Summary
ここでは、顕微鏡可視化し、細胞と組織と反応速度論、関数と内局内脱水素酵素の活動を定量化に使用できるプロトコルを提案する.
Abstract
変更された細胞の代謝は、癌、心血管疾患および感染症を含む多くの病気の特徴です。細胞の代謝運動単位酵素は、彼らの活動は大きく多く、転写などのレベルがあり、mRNA の安定性、翻訳、翻訳後修飾と機能レベルで規制されています。この複雑な規制を意味する究極の活動に関する酵素の機能の不完全な情報を定量的 mRNA 実験、西部のしみ、免疫組織化学など従来の定量的またはイメージング アッセイに収量および/またはその内局。定量的酵素組織化学および組織化学 (すなわち、代謝マッピング)の in situ酵素活性とその速度論、関数とほぼ真に自然状況で内局の詳細な情報を表示します。
NAD(P)+ 、流行などの補因子を減らすために酸化還元反応を実行する酵素、脱水素酵素の活動を検出するプロトコルについて述べる。セルおよびティッシュ セクションは 1 つ脱水素酵素の酵素活性のために特定の媒体で培養しました。その後、調査の主題である脱水素酵素は細胞内サイトにその酵素活性を実行します。反応中間体の化学反応でこれは最終的に脱水素酵素の活性部位に青色の塩を生成します。塩の吸光度は、脱水素酵素の活性の直接測定ではそれゆえ、単色光顕微鏡と画像解析を用いて定量化することができます。このプロトコルの量的側面これらの試金から統計的結論をすることも可能。 にします。
観測的研究以外にもこの手法は特定の酵素の抑制研究に使用できます。この文脈では、代謝マップの真の自然の利点の恩恵を研究でその場で結果を与えて体外酵素阻害試験より生理学的に関連あります。すべてでは、代謝マップは携帯または組織レベルでの代謝の研究に不可欠な技術です。技術を採用するは簡単です、詳細な包括的かつ統合された代謝情報を提供します、迅速な定量分析が可能します。
Introduction
細胞生理学の本質的な基礎代謝です。代謝すべての生理学的なプロセスに必要なエネルギーは、細胞、生体高分子の生合成のためのビルディング ブロックを提供、廃棄物、有毒物質および逆アセンブルに関する生体のホメオスタシスを調節して不要なまたは機能不全の細胞成分のリサイクル。酵素は、ほぼすべての重要な細胞の化学反応の触媒、したがって細胞生理学における運動単位は。1,2
酵素の活動が多くのレベルで堅く調整される、従って定量的酵素組織化学、細胞化学 (代謝のマッピングとも呼ばれる) は酵素の活動の場を検討する方法。転写レベルで遺伝子発現 mRNA には調整されます。マイクロ アレイや直接 RNA 配列の現場の交配 (サブ) 携帯に情報を与えるなど、質的の mRNA アッセイなどの定量的な mRNA アッセイを用いた転写制御の効果を定めることができます。mRNA の分子の局在。これにより、転写活性の細胞間の相対的な違いを理解することが可能。解釈および代謝活性に関してこれらの mRNA の試金の妥当性は、複雑な規制がまた配列と mRNA の分子の安定性が DNA から転写された後を編集、mRNA レベルで発生するため。この編集は、タンパク質アイソ フォームの翻訳とリボゾーム、蛋白質の翻訳量を調節します。さらに、タンパク質翻訳のプロセスは制御され、最終的には酵素の発現とそのための活動に影響を与えます。西部にしみが付くことや逆相蛋白ライセート マイクロ アレイ、または質的なタンパク質発現アッセイなど、量的蛋白質式の試金を使用して前述の規制の手順の組み合わせの効果を理解できます。これらの技術、免疫組織染色、免疫細胞化学は、タンパク質の翻訳後修飾とその混雑した微小環境における酵素機能の調節など下流の規制の効果を組み込むに失敗します。さらに、酵素の発現細胞や組織ホモジネートまたは希薄水溶液の精製酵素の活性測定は広く使用される酵素活性の研究、その活動と関連付ける悪いことがあります。しかし、これらの実験は酵素の活性に及ぼす混雑させた区分細胞質やオルガネラを複製に失敗します。さらに、すべての前述の各手法数量または mRNA または酵素発現の局在を決定するが、この統合ではおろか、酵素の発現のこれらの側面の両方の包括的な情報を与えることができません。酵素活性測定と情報。2,3,4
代謝のマッピングでは、酵素の活動を決定する前述の変数のすべての感謝をことができます。さらに、代謝のマッピングは、生きている細胞や組織イメージング細胞や酵素の活動のデータを生成するほぼ真に自然状況を生成する分析中にそのまま保たれる組織の形です。それは酵素の活動の場所として細胞や組織のコンパートメント内の酵素活性の堅牢な定量化の両方詳細な感謝を容易にする画像を生成します。3,4ここに記載した脱水素酵素の活動の代謝マッピング プロトコルは、原則定量的酵素組織化学、6の上に5のすべての利用可能な酵素組織化学的方法の実験室マニュアルに基づいています。定量的代謝マップの画像解析。4
脱水素酵素は、それぞれ NADH、NADPH および FADH2、+NAD, NADP+と流行など正規の補因子を減らすために酸化還元反応を行う酵素です。その他の試薬・基板・特定脱水素酵素およびテトラゾリウム塩の補因子が含まれ、反応媒体のままなセルまたは化学的に固定されていないクライオスタット切片に孵化します。その後、その脱水素酵素はその触媒活性を行い、削減、たとえば、NADP+を NADPH へ。電子キャリアを介して 2 NADPH 分子は最終的に、脱水素酵素のサイトですぐに沈殿物 1 水不溶性の青い塩の分子に 1 半無色の水溶性テトラゾリウム塩の分子を減らします。したがって、沈殿した塩の吸光度は脱水素酵素の地域活動の直接測定は、光学顕微鏡を使用して観察することができます、または単色光顕微鏡と画像解析を用いて定量化します。このプロトコルの量的側面これらの試金から統計的結論をすることも可能。 にします。さらに、この数量は、酵素の速度論的パラメーター最大酵素活性 (Vmax) (Km) 酵素に対する基質の親和性などその場での決定を促進します。3,4,5,6
それは実験、あたりは、孵卵中における一貫性を得るために時間の遅れを最小限に抑えるため 50 ガラス スライドへの付着細胞製剤またはティッシュ セクションの最大を推奨を実現するために重要な代謝のマッピングの実験を計画するとき結果。プロトコル手順は、1 つ以上の実験者によって協力して実行されるとき以上のスライドや培地成分を処理することが可能です。さらに、いくつかの変動は実験の間に存在します。したがって、同一の実験は、各セルの準備から cytospins または各組織サンプルからのセクションで、少なくとも 3 回繰り返す必要があります、適切なコントロールは、各試験に含まれるべき。常に非特異的酵素活性染色を制御する因子存在下で基板の不在で制御培養液を準備します。最も代表的な結果を取得する実験で異なる基板/因子濃度が同じサンプルからティッシュ セクションまたは細胞製剤に適用される実験者による酵素反応速度論解析を実行できるように、線量活動曲線。
Protocol
このプロトコル学術医療センターの医療倫理審査委員会のひと由来の材料の使用に関するガイドラインに従います。
1. 細胞またはティッシュ セクションの準備
- セル
- 10 mm のペトリ皿に 37 ° C で 5 分間 0.25% トリプシン-EDTA の 1 mL を使用して培養皿からセルを trypsinize、50,000 200,000 セル/ml セルのサイズによって懸濁液は 37 ° C のセルをもたらします。
- 室温で 5 分間で 20 x g で収集 cytospin 目標到達プロセスを使用して顕微鏡スライド上に細胞懸濁液 200 μ L を接続します。
- 室温で 24 時間 cytospins を空気乾燥します。これは、脱水素酵素活性には影響しません。5
- ティッシュ セクション
- 患者または倫理的な許可によると動物から組織を抽出します。組織の 10 mm3は複数の実験のために十分です。
- 小さな通気孔のある 2 mL プラスチック容器にティッシュの部分を入れ、スナップ-凍結液体窒素にティッシュの切れ端を含むバイアル。
- さらに処理まで −80 ° C で組織部分を含むバイアルを保存します。
- 水は、結晶を形成できませんので、急速に、-20 ° C ~-25 ° C までフリーズするチャックに組織サンプルをマウントするのに最適な切削温度 (10 月) と呼ばれるゲル状の培地を使用します。
- 切削と最初トリミング希望のレベルまでブロックのクライオスタットを使用 (理想的には、顕微鏡の幅の半分ガラス スライド、例えば5 mm × 5 mm)。
- 断面、時にセクションが上向きにカールすることを防ぐためにブラシおよびアンチロール プレートを使用します。
- 遅いが、一定速度で 6-10 μ m 厚のセクションに組織サンプルをカット (1 セクション毎秒)。セクションは正しくカット、アンチロール プレートの下には、ミクロトーム ナイフに残ります。
- 顕微鏡によるガラス スライド上の 1-3 セクションをピックアップし、使用するまで −80 ° C で保存します。準備のセクションの数は、組織サンプルのサイズと各セクションの所望の厚さに依存します。
2. 酵素病理組織/溶脱水素酵素の組織化学
- 反応バッファーを準備します。
- 正しい pH のリン酸バッファーの 100 mL を準備 (表 1を参照してくださいすべての酵素はその活動は最高で最適な pH)。たとえば、正しい pH のバッファーが行われるまで 0.1 M KH2PO4 (酸性) と 0.1 M NA2HPO4 (基礎) のソリューションをミックスします。
- PVA はほこりや有毒なヒューム フードの下でリン酸バッファーにポリビニル アルコール (PVA) の 18 グラムの重量を量る。
- バッファーを温暖化によって 18 %w/v PVA 100 ° C でりん酸緩衝を溶かすau のベインさんマリー (水を沸騰のガラス瓶を置く) と PVA を完全に溶解するまで攪拌します。ソリューションは、攪拌によって引き起こされる小さい空気泡と透明になります。通常、溶解する PVA 〜 15 分が必要です。
注: 18 %w/v PVA リン酸バッファーには粘性と広いピペットを使用して 15 mL 反応バッファー管に転送することができます。リン酸バッファーの w/v 18 %pva の短期記憶は ≥ に ≥40 ° C および長期保管 (2 週間) で発生する 60 ° Cリン酸バッファーの w/v 18 %pva の 250 μ L は、500 μ L はティッシュ セクションに必要な通常 cytospin の準備のため必要です。
- バッファーを温暖化によって 18 %w/v PVA 100 ° C でりん酸緩衝を溶かすau のベインさんマリー (水を沸騰のガラス瓶を置く) と PVA を完全に溶解するまで攪拌します。ソリューションは、攪拌によって引き起こされる小さい空気泡と透明になります。通常、溶解する PVA 〜 15 分が必要です。
- テトラゾリウム塩 (nitroBT) の溶液を準備します。1 mL の培養液のすべて、nitroBT 溶液 40 μ L が必要、20 μ L ジメチルホルムアミド (DMF) のミックスで溶解した nitroBT (黄色い粉) の 5 mg から成ると 20 μ L のエタノールは、黄色い透明な溶液になります。
注: nitroBT の安定性が必要な試薬はすべての最も低い、ためにお勧め最後 nitroBT 原液を用意し、まず、nitroBT を反応媒体に溶解します。- DMF やエタノールに nitroBT を時間の短い期間の間にガラスの瓶のそれを熱することによって溶解 (~ 10 s) ブンゼン バーナーを使用しています。加熱中にバイアルを振るし、蒸発を防ぐために炎で長すぎるバイアルを放置しないでください。
- 10% にする溶解プロセス中に DMF とエタノールの蒸発のために余分な nitroBT ソリューション。
- 電子キャリア フェナジン methosulfate (PMS) または (1-メトキシ) の盾-フェナチン methosulfate (Mpm) とインキュベーション メディア バイアル ストレージ周りのアルミ箔をラップすることによって直接光から m(PMS) を含みます。
- 蒸留 H2o. でそれらを溶解して表 1によると、試薬を準備します。いくつかの試薬は急速に滅びる、だからできるだけ実験直前にそれらを準備します。使用するまで氷の上または 4 ° C で、試薬を維持します。
- 表 1に示すように、培養メディアを準備し、各手順の後穏やかな攪拌によるソリューションを均質化します。培養液中の気泡の生成を避けるため、継続的に攪拌、攪拌しながら培養液の表面の下のへらを保つことによって。
- 培養液をティッシュ セクションに適用します。
- Cytospins 付き中古暖かい顕微鏡用スライドまたはティッシュ セクション 37 ° c 15 分免疫培養室で接続されている水没で一定の温度を維持するために暖かい水で免疫組織化学培養チャンバーの底、インキュベーター。
- 慎重に分割または狭いから広い部分への移行にパスツール ピペットを見送った。正規のパスツール ピペットが狭いので、このステップはパスツール ピペット培養液の吸引のための十分な幅に必要な粘性培養液を吸引します。
- 適切な培養液の 250-500 μ L を各セル準備またはティッシュ セクション パスツール ピペットの広い部分を使って顕微鏡スライド上に適用されます。
- 培養液を均等に広げるためピペット チップを使用します。これらは表面に浮くし、顕微鏡スライドのセルの準備またはティッシュ セクションで酵素反応と干渉しないので、潜伏中に小さな気泡を無視します。
- 酵素反応速度論と特定セル準備におけるその表現によって、あらかじめ指定された期間間インキュベート細胞または組織切片の顕微鏡スライド 37 ° C の定温器 (例えば培養インキュベーター) または組織 (表 1)。反応バッファーが乾くを防ぐために湿潤環境を維持するために閉じた免疫培養チャンバのリッドを維持します。
- 顕微鏡スライドを洗浄
- ティッシュで余分な培養液をオフをタップします。
- 機械的に 60 ° C リン酸バッファー、バッファーの顕微鏡スライドを上下移動することによって pH は 5.3 の顕微鏡スライドから培養液を洗い流します。これは、酵素反応を停止します。
- 60 ° C リン酸バッファー pH 5.3 20 分のためにそれらを保つことによって顕微鏡スライドを洗います。
- 60 ° C 水道水で顕微鏡スライドを機械的に洗浄します。
- 20 分の 60 ° C 水道水でそれらを保つことによって顕微鏡スライドを洗います。
- 水とスライドがゆっくりと 1 分のコース上 60 ° C 水道水常温水道水を混合することによって冷却します。
- 常温蒸留水に最終的な機械的洗浄のステップを実行します。
- ステンド グラス Cytospins または組織切片を顕微鏡スライド上で囲む
- 前 50-60 ° C で暖かいスライドを温める
- 慎重にペーパー タオルを使用して顕微鏡スライドの後ろ側を乾燥、顕微鏡スライドの上面を乾燥して暖かいスライドに配置。
- スライドが乾燥しているとき、細胞製剤、グリセリン ゼリー マウント媒体と coverslips を用いた顕微鏡スライドに組織切片を囲みます。
- 4 ° C で冷蔵庫で暗闇の中で細胞またはティッシュ セクション顕微鏡スライドを保存または画像集録をすぐに続行します。
3. 画像の取得
- 固定、十分なダイナミック レンジ (少なくとも 8 ビットが、好ましくは 10 ビットまたは 12 ビット)、科学的な白黒 CCD カメラで画像を記録利得と線形応答。
- (Cytospins の X-63 X 20) と 10 63 X 切片の適切な目的を選択します。
- ビューのフィールドよりも若干大きいので、フィールド ダイヤフラムを狭くすることによって、まぶしさを軽減します。
- 赤外線ブロックとの組み合わせで塩沈殿物7の isobestic 波長付近 10 nm 広い帯域推定フィルターを適用して単色光フィルター (表を参照) を使用します。
注: nitroBT の最大 isobestic の吸光度は、585 nm。 - カメラの全体のグレーのレベル範囲が使用されるようにする照明を最適化 (過剰空白顕微鏡スライドを記録するときにさらすことがなく最高の照明を達成するすなわち、照明レベルを設定する)。
- 測定の灰色レベル知られている吸光度 (または光学密度 [外径]) に値を調整します。このため、校正スライドまたはステップの少なくとも 10 の異なる手順のグレイ スケール画像をキャプチャか市販 (参照材料表) 既知の OD 値 (ステップ 4.1.1 を参照) を搭載したタブレットまたは測定によるカスタムメイドのグレー スケール ウェッジ ステップ タブレット、densitophotometer と使用を調整する結果測定知られている吸光度の値に値を灰色します。
- 興味のティッシュ セクションまたは細胞の顕微鏡写真をキャプチャします。
4. 画像解析
- 画像解析の前に吸光測定の ImageJ ソフトウェアを調整します。
- 既知の OD 値と校正スライドまたはステップ タブレットで知られている吸光度パラメーターを少なくとも 10 の校正領域の顕微鏡写真の吸光度 (OD) を測定します。ImageJ、分析 → 対策メニューまたは Ctrl + M ホットキーを使用して、選択した領域を測定します。
- 分析に行くことによって吸光度調整手順を開始 → 校正。関数「Rodbard (NIH Image)」を選択します。開いたウィンドウの左の列に校正スライド/ステップ タブレット 4.1.1 以降で実行の各ステップから灰色のレベル測定の結果は既にあります。されていない場合は、ImageJ 結果画面からそれらをコピーします。右側の列で校正ステップ タブレットで受信した証明書に印刷される各対応する既知の吸光度の値を入力します。ボックス「グローバル校正」と「表示印刷」をチェックして、「OK」を押します。
- 品質管理、Rodbard 関数の R2ことを確認 > 0.99。それは場合 < 0.99、チェック知られている吸光度パラメーターが正しく入力されたかどうか、かどうか調整スライドを撮影され、正しく測定します。
- ImageJ のキャリブレーションが完了、プログラムを閉じるまで (それ故に「グローバル校正」).吸光度測定用校正 ImageJ セッションを常に観測された吸光度は 0 0 と 1 の間の値に意味に変換 1 ゼロの漸近線と、吸光度をそれぞれフルします。
- Cytospins、選択 > ランダムな方法で 100 シングル セル。ティッシュ セクションのすべてのセクションで固定の長さと幅の興味の 1 つまたは複数のフィールドを選択します。
- 公平なセルの範囲を支援する顕微鏡写真でラスターのプロジェクトです。ImageJ、プラグイン → 分析 → グリッド] メニューを介して画像にグリッドをプロジェクトします。
- ImageJ、楕円ツールを使用して、単一のセルを選択し、組織領域を選択する四角形ツールを使用します。
- 選択したセルまたは組織領域の面積と吸光度を測定します。光学濃度と周辺地域は、「意味」と呼ばれ、ImageJ の「部」結果スプレッドシート、それぞれ。
注: セルまたはティッシュの地域 (異なるサイズを持ついくつかの組織の領域を選択した) 場合の総吸光度吸光度で区切られたピクセルすべての合計と同じです。1000 ピクセル、セルのイメージを作成する場合は、全体の吸光度は 1000 の吸光度の和によって与えられるし、平均吸光度は合計 1000 分の吸光度によって与えられます。この手順では、分配のエラーも回避できます。 - 平均総吸光度を決定 > 30 セルまたはコントロールがない場合は基板が補因子の存在下で培養液にさらされたサンプルが含まれていますコントロール スライドから組織領域。このコントロールの吸光度は、非特異的酵素活性染色の制御に使用され、使用される顕微鏡スライド、媒体、カバー スリップまたは顕微鏡マウントによる吸光度の工芸品。
- すべての合計吸光度測定 (基質・阻害剤の濃度の異なる) が補因子の同じ濃度で培養液にさらされたサンプルから平均コントロール吸光度を減算します。これは細胞や組織の地域の修正総吸光度を提供します。
- 学生の T テストや実験デザインによって、一方向の分散分析テストを使用して平均の修正された合計カラムベッドを統計的に比較します。
- 塩吸光度による酵素活性 (分あたり mL あたり µmol 変換基板) に変換できるランバート ビールの法則: c=A/(є×d)、c は反応中間体の塩の濃度、A は ImageJ で校正後の測定した吸光度Є は塩の消散係数 (585 で 16.000 nm)8 d、走行可能距離、平均セル厚または公称断面切断厚 (このプロトコルで 6-10 μ m) に等しいである光。
注: 乾燥後、組織切片厚低下公称断面切断厚から 〜 50% が公称断面の切断厚は生物学的に高いので、これは上記の計算に反映されていません。平均セル厚及び球については顕微鏡のスライド ガラスに付着したセルの寸法は、共焦点顕微鏡や広視野顕微鏡のプロトコル見つけることができます他の場所を使用して決定できます。9,10
Representative Results
特定の脱水素酵素の活動を調査するため培養液を準備するいくつかのプロトコルのとおりです。各脱水素酵素の少なくとも 37 ° c. の温度を維持しながら PVA の水溶液で上場の試薬を溶解します。表に示す順序で試薬を溶解必要があります、すなわちnitroBT は、常に最初に分解した (m) PMS は常に最後に分解します。NitroBT の各 5 mg は 40 μ L ミックス (20 μ L エタノール + 20 μ L ジメチルホルムアミド) で分解します。すべてのボリュームは、〜 2 ティッシュ セクションまたはスライド ガラスの 〜 4 細胞製剤を染色する使用ことができます 18 %pva の水溶液 1 mL あたりです。NitroBT NAD+、NADP+、ADP と基板ソリューションはたてすべきであります。(M) PMS、MgCl2ナン3ソリューションを 1 ヶ月の 4 ° C で保存できます。18% リン酸に溶解した PVA 2 週間 60 ° C で格納されるバッファー。18% の PVA の水溶液の pH は、0.1 M のリン酸二水素カリウム (KH2PO4) と 0.1 M ナトリウム水素リン酸塩 (NA2HPO4) バッファーの組成の異なるを使用して設定できます。示されている平均潜伏期は、良い出発点を提供が、最適な潜伏期間は種、組織型および組織の保存によって異なります。一般に、セル準備は塩生産と同様のレベルを取得するティッシュ セクションより長く培養する必要があります。
野生型イソクエン酸脱水素酵素 1 と 2 (IDH1/2) はそれぞれ細胞質とミトコンドリアの NADPH に NADP+の併用削減とイソクエン酸の α-ケトグルタル酸 (αKG) への変換を触媒します。これらの酵素はひと癌、脳腫瘍の症例 (膠芽腫)、大腸癌を含むさまざまな種類でIDH1/2突然変異が発生するため、最近関心を集めているし、の可能性を実証するユニークな機会を提供代謝のマッピング。IDH1突然変異 IDH1 野生型酵素を無効にし、また生産や oncometabolite D-2 の後続の蓄積につながるネオ酵素活性を誘導する-ヒドロキシグルタル酸 (D-2 HG) である11別の場所で詳しく説明します。12代謝マッピング実験を示したその NADP+-依存 IDH1/2 活動はノックでヘテロIDH1突然変異よりもをした大腸癌細胞における大腸癌細胞で有意に低いIDH1野生型 (図 1 a)。この違いは、単色光顕微鏡写真 (図 1 b) の画像解析による定量化されました。12
代謝マッピング実験の別の示す例に示します図 2、ひと神経膠芽腫細胞を注入したマウス脳のクライオスタット切片像であります。IDH1/2 は、人間の脳の最も重要な NADPH プロバイダーとその活動は誘導野生型IDH1/2グリオブラストーマにおける IDH1/2 NADPH の生産能力ははるかに低い齧歯動物の頭脳の。11図 2 aは、高 NADP+の違いを示しています-ひと膠芽腫細胞と+の低の NADP 依存 IDH1/2 活動-健康なマウス脳内依存 IDH1/2 活動。IDH1/2 活動は組織図 2 bで毎分 1 mL あたり µmol NADPH 生産として定量化されます。
IDH1/2 の酵素反応は比較的簡単ですが、乳酸脱水素酵素 (LDH) 複雑なより複雑な酵素であります。LDH は乳酸からピルビン酸 NAD+ NADH またはその逆の低下への可逆的な変換を変換します。乳酸とピルビン酸の可用性と LDH 酵素の複合体の組成を決定かどうか乳酸は主に変換されます (これで LDH-B 触媒し、NADH が生成) ピルビン酸やピルビン酸は乳酸に変換主にかどうか (これはLDH の触媒し、NADH を消費する)。13代謝マッピング実験は NADH 生産は行われず、結果として nitroBT を塩に減少しませんので、彼らは「盲目」LDH の反応の活性が LDH B 反応のアクティビティを視覚化することができます。図 3に示す NAD+-乳酸 (図 3 b の高濃度の存在下で基板 (図 3 a) の不在のセクションを人間の脳に依存して LDH 活性は (すなわちピルビン酸を乳酸に変換))、(図 3) 6 mM 乳酸及び乳酸の低濃度と高濃度ピルビン酸 (図 3 D) の存在下における。これらの実験の結果を示す代謝キャプチャ適切にマッピング NAD+-ティッシュ セクションの依存の LDH 活性乳酸とピルビン酸反応中間体の供給によって決まります。
図 1.NADP+-ひと大腸癌細胞の依存 IDH1/2 活動。NADP+の染色後 HCT116 ひと大腸癌細胞の (A) 代表的な単色光顕微鏡写真-1 10 mM イソクエン酸と 0.8 mM NADP+に対して依存 IDH1/2 活動。スケール バー = 50 μ m。 (B) によって NADP+nitroBT 産青い塩の吸光度の定量化-セルごとの依存 IDH1/2 アクティビティは (A) の単色光と画像解析を使って表示されます。略語: IDH1WT/WT、イソクエン酸脱水素酵素 1 野生型;IDH1WT/ムト、イソクエン酸脱水素酵素 1 の変異。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.NADP+-膠サンプル依存 IDH1/2 活動。NADP+の染色後健康なマウスの脳 (h) およびひと膠芽腫腫瘍異種移植腫瘍 (t) を含むマウスの脳のセクションの (A) 代表的な顕微鏡写真-0.8 の存在下で依存すること IDH1/2 活動mM NADP+と 2 mM イソクエン酸。スケール バーのマウス脳 (h) および異種移植腫瘍 (t) ひと膠芽腫ランバート ビールの法則を使用して (A) に示すように領域の 200 μ m (B) 酵素活動定量化を =。エラーバーは標準偏差を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.NAD+-脳サンプルの依存の乳酸脱水素酵素 (LDH) 活性。脳 NAD+の染色後サンプルの切片の代表的な顕微鏡写真-制御条件 (不在基板とピルビン酸、3 mM NAD+のみ) に (B) に対する依存の LDH 活性 (A)150 mM 乳酸ピルビン酸 (C) 6 mM に対しての不在に対して 18 mM ピルビン酸、乳酸・ ピルビン酸反応の競争力のある製品の阻害薬の存在下で 6 mM 乳酸に対するピルビン酸と (D) のない状態で乳酸します。スケール バー = 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 酵素: | G6PDH | LDH | SDH | MDH | IDH1 | IDH2 | IDH3 | 6PGD | GDH |
| PVA 100 mM リン酸緩衝で 18% | 1 ミリリットルです。pH 7.4 を = | 1 ミリリットルです。 pH 7.4 を = | 1 ミリリットルです。 pH = 8.0 | 1 ミリリットルです。pH 7.4 を = | 1 ミリリットルです。pH 7.4 を = | 1 ミリリットルです。pH 7.4 を = | 1 ミリリットルです。pH 7.4 を = | 1 ミリリットルです。pH = 8.0 | 1 ミリリットルです。pH = 8.0 |
| 5 mM NitroBT | 5 mg/40 μ L ミックス | 5 mg/40 μ L ミックス | 5 mg/40 μ L ミックス | 5 mg/40 μ L ミックス | 5 mg/40 μ L ミックス | 5 mg/40 μ L ミックス | 5 mg/40 μ L ミックス | 5 mg/40 μ L ミックス | 5 mg/40 μ L ミックス |
| 5 mM ナン3 | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | |
| 5 mM MgCl2 | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | |||
| 3 mM NAD+ | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | ||||||
| 0.8 mM NADP | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | ||||
| 2 mM ADP | 10 Μ L | ||||||||
| 基板 | 10 mM グルコース-6-リン酸 | 150 mM 乳酸 | 50 mM コハク酸 | 100 mM リンゴ酸 | 2 mM イソクエン酸 | 2 mM イソクエン酸 | 2 mM イソクエン酸 | 10 mM 6-リン-galactonate | 10 mM グルタミン酸 |
| 0.32 mM Mpm | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | ||||
| 0.2 mM PMS | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | 10 Μ L | |||||
| 潜伏期間 | 5 分 | 30 分 | 60 分 | 60 分 | 30 分 | 30 分 | 30 分 | 10 分 | 30 分 |
テーブル 1。脱水素酵素の代謝マッピング プロトコルの概要。略語: ADP、アデノシン二リン酸;(m)PMS (メトキシ)-5-methylphenazinium メチル硫酸塩;nitroBT、ニトロ ブルー テトラゾリウム塩;G6PDH, グルコース-6-リン酸脱水素酵素;LDH、乳酸脱水素酵素。SDH、コハク酸脱水素酵素;MDH、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ;IDH、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ;6PGD、6-ホスホグルコン酸脱水素酵素;GDH、グルタミン酸脱水素酵素。
Discussion
細胞の代謝に関する研究は、代謝効果は病態と治療の多くの病気のための重要な研究を実現するために現在、ルネッサンスの経験をしています。1また、代謝研究は、質量分析法、アイソトープ標識核磁気共鳴分光法など、これまでより多くのツールと研究のこの分野を提供する技術の増加空室状況によって支援されています。代謝マップは新しい技術ではありませんが、ほぼ真に自然状況で酵素の活動の統合情報を与えるには、その能力は、この手法がこれまで以上に関連します。2
補因子 NAD+と NADP+脱水素酵素が進化の過程で非常に早く起こったことを示しますすべての生きている細胞であり、細胞の代謝に重要な役割があります。14,15現在、523 酵素触媒反応脱水素酵素として分類され、すべての種の間で発生することがあります。16 、理論的にすべて異なる脱水素酵素反応の活性調べることができます個別にここで説明した代謝マッピング ・ プロトコルをつまむことによって。すべての酵素の反応は、基板とその活動に必要な補助因子による一意です。したがって、各酵素反応の活性は、適切な基質と反応中に補因子代謝マッピング実験を使用して決定できます。しかし、いくつかの酵素のアイソ フォームの細胞内局在で異なる、別アイソ フォームは、ミトコンドリアの機能に対し例えば1 つアイソ フォームは細胞質に反応を触媒します。顕著な例は IDH1 と IDH2、前者は細胞質、後者はミトコンドリアと 2 つの異なる遺伝子によって符号化される 2 つの異なる蛋白質であります。11 1-メトキシ-5-methylphenazinium methylsulfate (メトキシ PMS) と 5 methylphenazinium methylsulfate (PMS) 両方使用できます電子キャリアとしてこれらの実験。前者後者はミトコンドリア膜を通過しません。したがって、ミトコンドリア酵素 (例えばIDH2) の調査は、Mpm を使用してください (例: IDH1) ゾル性細胞質の酵素に関する研究に対し、PMS を使用ください。
PMS の追加を除く多くのテクニック、テトラゾリウム塩の種類を使用するなど、このプロトコルの変化と同様、アジ化ナトリウム、水土台媒体を使用して様々 なインキュベーションと洗浄時間、存在して同様に動作可能性があります。テトラゾリウム塩と代謝のマッピングのアプリケーションは、脱水素酵素に制限はありません。プロトコルに小さな変更を加えるとに、直接機能酵素の活動の評価のため使用することができますも脱水素酵素で代謝経路の上流。グルタミナーゼ酵素、機能を直接17の民本主義前述したグルタミン酸脱水素酵素 glutaminolysis 経路の上流。18理論的には、同じ原理は関数を直接下流または上流、脱水素酵素例えばアコニターゼ、トリカルボン酸 (TCA) の IDH2 と IDH3 の直接上流にあるサイクルその他の酵素に適用できます。表 1 に示す濃度の別の簡単なバリエーションによるインキュベーション中バイアルを各種濃度の阻害剤や補因子基板を作るです。これは、抑制や補因子基板濃度の関数として線量活動曲線の生成可能です。
技術的に言えば、代謝のマッピング実験研究者が基板と因子レベルを反映していないと補助因子基板濃度を選ばなければならないので酵素活性の in situの公平な観察を促進しません。その場でプレゼントされます。さらに、粘性の 18% 反応媒体で PVA の場所および構造の高分子をそのままに保つのに役立つが、反応媒体を介して低分子化試薬の有効拡散を禁止を使用します。3,5したがって、生理学的基質濃度を使用するここで説明実験断固としたな酵素活性は反映していない特定基質濃度で体内の状況が適して内の実験的比較。したがって、代謝マッピング実験の結果は、現在原は、基質、補酵素レベルのコンテキストにおける酵素反応の生産能力 (最大活動) です。また、基板や補因子の濃度とマルチ サンプルを使用 (Vmax) の最大生産能力及び基板/補酵素の酵素の (Km) 親和性公平な比較セル準備、組織や組織の地域。これらのパラメーターは、酵素タンパク質の発現、翻訳後修飾酵素の活性に及ぼす混雑した微小環境の合計の結果です。したがって、代謝のマッピングはまだ蛋白質の表現を決定するまたは精製酵素活性の in vitroの実験よりも酵素活性の優れた反射です。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
R.J.M. は、AMC 博士課程奨学金によってサポートされます。この研究はオランダ癌協会 (KWF グラント UVA 2014-6839) によって支えられました。著者は博士 A. ジョンカーのプロトコルの執筆の彼の助けをありがちましょう。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| D-Glucose 6-phosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | G7879 | |
| Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4) | Merck Millipore | 106559 | |
| di-Sodium succinate | Sigma-Aldrich | W327700 | |
| DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | I1252 | |
| D-Malic acid | Sigma-Aldrich | 2300 | |
| Glycerol Gelatin | Sigma-Aldrich | GG1 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| Lithium 6-phospho-D-galactonate | Sigma-Aldrich | 55962 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| methoxy-Phenazine methosulfate | Serva | 28966.01 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N0505 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | NADP-RO | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Phenazine methosulfate | Serva | 32030.01 | |
| Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed | Sigma-Aldrich | P1763 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck Millipore | 104873 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Bandpass filter | Edmund optics | https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/ | |
| Grey-step wedge | Stouffer Industries | http://www.stouffer.net/TransPage.htm |
References
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