Metaboliske kortlægning: Kvantitative enzym Cytochemistry og histokemi at bestemme aktiviteten af Dehydrogenases i celler og væv

Summary

Vi præsenterer her, en protokol, der kan bruges til mikroskopisk visualisere og kvantificering af aktiviteten af dehydrogenases i celler og væv og dens forsvindingskinetik, funktion og subcellulært lokalisering.

Abstract

Ændrede cellulære metabolisme er kendetegnende for mange sygdomme, herunder kræft, hjerte-kar-sygdomme og infektion. De metaboliske motor enheder af celler er enzymer og deres aktivitet er stærkt reguleret på mange niveauer, herunder det transkriptionel, mRNA stabilitet, translationel, posttranslationelle og funktionelle plan. Dette kompleks forordning betyder, at konventionelle kvantitative eller tænkelig assays, såsom kvantitative mRNA eksperimenter, Western blotting og immunhistokemi, giver ufuldstændige oplysninger om den ultimative aktivitet af enzymer, deres funktion og/eller deres subcellulært lokalisering. Kvantitative enzym cytochemistry og histokemi (dvs. metaboliske kortlægning) Vis dybdegående information i situ enzymatisk aktivitet og dens kinetik, funktion og subcellulært lokalisering i en næsten ægte-til-naturen situation.

Vi beskriver en protokol for at registrere aktiviteten af dehydrogenases, som er enzymer der udfører redox reaktioner for at reducere cofaktorer som NAD(P)⁺ og FAD. Celler og væv sektioner er inkuberes i et medium, der er specifikke for ét dehydrogenase enzymatisk aktivitet. Efterfølgende, udfører den dehydrogenase, der er genstand for undersøgelsen RuBisCOs enzymaktivitet i sin subcellulært hjemmeside. I en kemisk reaktion med reaktion medium skaber dette i sidste ende blå-farvet formazankoncentrationen i stedet for den dehydrogenase aktivitet. Formazankoncentrationens absorbans er derfor en direkte måling af den dehydrogenase aktivitet og kan kvantificeres ved hjælp af monokromatisk lys mikroskopi og billede analyse. Det kvantitative aspekt af denne protokol gør det muligt for forskere at drage statistiske konklusioner af disse assays.

Udover observationsstudier, kan denne teknik bruges til hæmning undersøgelser af specifikke enzymer. I denne sammenhæng, undersøgelser fordel fra sand-til-naturen fordelene ved metaboliske kortlægning, kan giver resultater, og i situ der være fysiologisk mere relevant end in vitro- enzym hæmning undersøgelser. I alt er metaboliske mapping en uundværlig teknik til at studere metabolisme på celle- eller vævsdel niveau. Teknikken er let at vedtage, indeholder dybdegående, omfattende og integreret metaboliske oplysninger og giver mulighed for hurtig kvantitativ analyse.

Introduction

En afgørende hjørnesten for cellulær fysiologi er stofskiftet. Stofskifte giver celler med den energi, der kræves for alle fysiologiske processer, leverer byggesten for makromolekylære biosyntese og regulerer cellulær homøostase affaldsprodukter, giftige molekyler og dekompileringen og genanvendelse af unødvendige eller dysfunktionelle cellulære komponenter. Enzymer katalyserer næsten alle afgørende cellulære kemiske reaktioner og derfor er de motoriske enheder i fysiologi af celler. ^{1 , 2}

Aktiviteten af enzymer er stramt reguleret på mange niveauer og derfor kvantitative enzym histokemi og cytochemistry (også kaldet metaboliske kortlægning) er den foretrukne metode til at studere enzym aktivitet in situ. På niveauet transcriptional er genekspression i mRNA reguleret. Virkningen af regulering af transkription kan bestemmes ved hjælp af kvantitative mRNA assays, såsom microarrays eller direkte RNA sekvensering eller kvalitative mRNA assays, som in situ hybridisering, som giver oplysninger om (sub) trådløse lokalisering af mRNA molekyler. Dette gør det muligt at værdsætte relative forskelle i transcriptional aktivitet mellem celler. Fortolkning og gyldighed af disse mRNA assays til metaboliske aktivitet er imidlertid komplicerede, fordi forordning forekommer også på mRNA niveau, hvor sekvens og stabilitet af mRNA molekyler er redigeret efter det er transskriberet fra DNA. Denne redigering regulerer protein isoform oversættelse og protein oversættelse mængde på ribosomer. Derudover protein oversættelsesprocessen er kontrolleret og i sidste ende påvirker enzym udtryk og derfor aktivitet. De kombinerede virkninger af de ovennævnte lovgivningsmæssige skridt kan blive værdsat bruger kvantitativ protein udtryk assays, såsom Western Blotting eller omvendt fase protein lysate microarrays eller kvalitative protein udtryk assays, som immuncytokemi og immunhistokemi, men disse teknikker undgå at indarbejde downstream regulerende virkninger såsom posttranslationel modifikation af proteiner og funktionelle regulering af enzymer i deres overfyldte mikromiljø. Endvidere kan udtryk for et enzym dårligt korrelerer med sin aktivitet, således at aktiviteten målinger af en renset enzym i celle- eller vævsdel homogeniseret eller fortyndet løsninger er almindeligt brugt til enzym aktivitet undersøgelser. Men disse forsøg ikke at replikere en overfyldt opdelte cytoplasma eller organelle indflydelse på aktiviteten af et enzym. Desuden, alle førnævnte teknikker bestemme enten mængden eller lokalisering af mRNA eller enzym udtryk, men er ikke i stand til at give omfattende oplysninger på begge disse aspekter af enzymet udtryk for slet ikke at tale om integration af dette oplysninger med enzym aktivitet bestemmelser. ^{2 , 3 , 4}

Metaboliske kortlægning giver påskønnelse af alle de førnævnte variabler, der bestemmer aktiviteten af et enzym. Hvad mere er, er metabolisk mapping en form for levende celler eller væv imaging med celler og væv, der er bevaret intakt under analysen til at generere en næsten ægte-til-naturen situation at frembringe data af aktiviteten af enzymer. Det producerer billeder, der fremmer både detaljeret forståelse af placeringen af enzymaktivitet samt robust kvantificering af enzymaktivitet i en celle- eller vævsdel rum. ^{3 , 4} de protokoller er beskrevet her for metaboliske kortlægning af aktiviteten af dehydrogenases er baseret på laboratorium manual af alle tilgængelige enzym histokemiske metoder,⁵ på principperne om kvantitative enzym histokemi,⁶ og på billedanalyse af kvantitative metaboliske kortlægning. ⁴

Dehydrogenases er enzymer, der udfører redox reaktioner for at reducere kanoniske cofaktorer NAD⁺, NADP⁺ og FAD til NADH og NADPH FADH₂, henholdsvis. Intakt celler eller væv frysemikrotomsnit, der ikke er kemisk faste inkuberes i en reaktion medium, der indeholder, blandt andre reagenser, substrat og cofaktorer af en specifik dehydrogenase og en tetrazolium salt. Efterfølgende, at dehydrogenase udfører sin katalytiske aktivitet og reducerer f.eks NADP⁺ til NADPH. Via en elektron luftfartsselskab reducere 2 NADPH molekyler i sidste ende 1 vandopløselige semi-farveløs tetrazolium salt molekyle i 1 vanduopløselige blå formazankoncentrationen molekyle, der straks udfældes i stedet for dehydrogenase. Derfor absorbansen af udfældet formazankoncentrationen er en direkte måling af den lokale aktivitet af en dehydrogenase og kan observeres ved hjælp af lysmikroskopi eller kvantificeres ved hjælp af monokromatisk lys mikroskopi og billede analyse. Det kvantitative aspekt af denne protokol gør det muligt for forskere at drage statistiske konklusioner af disse assays. Derudover letter denne kvantificering bestemmelse af i situ kinetic enzym parametre, såsom maksimal enzymaktivitet (V_max) og affinitet af et substrat for et enzym (K_m). ^{3 , 4 , 5 , 6}

Når du planlægger en metabolisk kortlægning eksperiment, er det vigtigt at indse, at et maksimum af 50 glas dias med vedhængende celle præparater eller væv sektioner pr. eksperiment, anbefales at minimere forsinkelser under inkubation for at opnå overensstemmelse resultater. Det er muligt at behandle flere dias og/eller mellemstore kompositioner, når disse protokollen trin udføres sammen af mere end én eksperimentator. Desuden findes nogle variation mellem eksperimenter. Derfor identiske eksperimenter bør gentages mindst 3 gange med cytospins fra hver celle forberedelse eller sektioner fra hver vævsprøve og passende kontrol bør medtages i hvert forsøg. Altid udarbejde en kontrol inkubation medium i mangel af substrat men i nærværelse af cofaktorer til kontrol for uspecifik enzym aktivitet farvning. De mest repræsentative resultater opnås i eksperimenter hvor forskellige substrat/cofaktor koncentrationerne anvendes til væv sektioner eller celle præparater fra den samme prøve, således at eksperimentatoren kan udføre analyser af enzymet kinetik ved hjælp af dosis-aktivitet kurver.

Protocol

Denne protokol følger retningslinjerne om brug af humant materiale af medicinsk-etiske Review Board af Academic Medical Center.

1. forberedelse af celler eller væv sektioner

1. Celler
   1. Trypsinize celler fra kultur retter med 1 mL 0,25% trypsin-EDTA i 5 min ved 37 ° C i en 10 mm petriskål og bringe celler i et 37 ° C suspension af 50.000-200.000 celler/mL, afhængigt af størrelsen på cellerne.
   2. Vedhæfte 200 µL af cellesuspension til mikroskopi dias ved hjælp af cytospin kanaler i en cytocentrifuge på 20 x g i 5 min ved stuetemperatur.
   3. Lufttørre cytospins i 24 timer ved stuetemperatur. Dette påvirker ikke dehydrogenase aktivitet. ⁵
2. Væv sektioner
   1. Uddrag væv fra patienter eller dyr efter etiske godkendelser. 10 mm³ væv er tilstrækkelig for flere eksperimenter.
   2. Put stykker af væv i små udluftet 2 mL plastik hætteglas og snap-freeze hætteglas indeholdende stykke væv i flydende kvælstof.
   3. Gemme hætteglas indeholdende væv stykker på −80 ° C indtil videre forarbejdning.
   4. Bruge en gel-lignende medie kaldet optimal opskæring temperatur (OLT) til at montere vævsprøve på en chuck, der fryser ned til-20 ° C til 25 ° C hurtigt, således at vandet ikke danner krystaller.
   5. Bruge en kryostaterne til opskæring og første trim blok til det ønskede niveau (ideelt set halvdelen af bredden af en mikroskopi glas dias, fx 5 mm x 5 mm).
   6. Efter skæring, bruge pensler og en snitstrækkerpladen for at forhindre afsnittene i curling opad.
   7. Skær vævsprøver i 6-10 µm tykt sektioner på en langsom men konstant hastighed (1 s pr afsnit). Når en sektion er korrekt skåret, forbliver det fladt på mikrotomen kniven under den snitstrækkerpladen.
   8. Pick up 1-3 afsnit om mikroskopiske glas lysbilleder og opbevares ved −80 ° C indtil brug. Antallet af afsnit forberedt afhænger af størrelsen af vævsprøve og den ønskede tykkelse af sektionerne.

2. enzym Histò/Cytochemistry for opløselige Dehydrogenases

1. Forberede reaktion Buffer.
   1. Forberede 100 mL af fosfat buffer på den korrekte pH (Se tabel 1; hvert enzym har en optimal pH hvor dens aktivitet er det højeste). For eksempel, bland løsninger af 0,1 M KH₂PO₄ (sure) og 0,1 M NA₂HPO₄ (grundlæggende) indtil en buffer med den rigtige pH er lavet.
   2. Vej 18 g af polyvinylalkohol (PVA) til fosfat buffer under et stinkskab, som PVA er støvede og giftige.
      1. Opløses 18% w/v PVA i fosfat buffer ved 100 ° C ved opvarmning bufferen au bain marie (put glasflaske i kogende vand) og omrøring indtil PVA er helt opløst. Løsningen vil være gennemsigtig derefter, med små luftbobler, der er forårsaget af omrøring. Det kræver typisk ~ 15 min til PVA at opløse.
         Bemærk: 18% w/v PVA i fosfat buffer er tyktflydende og kan overføres til 15 mL reaktion buffer rør ved hjælp af en bred pipette. Kortvarig oplagring af 18% w/v PVA i fosfat buffer bør forekomme ved ≥40 ° C og langtidsopbevaring (op til 2 uger) på ≥ 60 ° C. 250 µL af 18% w/v PVA i fosfat buffer er typisk kræves for en cytospin forberedelse, mens 500 µL er nødvendig for en væv sektion.
   3. Forberede tetrazolium salt (nitroBT) løsning. For hver 1 mL inkubation medium, 40 µL af nitroBT løsning er påkrævet, bestående af 5 mg nitroBT (et gult pulver) opløses i en blanding af 20 µL dimethylformamid (DMF) og 20 µL af ethanol, som vil være en lys gul gennemsigtig løsning.
      Bemærk: Fordi nitroBT stabilitet er den laveste af alle nødvendige reagenser, er det anbefales at forberede nitroBT stamopløsningen sidst og opløse nitroBT ind i reaktion mediet først.
      1. Opløs nitroBT i DMF og ethanol ved at opvarme det i et hætteglas i en kort periode (~ 10 s) ved hjælp af en bunsenbrænder. Ryste hætteglasset under varme og lad ikke hætteglasset for længe i flammen til at forhindre fordampning.
      2. Få 10% ekstra nitroBT løsning at tillade fordampning af DMF og ethanol under den opløsende proces.
   4. Skjold elektron luftfartsselskaber phenazine methosulfate (PMS) eller (1-methoxy)-phenazine methosulfate (mPMS) og inkubering medier indeholdende m(PMS) fra direkte lys af indpakning stanniol omkring opbevaring hætteglasset.
   5. Forberede reagens løsninger i henhold til tabel 1 ved at opløse dem i destilleret H₂O. Nogle reagenser omkomme hurtigt, så forberede dem så kort før eksperimentet som muligt. Holde reagens løsninger på is eller ved 4 ° C indtil brug.
   6. Forberede inkubation medier som vist i tabel 1 og homogeniseres løsningen efter hvert trin ved let omrøring. Undgå generation af luftbobler i inkubation medium ved omrøring og holde spatel under overfladen af inkubation medium under omrøring.
2. Anvende inkubation Medium til væv sektioner
   1. Pre varm mikroskopi glider med cytospins eller væv sektioner fastgjort ved 37 ° C i en Immunhistokemi inkubation i 15 min. nedsænkes i bunden af Immunhistokemi inkubation kammer med varmt vand til at opretholde en konstant temperatur i den inkubator.
   2. Omhyggeligt bryde eller så off Pasteur pipetter ved overgangen fra smalt til bredt del. Regelmæssig Pasteur pipetter er for smalle til Opsug den tyktflydende inkubation medie, så dette trin er nødvendige for at gøre Pasteur pipetter bred nok til aspiration af inkubation medium.
   3. Anvende 250-500 µL af de relevante inkubation medium til hver celle forberedelse eller væv sektion på mikroskopi dias ved hjælp af den brede del af Pasteur pipette.
   4. Bruge pipette tip til jævnt ud inkubation medium. Ignorer små luftbobler i inkubation medium, fordi disse vil flyde til overfladen og vil ikke forstyrre den enzymatiske reaktion i celle forberedelse eller væv sektion på diasset mikroskopi.
   5. Inkuber celle præparater eller væv sektioner på mikroskopi dias i 37 ° C inkubator (f.eks. en vævskultur inkubator) i en forud angivne varighed, afhængigt af enzymkinetik og sit udtryk i en bestemt celle forberedelse eller væv (tabel 1). Holde låget af Immunhistokemi inkubation kammeret lukket for at opretholde et fugtigt miljø for at forhindre reaktion bufferen mod udtørring.
3. Vask mikroskopi dias
   1. Tryk på off overskydende inkubation medium på en væv.
   2. Mekanisk skylle inkubation medium fra mikroskopi dias i 60 ° C fosfat buffer, pH 5.3, ved at flytte mikroskopi slides op og ned i bufferen. Dette stopper enzymatisk reaktion.
   3. Vask mikroskopi dias ved at holde dem i 60 ° C fosfat buffer, pH 5.3 i 20 min.
   4. Mekanisk vaske mikroskopi dias i postevand, 60 ° C.
   5. Vask mikroskopi dias ved at holde dem i postevand, 60 ° C i 20 min.
   6. Lad vandet og dias køle ned af langsomt blandes stuetemperatur vand fra hanen med postevand 60 ° C i løbet af 1 minut.
   7. Udføre en afsluttende mekaniske vask trin i stuetemperatur destilleret vand.
4. Vedlægge farves Cytospins eller væv sektioner på mikroskopi dias
   1. Pre varme et dias varmere på 50-60 ° C.
   2. Omhyggeligt tørre bagsiden af mikroskopi dias ved hjælp af en køkkenrulle og læg dem på diaset varmere tørre oversiden af diasset mikroskopi.
   3. Når diasene er tør, vedlægge celle præparater eller væv sektioner på mikroskopi dias ved hjælp af glycerol jelly montering medium og coverslips.
   4. Gemme celle præparater eller væv sektioner mikroskopi dias i mørke i køleskab ved 4 ° C eller straks fortsætte med billede erhvervelse.

3. billede erhvervelse

1. Optage billeder med en videnskabelig monokrom CCD kamera med tilstrækkelig dynamisk område (mindst 8-bit, men helst 10-bit eller 12-bit), fast gevinst og en lineær respons.
2. Vælg et passende mål (20 X-63 X for cytospins) og 10-63 X for væv sektioner.
3. Reducere blænding af forsnævring feltblændet, således at det er lidt større end synsfeltet.
4. Brug monokromatiske lys ved at anvende en 10 nm bred inferens båndpasfilter nær isobestic bølgelængde på formazankoncentrationen bundfald⁷ i kombination med en infrarød blokerer filter (Se Materialer tabel).
   Bemærk: Den maksimale isobestic absorbans af nitroBT er på 585 nm.
5. Optimere belysning for at sikre, at den hele grå niveau vifte af kameraet er brugt (dvs. fastsætte den belysning så at maksimale lysstyrke opnås uden over udsætter Når du optager et tomt objektglas).
6. Kalibrere målte grå niveauer til kendte absorbans (eller optisk densitet [OD]) værdier. Med henblik herpå, fange grå skala billeder af mindst 10 forskellige trin af en kalibrering dias eller trin tablet med kendte OD værdier (Se trin 4.1.1), enten kommercielt tilgængelige (Se Materialer tabel) eller måle en skræddersyet grå skala kile trin tablet af en densitophotometer og brug resultaterne til at kalibrere målt grå værdier til kendte absorbans værdier.
7. Fange mikrofotografier af celler eller væv sektioner af interesse.

4. billedanalyse

1. Før billedanalyse, kalibrere ImageJ software til absorbans målinger.
   1. Måling af absorbans (OD) af mikrofotografier af mindst 10 kalibrering områder med kendte absorbans parametre i kalibrering dias eller trin tablet med kendte OD-værdier. I ImageJ, bruge analyser → foranstaltning menu eller Ctrl + M genvejstast til at måle et markeret område.
   2. Start kalibreringsproceduren absorbans ved at gå til at analysere → kalibrering. Vælg funktionen "Rodbard (NIH billede)". Der findes allerede grå niveau måleresultaterne fra hvert trin af kalibrering dias/step tavle udført i 4.1.1 i venstre kolonne af det vindue, der åbnes. Hvis ikke, kopiere dem fra ImageJ resultatet på skærmen. Angiv hver tilsvarende kendte absorbans værdi i kolonnen til højre som trykt på det certifikat, du har modtaget med kalibreret trin tablet. Marker afkrydsningsfelterne "Global kalibrering" og "Vis plot" og tryk på "OK".
   3. For kvalitetskontrol, Sørg for, Rasmussen² af funktionen Rodbard er > 0,99. Hvis det er < 0,99, tjekke om kalibrering dias blev fotograferet og målt korrekt og om de kendte absorbans parametre blev indtastet korrekt.
   4. ImageJ er nu kalibreret, indtil du lukker programmet (dermed "Global kalibrering"). Absorbansen målinger, en kalibreret ImageJ session altid konverterer den observerede absorbans betyder at værdier mellem 0 og 1, hvor 0 og 1 er asymptoter af nul og fuld absorbans, henholdsvis.
2. Cytospins, Vælg > 100 enkelt celler i en tilfældig måde. For væv sektioner, skal du vælge et eller flere interesseområder af en fast længde og bredde i alle sektioner.
   1. Projektet en raster over mikrofotografier til at hjælpe med uvildig celle valg. I ImageJ,-projekt et gitter over et billede via menuen Plugins → Analyze → gitter.
   2. I ImageJ, bruge værktøjet elliptisk for at vælge enkelt celler, og brug værktøjet rektangel til at vælge væv regioner.
3. Måling af absorbans og område af de markerede celler eller væv regioner. Optisk tæthed og området kaldes "Betyder" og "Område" i ImageJ resultater regneark, henholdsvis.
   Bemærk: Den samlede absorbans af en celle- eller vævsdel region (hvis du har valgt flere væv regioner med forskellige størrelser) er lig med summen af alle adskilt pixel absorptioner. Hvis en celle er afbildet af 1000 pixel, så den samlede absorbans er givet ved summen af 1000 absorptioner og den gennemsnitlige absorbans er givet ved samlede absorbans/1000. Denne procedure også undgår fordelingsmæssige fejl.
4. Bestemme den gennemsnitlige samlede absorbans af > 30 celler eller væv regioner fra kontrol-dias, som indeholder en sample, der var udsat for at styre inkubation medium i mangel af substrat men i nærværelse af cofaktorer. Denne kontrol absorbans bruges til at kontrollere for uspecifik enzym aktivitet farvning og absorbans artefakter induceret af de anvendte mikroskopi dias, montering medium, dække slip eller mikroskop.
5. Fratræk den gennemsnitlige kontrol absorbans fra alle samlede absorbans målinger af prøver, der blev udsat for inkubation medium med samme koncentration af cofaktor (men forskellige koncentrationer af substrat og/eller hæmmer). Dette giver den korrigerede samlede absorbans af en celle- eller vævsdel region.
6. Statistisk sammenligne de gennemsnitlige korrigerede samlede absorptioner ved hjælp af Student's T-test eller en-vejs ANOVA test, afhængigt af dine eksperimentelle design.
7. Formazankoncentrationen absorbans kan konverteres til enzym aktivitet (µmol konverteret substrat pr. mL / min) ved hjælp af loven om Lambert-Beer: c=A/(є×d), hvor c er koncentrationen af formazankoncentrationen i reaktion medium, A er den målte absorbans i ImageJ efter kalibrering; Є er den udslettelse koefficient for formazankoncentrationen (16.000 på 585 nm)⁸ og d er lyset rejser afstand, hvilket svarer til den gennemsnitlige celle tykkelse eller nominelle afsnit skære tykkelse (6-10 µm i denne protokol).
   Bemærk: Efter tørring, væv snittykkelse falder ~ 50% fra skæring nominelle snittykkelsen, men dette afspejles ikke i beregningen af ovennævnte fordi skæring nominelle snittykkelse er biologisk de mest relevante. Den gennemsnitlige celle tykkelse og kugle dimensioner af cellen preparates levet op til mikroskopi glas dias kan bestemmes ved hjælp af Konfokal mikroskopi eller wide-felt mikroskopi, for hvilke protokoller kan findes andre steder. ^{9 , 10}

Representative Results

Flere protokoller til at forberede inkubation medium er vist at undersøge aktivitet i en bestemt dehydrogenase. For hver dehydrogenase, opløses de anførte reagenser i opløsningen PVA fastholdes en temperatur på mindst 37 ° C. Reagenser skal opløses i den rækkefølge, der er anført i tabellen, dvs nitroBT opløses altid først og (m) PMS er altid opløst sidst. Hver 5 mg af nitroBT er opløst i 40 µL mix (20 µL ethanol + 20 µL dimethylformamid). Alle diskenheder er per 1 mL af 18% PVA løsning, som kan bruges til at plette ~ 2 væv sektioner eller ~ 4 celle præparater på glas dias. NitroBT, NAD⁺, NADP⁺, ADP og substrat løsninger bør gøres frisk. NaN₃, MgCl₂ og (m) PMS løsninger kan opbevares ved 4 ° C for en måned. 18% PVA opløst i fosfat buffer kan opbevares ved 60 ° C i 2 uger. PH i 18% PVA opløsning kan angives ved hjælp af forskellige sammensætninger af 0,1 M kalium dihydrogen fosfat (KH₂PO₄) og 0,1 M dinatrium hydrogen fosfat (NA₂HPO₄) buffere. Vist inkubation perioder give gode udgangspunkter, men de optimale inkubation perioder afhænger af arterne, vævstype og bevarelse af væv. Celle præparater bør generelt være inkuberes længere end væv sektioner til at opnå et tilsvarende niveau for formazankoncentrationen produktion.

Wild-type isocitrat dehydrogenase 1 og 2 (IDH1/2) katalyserer omdannelse af isocitrat til α-ketoglutarat (αKG) med en samtidig reduktion af NADP⁺ til NADPH i cytoplasma og mitokondrier, henholdsvis. Disse enzymer har for nylig tiltrak interesse, fordi IDH1/2 mutationer forekommer i forskellige former for menneskelige cancer, herunder primære hjerne kræft (glioblastom) og endetarmskræft, og tilbyder en unik mulighed for at demonstrere mulighederne for metaboliske kortlægning. IDH1 mutationer deaktivere IDH1 vildtype enzymaktivitet og også fremkalde en neo-enzymatisk aktivitet, der fører til produktion og efterfølgende ophobning af oncometabolite D-2-hydroxyglutarate (D-2 HG),¹¹ , som er diskuteret andetsteds i detaljer. ¹² metaboliske kortlægning eksperimenter viste, at NADP⁺-afhængige IDH1/2 aktivitet var væsentligt lavere i colorectal karcinom celler med en bankede i heterozygous IDH1 mutation end i colorectal karcinom celler, der var IDH1 wild-type (figur 1A). Denne forskel blev kvantificeres ved billedanalyse af monokromatisk lys mikrofotografier (figur 1B). ¹²

En anden illustrerer eksempel på metaboliske kortlægning forsøg er vist i figur 2, som er et billede af en kryostaten sektion af musen hjerne, der blev sprøjtet med menneskelige glioblastom celler. IDH1/2 er den vigtigste NADPH udbyder i menneskets hjerne og dens aktivitet er upregulated i wild-type IDH1/2 glioblastom, IDH1/2 NADPH produktionskapacitet er meget lavere i hjernen hos gnavere. ¹¹ Figur 2A viser forskellen mellem de høje NADP⁺-afhængige IDH1/2 aktivitet i menneskelige glioblastom celler og den lave NADP⁺-afhængige IDH1/2 aktivitet i sund mus hjerne. IDH1/2 aktivitet er talbestemt µmol NADPH produktion pr. mL af væv i minuttet i figur 2B.

Enzymatisk reaktion af IDH1/2 er relativt ligetil, men laktat dehydrogenase (LDH) er en mere kompliceret enzym kompleks. LDH konverterer reversible omdannelse fra laktat til pyruvat med deraf følgende reduktion af NAD⁺ til NADH eller omvendt. Tilgængeligheden af laktat og pyruvat og sammensætningen af LDH enzym kompleks dikterer om laktat primært omdannes til pyruvat, (der er katalyseret af LDH-B og udbytter NADH) eller om pyruvat primært omdannes til laktat (som er katalyseret af LDH-A og forbruger NADH). ¹³ metaboliske kortlægning eksperimenter er i stand til at visualisere aktiviteten af LDH-B reaktion, men de er "blinde" til aktiviteten af LDH-en reaktion, fordi NADH produktion ikke forekommer, og som følge heraf nitroBT er ikke reduceret til formazankoncentrationen. Figur 3 viser NAD⁺-afhængige LDH aktivitet (dvs. omdannelse af laktat til pyruvat) i menneskets hjerne sektioner i mangel af substrat (figur 3A), i nærværelse af en høj koncentration af laktat (figur 3B ), i nærværelse af 6 mM laktat (figur 3 c) og en lav koncentration af laktat og en højere koncentration af pyruvat (figur 3D). Resultaterne af disse eksperimenter illustrere metaboliske kortlægning tilstrækkeligt fanger, NAD⁺-afhængige LDH aktivitet i væv sektioner afhænger af tilgængeligheden af laktat og pyruvat på mellemlang og reaktion.

Figur 1 . NADP⁺-afhængige IDH1/2 aktiviteten af menneskelige colorectal karcinom celler. (A) repræsentative monokromatisk lys mikrofotografier HCT116 menneskelige colorectal karcinom celler efter farvning for NADP⁺-afhængige IDH1/2 aktivitet mod 1-10 mM isocitrat og 0,8 mM NADP⁺. Skalere barer = 50 µm. (B) en kvantificering af absorbansen af blå formazankoncentrationen fremstillet af nitroBT af NADP⁺-afhængige IDH1/2 aktivitet pr. celle er vist med anvendelse af monokromatisk lys i (A) og billedanalyse. Forkortelser: IDH1^WT/WT, isocitrat dehydrogenase 1 wild-type; IDH1^WT/MUT, isocitrat dehydrogenase 1 muteret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 . NADP⁺-afhængige IDH1/2 aktiviteten af menneskelige glioblastom prøver. (A) repræsentative photomicrograph af en mus hjernen sektion som indeholder sunde mus hjernen (h) og en menneskelig glioblastom tumor xenograft (t) efter farvning for NADP⁺-afhængige IDH1/2 aktivitet i nærværelse af 0,8 mM NADP⁺ og 2 mM isocitrat. Skalalinjen = 200 µm (B) enzym aktivitet kvantificering af musen hjernen (h) og menneskelige glioblastom xenograft (t) vist i (et) ved hjælp af loven om Lambert-Beer. Fejllinjer udgør standardafvigelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 . NAD⁺-afhængige laktat dehydrogenase (LDH) aktivitet af menneskelige hjerne prøver. Repræsentative mikrofotografier seriel afsnit af menneskelige hjerne prøver efter farvning for NAD⁺-afhængige LDH aktivitet (A) mod kontrol betingelser (i fravær substrat og pyruvat, 3 mM NAD⁺ kun) (B) mod 150 mM laktat i mangel af pyruvat (C) mod 6 mM laktat i mangel af pyruvat og (D) mod 6 mM laktat i nærværelse af 18 mM pyruvat, konkurrencedygtigt produkt hæmmer af laktat til pyruvat reaktion. Skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Enzym:	G6PDH	LDH	SDH	MDH	IDH1	IDH2	IDH3	6PGD	GDH
PVA 18% i 100 mM fosfat buffer	1 mL; pH = 7,4	1 mL;  pH = 7,4	1 mL;  pH = 8.0	1 mL; pH = 7,4	1 mL; pH = 7,4	1 mL; pH = 7,4	1 mL; pH = 7,4	1 mL; pH = 8.0	1 mL; pH = 8.0
5 mM NitroBT	5 mg/40 µL mix	5 mg/40 µL mix	5 mg/40 µL mix	5 mg/40 µL mix	5 mg/40 µL mix	5 mg/40 µL mix	5 mg/40 µL mix	5 mg/40 µL mix	5 mg/40 µL mix
5 mM NaN3	10 ΜL	10 ΜL	10 ΜL	10 ΜL	10 ΜL	10 ΜL	10 ΜL	10 ΜL
5 mM MgCl2	10 ΜL			10 ΜL	10 ΜL	10 ΜL	10 ΜL	10 ΜL
3 mM NAD+		10 ΜL					10 ΜL		10 ΜL
0,8 mM NADP	10 ΜL			10 ΜL	10 ΜL	10 ΜL		10 ΜL
2 mM ADP									10 ΜL
substrat	10 mM glucose-6-fosfat	150 mM laktat	50 mM succinat	100 mM æblesyre	2 mM isocitrat	2 mM isocitrat	2 mM isocitrat	10 mM 6-phospho-galactonate	10 mM glutaminsyre
0.32 mM mPMS	10 ΜL	10 ΜL		10 ΜL	10 ΜL			10 ΜL
0.2 mM PMS			10 ΜL			10 ΜL	10 ΜL		10 ΜL
Inkubation varighed	5 min	30 min	60 min	60 min	30 min	30 min	30 min	10 min	30 min

Tabel 1. Skematisk oversigt over metaboliske mapping protocol til dehydrogenases. Forkortelser: ADP, adenosin ud; (m) PMS (methoxy) -5-methylphenazinium methyl sulfat; nitroBT, nitro tetrazolium blå chlorid; G6PDH, glucose-6-fosfat dehydrogenase; LDH, laktat dehydrogenase; SDH, succinat dehydrogenase; MDH, malat dehydrogenase; IDH, isocitrat dehydrogenase; 6PGD, 6-phosphogluconate dehydrogenase; GDH, glutamat dehydrogenase.

Discussion

Forskning på cellulære metabolisme i øjeblikket oplever en renæssance, fordi forskere indser nu, at metaboliske effekter er afgørende for patogenese og behandling af mange sygdomme. ¹ øvrigt, metabolisk forskning er hjulpet af en stigende tilgængelighed af teknikker, der giver dette område af forskningen med flere funktioner end nogensinde, herunder massespektrometri, radioisotopic mærkning og Kernemagnetisk resonans massespektrometri. Metaboliske kortlægning er på ingen måde en ny teknik, men dens kapacitet til at give integrerede oplysninger om aktiviteten af enzymer i en næsten ægte-til-naturen situation gør denne teknik mere relevant end nogensinde. ²

Cofaktorer NAD⁺ og NADP⁺ findes i alle levende celler, som angiver, at dehydrogenases opstod meget tidligt i udviklingen og have nøgleroller i cellulære stofskifte. ^{14 , 15} i øjeblikket, der er 523 enzym-katalyserede reaktioner, der er klassificeret som dehydrogenases og opstår på tværs af alle arter. ¹⁶ teoretisk, aktiviteten af alle forskellige dehydrogenase reaktioner kan særskilt undersøges ved tweaking metaboliske kortlægning protokollen beskrevet her. Hver enzymatisk reaktion er unikt ved hjælp af substrat og cofaktorer, der er nødvendige for dets aktivitet. Derfor, aktiviteten af hver enzymatisk reaktion kan bestemmes ved hjælp af en metabolisk kortlægning eksperiment med fyldestgørende substrat og cofaktorer på mellemlang og reaktion. Men nogle enzym isoformer afviger i deres subcellulært lokalisering, fx én isoform katalyserer en reaktion i cytoplasmaet, mens en anden isoform funktioner i mitokondrierne. Et bemærkelsesværdigt eksempel er IDH1 og IDH2, hvoraf førstnævnte er cytoplasmatisk og sidstnævnte er mitokondrie og der er to forskellige proteiner kodet af to forskellige gener. ¹¹ 1-methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate (methoxy-PMS) og 5-methylphenazinium methylsulfate (PMS) kan både bruges som elektron luftfartsselskaber for disse eksperimenter. Den tidligere passere ikke mitokondrie membraner, sidstnævnte ikke. Undersøgelser af mitokondrie enzymer (f.eks. IDH2) skal derfor bruge PMS, mens undersøgelser på cytosole enzymer (f.eks. IDH1) skal bruge mPMS.

Som med mange teknikker, variationer af denne protokol, som ved hjælp af forskellige typer af tetrazolium salte, bortset fra tilføjelsen af PMS og natriumazid, ved hjælp af en vandig montering medium, og varierende inkubation og skylning gange, eksisterer og fungerer lige så godt. Anvendelsen af metaboliske kortlægning med tetrazolium salte er ikke begrænset til dehydrogenases. Med små ændringer til protokollen, kan det også bruges til vurdering af aktiviteten af enzymer, der fungere direkte opstrøms af en dehydrogenase i en stofskiftevej. Vi har tidligere beskrevet dette princip for glutaminase enzym,¹⁷ som fungerer direkte opstrøms af glutamat dehydrogenase i glutaminolysis vej. ¹⁸ i teorien, det samme princip kan anvendes på andre enzymer, der funktion direkte downstream eller opstrøms af en dehydrogenase fx aconitase, som ligger direkte opstrøms af IDH2 og IDH3 i den tricarboxylic syre (TCA) cyklus. En anden simpel variation af de koncentrationer, der er beskrevet i tabel 1 er ved at gøre inkubation medium hætteglas med forskellige koncentrationer af substrat, cofaktor og/eller hæmmer. Dette giver mulighed for generation af dosis-aktivitet kurver som funktion af substrat, cofaktor og/eller hæmning.

Teknisk taler, metabolisk kortlægning eksperimenter lette ikke upartiske observationer i situ enzym aktivitet, fordi forskerne har til at vælge et substrat og cofaktor koncentration, der ikke måske afspejler substrat og cofaktor niveauerne der er til stede i situ. Desuden brug af tyktflydende 18% PVA i reaktion medium tjener til at holde makromolekyler intakt, og i kropsbygning men forbyder effektiv udbredelse af lav molekylvægt reagenser gennem reaktion. ^{3 , 5} derfor bestemt enzym aktiviteter i eksperimenter beskrevet her, der bruger suprafysiologiske substrat koncentrationer ikke afspejler i vivo situation på en given substratkoncentrationen men egner sig til intra eksperimentelle sammenligninger. Resultatet af metaboliske kortlægning eksperimenter er således en enzymatisk reaktion inden for rammerne af de substrat og cofaktor niveauer, der er til stede i situproduktionskapacitet (maksimal aktivitet). Desuden, brug af forskellige koncentrationer af substrat og/eller cofaktorer og flere prøver giver uvildig sammenligning af maksimale produktionskapacitet (V_max) og affinitet (K_m) af et enzym til et substrat/cofaktor i celle præparater , væv eller væv regioner. Disse parametre er et resultat af summen af enzymet protein udtryk, posttranslationelle modifikationer og effekten af en overfyldt mikromiljø på aktiviteten af enzymer. Metaboliske kortlægning er derfor stadig en bedre afspejling af enzymaktivitet end eksperimenter, der bestemme protein udtryk eller renset enzym aktivitet i vitro.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	A2754
D-Glucose 6-phosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	G7879
Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4)	Merck Millipore	106559
di-Sodium succinate	Sigma-Aldrich	W327700
DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	I1252
D-Malic acid	Sigma-Aldrich	2300
Glycerol Gelatin	Sigma-Aldrich	GG1
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G1251
Lithium 6-phospho-D-galactonate	Sigma-Aldrich	55962
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
methoxy-Phenazine methosulfate	Serva	28966.01
Nicotinamide adenine dinucleotide	Sigma-Aldrich	N0505
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate	Sigma-Aldrich	NADP-RO
Nitrotetrazolium Blue chloride	Sigma-Aldrich	N6876
Phenazine methosulfate	Serva	32030.01
Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed	Sigma-Aldrich	P1763
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Merck Millipore	104873
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium L-lactate	Sigma-Aldrich	L7022
Bandpass filter	Edmund optics		https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/
Grey-step wedge	Stouffer Industries		http://www.stouffer.net/TransPage.htm