적어도 8 비트 하지만 선호 10-비트 또는 12 비트), 충분 한 다이나믹 범위와 과학적인 흑백 CCD 카메라 고정 이득 그리고 선형 응답.
- (Cytospins 위한 X-63 X 20)와 10-63 X 조직 섹션에 대 한 적절 한 목표를 선택 합니다.
- 보기 보다 약간 더 큰 있도록 필드 다이어 프 램을 좁혀서 눈부심을 줄일 수 있습니다.
- 적외선 차단 함께에서 formazan 촉진7 의 isobestic 파장 근처 10 nm 넓은 대역 유추 필터를 적용 하 여 단색 광 필터 ( 자료 표참조)를 사용 합니다.
참고: nitroBT의 최대 isobestic 흡 광도 585 nm. - 조명 카메라의 전체 회색 레벨 범위 사용 되도록 최적화 (즉, 조명 수준을 설정 최대 조명-빈 현미경 슬라이드를 기록할 때를 노출 하지 않고 달성 된다 그래야).
- 알려진된 흡 광도 (또는 광학 밀도 [OD]) 측정된 회색 레벨 값을 보정. 이 위해 교정 슬라이드 또는 단계의 적어도 10 가지 단계 그레이 스케일 이미지를 캡처 중 상용 (참조 자료 테이블) 알려진 OD 값 (4.1.1 단계 참조), 태블릿 또는로 주문 품 그레이 스케일 쐐기 단계 태블릿을 측정 한 densitophotometer와 보정 결과 측정 사용 회색 알려진된 흡 광도 값을 값.
- 셀의 photomicrographs 또는 관심의 조직 단면도 캡처하십시오.
4. 이미지 분석
- 이미지 분석, 전에 흡 광도 측정 ImageJ 소프트웨어 보정.
- 알려진 OD 값 보정 슬라이드 또는 단계 태블릿 매개 변수 알려진된 흡 광도 10 교정 분야의 photomicrographs의 흡 광도 (OD)를 측정 합니다. ImageJ에서 선택된 영역을 측정 하는 분석 → 측정 메뉴 또는 Ctrl + M 단축키를 사용 합니다.
- 분석 하 여 흡 광도 보정 절차를 시작 → 교정. 함수 "Rodbard (NIH 이미지)"를 선택 하십시오. 열리는 창의 왼쪽된 열에서 보정 슬라이드/단계 태블릿 4.1.1에서 수행의 각 단계에서 회색 레벨 측정의 결과 이미 존재. 그렇지 않다면 ImageJ 결과 화면에서 그들을 복사. 오른쪽 열에서 보정된 단계 정제와 함께 인증서에 인쇄 각 해당 알려진된 흡 광도 값을 입력 합니다. 상자 "글로벌 교정" 및 "보기 음모" 똑 딱 거리 십시오 하 고 "확인"을 누릅니다.
- 품질 관리에 대 한 확인 R2 의 Rodbard 함수는 > 0.99. 만약 그것이 < 0.99, 확인 여부 교정 슬라이드 촬영 되었고 정확 하 게 측정 여부 알려진된 흡 광도 매개 변수가 올바르게 입력 했다.
- ImageJ는 지금 프로그램을 닫을 때까지 교정 (따라서 "글로벌 교정"). 흡 광도 측정에 대 한 보정된 ImageJ 세션 항상 변환 관찰된 흡 광도 여기서 0 0과 1 사이의 값을 의미 하 고 1 0의 점근 이며 전체 흡 광도, 각각.
- Cytospins, 선택 > 임의의 방식으로 100 단일 셀. 조직 섹션에 대 한 모든 섹션에 고정된 길이 너비의 관심의 하나 이상의 필드를 선택 합니다.
- 프로젝트 편견된 셀 선택에 도움을 photomicrographs 통해 래스터. ImageJ, 플러그인 → 분석 → 그리드 메뉴를 통해 이미지 위에 격자 프로젝트.
- ImageJ에서 타원형 도구를 사용 하 여 단일 셀을 선택 하 고 사각형 도구를 사용 하 여 조직 영역을 선택 합니다.
- 흡 광도 조직 지역 또는 선택 된 셀의 영역을 측정 합니다. 광학 밀도 지역 "의미" 라고 하며 "지역"는 ImageJ 결과 스프레드시트, 각각.
참고: 셀 또는 조직 영역 (만약 당신이 다른 크기를 가진 여러 조직 지역 선택)의 총 흡수도 모든 분리 된 픽셀 absorbances의 합과 같습니다. 셀은 1000 픽셀로 몇 군데, 총 흡수도 1000 absorbances의 합계에 의해 주어진 다 고 평균 흡 광도 전체 흡 광도/1000에 의해 주어진 다. 이 절차는 또한 분포 오류를 방지합니다. - 결정의 평균 총 흡 광도 > 30 셀 또는 공동 인자 존재 하지만 기판의 부재에서 인큐베이션 매체 제어에 노출 되었다 샘플을 포함 하는 컨트롤 슬라이드에서 조직 지역. 이 제어 흡 광도 비 특정 효소 활동 얼룩에 대 한 제어를 사용 하 고 흡 광도 유물 매체, 커버 슬립 또는 현미경 장착 사용된 현미경 슬라이드에 의해 유도 된.
- 공동 인자 (하지만 기판 억제제의 다른 농도)의 동일한 농도로 인큐베이션 매체에 노출 된 샘플의 모든 총 흡 광도 측정에서 평균 제어 흡 광도를 뺍니다. 이것은 세포 또는 조직 영역의 수정된 총 흡수도 준다.
- 통계적으로 평균 수정된 총 absorbances 학생의 T 시험 또는 실험 설계에 따라 단방향 ANOVA 테스트를 사용 하 여 비교 합니다.
- Formazan의 흡 광도 효소 활동 (mL 당 분 당 µmol 변환 기판) 사용 하 여 변환할 수 있는 램버트-맥주의 법칙: c=A/(є×d), 여기서 c는 반응 매체에서 formazan의 농도, A는 교정; 후 ImageJ에서 측정 된 흡 광도 우크라이나는 formazan의 소멸 계수 (585에서 16.000 nm)8 , d는 평균 셀 두께 또는 공칭 단면 절단 두께 (6-10 µ m이 프로토콜에서)가 거리를 여행 하는 빛.
참고: 건조 후, 조직 섹션 두께 감소 공칭 단면 절단 두께에서 50% 그러나 공칭 단면 절단 두께 생물학적으로 가장 관련성이 높은 있기 때문에이 위에 계산에 반영 되지. 평균 셀 간격 및 셀 preparates 현미경 유리 슬라이드에 준수의 영역 크기는 confocal 현미경 검사 법 또는 넓은 필드 현미경 검사 법, 어떤 프로토콜 찾을 수 있습니다 다른 곳을 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 9 , 10
Representative Results
여러 프로토콜 인큐베이션 매체를 준비 하는 특정 효소의 활동을 조사 하기 위해 표시 됩니다. 적어도 37 ° c.의 온도 유지 하면서 PVA 솔루션에 나열 된 시 약 각 효소에 대 한 해산 시 약 테이블에 나열 된 순서로 해산 한다, 즉 nitroBT 항상 먼저 용 해 하 고 (m) PMS 항상 마지막 해산. NitroBT의 각 5 mg 40 µ L 믹스 (20 µ L 에탄올 + 20 µ L dimethylformamide)에 녹아 있다. 모든 볼륨 18 %PVA 솔루션 얼룩 ~ 2 조직 단면도 또는 유리 슬라이드에 ~ 4 셀 준비 하는 데 사용할 수의 1 mL 당 이다. NitroBT, 나드++, NADP ADP 및 기판 솔루션 갓 여야 한다. NaN3, MgCl2 , (m) PMS 솔루션 4 ° C에서 한 달 동안 저장할 수 있습니다. 18% 인산 염에 녹아 있는 PVA 버퍼 2 주 동안 60 ° C에 저장 될 수 있습니다. 18 %PVA 용액의 pH는 0.1 m M 칼륨 디 인산 (KH2포4) 및 0.1 M disodium 수소 인산 염 (NA2HPO4) 버퍼의 다른 작곡을 사용 하 여 설정할 수 있습니다. 표시 부 화 기간 좋은 시작 지점을 제공 하지만 최적의 부 화 기간 종, 조직 유형 및 직물의 보존에 따라 달라 집니다. 일반적으로, 셀 준비 해야 알을 품 formazan 생산의 비슷한 수준을 얻으려면 조직 단면도 보다는 더 이상.
야생-타입 isocitrate 효소 1과 2 (IDH1/2) NADP에 NADPH+ 의 수 반하는 감소 된 세포질 및 미토 콘 드리 아, α ketoglutarate (αKG)에 isocitrate의 변환 각각 촉매. 이러한 효소 IDH1/2 돌연변이 다양 한 유형의 기본 뇌 암 (glioblastoma) 등 대 장 암, 인간의 암에 발생 하기 때문에 최근 관심을 끌 고의 가능성을 설명 하는 독특한 기회를 제공 신진 대사 매핑입니다. IDH1 돌연변이 IDH1 야생 형 효소 활동을 억제 하 고 또한 생산, oncometabolite D-2의 후속 축적 하는 네오-효소 활동 유도-hydroxyglutarate (D-2 HG), 이다11 다른 곳에서 자세히 설명합니다. 12 대사 매핑 실험 보여주었다 그 NADP+-종속 IDH1/2 활동은 절에서 heterozygous IDH1 돌연변이 보다 했다 colorectal 암 세포에서과 대 장 암 세포에서 현저 하 게 낮은 IDH1 야생-타입 (그림 1A). 이 차이 단색 빛 photomicrographs (그림 1B)의 이미지 분석에 의해 정량 했다. 12
신진 대사 매핑 실험의 또 다른 설명 예 그림 2인간의 세포종 세포 주입 된 쥐의 뇌의 cryostat 섹션의 이미지에에서 표시 됩니다. IDH1/2 인간 두뇌에서 가장 중요 한 NADPH 공급자 이며 그 활동은 upregulated 야생-타입 IDH1/2 세포종 IDH1/2의 NADPH 생산 능력은 설치류의 두뇌에 훨씬 낮은 반면. 11 그림 2A 높은 NADP+사이의 차이 보여줍니다-인간의 세포종 세포와 낮은 NADP+종속 IDH1/2 활동-건강 한 쥐의 뇌에 종속 IDH1/2 활동. IDH1/2 활동 그림 2B에서 분 당 조직의 mL 당 µmol NADPH 생산으로 정량입니다.
IDH1/2의 효소 반응은 비교적 간단 하지만 젖 산 효소 (LDH)은 더 복잡 한 효소 복잡 한. LDH 나드+ 또는 NADH의 부수적인 감소와 더불어 pyruvate 젖에서 가역 변환으로 변환합니다. 젖 산 염 그리고 pyruvate의 가용성과 복잡 한 LDH 효소의 구성 여부 젖은 주로 pyruvate (는 LDH b 촉매와 NADH를 생성) 또는 변환 여부 pyruvate는 젖이 나올으로 주로 변환 (지시 LDH A로 촉매와 NADH를 사용). 13 대사 매핑 실험 LDH B 반응의 활동을 시각화 수 있습니다 하지만 그들은 LDH A 반응의 활동에 "장 님" NADH 생산 발생 하지 않습니다 때문에 결과적으로 nitroBT formazan에 감소 되지 않는다. 그림 3 은 나드+-종속 LDH 활동 (즉, pyruvate에 젖 산의 변환) 인간의 두뇌에는 젖 산 염 (그림 3B의 높은 농도 존재 기판 (그림 3A)의 부재에 섹션 ), 6mm 젖 산 (그림 3C)의 존재와 젖 산의 낮은 농도 pyruvate (그림 3D)의 높은 농도 존재. 이러한 실험의 결과 설명 대사를 캡처 적절 하 게 매핑 나드+-종속 LDH 활동 조직 섹션에서 젖 산 및 반응 매체에 pyruvate의 가용성에 따라 달라 집니다.
그림 1 . NADP+-인간의 대 장 암 세포의 종속 IDH1/2 활동. (A) NADP+에 대 한 얼룩 후 HCT116 인간 대 장 암 세포의 대표적인 단색 빛 photomicrographs-1-10 m m isocitrate와 0.8 m m NADP+에 대 한 종속 IDH1/2 활동. 스케일 바 = 50 µ m. (B) 블루 formazan의 흡 광도의 정량화 NADP+에 의해 nitroBT에서 생산-셀 당 종속 IDH1/2 활동 (A)에서 단색 광 및 이미지 분석을 사용 하 여 표시 됩니다. 약어: IDH1WT/WT, isocitrate 효소 1 야생-타입; IDH1WT/MUT, isocitrate 효소 1 돌연변이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . NADP+-인간의 세포종 샘플의 종속 IDH1/2 활동. (A) NADP+에 대 한 얼룩 후 건강 한 쥐의 뇌 (h)와 인간의 세포종 종양이 종이 식 (t)를 포함 하는 마우스 뇌 섹션의 대표 photomicrograph-0.8 존재 종속 IDH1/2 활동 mM NADP+ 와 2 mM isocitrate. 눈금 막대 = 200 µ m (B) 효소 활동의 부 량 쥐의 뇌 (h) 및 인간의 세포종이 종이 식 (t) 램버트-맥주의 법률을 사용 하 여 (A)에 표시 된. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 나드+-인간 두뇌 샘플의 종속 젖 산 효소 (LDH) 활동. 나드+에 대 한 얼룩 후 인간의 두뇌 샘플의 직렬 부분의 대표 photomicrographs-제어 조건 (부재 기판 pyruvate, 3mm 나드+ 만에서) (B)에 대 한 종속 LDH 활동 (A) 150 m m 6 m m에 대하여 pyruvate (C)의 부재에 젖 산에 대 한 젖이 나올 pyruvate와 (D)의 부재에 6mm 젖 18 mM pyruvate, 젖 산 염에 pyruvate 반응의 경쟁 제품 억제제의 존재에 대 한. 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 효소: | G6PDH | LDH | SDH | MDH | IDH1 | IDH2 | IDH3 | 6PGD | GDH |
| PVA 100 m m 인산 염 버퍼에 18% | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 8.0 | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 8.0 | 1 mL; pH = 8.0 |
| 5 mM NitroBT | 5 mg/40 µ L 믹스 | 5 mg/40 µ L 믹스 | 5 mg/40 µ L 믹스 | 5 mg/40 µ L 믹스 | 5 mg/40 µ L 믹스 | 5 mg/40 µ L 믹스 | 5 mg/40 µ L 믹스 | 5 mg/40 µ L 믹스 | 5 mg/40 µ L 믹스 |
| 5mm 앤3 | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | |
| 5 mM MgCl2 | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | |||
| 3mm 나드+ | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | ||||||
| 0.8 m m NADP | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | ||||
| 2mm ADP | 10 Μ L | ||||||||
| 기판 | 10 m m 포도 당 6 인산 염 | 150 mM 젖 | 50mm 호박 | 100 mM 금산 | 2 m m isocitrate | 2 m m isocitrate | 2 m m isocitrate | 10 m m 6-인-galactonate | 10mm 글루탐산 |
| 0.32 m m Mpm | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | ||||
| 0.2 m m PMS | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | |||||
| 부 화 기간 | 5 분 | 30 분 | 60 분 | 60 분 | 30 분 | 30 분 | 30 분 | 10 분 | 30 분 |
표 1입니다. Dehydrogenases에 대 한 대사 매핑 프로토콜의 개요 개요. 약어: ADP를 아데노신 diphosphate; (m) PMS (methoxy)-5-methylphenazinium 메 틸 황산 염; nitroBT, 니트로 tetrazolium 블루 염화 물; G6PDH, 포도 당-6-인산 효소; LDH, 젖 산 효소; SDH, 호박 효소; MDH, malate 효소; IDH, isocitrate 효소; 6PGD, 6-phosphogluconate 효소; GDH, 조미료 효소
Discussion
현재 세포질 물질 대사에 대 한 연구는 대사 효과 많은 질병의 치료와 병에 대 한 중요 한 지금 연구원 실현 때문에 르네상스를 겪고 있다. 1 또한, 신진 대사 연구 질량 분석, 인체 라벨 및 핵 자기 공명 분석을 포함 하 여 그 어느 때 보다 더 많은 도구와 연구의이 분야를 제공 하는 기술의 증가 가용성에 의해도 왔입니다. 신진 대사 매핑 절대로 소설 기법 이지만 거의 사실에 자연 상황에서 효소의 활동에 대 한 통합된 정보를 제공을 만드는이 기술은 그 어느 때 보다 관련성이. 2
+ NAD와 NADP+ 공동 인자와 세포 물질 대사에 있는 주요 역할 dehydrogenases 매우 일찍 진화 중 발생 하는 것을 나타내는 모든 살아있는 세포에서 발견 된다. 14 , 15 현재, 있다 dehydrogenases로 분류 되 고 모든 종족에서 발생 523 효소 촉매 반응. 16 이론적으로, 모든 다른 효소 반응의 활동 수 별도로 조사 여기에 설명 된 대사 매핑 프로토콜을 조정 하 여. 모든 효소 반응 기질 및 그것의 활동에 필요한 공동 인자에 의하여 유일 하다. 따라서 각 효소 반응의 활동 적절 한 기질과 반응 매체에 있는 공동 인자와 대사 매핑 실험을 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 그러나, 그들의 subcellular 지 방화에 따라 다를 일부 효소 isoforms, 예를 들어 한 isoform catalyzes 세포질에 반응 다른 isoform는 미토 콘 드리 아에 작용 하는 반면. 주목할 만한 예제 IDH1 및 IDH2의 전은 세포질 및 미토 콘 드 리아는 이며는 두 개의 서로 다른 유전자에 의해 두 개의 서로 다른 단백질. 11 1-methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate (methoxy-PMS) 및 5-methylphenazinium methylsulfate (PMS) 모두 사용할 수 있습니다 전자 사업자로 서 이러한 실험에 대 한. 전 전달 하지 않습니다 미토 콘 드리 아 막, 후자 않습니다. 따라서, 미토 콘 드리 아 효소 (예: IDH2)에 대 한 조사 (예: IDH1) cytosolic 효소에 대 한 조사는 Mpm을 사용 해야 하는 반면 PMS를 사용 해야 합니다.
많은 기술, tetrazolium 소금의 다른 종류를 사용 하 여이 프로토콜의 변이와 마찬가지로 PMS의 추가 제외 하 고 나트륨 아 지 드, 수성 설치 매체를 사용 하 여 다양 한 인큐베이션 및 시간, rinsing 존재 똑같이 잘 작동 수 있습니다. Tetrazolium 염 분 대사 매핑 응용 프로그램 dehydrogenases에 국한 되지 않습니다. 프로토콜에 대 한 작은 수정, 그것은 또한 사용할 수 있습니다 직접 작동 하는 효소의 활동의 평가 대 한 업스트림 신진 대사 통로 있는 효소의. 우리는 이전 glutaminase 효소,17 직접 기능에 대 한이 원리를 설명 glutaminolysis 통로에 조미료 효소의 업스트림. 18 이론, 동일한 원리는 함수 직접 하류 또는 상류는 효소 예를 들면 aconitase, 직접 tricarboxylic 산 (TCA)에 IDH2와 IDH3의 업스트림 거짓말의 주기는 다른 효소에 적용할 수 있습니다. 표 1에 설명 된 농도의 또 다른 간단한 변화는 기판, 공동 인자 억제제의 다양 한 농도와 외피 중간 튜브를 만드는 수단 이다. 기판, 공동 인자 및 저해 농도의 기능으로 복용량 활동 커브의 생성 수 있습니다.
기술적으로 말하기, 대사 매핑 실험 연구원 기판 및 공동 인자 농도 기판 및 공동 인자 수준 반영 되지 않을 수 있습니다 선택 해야 하기 때문에 효소 활동 현장에서 의 공평한 관찰을 촉진 하지 않습니다. 그 현재 위치에있습니다. 또한, 점성 18% 반응 매체에서 PVA과 나 란 고분자를 그대로 유지 하는 역할을 하지만 반응 매체를 통해 낮은 분자-무게 약의 효과적인 보급을 금지의 사용. 3 , 5 따라서 supraphysiological 기질 농도 사용 하는 여기에 설명 된 실험에서 결정된 효소 활동을 반영 하지 않습니다 하지만 주어진된 기질 농도에서 vivo에서 상황은 적합 내 실험 비교입니다. 따라서, 대사 매핑 실험의 결과 기판 및 공동 인자 레벨을 현재 제자리의 맥락에서 효소 반응의 생산 능력 (최대 활동). 또한, 기판 cofactors의 다양 한 농도 여러 샘플을 사용 하 여 셀 준비에 최대 생산 능력 (V최대) 및 기판/공동 인자에 대 한 효소의 선호도 (Km)의 공평한 비교를 허용 조직 또는 조직 영역. 이 매개 변수는 효소 단백질 표정, 포스트 번역 상 수정 효소의 활동에 붐비는 microenvironment의 효과의 합계의 결과. 따라서, 신진 대사 매핑을 여전히 단백질 식을 결정 또는 효소 활동에서 생체 외에서정화 실험 보다 효소 활동의 더 나은 반영 이다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
R.J.M.는 AMC 박사 장학금에 의해 지원 됩니다. 이 연구는 네덜란드 암 협회 (KWF 부여 UVA 2014-6839)에 의해 지원 되었다. 저자는 프로토콜의 쓰기를 가진 그의 도움에 대 한 박사 A. Jonker 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| D-Glucose 6-phosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | G7879 | |
| Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4) | Merck Millipore | 106559 | |
| di-Sodium succinate | Sigma-Aldrich | W327700 | |
| DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | I1252 | |
| D-Malic acid | Sigma-Aldrich | 2300 | |
| Glycerol Gelatin | Sigma-Aldrich | GG1 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| Lithium 6-phospho-D-galactonate | Sigma-Aldrich | 55962 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| methoxy-Phenazine methosulfate | Serva | 28966.01 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N0505 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | NADP-RO | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Phenazine methosulfate | Serva | 32030.01 | |
| Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed | Sigma-Aldrich | P1763 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck Millipore | 104873 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Bandpass filter | Edmund optics | https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/ | |
| Grey-step wedge | Stouffer Industries | http://www.stouffer.net/TransPage.htm |
References
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