Summary
Nous présentons ici un protocole qui permet de visualiser et de quantifier l’activité des déshydrogénases dans les cellules et tissus et sa cinétique, la fonction et la localisation sous-cellulaire au microscope.
Abstract
Altération du métabolisme cellulaire est une caractéristique de nombreuses maladies, y compris les infections, les maladies cardiovasculaires et du cancer. Les unités motrices métaboliques des cellules sont des enzymes et leur activité est très réglementée à plusieurs niveaux, y compris la transcription, stabilité de l’ARNm, niveau traductionnel, poteau-de translation et fonctionnel. Cette réglementation complexe signifie que des tests quantitatifs ou d’imagerie conventionnelles, comme quantitatives ARNm expériences, Western Blots et immunohistochimie, donnent des informations incomplètes au sujet de l’activité ultime d’enzymes, de leur fonction ou leur localisation subcellulaire. Cytochimie enzymatique quantitative et histochimie (c.-à-d., la cartographie métabolique) montrent des informations approfondies sur in situ l’activité enzymatique et sa cinétique, la fonction et la localisation subcellulaire dans une situation presque respectueux de la nature.
Les auteurs décrivent un protocole visant à détecter l’activité des déshydrogénases, qui sont des enzymes qui effectuent des réactions d’oxydo-réduction afin de réduire les cofacteurs tels que mole+ et FAD. Coupes de tissus et de cellules sont incubées dans un milieu qui est spécifique pour l’activité enzymatique d’une déshydrogénase. Par la suite, la déshydrogénase qui fait l’objet d’enquête effectue son activité enzymatique dans son site subcellulaire. Dans une réaction chimique avec le milieu réactionnel, cela génère finalement formazan de couleur bleue sur le site de l’activité de la déshydrogénase. Absorbance de la formazan est donc une mesure directe de l’activité de la déshydrogénase et peut être quantifiée à l’aide de monochromatique lumière microscopie et analyse d’images. L’aspect quantitatif de ce protocole permet aux chercheurs de tirer des conclusions statistiques de ces tests.
Outre les études observationnelles, cette technique peut être utilisée pour des études d’inhibition d’enzymes spécifiques. Dans ce contexte, les études bénéficient d’avantages respectueux de la nature de la cartographie métabolique, donnant sur place des résultats qui peut-être être physiologiquement plus pertinent que des études d’inhibition in vitro enzyme. En tout, cartographie métabolique est une technique indispensable à l’étude du métabolisme au niveau cellulaire ou tissulaire. La technique est facile à adopter, fournit de l’information métabolique approfondie, globale et intégrée et permet le dosage rapid.
Introduction
Des pierres angulaires essentielle de physiologie cellulaire est métabolisme. Le métabolisme fournit l’énergie nécessaire pour tous les processus physiologiques des cellules, fournit les blocs de construction pour la biosynthèse de macromoléculaire et régule l’homéostasie cellulaire en ce qui concerne les déchets, les molécules toxiques et le démontage et recyclage des composants cellulaires inutiles ou dysfonctionnels. Les enzymes catalysent la quasi-totalité des réactions chimiques cellulaires vitales et par conséquent sont les unités motrices dans la physiologie des cellules. 1 , 2
L’activité des enzymes est étroitement contrôlée à plusieurs niveaux et par conséquent l’histochimie enzymatique quantitative et cytochimie (aussi appelée cartographie métabolique) est la méthode préférée pour l’étude de l’activité enzymatique in situ. Au niveau transcriptionnel, expression des gènes dans l’ARNm est réglementée. L’effet de la régulation de la transcription peut être déterminée à l’aide de dosages quantitatifs de mRNA, tels que les puces ou séquençage direct de RNA ou des tests d’ARNm qualitative, comme l’hybridation in situ qui donne des informations sur le cellulaire (void) localisation des molécules d’ARNm. Cela permet d’apprécier les différences relatives à l’activité transcriptionnelle entre les cellules. Cependant, l’interprétation et la validité de ces tests ADN messagère en ce qui concerne l’activité métabolique est compliquée car la régulation se fait également au niveau de l’ARNm, où la séquence et la stabilité des molécules d’ARNm sont édités après qu’il est transcrit de l’ADN. Ce montage régule la traduction des protéines isoformes et quantité de translation de protéines dans les ribosomes. En outre, le processus de traduction des protéines est contrôlé et en fin de compte influe sur l’activité et, par conséquent, expression de l’enzyme. Les effets combinés des étapes réglementaires susmentionnées peuvent être appréciés à l’aide de tests d’expression quantitative de protéines, telles que Western Blotting ou microarrays lysat de protéine de phase inverse ou tests d’expression qualitative de protéines, tels que immunocytochimie et immunohistochimie, mais ces techniques ne parviennent pas à incorporer des effets régulateurs en aval telles que la modification post-traductionnelle des protéines et la régulation fonctionnelle des enzymes dans leur microenvironnement bondé. En outre, l’expression d’une enzyme peut mal corréler avec son activité, afin que les mesures de l’activité d’une enzyme purifiée dans des homogénats cellulaires ou tissulaires ou en solutions diluées sont largement utilisés pour les études de l’activité enzymatique. Toutefois, ces expériences ne parviennent pas à reproduire l’influence d’un cytoplasme compartimenté bondé ou organite sur l’activité d’une enzyme. En outre, toutes les techniques précitées déterminer ni la quantité ni la localisation de l’expression d’ARNm ou enzyme, mais sont incapables de donner des informations complètes sur ces deux aspects de l’expression de l’enzyme, sans parler de l’intégration de cette informations aux conclusions de l’activité enzymatique. 2 , 3 , 4
La cartographie métabolique permet l’appréciation de toutes les variables susmentionnées qui déterminent l’activité d’une enzyme. Qui plus est, la cartographie métabolique est une forme de la cellule vivante ou imagerie tissulaire avec les cellules et les tissus qui sont gardées intactes lors de l’analyse pour générer une situation presque respectueux de la nature pour générer des données de l’activité des enzymes. Il produit des images qui facilitent tant l’appréciation détaillée de l’emplacement de l’activité enzymatique, mais aussi robuste quantification de l’activité enzymatique dans un compartiment cellulaire ou tissulaire. 3 , 4 protocoles décrits ici pour la cartographie métabolique de l’activité des déshydrogénases sont basés sur le manuel de laboratoire de toutes les méthodes histochimiques de l’enzyme disponible,5 sur les principes de l’histochimie enzymatique quantitative,6 et sur analyse d’images de cartographie métabolique quantitative. 4
Déshydrogénases sont des enzymes qui effectuent des réactions redox pour réduire des cofacteurs canoniques comme NAD+, NADP+ et FAD à NADH, NADPH et FADH2, respectivement. Les cellules intactes ou des sections de tissu cryostat qui ne sont pas chimiquement fixes sont incubées dans un milieu réactionnel qui contient, parmi d’autres réactifs, le substrat et les cofacteurs d’une déshydrogénase spécifique et un sel de tétrazolium. Par la suite, cette déshydrogénase effectue son activité catalytique et réduit, par exemple, NADP+ de NADPH. Via un transporteur d’électrons, 2 molécules de NADPH finalement réduisent 1 tétrazolium semi incolore soluble dans l’eau salée molécule en molécule 1 insolubles dans l’eau bleu formazan qui précipite immédiatement sur le site de la déshydrogénase. Par conséquent, l’absorbance de formazan précipité est une mesure directe de l’activité locale d’une déshydrogénase et peut être observée au microscope photonique ou quantifiés à l’aide de monochromatique lumière microscopie et analyse d’images. L’aspect quantitatif de ce protocole permet aux chercheurs de tirer des conclusions statistiques de ces tests. En outre, cette quantification facilite la détermination de in situ cinétique enzymatique paramètres, tels que l’activité enzymatique maximale (Vmax) et l’affinité d’un substrat d’une enzyme (K,m). 3 , 4 , 5 , 6
Lorsque vous planifiez une expérience en cartographie métabolique, il est important de réaliser que, par expérience, un maximum de cinquante plaques en verre avec des préparations de cellules adhérentes ou des sections de tissu sont recommandés pour réduire au minimum les délais durant l’incubation pour obtenir conformément résultats. Il est possible de traiter des diapositives ou des compositions moyennes plus lorsque ces étapes de protocole sont effectuées en collaboration par plus d’un expérimentateur. En outre, certains variabilité existe entre les expériences. Par conséquent, des expériences identiques doivent être répétées au moins 3 fois avec cytospins de chaque préparation de cellules ou des sections de chaque échantillon de tissu et des contrôles appropriés devraient être inclus dans chaque expérience. Préparez toujours un milieu d’incubation de contrôle en l’absence de substrat, mais en présence de cofacteurs au contrôle pour la coloration de l’activité enzymatique non spécifique. Les résultats plus représentatifs sont obtenus dans les expériences où des concentrations de substrat/cofacteur différentes sont appliquées à des sections de tissu ou de préparations de cellules du même échantillon, afin que l’expérimentateur peut effectuer des analyses de l’utilisation de la cinétique enzymatique courbes dose-activité.
Protocol
Ce protocole conforme aux lignes directrices sur l’utilisation du matériel humain de la Commission d’examen médical et éthique de l’Academic Medical Center.
1. préparation des cellules ou des coupes de tissus
- Cellules
- Trypsinize cellules de Pétri en utilisant 1 mL de 0,25 % de trypsine-EDTA pendant 5 min à 37 ° C dans une boîte de Pétri de 10 mm et mettre les cellules en suspension de 50 000-200 000 cellules/mL, selon la taille des cellules 37 ° C.
- Fixer 200 µL de la suspension cellulaire sur lames de microscope utilisant cytospin entonnoirs dans un cytocentrifuge à 20 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Sécher à l’air le cytospins pendant 24 h à température ambiante. Cela n’affecte pas l’activité déshydrogénase. 5
- Coupes de tissus
- Extrait de tissus de patients ou d’animaux selon l’éthiques permis. 10 mm3 de tissu suffit aux expériences multiples.
- Mettre les morceaux de tissus dans les flacons en plastique de petit ventilé 2 mL et gel des clin d’oeil les flacons contenant le morceau de tissu dans l’azote liquide.
- Conserver les flacons contenant des morceaux de tissu à −80 ° C jusqu'à ce que la poursuite de la procédure.
- Utiliser un milieu gélatineuse appelé température de coupe optimale (OCT) pour monter l’échantillon de tissu sur un mandrin qui gèle rapidement, jusqu'à-20 ° C à-25 ° C pour que l’eau ne peut pas former des cristaux.
- Utiliser un cryostat pour coupe et premier trim le bloc jusqu’au niveau souhaité (idéalement la moitié de la largeur d’une microscopie verre diapositive, par exemple 5 x 5 mm).
- Après la découpe, utiliser pinceaux et une plaque anti-roll pour empêcher les sections de curling vers le haut.
- Couper les échantillons de tissus en 6 à 10 µm d’épaisseur sections à une vitesse lente mais constante (1 s par section). Lorsqu’un article est coupé correctement, il reste plat sur le couteau microtome sous la plaque anti-roll.
- Prenez 1-3 sections sur lames de verre microscopique et conserver à −80 ° C jusqu'à l’utilisation. Le nombre de coupes préparées dépend de la taille de l’échantillon de tissu et de l’épaisseur désirée des sections.
2. enzyme Histo/cytochimie des déshydrogénases Soluble
- Préparation de tampon de réaction.
- Préparation de 100 mL de tampon phosphate du pH correct (voir le tableau 1; chaque enzyme a un pH optimal au cours de laquelle son activité est la plus élevée). Par exemple, mélanger des solutions de 0,1 M KH2PO4 (acide) et 0,1 M NA2HPO4 (base) jusqu'à ce qu’un tampon avec le bon pH est fait.
- Peser 18 g d’alcool polyvinylique (PVA) dans le tampon de phosphate sous une hotte aspirante en PVA est poussiéreux et toxique.
- Dissoudre les 18 % w/v PVA dans le tampon de phosphate à 100 ° C de réchauffement le tampon au bain marie (mettre la bouteille dans l’eau bouillante) et agiter jusqu'à dissolution complète de la PVA. La solution sera alors, transparente avec petites bulles d’air qui sont causés par l’agitation. Elle nécessite généralement environ 15 min pour le PVA dissoudre.
Remarque : Les 18 % w/v PVA dans un tampon phosphate est visqueux et peuvent être transféré à 15 mL tampon réactionnels à l’aide d’une pipette de large. Stockage de courte durée de 18 % w/v PVA dans un tampon phosphate doit avoir lieu au moins 40 ° C et le stockage à long terme (jusqu'à 2 semaines) au ≥ 60 ° C. 250 µL de 18 % w/v PVA dans un tampon phosphate est généralement requise pour une préparation cytospin, tandis que 500 µL est requis pour une section de tissu.
- Dissoudre les 18 % w/v PVA dans le tampon de phosphate à 100 ° C de réchauffement le tampon au bain marie (mettre la bouteille dans l’eau bouillante) et agiter jusqu'à dissolution complète de la PVA. La solution sera alors, transparente avec petites bulles d’air qui sont causés par l’agitation. Elle nécessite généralement environ 15 min pour le PVA dissoudre.
- Préparer la solution de sel (nitroBT) de tétrazolium. Pour chaque 1 mL de milieu d’incubation, 40 µL de solution de nitroBT est requis, composé de 5 mg de nitroBT (une poudre jaune) dissous dans un mélange de 20 µL diméthylformamide (DMF) et de 20 µL d’éthanol, qui sera une solution transparente jaune clair.
Remarque : La stabilité des nitroBT étant la plus faible de tous les réactifs nécessaires, il est recommandé de préparer la solution mère de nitroBT dernière et dissoudre le nitroBT dans le milieu réactionnel, tout d’abord.- Dissoudre nitroBT en DMF et éthanol en le chauffant dans un flacon en verre pendant un court laps de temps (environ 10 s) à l’aide d’un bec Bunsen. Agiter le flacon pendant la cuisson et ne pas laisser le flacon trop longtemps dans la flamme pour éviter l’évaporation.
- Faire 10 % solution nitroBT supplémentaire pour permettre l’évaporation du DMF et éthanol pendant le processus de dissolution.
- Protéger les transporteurs d’électrons phénazine méthosulfate (PMS) ou (1-méthoxy)-phénazine méthosulfate (mPMS) et incubation des médias contenant des m(PMS) de la lumière directe en enroulant le papier d’aluminium autour du flacon en verre de stockage.
- Préparer des solutions de réactif selon le tableau 1 en les dissolvant dans distillée H2O. Certains réactifs périssent rapidement, afin de les préparer que peu de temps avant l’expérience possible. Conserver les solutions-réactif sur la glace ou à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
- Préparer le milieu d’incubation comme indiqué dans le tableau 1 et homogénéiser la solution après chaque étape par agitation douce. Éviter la production de bulles d’air dans le milieu d’incubation en agitant continuellement et de garder la spatule sous la surface du milieu d’incubation tout en remuant.
- Application de milieu d’Incubation aux Sections de tissu
- Préchauffez microscope slides avec cytospins ou des sections de tissu fixées à 37 ° C dans une chambre d’incubation immunohistochemistry pour 15 min. plonger le fond de la chambre d’incubation immunohistochimie avec de l’eau pour maintenir une température constante dans le incubateur.
- Soigneusement, casser ou scier des pipettes Pasteur lors de la transition de l’étroit à la partie large. Des pipettes Pasteur ordinaires sont trop étroites pour aspirer le milieu d’incubation visqueux, donc cette étape est nécessaire pour faire des pipettes assez large pour l’aspiration du milieu d’incubation de Pasteur.
- Appliquer 250-500 µL de milieu d’incubation appropriés à chaque préparation de cellules ou de la section de tissus sur lames de microscope à l’aide de la partie large de la pipette Pasteur.
- Utilisez la pipette d’étaler uniformément de milieu d’incubation. Ne pas tenir compte de petites bulles d’air dans le milieu, parce qu’elles flotteront à la surface et n’interférera pas avec la réaction enzymatique dans la section de préparation ou d’un tissu cellulaire sur la lame de microscope.
- Incuber les préparations de cellules ou des coupes de tissus sur les lames de microscope dans un incubateur à 37 ° C (par exemple un incubateur de culture de tissus) pour une durée prédéterminée, selon la cinétique enzymatique et son expression dans une préparation de cellules particulières ou tissu (tableau 1). Laisser le couvercle de la chambre d’incubation immunohistochimie fermé afin de maintenir un environnement humide pour éviter que le tampon de réaction se dessèchent.
- Laver les lames de microscope
- Robinet hors milieu de l’excès d’incubation sur un mouchoir en papier.
- Mécaniquement, rincez le milieu d’incubation des lames microscopie dans un tampon phosphate 60 ° C, pH 5,3, en déplaçant les lames de microscope haut et en bas dans la mémoire tampon. Ceci empêche la réaction enzymatique.
- Laver les lames microscopie en les gardant dans un tampon phosphate 60 ° C, pH 5,3 pendant 20 min.
- Mécaniquement, laver les lames de microscope à 60 ° C l’eau du robinet.
- Laver les lames microscopie en les gardant dans l’eau du robinet 60 ° C pendant 20 min.
- Laissez l’eau et diapositives refroidissent en mélangeant lentement l’eau du robinet avec l’eau du robinet 60 ° C température de la pièce au cours d’une minute.
- Effectuer une étape de lavage mécanique finale dans l’eau à température ambiante distillée.
- Joindre le Cytospins tachées ou des Sections de tissu sur des lames de microscope
- Préchauffer une diapositive plus chaude à 50-60 ° C.
- Soigneusement sécher la face arrière des lames microscopie à l’aide de papier absorbant et placez-les sur la diapositive plus chaud pour sécher le dessus de la lame de microscope.
- Lorsque les lames sont sèches, placer des préparations de cellules ou des coupes de tissus sur lames de microscope à l’aide de lamelles et milieu de montage glycérol gelée.
- Enregistrez les préparations cellulaires ou des lames de microscope sections tissu dans l’obscurité dans un réfrigérateur à 4 ° C ou immédiatement procéder à l’acquisition d’images.
3. image Acquisition
- Gain d’enregistrer des images avec une caméra scientifique de CCD monochrome avec une plage dynamique suffisante (au moins 8 bits mais préférence 10- ou 12 bits), fixées et une réponse linéaire.
- Sélectionnez un objectif approprié (20 X X-63 pour cytospins) et 10-63 X pour des sections de tissu.
- Réduire l’éblouissement en rétrécissant le diaphragme de champ pour qu’il soit légèrement plus grand que le champ de vision.
- Utilisez une lumière monochromatique en appliquant un filtre d’inférence de large bande passante nm 10 près la longueur d’onde isobestic du précipité7 formazan en combinaison avec un blocage infrarouge filtre (voir la Table des matières).
Remarque : L’absorbance maximale isobestic de nitroBT est à 585 nm. - Optimiser l’éclairage pour garantir que toute la gamme de niveau grise de la caméra est utilisée (c'est-à-dire, définir le niveau d’éclairement afin que l’éclairement maximal est atteint sans surexposer lors de l’enregistrement d’une lame de microscope vide).
- Étalonner les valeurs de niveaux de gris mesuré absorbance connu (ou densité optique [do]). À cette fin, échelle de gris capturer des images d’au moins 10 étapes différentes d’une diapositive d’étalonnage ou d’étape tablet avec valeurs OD connues (voir étape 4.1.1), soit disponible dans le commerce (voir Table des matières) ou mesurer un comprimé d’étape coin gris sur mesure par un densitophotometer et utiliser les résultats pour calibrer mesurés gris valeurs à des valeurs d’absorbance connus.
- Capturer les photomicrographies des cellules ou des coupes de tissus d’intérêt.
4. image Analysis
- Avant l’analyse de l’image, calibrer les logiciels ImageJ pour mesures d’absorbance.
- Mesurer l’absorbance (do) de microphotographies au moins 10 zones d’étalonnage avec des paramètres connus absorbance dans le comprimé de diapositive ou étape de calibrage avec les valeurs connues de OD. Dans ImageJ, utilisez le menu de mesure → analyser ou le raccourci clavier Ctrl + M pour mesurer une zone sélectionnée.
- Commencer la procédure d’étalonnage absorbance en allant à analyser → calibrage. Choisissez la fonction « Rodbard (Image de NIH) ». Dans la colonne de gauche de la fenêtre qui s’ouvre, les résultats des mesures du niveau gris de chaque étape de la tablette de glisser/étape étalonnage effectué en 4.1.1 sont déjà présents. Si ce n’est pas le cas, copiez-les sur l’écran de résultats ImageJ. Dans la colonne de droite, entrez chaque valeur connue absorbance correspondante lors de l’impression sur le certificat que vous avez reçu avec la tablette étape calibré. Cochez les cases « étalonnage Global » et « Voir la parcelle » et appuyez sur « OK ».
- Pour le contrôle de qualité, assurez-vous que la R-2 de la fonction Rodbard est > 0,99. Si c’est < 0,99, vérifier si les diapositives d’étalonnage ont été photographiés et mesurés correctement et si les paramètres de l’absorbance connus ont été entrées correctement.
- ImageJ est maintenant réglé jusqu'à ce que vous fermez le programme (donc « Étalonnage Global »). Pour les mesures d’absorbance, une session de ImageJ calibrée toujours convertit que l’absorbance observée signifie pour les valeurs comprises entre 0 et 1, où 0 et 1 sont les asymptotes de zéro et complet absorbance, respectivement.
- Pour cytospins, sélectionnez > 100 cellules individuelles d’une manière aléatoire. Pour des coupes de tissus, sélectionnez un ou plusieurs champs d’intérêt d’une longueur fixe et de la largeur dans toutes les sections.
- La trame du projet sur les photomicrographies pour aider dans les sélections de cellules non biaisée. Dans ImageJ, projet une grille au-dessus d’une image via le menu Plugins → analyser → grille.
- Dans ImageJ, utilisez l’outil elliptique pour sélectionner des cellules individuelles et utilisez l’outil Rectangle pour sélectionner des regions tissulaires.
- Mesurer l’absorbance et la zone des cellules sélectionnées ou des régions de tissus. La densité optique et la région sont appelés « Signifie » et « Espace » dans le ImageJ résultats tableur, respectivement.
Remarque : L’absorption totale d’une région cellulaires ou tissulaires (si vous avez sélectionné plusieurs régions de tissus de différentes tailles) est égale à la somme de tous les absorbances pixel séparées. Si une cellule est imagée par 1000 pixels, alors l’absorbance totale est donnée par la somme de 1000 absorbances et l’absorbance moyenne est donnée par absorbance totale/1000. Cette procédure évite également d’erreur distributifs. - Déterminer l’absorbance totale moyenne de > 30 cellules ou des tissus régions depuis les diapositives de contrôle, qui contient un exemple qui a été exposé au milieu d’incubation en l’absence de substrat, mais en présence de cofacteurs de contrôle. Cette absorbance de contrôle est utilisé comme contrôle pour la coloration de l’activité enzymatique non spécifique et artefacts de l’absorbance induite par les lames de microscope utilisé, montage moyen, lamelle couvre-objet ou microscope.
- Soustraire l’absorbance moyenne contrôle de toutes les mesures d’absorbance totale des échantillons qui ont été exposés au milieu d’incubation avec la même concentration de cofacteur (mais différentes concentrations du substrat et/ou inhibiteur). Cela donne l’absorbance totale corrigée d’une région de cellule ou tissu.
- Statistiquement, comparer les moyennes absorbances totales corrigés en utilisant le test T ou aller simple test ANOVA, selon votre conception expérimentale de l’étudiant.
- Absorbance de formazan peut être converti en enzyme activité (substrat µmol converti par mL / min) en utilisant la Loi de Lambert-Beer : c=A/(є×d), où c est la concentration de formazan dans le milieu réactionnel, A est l’absorbance mesurée dans ImageJ après l’étalonnage ; Є est le coefficient d’extinction de formazan (16.000 à 585 nm)8 et d est la lumière voyageant à distance, qui est égale à l’épaisseur moyenne des cellules ou l’épaisseur de coupe section nominale (6-10 µm dans le présent protocole).
Remarque : Après le séchage, l’épaisseur de coupe de tissus diminue environ 50 % de l’épaisseur de coupe de section nominale, mais cela n’apparaît pas dans le calcul ci-dessus parce que l’épaisseur de coupe de section nominale est biologiquement la plus pertinente. L’épaisseur moyenne des cellules et les dimensions de la sphère de cellule préparations adhérées aux lames de Microscope Vitre peuvent être déterminées à l’aide de la microscopie confocale ou grand-angulaire microscopie, pour lesquels des protocoles se trouvent ailleurs. 9 , 10
Representative Results
Plusieurs protocoles de préparer le milieu d’incubation sont indiquées pour enquêter sur l’activité d’une déshydrogénase particulière. Pour chaque déshydrogénase, dissoudre les réactifs énumérés dans la solution PVA tout en maintenant une température de 37 ° c au moins. Les réactifs doivent être dissous dans l’ordre indiqué dans le tableau, c'est-à-dire nitroBT se dissout toujours premier et (m) PMS se dissout toujours modifié. Chaque 5 mg de nitroBT se dissout dans 40 mix µL (20 µL éthanol + 20 µL diméthylformamide). Tous les volumes sont par 1 mL de solution PVA 18 %, ce qui peut être utilisée pour colorer des sections de tissu 2 ~ ou ~ 4 préparations de cellules sur des lames de verre. NitroBT, NAD+, NADP+, solutions ADP et substrat convient fraîchement. NaN3, MgCl2 et (m) PMS des solutions peuvent être stockées à 4 ° C pendant un mois. 18 % PVA dissous en phosphate tampon peut être conservée à 60 ° C pendant 2 semaines. Le pH de la solution PVA de 18 % peut être défini à l’aide de différentes compositions du dihydrogénophosphate de potassium 0,1 M (KH2PO4) et tampons de 0,1 M disodique hydrogène phosphate (NA2HPO4). Les périodes d’incubation indiqué fournissent de bons points de départ, mais les périodes d’incubation optimale dépendant de l’espèce, le type de tissu et la préservation du tissu. En général, les préparations de cellules doivent être incubées plus longtemps que des sections de tissu pour obtenir un niveau de production de formazan similaire.
Sauvage isocitrate déshydrogénase 1 et 2 (IDH1/2) catalysent la conversion de l’isocitrate en α-cétoglutarate (αKG) avec une réduction concomitante du PNDA+ à NADPH dans le cytoplasme et les mitochondries, respectivement. Ces enzymes ont récemment suscité un intérêt car IDH1/2 mutations se produisent dans différents types de cancer chez l’humain, y compris les cancers du cerveau primaire (glioblastome) et le cancer colorectal et offrent une occasion unique de démontrer les possibilités de cartographie métabolique. Les mutations IDH1 désactiver l’activité enzymatique de type sauvage IDH1 et également induire une activité enzymatique neo qui mène à la production et l’accumulation subséquente de l’oncometabolite D-2-hydroxyglutarate (D-2 HG),11 , qui est décrits en détail. 12 expériences de cartographie métabolique ont montré que NADP+-activité dépendante de IDH1/2 était significativement plus faible dans les cellules de carcinome colorectal avec une frappé en hétérozygotes IDH1 mutation que dans les cellules de carcinome colorectal qui ont été IDH1 sauvage (Figure 1 a). Cette différence a été quantifiée par analyse d’image des microphotographies de lumière monochromatiques (Figure 1 b). 12
Un autre exemple illustrant des expériences de cartographie métabolique est montré dans la Figure 2, qui est une image d’une section de cryostat du cerveau de souris qui a été injectée avec des cellules de glioblastome humain. IDH1/2 est le plus important fournisseur de NADPH dans le cerveau humain et son activité est augmentée dans le glioblastome de type sauvage de IDH1/2 , alors que la capacité de production de NADPH IDH1/2 est beaucoup plus faible dans le cerveau des rongeurs. 11 Figure 2 a montre la différence entre le NADP haute+-activité dépendante de IDH1/2 dans les cellules de glioblastome humain et le NADP faible+-activité dépendante de IDH1/2 dans le cerveau des souris saines. Activité IDH1/2 est quantifiée en production de NADPH µmol / mL de tissu par minute dans la Figure 2 b.
La réaction enzymatique de IDH1/2 est relativement simple, mais la lactate déshydrogénase (LDH) est une complexe d’enzymes plus compliquée. LDH convertit la transformation réversible du lactate en pyruvate avec réduction concomitante du NAD+ à NADH ou vice versa. La disponibilité de lactate et pyruvate et la composition de l’enzyme LDH complexe dicte si lactate est convertie principalement en pyruvate (qui est catalysée par la LDH-B et les rendements NADH) ou si le pyruvate est principalement converti pour le lactate (ce qui est catalysée par la LDH-A et consomme NADH). Expériences de cartographie métabolique 13 sont en mesure de visualiser l’activité de la réaction de LDH-B, mais ils sont « aveugles » à l’activité de la réaction de la LDH-A, parce que la production de NADH ne se produit pas et par conséquent nitroBT n’est pas réduite en formazan. La figure 3 montre le NAD+-activité LDH dépendante (c'est-à-dire la conversion du lactate en pyruvate) dans le cerveau humain des sections en l’absence de substrat (Figure 3 a), en présence d’une forte concentration de lactate (Figure 3 b ), en présence de lactate de 6 mM (Figure 3) et en présence d’une faible concentration de lactate et pyruvate (Figure 3D) une concentration plus élevée. Les résultats de ces expériences illustrent métabolique cartographie adéquate qui capte le NAD+-activité dépendante de LDH dans des sections de tissu dépend de la disponibilité de lactate et pyruvate dans le milieu réactionnel.
Figure 1 . NADP+-activité IDH1/2 dépendante des cellules de carcinome colorectal humain. (A) représentant photomicrographies lumière monochromatiques de cellules de carcinome colorectal humain HCT116 après coloration pour NADP+-activité dépendante de IDH1/2 contre 1 à 10 mM NADP isocitrate et 0,8 mM+. Barreaux de l’échelle = 50 µm. (B) une quantification de l’absorbance du bleu formazan produite à partir de nitroBT par NADP+-activité dépendante de IDH1/2 par cellule est affiché à l’aide d’une lumière monochromatique (a) et analyse d’images. Abréviations : IDH1WT/WT, isocitrate déshydrogénase 1 sauvage ; IDH1WT/MUT, isocitrate déshydrogénase 1 mutés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . NADP+-activité IDH1/2 dépendante des échantillons de glioblastome humain. (A) photomicrographie représentatif d’une section de cerveau de souris contenant le cerveau de souris saines (h) et une xénogreffe de tumeur de glioblastome humain (t) après coloration pour NADP+-activité dépendante de IDH1/2 en présence de 0,8 NADP mM+ et isocitrate de 2 mM. Echelle = quantification de l’activité enzymatique de 200 µm (B) des zones du cerveau de souris (h) et des xénogreffes de glioblastome humain (t) montré en (A) en utilisant la Loi de Lambert-Beer. Barres d’erreur représentent des écarts-types. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . NAD+-activité dépendante lactate déshydrogénase (LDH) des échantillons de cerveau humain. Photomicrographies représentatifs de coupes sériées d’échantillons de cerveau humain après coloration pour NAD+-activité dépendante de LDH (A) contre les conditions de contrôle (dans le substrat de l’absence et du pyruvate, 3 mM NAD+ uniquement) (B) contre 150 mM de lactate en l’absence de pyruvate (C) contre 6 mM le lactate en l’absence de pyruvate et (D) contre 6 mM de lactate en présence de l’inhibiteur compétitif produit de la réaction de lactate-à-pyruvate pyruvate de 18 mM. Echelle = 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Enzyme : | G6PDH | LDH | SDH | MDH | IDH1 | IDH2 | IDH3 | 6PGD | DD + |
| PVA 18 % dans un tampon phosphate 100 mM | 1 mL ; pH = 7,4 | 1 mL ; pH = 7,4 | 1 mL ; pH = 8,0 | 1 mL ; pH = 7,4 | 1 mL ; pH = 7,4 | 1 mL ; pH = 7,4 | 1 mL ; pH = 7,4 | 1 mL ; pH = 8,0 | 1 mL ; pH = 8,0 |
| 5 mM NitroBT | mélange de 5 mg/40 µL | mélange de 5 mg/40 µL | mélange de 5 mg/40 µL | mélange de 5 mg/40 µL | mélange de 5 mg/40 µL | mélange de 5 mg/40 µL | mélange de 5 mg/40 µL | mélange de 5 mg/40 µL | mélange de 5 mg/40 µL |
| 5 mM NaN3 | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | |
| 5 mM MgCl2 | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | |||
| 3 mM NAD+ | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | ||||||
| 0,8 mM NADP | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | ||||
| 2 mM ADP | 10 ΜL | ||||||||
| substrat | glucose-6-phosphate 10 mM | lactate de 150 mM | succinate de 50 mM | acide malique 100 mM | isocitrate 2 mM | isocitrate 2 mM | isocitrate 2 mM | 10 mM 6-phospho-galactonate | acide glutamique 10 mM |
| mPMS 0,32 mM | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | ||||
| 0,2 mM PMS | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | |||||
| Durée de l’incubation | 5 min | 30 min | 60 min | 60 min | 30 min | 30 min | 30 min | 10 min | 30 min |
Tableau 1. Aperçu schématique du protocole cartographie métabolique des déshydrogénases. Abréviations : ADP, l’adénosine diphosphate ; (m) PMS (méthoxy) -5-methylphenazinium sulfate de méthyle ; nitroBT, nitro bleu tetrazolium chlorure ; G6PDH, glucose-6-phosphate déshydrogénase ; LDH, lactate déshydrogénase ; SDH, succinate déshydrogénase ; MDH, malate déshydrogénase ; IDH, isocitrate déshydrogénase ; 6Pgd, 6-phosphogluconate déshydrogénase ; GDH, glutamate déshydrogénase.
Discussion
Recherche sur le métabolisme cellulaire connaît actuellement une renaissance parce que les chercheurs se rendent compte maintenant que les effets métaboliques sont essentielles pour la pathogénie et le traitement de nombreuses maladies. 1 en outre, recherche métabolique est facilitée par une multiplication des techniques qui fournissent ce champ de recherche avec des outils plus que jamais, y compris la spectrométrie de masse, marquage radioisotopique et spectrométrie de résonance magnétique nucléaire. Cartographie métabolique n’est absolument pas une nouvelle technique, mais sa capacité à donner intégré d’information sur l’activité des enzymes dans une situation presque respectueux de la nature rend cette technique plus pertinente que jamais. 2
Les cofacteurs NAD+ et NADP+ sont trouvent dans toutes les cellules vivantes, ce qui indique que les déshydrogénases est née très tôt au cours de l’évolution et ont un rôle important dans le métabolisme cellulaire. 14 , 15 actuellement, il y a 523 réactions catalysées par les enzymes qui sont classées comme déshydrogénases et se produisent à travers toutes les espèces. 16 en théorie, l’activité de toutes les réactions de différents déshydrogénase peut être séparément étudiée en tordant le protocole de cartographie métabolique décrit ici. Chaque réaction enzymatique est unique par le substrat et les cofacteurs nécessaires à son activité. Par conséquent, l’activité de chaque réaction enzymatique peut être déterminée à l’aide d’une expérience de cartographie métabolique avec le substrat adéquat et les cofacteurs dans le milieu réactionnel. Cependant, certaines isoformes de l’enzyme se distinguent par leur localisation subcellulaire, par exemple une isoforme catalyse une réaction dans le cytoplasme, alors qu’une autre isoforme fonctionne dans les mitochondries. Un exemple notable est IDH1 et IDH2, dont le premier est cytoplasmique et ce dernier est mitochondrial et qui sont deux différentes protéines codées par deux gènes différents. 11 1-méthoxy-5-methylphenazinium methylsulfate (méthoxy-PMS) et 5-methylphenazinium methylsulfate (PMS) être utilisable comme transporteurs d’électrons pour ces expériences. L’ancien ne passe pas les membranes mitochondriales, l’argument de ce dernier. Par conséquent, enquêtes sur des enzymes mitochondriales (p. ex. IDH2) devraient utiliser PMS alors que les enquêtes sur les enzymes cytosoliques (p. ex. IDH1) doivent utiliser des mPMS.
Comme avec beaucoup de techniques, les variations du présent protocole, telles que l’utilisation de différents types de sels de tétrazolium, à l’exception de l’ajout du syndrome prémenstruel et azoture de sodium, à l’aide d’un support de montage aqueux et variant d’incubation et rinçage fois, existent et peuvent fonctionner tout aussi bien. L’application de cartographie métabolique avec les sels de tétrazolium n’est pas limitée aux déshydrogénases. Avec de petites modifications au protocole, il peut également être utilisé pour l’évaluation de l’activité des enzymes qui agissent directement en amont d’une déshydrogénase dans une voie métabolique. Nous avons déjà décrit ce principe pour l’enzyme glutaminase,17 qui fonctionne directement en amont de la glutamate déshydrogénase dans la voie de glutaminolyse. 18 en théorie, le même principe peut être appliqué à d’autres enzymes qui fonction directement en aval ou en amont d’une déshydrogénase par exemple aconitase, qui se trouve directement en amont de IDH2 et IDH3 dans l’acide tricarboxylique (TCA) du cycle. Une autre variante simple des concentrations décrites dans le tableau 1 est au moyen de faire des flacons de medium d’incubation avec différentes concentrations de substrat, cofacteur et/ou inhibiteur. Cela permet la génération de courbes dose-activité en fonction de la concentration de substrat, cofacteur et/ou inhibition.
Techniquement parlant, métabolique des expériences de cartographie ne facilitent pas impartiale des observations in situ l’activité enzymatique, parce que les chercheurs doivent choisir une concentration de substrat et le cofacteur qui peut-être ne pas refléter les niveaux de substrat et le cofacteur qui sont présents sur place. En outre, l’utilisation de visqueux 18 % PVA dans le milieu réactionnel sert à garder les macromolécules intactes, en place et en conformation, mais interdit la diffusion efficace de faibles poids moléculaire réactifs au moyen de la réaction. 3 , 5 c’est pourquoi, les activités enzymatiques déterminé dans les expériences décrites ici qui utilisent des concentrations du substrat supra-physiologiques ne reflètent pas la situation in vivo à une concentration de substrat donné mais conviennent pour comparaisons intra-expérimentales. Ainsi, les résultats des expériences de cartographie métabolique sont la capacité de production (activité maximale) d’une réaction enzymatique dans le contexte des niveaux de substrat et le cofacteur qui sont présentes in situ. En outre, l’utilisation de diverses concentrations de substrat et/ou de cofacteurs et d’échantillons multiples permet une comparaison objective de la capacité de production maximale (Vmax) et l’affinité (K,m) d’une enzyme pour le substrat/cofacteur dans des préparations de cellules , tissus ou regions tissulaires. Ces paramètres sont le résultat de la somme de l’expression de la protéine enzymatique, modifications post-traductionnelles et l’effet d’un micro-environnement bondé sur l’activité des enzymes. La cartographie métabolique est donc encore mieux compte de l’activité enzymatique qu’expériences que déterminer l’expression de la protéine ou purifié l’activité enzymatique in vitro.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
R.J.M. est soutenu par une bourse de doctorat de AMC. Cette recherche a été financée par la société néerlandaise de Cancer (subvention KWF UVA 2014-6839). Les auteurs remercient Dr A. Jonker pour son aide à la rédaction du protocole.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| D-Glucose 6-phosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | G7879 | |
| Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4) | Merck Millipore | 106559 | |
| di-Sodium succinate | Sigma-Aldrich | W327700 | |
| DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | I1252 | |
| D-Malic acid | Sigma-Aldrich | 2300 | |
| Glycerol Gelatin | Sigma-Aldrich | GG1 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| Lithium 6-phospho-D-galactonate | Sigma-Aldrich | 55962 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| methoxy-Phenazine methosulfate | Serva | 28966.01 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N0505 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | NADP-RO | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Phenazine methosulfate | Serva | 32030.01 | |
| Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed | Sigma-Aldrich | P1763 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck Millipore | 104873 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Bandpass filter | Edmund optics | https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/ | |
| Grey-step wedge | Stouffer Industries | http://www.stouffer.net/TransPage.htm |
References
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