Summary
Här presenterar vi ett protokoll som kan användas för att mikroskopiskt visualisera och kvantifiera aktivitet mellan östradiol och östron i celler och vävnader och dess kinetik, funktion och subcellulär lokalisering.
Abstract
Förändrad cellulär metabolism är ett kännetecken för många sjukdomar, inklusive cancer, hjärt-kärlsjukdomar och infektioner. De metabola motoriska enheterna av celler är enzymer och deras verksamhet är starkt reglerad på många nivåer, inklusive den transkriptionell, mRNA-stabilitet, translationell, post-translationella och funktionell nivå. Denna komplexa förordning innebär att konventionella kvantitativa eller imaging analyser, såsom kvantitativa mRNA experiment, Western blotting och immunohistokemi, ger ofullständig information angående den ultimata aktiviteten av enzymer, deras funktion och/eller deras subcellulär lokalisering. Kvantitativa enzymet cytochemistry och histokemi (dvs metabola mappning) visar ingående information på i situ enzymatisk aktivitet och dess kinetik, funktion och subcellulär lokalisering i en nästan sann-till-naturen-situation.
Vi beskriver ett protokoll för att identifiera aktiviteten av mellan östradiol och östron, som är enzymer som utför redoxreaktioner för att minska kofaktorer som NAD(P)+ och FAD. Celler och vävnadssnitt inkuberas i ett medium som är specifik för den enzymatiska aktiviteten av ett dehydrogenas. Därefter utför på dehydrogenas som är föremål för utredning dess enzymatiska aktivitet i dess subcellulär webbplats. I en kemisk reaktion med reaktion medium genererar detta i slutändan blå-färgade formazan på platsen för den dehydrogenass verksamhet. Den formazan absorbansen är därför ett direkt mått på dehydrogenass verksamhet och kan kvantifieras med monokromatiskt ljus microscopy och bild analys. Den kvantitativa aspekten av detta protokoll gör det möjligt för forskare att dra några statistiska slutsatser från dessa analyser.
Förutom observationsstudier, kan denna teknik användas för hämning studier av särskilda enzymer. I detta sammanhang studier nytta sann-till-naturen fördelarna av metabola kartläggning, kan ger i situ resultat som vara fysiologiskt mer relevant än i vitro enzym hämning studier. I alla är metabola mapping en oumbärlig teknik att studera metabolismen på cell eller vävnad. Tekniken är lätt att anta, ger djupgående, omfattande och integrerade metabola information och möjliggör snabb kvantitativ analys.
Introduction
En viktig hörnsten i cellulär fysiologi är ämnesomsättningen. Ämnesomsättning ger celler med den energi som behövs för alla fysiologiska processer, ger byggstenar för makromolekylära biosyntes och reglerar cellulär homeostas avseende avfallsprodukter, giftiga molekyler och demonteringen och återvinning av onödiga eller dysfunktionella cellulära komponenter. Enzymer katalysera nästan alla vitala cellulära kemiska reaktioner och därför är de motoriska enheterna i fysiologi av celler. 1 , 2
Aktiviteten av enzymer är hårt reglerad på många nivåer och kvantitativa enzym histokemi och cytochemistry (kallas även metabola mappning) är därför att föredra att studera enzym aktivitet i situ. På transkriptionell nivå regleras genuttryck i mRNA. Effekten av regleringen av transkription kan bestämmas med hjälp av kvantitativa mRNA analyser, såsom microarrays eller direkt RNA-sekvensering eller kvalitativa mRNA analyser, såsom in situ - hybridisering som ger information om (sub) cellulära lokalisering av mRNA-molekyler. Detta gör det möjligt att uppskatta relativa skillnader i transkriptionell aktivitet mellan celler. Tolkningen och giltigheten av dessa mRNA analyser med avseende på metabolisk aktivitet är emellertid komplicerat eftersom förordning uppstår även på mRNA-nivå, där ordning och stabilitet av mRNA-molekyler redigeras efter det transkriberas från DNA. Denna redigering reglerar protein isoform översättning och protein översättning kvantitet på ribosomerna. Dessutom protein översättning kontrolleras och i slutändan påverkar enzymet uttryck och därför aktivitet. De kombinerade effekterna av de tidigare nämnda rättsliga steg kan uppskattas med kvantitativa protein uttryck analyser, såsom Western Blotting eller omvänd fas protein lysate microarrays eller kvalitativt protein uttryck analyser, såsom immuncytokemi och immunohistokemi, men dessa metoder misslyckas med att införliva nedströms reglerande effekter såsom posttranslationella modifieringen av proteiner och funktionell reglering av enzymer i deras trånga mikromiljö. Dessutom kan ett uttryck för ett enzym dåligt korrelerar med sin verksamhet, så att Aktivitetsmätningar av en renade enzymet i cell eller vävnad homogenates eller utspädda lösningar används allmänt för enzym aktivitet studier. Dessa experiment fungerar emellertid inte att replikera påverkan av en fullsatt konkurrensbetingat cytoplasman eller organell på aktiviteten hos ett enzym. Dessutom alla ovannämnda tekniker bestämma antingen mängden eller localizationen av mRNA eller enzym uttryck, men inte kan ge omfattande information om båda dessa aspekter av enzymet uttryck, för att inte tala om integrationen av detta information med enzym aktivitet bestämningar. 2 , 3 , 4
Metaboliska mappning kan apprecieringen av alla ovannämnda variabler som bestämmer aktiviteten hos ett enzym. Vad är mer, är metabola mappning en form av levande cell eller vävnad bildbehandling med celler och vävnader som hålls intakt under analysen att generera en nästan sann-till-naturen situation för att generera data av aktiviteten av enzymer. Det ger bilder som underlättar både detaljerad uppskattning av placeringen av enzymaktivitet samt robust kvantifiering av enzymaktivitet inom en cell eller vävnad kupé. 3 , 4 de protokoll som beskrivs här för metabola kartläggning av aktivitet av mellan östradiol och östron baseras på laboratoriet handboken av alla tillgängliga enzym histochemical metoder,5 på principerna om kvantitativa enzym histokemi,6 och på bildanalys av kvantitativa metabola kartläggning. 4
Mellan östradiol och östron är enzymer som utför redoxreaktioner för att minska kanoniska kofaktorer som NAD+, NADP+ och modefluga NADH, NADPH och Fransson2, respektive. Intakta celler eller kryostaten vävnadssnitt som inte är kemiskt fasta inkuberas i en reaktion medium som innehåller, bland andra reagenser, substrat och kofaktorer av en specifik dehydrogenas och en tetrazolium salt. Därefter det Dehydrogenasen utför dess katalytiska aktivitet och minskar, till exempel NADP+ till NADPH. Via en elektron bärare minska 2 NADPH molekyler i slutändan 1 vattenlösliga semi färglös tetrazolium salt molekyl till 1 olöslig blå formazan molekyl som omedelbart fällningar på platsen för Dehydrogenasen. Därför absorbansen av utfällda formazan är ett direkt mått på den lokala aktiviteten ett dehydrogenas och kan observeras med hjälp av ljusmikroskop eller kvantifieras med hjälp av monokromatiskt ljus mikroskopi och bild analys. Den kvantitativa aspekten av detta protokoll gör det möjligt för forskare att dra några statistiska slutsatser från dessa analyser. Dessutom underlättar denna kvantifiering fastställandet av i situ kinetiska enzym parametrar, såsom maximal enzymaktivitet (Vmax) och affinitet av ett substrat för ett enzym (Km). 3 , 4 , 5 , 6
När du planerar en metabolisk mappning experiment, är det viktigt att inse att per experiment, högst femtio glasskivor med vidhängande cell preparat eller vävnadssnitt rekommenderas att minimera förseningar under inkubation för att få konsekvent resultat. Det är möjligt att bearbeta mer bilder eller medellång kompositioner när dessa protokoll steg utförs kooperativt av mer än en försöksledaren. Dessutom finns vissa variationer mellan experiment. Därför identiska experiment bör upprepas minst 3 gånger med cytospins från varje cell förberedelse eller avsnitt från varje vävnadsprov och lämpliga kontroller bör ingå i varje experiment. Alltid förbereda kontroll inkubation medium i avsaknad av substrat men i närvaro av kofaktorer kontroll för icke-specifika enzym aktivitet färgning. De mest representativa resultat erhålls i experiment där olika substrat/kofaktor koncentrationer tillämpas på vävnadssnitt eller cell preparat från samma prov, så att försöksledaren kan utföra analyser av enzymet kinetik med hjälp dos-aktivitet kurvor.
Protocol
Detta protokoll följer riktlinjerna om användning av humant material för medicinsk-etisk granskning styrelse akademiska medicinska Center.
1. beredning av celler eller vävnad sektioner
- Celler
- Trypsinize celler från kultur rätter med 1 mL av 0,25% trypsin-EDTA för 5 min vid 37 ° C i en 10 mm petriskål och föra celler i en 37 ° C suspension av 50.000-200.000 celler/mL, beroende på storleken på cellerna.
- Fäst 200 µL cellsuspension på mikroskopi diabilder med cytospin trattar i en cytocentrifuge på 20 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
- Lufttorka i cytospins under 24 timmar vid rumstemperatur. Detta påverkar inte dehydrogenas aktivitet. 5
- Vävnadssnitt
- Extrahera vävnad från patienter eller djur enligt etiska tillstånd. 10 mm3 vävnad räcker för flera experiment.
- Sätt bitar av vävnad i små ventilerade 2 mL injektionsflaskor av plast och snapin-frysa i injektionsflaskor innehållande en bit vävnad i flytande kväve.
- Lagra flaskorna som innehåller vävnad bitar vid −80 ° C tills vidare bearbetning.
- Använd en gel-liknande medium kallas optimal skärtemperatur (ULT) och montera vävnadsprov på chuck som fryser ner till-20 ° C till-25 ° C snabbt, så att vatten inte kan bilda kristaller.
- Använda en kryostat för skärning och första trimma blocket till önskad nivå (helst halva bredden av en mikroskopi glas bild, t.ex. 5 x 5 mm).
- Vid snittning, använda penslar och en anti-rullningsplattan för att förhindra avsnitten från curling uppåt.
- Skär vävnadsprover i 6-10 µm tjocka sektioner med en långsam men konstant hastighet (1 s per avsnitt). När ett avsnitt skärs korrekt, det är fortfarande platt på mikrotomen kniven under antirullningsplattan.
- Plocka upp 1-3 sektioner på mikroskopiska glasskivor och lagra på −80 ° C fram till användning. Antalet sektioner beredd beror på storleken på vävnadsprov och önskad tjocklek av avsnitten.
2. enzymet Histo/Cytochemistry för lösliga mellan östradiol och östron
- Förbereda reaktion buffert.
- Bereda 100 mL fosfatbuffert rätt pH (se tabell 1; varje enzym har en optimal pH som dess aktivitet är det högsta). Till exempel blanda lösningar av 0,1 M KH2PO4 (surt) och 0,1 M NA2HPO4 (basic) tills en buffert med rätt pH görs.
- Väga 18 g av polyvinylalkohol (PVA) till fosfat bufferten under en spiskåpa som PVA är dammiga och giftigt.
- Upplösa 18% w/v PVA i fosfatbuffert vid 100 ° C vid uppvärmningen bufferten au bain marie (sätta glasflaska i kokande vatten) och omrörning tills PVA är helt upplöst. Lösningen kommer att vara transparent sedan med små luftbubblor som orsakas av omrörningen. Det kräver normalt ~ 15 min för PVA att upplösa.
Obs: 18% w/v PVA i fosfatbuffert är trögflytande och kan överföras till 15 mL buffert reaktionsrören med brett pipett. Kortvarig förvaring av 18% w/v PVA i fosfatbuffert bör ske vid ≥40 ° C och långsiktig lagring (upp till 2 veckor) på ≥ 60 ° C. 250 µL av 18% w/v PVA i fosfatbuffert krävs vanligtvis för ett cytospin preparat, medan 500 µL krävs för en vävnad avsnitt.
- Upplösa 18% w/v PVA i fosfatbuffert vid 100 ° C vid uppvärmningen bufferten au bain marie (sätta glasflaska i kokande vatten) och omrörning tills PVA är helt upplöst. Lösningen kommer att vara transparent sedan med små luftbubblor som orsakas av omrörningen. Det kräver normalt ~ 15 min för PVA att upplösa.
- Bered tetrazolium salt (nitroBT). För varje 1 mL inkubation medium, 40 µL nitroBT lösning krävs, bestående av 5 mg nitroBT (ett gult pulver) löses i en blandning av 20 µL dimetylformamid (DMF) och 20 µL etanol, som kommer att vara en ljus gul genomskinlig lösning.
Obs: Eftersom stabiliteten av nitroBT är den lägsta av alla nödvändiga reagens, det rekommenderas att förbereda nitroBT stamlösning senast och upplösa nitroBT till reaktion medium först.- Lös upp nitroBT i DMF och etanol genom att värma det i en injektionsflaska av glas under en kort tidsperiod (~ 10 s) med hjälp av en bunsenbrännare. Skaka injektionsflaskan under uppvärmning och lämna inte injektionsflaskan för länge i lågan att förhindra avdunstning.
- Tjäna 10% extra nitroBT lösning för avdunstning av DMF och etanol under Proteinupplösande processen.
- Skydda den elektron bärare phenazine metosulfat (PMS) eller (1-metoxi)-phenazine metosulfat (mPMS) och inkubation media som innehåller m(PMS) från direkt ljus genom att Linda aluminiumfolie runt lagring glasflaskan.
- Förbereda reagens lösningar enligt tabell 1 genom att lösa upp dem i destillerat H2O. Vissa reagenser förgås snabbt, så förbereda dem så strax innan experimentet som möjligt. Hålla reagens lösningar på is eller vid 4 ° C fram till användning.
- Förbereda inkubation media som visas i tabell 1 och homogenisera lösningen efter varje steg genom skonsam omrörning. Undvika generationen av luftbubblor i inkubation medium genom omrörning och hålla spateln under ytan av inkubation medium under omrörning.
- Tillämpa inkubation Medium på vävnadssnitt
- Pre varma mikroskopi glider med cytospins eller vävnadssnitt fäst vid 37 ° C i en immunohistokemi inkubation kammare för 15 min. doppa botten av immunhistokemi inkubation kammaren med varmt vatten för att hålla en konstant temperatur i det inkubator.
- Försiktigt bryta eller såga av Pasteur-Pipetter på övergången från smalt till den breda delen. Regelbundna Pasteur-pipetter är för smal för att aspirera trögflytande inkubation medium, så detta steg behövs för att göra Pasteur pipetter tillräckligt bred för ambitionen av inkubation medium.
- Gälla varje cell beredning eller vävnad avsnitt på mikroskopi diabilder med den breda delen av en Pasteur-pipett 250-500 µL av lämpliga inkubation medium.
- Använd pipettspetsen för att sprida ut inkubation medium jämnt. Bortse från små luftbubblor i inkubation medium, eftersom dessa kommer att flyta till ytan och inte stör den enzymatiska reaktionen i cell beredning eller vävnaden avsnittet i mikroskopi bilden.
- Ruva cell preparat eller vävnadssnitt på mikroskopi bilderna i en 37 ° C-inkubator (t.ex. en vävnadskultur inkubator) för en förutbestämd varaktighet, beroende på enzymkinetik och dess uttryck i en viss cell beredning eller vävnad (tabell 1). Hålla locket på immunohistokemi inkubation avdelningen stängd för att upprätthålla en fuktig miljö för att förhindra reaktion bufferten från att torka ut.
- Tvätta mikroskopi bilder
- Tryck på av överskjutande inkubation medium på en vävnad.
- Mekaniskt skölj inkubation medium från mikroskopi bilder i 60 ° C fosfatbuffert, pH 5.3, genom att flytta mikroskopi bilder upp och ner i bufferten. Detta stoppar den enzymatiska reaktionen.
- Tvätta mikroskopi bilder genom att hålla dem i 60 ° C fosfatbuffert, pH 5.3 i 20 min.
- Mekaniskt tvätta mikroskopi bilderna i 60 ° C vatten.
- Tvätta mikroskopi bilder genom att hålla dem i 60 ° C vatten i 20 min.
- Låt vattnet och bilder kyla ner genom att blanda långsamt rumstemperatur kranvatten med 60 ° C kranvatten under loppet av en minut.
- Utföra en slutlig mekanisk tvätt steg i rumstemperatur destillerat vatten.
- Bifoga den färgade Cytospins eller vävnadssnitt på mikroskopi bilder
- Pre värma en bild varmare vid 50-60 ° C.
- Försiktigt torka baksidan av mikroskopi bilderna med en pappershandduk och placera dem på bilden varmare torka ovansidan av mikroskopi bilden.
- När bilderna är torra, omsluter cellen preparat eller vävnadssnitt på mikroskopi diabilder med glycerol gelé monteringsmedium och coverslips.
- Spara i cell preparat eller vävnad sektioner mikroskopi bilderna i mörker i kylskåp vid 4 ° C eller omedelbart fortsätta med bild förvärv.
3. bild förvärv
- Spela in bilder med en vetenskaplig svartvit CCD kamera med tillräckligt dynamiskt omfång (minst 8-bitars men helst 10-bitars eller 12-bitars), fast vinst och en linjär respons.
- Välj ett korrekt mål (20 X-63 X för cytospins) och 10-63 X för vävnadssnitt.
- Minska bländning av förträngning fältbländaren så att det är något större än synfältet.
- Användning monokromatiskt ljus genom att tillämpa ett 10 nm brett inferens bandpassfilter nära isobestic våglängd av formazan fällning7 i kombination med en infraröd blockering filtrera (se Material tabell).
Obs: Maximalt isobestic absorbans nitroBT är på 585 nm. - Optimera belysning för att säkerställa att hela grå nivå sortimentet av kameran används (dvs ange belysning så att maximal belysning uppnås utan att överexponera när du spelar in ett tomt objektglas).
- Kalibrera uppmätta grå nivåer till känd absorbans (eller optisk densitet [OD]) värden. För detta ändamål ta gråskala bilder av minst 10 olika steg i en kalibrering bild eller steg surfplatta med kända OD-värdena (se steg 4.1.1), antingen kommersiellt tillgängliga (se Material tabell) eller mäta en skräddarsydd gråskalan Kil steg tablet av en densitophotometer och använda resultaten att kalibrera mätt grå värden till kända absorbansvärden.
- Fånga mikrofotografier av celler eller vävnad sektioner av intresse.
4. bildanalys
- Innan bildanalys, kalibrera ImageJ programvaran för absorbans mätningar.
- Mät absorbansen (OD) av mikrofotografier av minst 10 kalibrering områden med känd absorbans parametrar i kalibrering bild eller steg tabletten med kända OD-värdena. I ImageJ, använda analysera → åtgärd-menyn eller Ctrl + M hotkey för att mäta ett markerat område.
- Starta absorbansen kalibreringen genom att analysera → kalibrering. Välj funktionen ”Rodbard (NIH bild)”. I den vänstra kolumnen i fönstret som öppnas, är grå nivå mätresultaten från varje steg av kalibrering bild/steg tabletten utförs i 4.1.1 redan närvarande. Om inte, kopiera dem från skärmen ImageJ resultat. I den högra kolumnen ange varje motsvarande kända absorbansvärde som tryckt på det certifikat som du fått med kalibrerad steg tabletten. Markera kryssrutorna ”Global kalibrering” och ”Visa tomt” och tryck på ”OK”.
- För kvalitetskontroll, se till att den R2 för funktionen Rodbard är > 0,99. Om det är < 0,99, kontrollera huruvida kalibrering bilderna var fotograferade och mäts korrekt och om de kända absorbans parametrarna har angetts korrekt.
- ImageJ är nu kalibrerad tills du stänger programmet (därav ”Global kalibrering”). För absorbans mätningar, en kalibrerad ImageJ session alltid konverterar observerade absorbansen innebär att värden mellan 0 och 1, där 0 och 1 är asymptoter noll och full absorbans, respektive.
- För cytospins, väljer du > 100 enstaka celler på ett slumpmässigt sätt. För vävnadssnitt, Välj ett eller flera områden av intresse för en fast längd och bredd i alla sektioner.
- Projektet ett raster över de mikrofotografier att hjälpa opartisk cellmarkeringar. I ImageJ, projekt ett rutnät över en bild via menyn Plugins → analysera → rutnät.
- Använd verktyget Elliptical för att välja enstaka celler i ImageJ, och använda verktyget rektangel Välj vävnad regioner.
- Mät absorbansen och område i markerade celler eller vävnad regioner. De optiska densitet och området kallas ”betyder” och ”område” i ImageJ resultat kalkylblad, respektive.
Obs: Totala absorbansen hos en cell eller vävnad region (om du har markerat flera vävnad regioner med olika storlekar) är lika med summan av alla separerade pixel absorbanserna. Om en cell är fotograferad av 1000 pixlar, sedan totala absorbansen ges av summan av 1000 absorbanserna och genomsnittlig absorbans ges av totala absorbansen/1000. Detta förfarande även undviker fördelningsmässiga fel. - Fastställa genomsnittliga totala absorbans > 30 celler eller vävnad regioner från den kontroll diabild(er), som innehåller ett urval som var utsatt för att styra inkubation medium i avsaknad av substrat men i närvaro av kofaktorer. Denna kontroll absorbansen används till kontroll för icke-specifika enzym aktivitet färgning och absorbansen artefakter induceras av begagnade mikroskopi bilderna, montering medium, täckglas eller Mikroskop.
- Subtrahera genomsnittliga kontroll absorbansen från alla totala absorbansen mätningar av prover som utsattes för inkubation medium med samma koncentration av kofaktor (men olika koncentrationer av substrat eller -hämmare). Detta ger en cell eller vävnad region korrigerade totala absorbans.
- Statistiskt jämföra genomsnittliga korrigerade totala absorbanserna med Students T-test eller one-way ANOVA-test, beroende på din experimentell design.
- Formazan absorbansen kan omvandlas till enzym aktivitet (µmol omvandlas substrat per mL per minut) med lagen av Lambert-öl: c=A/(є×d), där c är koncentrationen av formazan reaktion medium, A är den uppmätta absorbansen i ImageJ efter kalibrering; Є är koefficienten för utrotning av formazan (16.000 på 585 nm)8 och d är ljus reser avstånd, vilket är lika med den genomsnittliga cell tjocklek eller nominell snittjocklek skärning (6-10 µm i detta protokoll).
Obs: Efter torkning, vävnad snittjockleken minskar ~ 50% från nominell snittjocklek skärning, men detta återspeglas inte i beräkningen ovan eftersom nominell snittjocklek skärning är biologiskt mest relevant. Genomsnittliga cell tjocklek och sfär dimensioner av cell preparates följs mikroskopi glasskivor kan bestämmas med konfokalmikroskopi eller wide-fältet mikroskopi, för vilka protokoll finns någon annanstans. 9 , 10
Representative Results
Flera protokoll att förbereda inkubation medium visas att undersöka aktiviteten av en viss dehydrogenas. Varje dehydrogenas, upplösa de börsnoterade reagenserna i PVA-lösningen samtidigt bibehålla en temperatur av minst 37 ° C. Reagenserna bör lösas upp i den ordning som visas i tabellen, dvs nitroBT löses alltid först och (m) PMS löses alltid senast. Varje 5 mg av nitroBT löses i 40 µL mix (20 µL etanol + 20 µL dimetylformamid). Alla volymer är per 1 mL 18% PVA lösning, som kan användas för att färga ~ 2 vävnadssnitt eller ~ 4 cell preparat på glasskivor. NitroBT, NAD+, NADP+, ADP och substrat lösningar bör göras färsk. NaN3, MgCl2 (m) PMS lösningar kan lagras vid 4 ° C för en månad. 18% PVA löst fosfat buffert kan lagras vid 60 ° C i 2 veckor. De 18% PVA lösningen pH kan ställas in med olika sammansättningar av 0,1 M kaliumdivätefosfat (KH2PO4) och 0,1 M dinatrium väte fosfat (NA2HPO4) buffertar. Visad inkubation perioder ger bra utgångspunkter, men de optimala inkubation perioderna beror på arten, vävnadstyp och bevarandet av vävnaden. I allmänhet bör cell preparat inkuberas längre än vävnadssnitt att få en liknande nivå av formazan produktion.
Vildtyp isocitrate dehydrogenas 1 och 2 (IDH1/2) katalyserar omvandlingen av isocitrate till α-ketoglutarat (αKG) med samtidig minskning av NADP+ till NADPH i cytoplasman och mitokondrierna, respektive. Dessa enzymer har nyligen rönt intresse eftersom IDH1/2 mutationer förekommer i olika typer av human cancer, inklusive primär hjärncancer (glioblastoma) och kolorektal cancer, och erbjuder en unik möjlighet att demonstrera möjligheterna till metaboliska mappning. IDH1 mutationer inaktivera IDH1 vildtyp enzymaktivitet och också inducera en neo-enzymatisk aktivitet som leder till produktion och efterföljande ackumulation av oncometabolite D-2-hydroxyglutarate (D-2 HG),11 som är diskuteras på annat håll i detalj. 12 metabola mappning experiment visade att NADP+-beroende IDH1/2 aktivitet var signifikant lägre i kolorektal carcinom celler med en knackade-i heterozygot IDH1 mutation än i kolorektal carcinom celler som var IDH1 vildtyp (figur 1A). Denna skillnad kvantifierades genom bildanalys av monokromatiskt ljus mikrofotografier (figur 1B). 12
Ett illustrerande exempel på metabola mappning experiment visas i figur 2, som är en bild av ett kryostaten avsnitt av mus hjärnan som injicerades med mänskliga glioblastoma celler. IDH1/2 är det viktigaste NADPH i mänskliga hjärnan och dess verksamhet är uppreglerad i vildtyp IDH1/2 glioblastom, IDH1/2 NADPH produktionskapacitet är mycket lägre i hjärnan hos gnagare. 11 Figur 2A visar skillnaden mellan den höga NADPEN+-beroende IDH1/2 aktivitet i mänskliga glioblastoma celler och den låga NADPEN+-beroende IDH1/2 aktivitet i friska mus hjärnan. IDH1/2 aktivitet kvantifieras som µmol NADPH produktion per mL av vävnad per minut i figur 2B.
Den enzymatiska reaktionen IDH1/2 är relativt okomplicerad, men laktatdehydrogenas (LDH) är en mer komplicerad enzymkomplex. LDH konverterar reversibla omvandlingen från laktat till Pyruvat med samtidig minskning av NAD+ till NADH eller vice versa. Tillgängligheten av laktat och pyruvat och sammansättningen av enzymet LDH komplexa dikterar huruvida laktat primärt omvandlas till Pyruvat (som katalyseras av LDH-B och ger NADH) eller huruvida pyruvat omvandlas främst för att laktat (som är katalyseras av LDH-A och förbrukar NADH). 13 metabola mappning experiment är att visualisera aktiviteten av LDH-B reaktionen, men de är ”blinda” för aktiviteten av LDH-A reaktionen eftersom NADH produktion uppstår inte och följaktligen nitroBT inte reduceras till formazan. Figur 3 visar NAD+-beroende LDH aktivitet (dvs. omvandling av laktat till Pyruvat) i mänskliga hjärnan avsnitten i avsaknad av substrat (figur 3A), i närvaro av en hög koncentration av laktat (figur 3B ), i närvaro av 6 mM laktat (figur 3 c) och i närvaro av en låg koncentration av laktat och pyruvat (figur 3D) i högre koncentration. Resultaten av dessa experiment illustrerar metabola mappning på lämpligt sätt fångar som NAD+-beroende LDH aktivitet i vävnadssnitt beror på tillgängligheten av laktat och pyruvat reaktion medium.
Figur 1 . NADP+-beroende IDH1/2 aktivitet av mänskliga kolorektal carcinom celler. (A) representativa monokromatiskt ljus mikrofotografier HCT116 mänskliga kolorektal carcinom celler efter färgning för NADP+-beroende IDH1/2 aktivitet mot 1-10 mM isocitrate och 0,8 mM NADP+. Skala barer = 50 µm. (B) en kvantifiering av absorbans blå formazan produceras från nitroBT av NADP+-beroende IDH1/2 aktivitet per cell visas med användning av monokromatiskt ljus (a) och bildanalys. Förkortningar: IDH1WT/WT, isocitrate-dehydrogenas 1 vildtyp; IDH1WT/MUT, isocitrate-dehydrogenas 1 muterad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . NADP+-beroende IDH1/2 aktivitet av mänskliga glioblastoma prover. (A) representativa photomicrograph en mus hjärnan avsnitt som innehåller friska mus hjärnan (h) och en mänskliga glioblastoma tumör xenograft (t) efter färgning för NADP+-beroende IDH1/2 aktivitet i närvaro av 0,8 mM NADP+ och 2 mM isocitrate. Skalstapeln = 200 µm (B) enzym aktivitet kvantifiering av mus hjärnan (h) och mänskliga glioblastoma xenograft (t) visas i (A) med lagen av Lambert-öl. Felstaplar representera standardavvikelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . NAD+-beroende av laktatdehydrogenas (LDH) aktivitet av mänskliga hjärnan prover. Representativa mikrofotografier seriell avsnitt av mänskliga hjärnan prover efter färgning för NAD+-beroende LDH aktivitet (A) mot kontroll villkor (i avsaknad substrat och pyruvat, 3 mM NAD+ endast) (B) laktat i avsaknad av pyruvat och (D) mot 6 mM laktat i närvaro av 18 mM pyruvat, den konkurrerande produkt hämmaren av laktat-till-Pyruvat reaktionen mot 150 mM laktat i avsaknad av pyruvat (C) mot 6 mM. Skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Enzym: | G6PDH | LDH | SDH | MDH | IDH1 | IDH2 | IDH3 | 6PGD | GDH |
| PVA 18% i 100 mM fosfatbuffert | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 8,0 | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 8,0 | 1 mL; pH = 8,0 |
| 5 mM NitroBT | 5 mg/40 µL mix | 5 mg/40 µL mix | 5 mg/40 µL mix | 5 mg/40 µL mix | 5 mg/40 µL mix | 5 mg/40 µL mix | 5 mg/40 µL mix | 5 mg/40 µL mix | 5 mg/40 µL mix |
| 5 mM NaN3 | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | |
| 5 mM MgCl2 | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | |||
| 3 mM NAD+ | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | ||||||
| 0,8 mM NADP | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | ||||
| 2 mM ADP | 10 ΜL | ||||||||
| substrat | 10 mM glukos-6-fosfat | 150 mM laktat | 50 mM succinat | 100 mM äppelsyra | 2 mM isocitrate | 2 mM isocitrate | 2 mM isocitrate | 10 mM 6-phospho-galactonate | 10 mM glutaminsyra |
| 0,32 mM mPMS | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | ||||
| 0,2 mM PMS | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | |||||
| Inkubation varaktighet | 5 min | 30 min | 60 min | 60 min | 30 min | 30 min | 30 min | 10 min | 30 min |
Tabell 1. Schematisk översikt av protokollet metabola mappning för mellan östradiol och östron. Förkortningar: ADP, adenosindifosfat; (m) PMS (metoxi) -5-methylphenazinium metyl sulfate; nitroBT, nitro blue-tetrazoliumklorid; G6PDH, glukos-6-fosfatdehydrogenas; LDH, laktatdehydrogenas; SDH, succinat dehydrogenas; MDH, malate dehydrogenas; IDH, isocitrate-dehydrogenas; 6PGD, 6-phosphogluconate-dehydrogenas; GDH, glutamat dehydrogenas.
Discussion
Forskning på cellulär metabolism upplever nu en renässans eftersom forskare inser nu att metabola effekter är av avgörande betydelse för patogenes och behandling av många sjukdomar. 1 dessutom metabolisk forskning är understödda av en ökande tillgången till tekniker som tillhandahåller forskningsområdet med fler verktyg än någonsin, inklusive masspektrometri, Radioisotopiska märkning och kärnmagnetisk resonans spectrometry. Metaboliska mappning är ingalunda ny teknik, men dess kapacitet att ge integrerad information om aktiviteten av enzymer i en nästan sann-till-naturen-situation gör denna teknik mer relevant än någonsin. 2
Kofaktorer NAD+ och NADP+ finns i alla levande celler, vilket indikerar att mellan östradiol och östron uppstod mycket tidigt under utvecklingen och har viktiga roller i cellulär metabolism. 14 , 15 för närvarande finns 523 enzymkatalyserade reaktioner som klassificeras som mellan östradiol och östron och förekomma på alla arter. 16 teoretiskt, aktiviteten av alla olika dehydrogenas reaktioner kan separat undersökas genom tweaking det metabola kartläggning-protokollet som beskrivs här. Varje enzymatisk reaktion är unik genom underlaget och kofaktorer som behövs för verksamheten. Därför kan aktiviteten av varje enzymatisk reaktion bestämmas med hjälp av en metabolisk mappning experiment med lämpliga substrat och kofaktorer reaktion medium. Dock vissa enzym isoformer skiljer sig åt i deras subcellulär lokalisering, e.g. en isoform katalyserar en reaktion i cytoplasman medan en annan isoform fungerar i mitokondrierna. Ett anmärkningsvärt exempel är IDH1 och IDH2, varav den förstnämnda är cytoplasmiska och den senare är mitokondrie och som är två olika proteiner som kodas av två olika gener. 11 1-metoxi-5-methylphenazinium methylsulfate (metoxi-PMS) och 5-methylphenazinium methylsulfate (PMS) kan både användas som elektron bärare för dessa experiment. Den förstnämnda passerar inte mitokondriell membran, den sistnämnda har. Utredningar på mitokondriella enzymer (t.ex. IDH2) bör därför använda PMS medan utredningar på cytosoliska enzymerna (e.g. IDH1) bör använda mPMS.
Som med många tekniker, variationer av detta protokoll, som att använda olika typer av tetrazolium salter, exklusive tillägg av PMS och natriumazid, använda en vattenlösning monteringsmedium, och varierande inkubation och sköljning gånger, existerar och kan fungera lika bra. Tillämpningen av metabola mappning med tetrazolium salter är inte begränsat till mellan östradiol och östron. Med små ändringar av protokollet, kan det också användas för bedömning av aktiviteten av enzymer som fungerar direkt uppströms ett dehydrogenas i en metaboliska väg. Vi har tidigare beskrivit denna princip för enzymet glutaminase,17 som fungerar direkt uppströms glutamat dehydrogenas i glutaminolysis väg. 18 i teorin samma princip kan tillämpas på andra enzymer som funktion direkt nedströms eller uppströms ett dehydrogenas t.ex. aconitase, som ligger direkt uppströms IDH2 och IDH3 i den tricarboxylic syran (TCA) cykel. En annan enkel variant av de koncentrationer som beskrivs i tabell 1 är genom att göra inkubation medium injektionsflaskor med olika koncentrationer av substrat, kofaktor eller hämmare. Detta tillåter generationen av dos-aktivitet kurvor som en funktion av substrat, kofaktor eller hämning.
Tekniskt sett, metabola mappning experiment underlättar inte opartiska yttranden i situ enzymaktivitet, eftersom forskare har att välja ett substrat och kofaktor koncentration som inte kanske återspeglar de substrat och kofaktor nivåerna som är närvarande i situ. Dessutom användningen av trögflytande 18% PVA reaktion medium tjänar till att hålla makromolekyler intakt, på plats och i konformation men förbjuder effektiv spridning av låg molekylvikt reagenser genom reaktion. 3 , 5 därför de beslutsamma Enzymaktiviteter i de experiment som beskrivs här som använder suprafysiologiska substrat koncentrationer inte återspeglar i vivo situationen vid en viss substrat koncentrationen men lämpar sig för inom experimentell jämförelser. Resultatet av metabola mappning experiment är alltså en enzymatisk reaktion i samband substrat och kofaktor nivåer som är närvarande i situproduktionskapacitet (maximal aktivitet). Dessutom tillåter användning av olika koncentrationer av substrat eller kofaktorer och flera prover opartisk jämförelse av maximal produktionskapacitet (Vmax) och affinitet (Km) av ett enzym för en substrat/kofaktor i cell preparat , vävnader eller vävnad regioner. Dessa parametrar är resultatet av summan av enzymet proteinuttryck, post-translationella modifieringar och effekten av en fullsatt närmiljön på aktiviteten av enzymer. Metaboliska mappning är därför fortfarande en bättre återspegling av enzymaktivitet än experiment som bestämma proteinuttryck eller renade enzymet aktivitet in vitro.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
R.J.M. stöds av en AMC PhD stipendium. Denna forskning stöddes av den holländska Cancer Society (KWF grant UVA 2014-6839). Författarna vill tacka Dr A. Jonker för hans hjälp med skrivandet av protokollet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| D-Glucose 6-phosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | G7879 | |
| Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4) | Merck Millipore | 106559 | |
| di-Sodium succinate | Sigma-Aldrich | W327700 | |
| DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | I1252 | |
| D-Malic acid | Sigma-Aldrich | 2300 | |
| Glycerol Gelatin | Sigma-Aldrich | GG1 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| Lithium 6-phospho-D-galactonate | Sigma-Aldrich | 55962 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| methoxy-Phenazine methosulfate | Serva | 28966.01 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N0505 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | NADP-RO | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Phenazine methosulfate | Serva | 32030.01 | |
| Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed | Sigma-Aldrich | P1763 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck Millipore | 104873 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Bandpass filter | Edmund optics | https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/ | |
| Grey-step wedge | Stouffer Industries | http://www.stouffer.net/TransPage.htm |
References
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metab. 23 (1), 27-47 (2016).
- Van Noorden, C. J. Imaging enzymes at work: metabolic mapping by enzyme histochemistry. J Histochem Cytochem. 58 (6), 481-497 (2010).
- Mcmanus, L. M., Mitchell, R. N. Pathobiology of Human Disease. , Elsevier. 3760-3774 (2014).
- Chieco, P., Jonker, A., De Boer, B. A., Ruijter, J. M., Van Noorden, C. J. Image cytometry: protocols for 2D and 3D quantification in microscopic images. Prog Histochem Cytochem. 47 (4), 211-333 (2013).
- Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. Enzyme histochemistry : a laboratory manual of current methods. , Oxford University Press, Royal Microscopical Society. (1992).
- Van Noorden, C. J. F., Butcher, R. G. Histochemistry, theoretical and applied. Vol 3.: enzyme histochemistry. Stoward, P. J., Pearse, A. G. E. , Churchill Livingstone. 355-432 (1991).
- Van Noorden, C. J., Tas, J., Vogels, I. M. Cytophotometry of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual cells. Histochem J. 15 (6), 583-599 (1983).
- Butcher, R. G. The measurement in tissue sections of the two formazans derived from nitroblue tetrazolium in dehydrogenase reactions. Histochem J. 10 (6), 739-744 (1978).
- Matsumoto, B. Cell biological applications of confocal microscopy. , Elsevier. (2002).
- Errington, R. J., White, N. S. Measuring dynamic cell volume in situ by confocal microscopy. Methods Mol Biol. 122, 315-340 (1999).
- Molenaar, R. J., Radivoyevitch, T., Maciejewski, J. P., van Noorden, C. J., Bleeker, F. E. The driver and passenger effects of isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations in oncogenesis and survival prolongation. Biochim Biophys Acta. 1846 (2), 326-341 (2014).
- Molenaar, R. J., et al. Radioprotection of IDH1-Mutated Cancer Cells by the IDH1-Mutant Inhibitor AGI-5198. Cancer Res. 75 (22), 4790-4802 (2015).
- Khurshed, M., Molenaar, R. J., Lenting, K., Leenders, W. P., van Noorden, C. J. F. In silico gene expression analysis reveals glycolysis and acetate anaplerosis in IDH1 wild-type glioma and lactate and glutamate anaplerosis in IDH1-mutated glioma. Oncotarget. 8 (30), 49165-49177 (2017).
- Alberts, B. Molecular biology of the cell. , Sixth, Garland Science, Taylor and Francis Group. (2015).
- Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, G. J., Stryer, L. Biochemistry. , Eighth edition, W.HFreeman & Company, a Macmillan Education Imprint. (2015).
- Webb, E. C. International Union of Biochemistry and Molecular Biology. Enzyme nomenclature 1992 : recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes. , Published for the International Union of Biochemistry and Molecular Biology by Academic Press (1992).
- Botman, D., Tigchelaar, W., Van Noorden, C. J. Determination of Phosphate-activated Glutaminase Activity and Its Kinetics in Mouse Tissues using Metabolic Mapping (Quantitative Enzyme Histochemistry). J Histochem Cytochem. 62 (11), 813-826 (2014).
- van Lith, S. A., et al. Glutamate as chemotactic fuel for diffuse glioma cells: are they glutamate suckers? Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 66-74 (2014).
