Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Metabolsk kartlegging: Kvantitative enzymet Cytochemistry og Histochemistry å bestemme aktiviteten til Dehydrogenases i celler og vev

Published: May 26, 2018 doi: 10.3791/56843
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Cancer Center Amsterdam, Department of Medical Biology, Academic Medical Center, University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands

Summary

Her presenterer vi en protokoll som kan brukes til mikroskopisk visualisere og kvantifisere aktiviteten til dehydrogenases i celler og vev og kinetics, funksjon og subcellular lokalisering.

Abstract

Endret cellenes stoffskifte er et kjennetegn på mange sykdommer, inkludert kreft, hjerte-og karsykdommer og infeksjon. Metabolsk motor enhetene celler er enzymer og deres aktivitet er sterkt regulert på mange nivåer, inkludert det transcriptional, mRNA stabilitet, translasjonsforskning, post-translasjonell og funksjonelle. Denne komplekse forskriften betyr at konvensjonelle kvantitative eller tenkelig analyser, som kvantitative mRNA eksperimenter, Western blotter og immunohistochemistry, gir ufullstendig informasjon om ultimate aktiviteten av enzymer, deres funksjon og/eller deres subcellular lokalisering. Kvantitativ enzymet cytochemistry og histochemistry (dvs. metabolske tilordning) viser detaljert informasjon i situ enzymatisk aktivitet og kinetics, funksjon og subcellular lokalisering i en nesten sant-til-naturen.

Vi beskriver en protokoll for å oppdage aktiviteten til dehydrogenases, som er enzymer som utfører redoksreaksjoner å redusere kofaktorer som NAD(P)+ og Kjepphest. Celler og vev deler er ruges i et medium som er spesifikk for den enzymatiske aktiviteten en dehydrogenase. Deretter utfører dehydrogenase som er gjenstand for etterforskning den enzymatiske aktiviteten i subcellular området. I en kjemisk reaksjon med reaksjon medium, til slutt genereres blå-farget formazan på stedet av den dehydrogenase aktivitet. Den formazan absorbans er derfor et direkte mål på dehydrogenase aktivitet og kan kvantifiseres monokromatisk lys mikroskopi og bilde analyse. Kvantitativ aspekt av denne protokollen kan forskere til å trekke statistiske slutninger fra disse analyser.

Foruten observasjonsstudier, kan denne teknikken brukes for hemming studier av spesielle enzymer. I denne sammenheng, studier dra nytte av ekte-til-naturen fordelene av metabolske kartlegging, kan gir i situ resultater som være fysiologisk mer relevant enn i vitro enzym hemming studier. I alle er metabolske kartlegging en uunnværlig teknikk å studere stoffskiftet på mobiltelefonen eller vev. Teknikken er lett å adoptere, gir detaljert, omfattende og integrert metabolske informasjon og muliggjør rask kvantitativ analyse.

Introduction

En vesentlig hjørnestein for mobilnettet fysiologi er metabolisme. Metabolisme gir cellene energien som trengs for alle fysiologiske prosesser, gir byggesteinene for macromolecular biosyntesen og regulerer mobilnettet homeostase med tanke avfallsprodukter, giftige molekyler og demonteringen og resirkulering av unødvendige eller dysfunksjonelle cellulære komponenter. Enzymer katalysere nesten alle viktige mobilnettet kjemiske reaksjoner og derfor er de motoriserte enhetene i fysiologi av celler. 1 , 2

Aktiviteten av enzymer er strengt regulert på mange nivåer og derfor kvantitative enzym histochemistry og cytochemistry (også kalt metabolske kartlegging) er den foretrukne metoden å studere enzym aktivitet i situ. På transcriptional nivå, er genuttrykk i mRNA regulert. Effekten av regulering av transkripsjon kan bestemmes ved hjelp av kvantitative mRNA analyser, for eksempel microarrays eller direkte RNA sekvensering kvalitativ mRNA analyser, for eksempel på plass hybridisering som gir informasjon om (sub) mobilnettet lokalisering av mRNA molekyler. Dette gjør det mulig å verdsette relative forskjeller i transcriptional aktivitet mellom celler. Men er tolkningen og gyldigheten av disse mRNA analyser med hensyn til metabolsk aktivitet komplisert fordi regulering oppstår også på mRNA nivå, der rekkefølgen og stabilitet av mRNA molekyler er endret etter at det er transkribert fra DNA. Dette redigerer regulerer protein isoformen oversettelse og protein oversettelsen antallet på ribosomene. I tillegg prosessen med protein oversettelsen er kontrollert og til slutt påvirker enzym uttrykk og derfor aktivitet. Den kombinerte effekten av nevnte regulatoriske trinnene kan nytes med kvantitative protein uttrykk analyser, for eksempel Western Blotting omvendt fase protein lysate microarrays eller kvalitativ protein uttrykk analyser, som immunocytochemistry og immunohistochemistry, men disse teknikkene ikke innlemme nedstrøms regulatoriske effekter som post-translasjonell modifikasjon av proteiner og funksjonelle regulering av enzymer i sine overfylt microenvironment. Videre kan uttrykk for et enzym dårlig korrelerer med sin aktivitet, slik at aktiviteten målinger av en renset enzym i cellen eller vev homogenates eller utvannet løsninger er mye brukt for enzym aktivitet studier. Imidlertid mislykkes disse eksperimentene å gjenskape påvirkning av en overfylt compartmentalized cytoplasma eller organelle på aktiviteten til et enzym. Videre alle nevnte teknikker bestemme antallet eller lokalisering av mRNA eller enzym, men ikke klarer å gi omfattende informasjon om begge disse aspektene av enzymet uttrykk, enn si integrering av dette informasjon med enzym aktivitet bestemmelser. 2 , 3 , 4

Metabolsk tilordning gjør styrkingen av alle nevnte variablene som bestemmer handlingen av et enzym. Hva mer, er metabolske kartlegging en form for levende celle eller vev bildebehandling med celler og vev som holdes vedlike under analyse for å generere en nesten sant-til-naturen situasjon for å generere data for aktiviteten av enzymer. Den produserer bilder som forenkler både detaljert styrkingen av plasseringen av enzym aktivitet i tillegg til robust kvantifisering av enzym aktivitet i en celle eller vev kupé. 3 , 4 protokollene beskrevet her for metabolske tilordning av aktivitet av dehydrogenases er basert på laboratoriet manualen for alle tilgjengelige enzymet histochemical metoder,5 på prinsippene kvantitative enzym histochemistry,6 og på bildeanalyse av kvantitative metabolske kartlegging. 4

Dehydrogenases er enzymer som utfører redoksreaksjoner å redusere kanoniske kofaktorer som NAD+, NADP+ og Kjepphest NADH, NADPH og FADH2, henholdsvis. Intakt celler eller kryostaten vev inndelinger som ikke kjemisk fast er ruges i et reaksjon medium som inneholder, blant andre, substrat og kofaktorer av en bestemt dehydrogenase og en tetrazolium salt. Deretter at dehydrogenase utfører sin katalytisk aktivitet og reduserer, for eksempel NADP+ å NADPH. Via et elektron carrier redusere 2 NADPH molekyler til slutt 1 vannløselige semi fargeløs tetrazolium salt molekyl i 1 vann-uløselig blå formazan molekyl som precipitates umiddelbart på stedet av dehydrogenase. Derfor absorbansen av utfelt formazan er et direkte mål på lokale aktiviteten til en dehydrogenase og kan observeres med * lys eller kvantifisert monokromatisk lys mikroskopi og bilde analyse. Kvantitativ aspekt av denne protokollen kan forskere til å trekke statistiske slutninger fra disse analyser. I tillegg forenkler denne kvantifisering fastsettelse av i situ kinetic enzym parametere, for eksempel maksimal enzym aktivitet (VMaks) og affinitet av et substrat for et enzym (K-m). 3 , 4 , 5 , 6

Når du planlegger en metabolsk kartlegging eksperimentet, er det viktig å innse at per forsøk, opptil femti glass lysbilder med overholde celle forberedelser eller vev inndelinger er anbefalt å minimere forsinkelser under inkubasjonen for å få konsekvent resultater. Det er mulig å behandle flere lysbilder og/eller middels komposisjoner når følgende protokollen utføres fellesskap av flere eksperimentator. Videre finnes noen variasjoner mellom eksperimenter. Derfor identiske eksperimenter bør gjentas 3 ganger med cytospins fra hver celle forberedelse eller inndelinger fra hver Vevsprøve og egnede kontroller skal inkluderes i hvert eksperiment. Alltid forberede en kontroll inkubasjon medium i fravær av underlaget, men i nærvær av kofaktorer kontroll uspesifisert enzym aktivitet flekker. De mest representative resultatene er oppnådd i eksperimenter der ulike substrat/kofaktor konsentrasjoner brukes til vev deler eller cellen forberedelser fra samme eksempel, slik at eksperimentator kan utføre analyser av enzymet kinetics bruker dose-aktivitet kurver.

Protocol

Denne protokollen følger retningslinjene for bruk av menneskelige materiale av medisinsk-etisk gjennomgang Academic Medical Center.

1. utarbeidelse av celler og vev deler

  1. Celler
    1. Trypsinize celler fra kultur retter 1 mL av 0,25% trypsin-EDTA i 5 min på 37 ° C i en 10 mm Petriskål og bringe celler i en 37 ° C suspensjon av 50.000-200 000 celler/mL, avhengig av størrelsen på cellene.
    2. Fest 200 µL av cellen suspensjon på mikroskopi lysbilder bruke cytospin trakter i en cytocentrifuge på 20 x g for 5 min ved romtemperatur.
    3. Air-Dry cytospins for 24 timer ved romtemperatur. Dette påvirker ikke dehydrogenase aktivitet. 5
  2. Vev deler
    1. Pakk ut vev fra pasienter eller dyr etter etiske tillatelser. 10 mm3 av vev er tilstrekkelig for flere eksperimenter.
    2. Sett biter av vev i små ventilerte 2 mL plast ampuller og snapin-fryse hetteglass inneholder stykke vev i flytende nitrogen.
    3. Lagre hetteglass med vev brikkene på −80 ° C før videre behandling.
    4. Bruke en gel-lignende medium kalt optimal kutte temperatur (OCT) for å montere Vevsprøve på en chuck som fryser ned til-20 ° C til-25 ° C, slik at vann ikke danne krystaller.
    5. Bruke en kryostat for skjæring og første trim blokken til ønsket nivå (ideelt halve bredden av en mikroskopi glass lysbilde, f.eks 5 x 5 mm).
    6. Ved snitting bruker du børster og en stabiliseringsplaten for å hindre delene i curling oppover.
    7. Skjær vevsprøver i 6-10 µm tykke inndelinger på en sakte men konstant hastighet (1 s per seksjon). Når en inndeling er riktig kuttet, fortsatt det flatt på mikrotomen kniven under stabiliseringsplaten.
    8. Plukk opp 1-3 deler på microscopical glass lysbilder og lagre på −80 ° C før bruk. Antall snitt forberedt avhenger av størrelsen på Vevsprøve og ønsket tykkelse av delene.

2. enzym Histo/Cytochemistry for løselig Dehydrogenases

  1. Forbereder reaksjon Buffer.
    1. Forberede 100 mL fosfatbuffer med riktig pH (se tabell 1; hver enzymet har en optimal pH som sin virksomhet er den høyeste). For eksempel bland løsninger av 0.1 M KH2PO4 (Sure) og 0.1 M NA2HPO4 (grunnleggende) til en buffer med riktig pH er laget.
    2. Veie 18 g polyvinylalkohol (PVA) inn i fosfatbuffer under avtrekksvifte PVA er støvete og giftige.
      1. Oppløse 18% w/v-PVA i fosfat bufferen ved 100 ° C ved oppvarming bufferen au bain marie (sette glassflaske i kokende vann) og under omrøring til PVA er fullstendig oppløst. Løsningen vil være gjennomsiktig deretter med små luftbobler som skyldes omrøring. Det krever vanligvis ~ 15 min for PVA å oppløse.
        Merk: 18% w/v-PVA fosfat buffer er tyktflytende og kan overføres til 15 mL reaksjon buffer rør med en bred pipette. Kortsiktige lagring av 18% w/v PVA fosfat buffer bør skje på ≥40 ° C og langvarig lagring (opptil 2 uker) ved ≥ 60 ° C. 250 µL av 18% w/v PVA fosfat buffer er vanligvis nødvendig for en cytospin forberedelse, mens 500 µL kreves for en vev-inndeling.
    3. Forberede tetrazolium salt (nitroBT) løsning. For hver 1 mL av inkubasjon medium, 40 µL nitroBT løsning er nødvendig, bestående av 5 mg nitroBT (et gult pulver) oppløst i en blanding av 20 µL vannistedenfor (DMF) og 20 µL av etanol, som er en lys gul gjennomsiktig løsning.
      Merk: Fordi stabiliteten på nitroBT er den laveste av alle nødvendige reagenser, anbefales det å forberede nitroBT lager løsningen sist og oppløse nitroBT til reaksjon medium først.
      1. Oppløse nitroBT DMF og etanol av varme den i et hetteglass i en kort tidsperiode (~ 10 s) bruker en Bunsen-brenner. Riste ampullen under oppvarming og ikke la ampullen for lenge i flammen å hindre fordampning.
      2. Få 10% ekstra nitroBT løsning å tillate fordampning av DMF og etanol under oppløsning prosessen.
    4. Skjerme elektron bærere phenazine methosulfate (PMS) eller (1-methoxy)-phenazine methosulfate (mPMS) og inkubasjon mediet som inneholder m(PMS) fra lys ved å pakke tinfoil rundt lagring hetteglass.
    5. Forberede reagens løsninger tabell 1 smelte dem i destillert H2O. Noen reagenser omkomme raskt, så forberede dem så kort tid før eksperimentet som mulig. Holde reagens løsninger på isen eller i 4 ° C før bruk.
    6. Forberede inkubasjon media som vist i tabell 1 og homogenize løsningen etter hvert trinn av mild omrøring. Unngå den luftbobler i inkubasjon medium ved røring kontinuerlig og holde spatula under overflaten av inkubasjon mediet under omrøring.
  2. Bruke inkubasjon Medium til vev deler
    1. Pre varme mikroskopi lysbilder med cytospins eller vev deler festet på 37 ° C i en immunohistochemistry inkubasjon kammer i 15 min. Senk bunnen av immunohistochemistry inkubasjon kammeret med varmt vann å opprettholde en konstant temperatur i i inkubator.
    2. Nøye bryte eller så av Pasteur Pipetter ved overgangen fra smalt til brede del. Vanlig Pasteur Pipetter er for smal inneholder tyktflytende inkubasjon mediet, så dette trinnet er nødvendig å gjøre Pasteur Pipetter bred nok for aspirasjon av inkubasjon medium.
    3. Bruke 250-500 µL av aktuelle inkubasjon medium hver celle forberedelse eller vev inndeling mikroskopi lysbildene bruker bredt del av en Pasteur pipette.
    4. Bruk pipette spissen for å spre ut inkubasjon mediet jevnt. Se bort fra små luftbobler i inkubasjon medium, fordi dette vil flyte til overflaten og vil ikke forstyrre den enzymatiske reaksjonen under cellen forberedelse eller vev på mikroskopi lysbildet.
    5. Inkuber celle forberedelser eller vev deler på mikroskopi lysbildene i en 37 ° C inkubator (f.eks en vev kultur inkubator) for en pre-spesifiserte varighet, avhengig av enzymet kinetics og sitt uttrykk i en bestemt celle forberedelse eller vev (tabell 1). Holde lokket på immunohistochemistry inkubasjon kammeret lukket for å opprettholde et fuktig miljø å hindre reaksjon bufferen tørker.
  3. Vask mikroskopi lysbildene
    1. Trykk av overflødig inkubasjon mediet på en vev.
    2. Mekanisk skyll inkubasjon mediet mikroskopi lysbildene i 60 ° C fosfatbuffer, pH 5.3, ved å flytte mikroskopi lysbildene opp og ned i bufferen. Dette stopper den enzymatiske reaksjonen.
    3. Vask mikroskopi lysbildene ved å holde dem i 60 ° C fosfatbuffer, pH 5.3 for 20 min.
    4. Mekanisk vask mikroskopi lysbildene i 60 ° C vann fra springen.
    5. Vask mikroskopi lysbildene ved å holde dem i 60 ° C vann for 20 min.
    6. La vannet og lysbilder avkjølt ved å sakte blande romtemperatur vann med springvannet 60 ° C i løpet av minutter.
    7. Utføre en siste mekanisk vask trinnet i romtemperatur destillert vann.
  4. Vedlegge farget Cytospins eller vev deler på mikroskopi lysbilder
    1. Forvarm et lysbilde varmere ved 50-60 ° C.
    2. Nøye tørke baksiden mikroskopi lysbildene med tørkepapir og plassere dem på lysbildet varmere tørke oversiden mikroskopi lysbildet.
    3. Når lysbildene er tørr, sett celle forberedelser eller vev deler på mikroskopi lysbilder med glyserol gelé montering medium og coverslips.
    4. Lagre celle forberedelser eller vev deler mikroskopi lysbilder i mørket i et kjøleskap på 4 ° C eller gå rett med bildeopptak.

3. image vinningen

  1. Ta bilder med en vitenskapelig monokrom CCD kamera med tilstrekkelig dynamisk område (minst 8-biters men helst 10-biters eller 12-bit), fast gevinst og lineær frekvensgang.
  2. Velg et riktig mål (20 X-63 X for cytospins) og 10-63 X vev deler.
  3. Redusere gjenskinn innsnevring feltblenderen slik at det er litt større enn synsfelt.
  4. Bruk monokromatisk lys ved å bruke en 10 nm bredt slutning båndpassfilter nær isobestic bølgelengde av formazan bunnfall7 i kombinasjon med en infrarød blokkerer filtrere (se Materialer tabell).
    Merk: Maksimal isobestic absorbansen av nitroBT er på 585 nm.
  5. Optimalisere belysning for å sikre at hele grå nivå rekke kameraet brukes (dvs. angi belysning slik at maksimal lysstyrke oppnås uten over-eksponere registrere en tom microscope skyve).
  6. Kalibrere målt gråtoner kjent absorbansen (eller optisk densitet [OD]) verdier. Dette grå skala avbildninger av minst 10 forskjellige trinnene i en kalibrering lysbilde eller trinn tavle med kjente OD verdier (se trinn 4.1.1), enten kommersielt tilgjengelig (se Materialer tabell) eller måle en skreddersydd grå skala kile trinn tablett av en densitophotometer og bruke resultatene til kalibrere målt grå verdier til kjente absorbansen verdier.
  7. Ta photomicrographs av celler eller vev deler av interesse.

4. bildeanalyser

  1. Før bildeanalyser, kalibrere ImageJ programvaren for absorbansen målinger.
    1. Måle absorbansen (OD) av photomicrographs av minst 10 kalibrering områder med kjente absorbansen parametere i kalibrering lysbilde eller trinn tavle med kjente OD verdier. I ImageJ, bruker du analysere → mål menyen eller Ctrl + M løsningen for å måle et merket område.
    2. Start kalibreringsprosedyren absorbansen ved skal analysere → kalibrering. Velg funksjonen "Rodbard (NIH bilde)". I venstre kolonne i vinduet som åpnes, er resultatene av grå nivå målinger for hvert trinn av kalibrering lysbilde/trinn tablet i 4.1.1 allerede tilstede. Hvis ikke, må du kopiere dem fra ImageJ resultatene skjermen. I kolonnen til høyre angi hver tilsvarende kjent absorbansen verdien som vises på sertifikatet du mottok med kalibrert trinn tavle. Bokser "Global kalibrering" og "Vis tomten" og trykk "OK".
    3. For kvalitetskontroll, kontroller at R2 av Rodbard funksjonen er > 0,99. Hvis det er < 0,99, sjekk om kalibrering lysbildene ble fotografert og målt riktig og om kjente absorbansen parametere er angitt riktig.
    4. ImageJ er nå kalibrert til du lukker programmet (derav "Global kalibrering"). For absorbansen målinger, en kalibrert ImageJ økt alltid konverterer observert absorbansen betyr for verdier mellom 0 og 1, der 0 og 1 er asymptoter null og full absorbansen, henholdsvis.
  2. Cytospins, Velg > 100 enkeltceller i en tilfeldig måte. For vev deler, velger du ett eller flere felt av interesse av en fast lengde og bredde i alle delene.
    1. Prosjekt en raster over photomicrographs å hjelpe saklig Cellevalg. I ImageJ, prosjektet et rutenett over et bilde via Plugins → analyser → rutenettet menyen.
    2. I ImageJ, elliptiske verktøyet for å velge enkeltceller og bruk rektangelverktøyet for å velge vev regioner.
  3. Mål absorbansen og de merkede cellene eller vev regioner. Optisk densitet og området kalles "Betyr" og "Området" i ImageJ resultater regneark, henholdsvis.
    Merk: Totalt absorbansen av en celle eller vev region (Hvis du har valgt flere vev regioner med ulike størrelser) er lik summen av alle atskilt pixel absorbances. Hvis en celle er fotografert 1000 piksler, så totalt absorbansen gis på summen av 1000 absorbances og mener absorbansen er gitt av totale absorbansen/1000. Denne prosedyren unngår også fordelingsvirkninger feil.
  4. Bestem gjennomsnittlige totale absorbansen av > 30 celler og vev regioner fra kontroll lysbildene, som inneholder et eksempel som ble utsatt for å kontrollere inkubasjon medium i fravær av underlaget, men i nærvær av kofaktorer. Denne kontrollen absorbansen brukes til å kontrollere til ikke-spesifikk enzym aktivitet farging og absorbansen gjenstander indusert av brukte mikroskopi lysbildene montering medium, cover slip eller mikroskop.
  5. Trekk gjennomsnittlig kontroll absorbansen fra alle totale absorbansen mål av prøver som ble utsatt for inkubasjon medium med samme konsentrasjonen av kofaktor (men ulike konsentrasjoner av underlaget og/eller hemmer). Dette gir korrigert totalt absorbansen en celle eller vev-regionen.
  6. Statistisk sammenligne de gjennomsnittlige korrigert totalt absorbances Student T-test eller enveis ANOVA test, avhengig av eksperimentell design.
  7. Formazan absorbans kan konverteres til enzym aktivitet (µmol konvertert substrat per mL per min) bruke loven om Lambert-øl: c=A/(є×d), der c er konsentrasjonen av formazan i reaksjon medium, er målt absorbansen i ImageJ etter kalibrering; Є er den utryddelse koeffisienten i formazan (16.000 på 585 nm)8 og d er lyset reiser avstanden, som er lik den gjennomsnittlige celle tykkelse eller nominell kutte snittykkelsen (6-10 µm i denne protokollen).
    Merk: Etter tørking, vev snittykkelsen reduserer ~ 50% fra den nominelle snittykkelsen for skjæring, men dette gjenspeiles ikke i beregningen ovenfor fordi den nominelle snittykkelsen for skjæring er biologisk mest relevante. Gjennomsnittlig celle tykkelse og sfære dimensjoner i celle preparates overholdt mikroskopi glass lysbilder kan bestemmes ved hjelp av AC confocal mikroskopi eller wide-field mikroskopi, som protokoller finner andre steder. 9 , 10

Representative Results

Flere protokoller å forberede inkubasjon medium vises undersøke aktiviteten til en bestemt dehydrogenase. For hver dehydrogenase, oppløse oppført reagenser i PVA løsningen samtidig opprettholde en temperatur på minst 37 ° C. Reagenser skal oppløses i rekkefølgen som er oppført i tabellen, i.e. nitroBT oppløses alltid først og (m) PMS er alltid oppløst sist. Hver 5 mg nitroBT oppløses i 40 µL blanding (20 µL etanol + 20 µL vannistedenfor). Alle volumer er per 1 mL av 18% PVA løsning, som kan brukes til å flekken ~ 2 vev deler eller ~ 4 celle forberedelser på glass lysbilder. NitroBT, NAD+, NADP+, ADP og underlaget bør gjøres fersk. NaN3, MgCl2 og (m) PMS løsninger kan lagres på 4 ° C i en måned. 18% PVA oppløst i fosfat bufferen kan lagres ved 60 ° C i 2 uker. PH i 18% PVA løsningen kan angis ved hjelp av forskjellige komposisjoner av 0.1 M kalium dihydrogen fosfat (KH2PO4) og 0.1 M disodium hydrogen fosfat (NA2HPO4) buffere. Periodene som vises inkubasjon gir gode utgangspunkt, men optimal inkubasjon periodene avhengig av arten, vev type og bevaring av vev. Generelt, bør celle forberedelser være ruges lenger enn vev deler å få nivå av formazan.

Vill-type isocitrate dehydrogenase 1 og 2 (IDH1/2) katalysere konvertering av isocitrate til α-ketoglutarate (αKG) med samtidig reduksjon av NADP+ å NADPH i cytoplasma og mitokondrier, henholdsvis. Disse enzymene har nylig tiltrukket interesse fordi IDH1/2 mutasjoner oppstår i ulike typer menneskelig kreft, inkludert primære hjernen kreft (glioblastom) og endetarmskreft, og tilbyr en unik mulighet til å demonstrere muligheter av Metabolsk kartlegging. IDH1 mutasjoner deaktivere IDH1 vill-type enzym aktivitet og også føre en neo-enzymatisk aktivitet som fører til produksjon og påfølgende opphopning av oncometabolite D-2-hydroxyglutarate (D-2 HG),11 som er nevnt i detalj. 12 metabolske kartlegging viste at NADP+-avhengige IDH1/2 aktivitet var betydelig lavere i colorectal karsinom celler med en banket i heterozygote IDH1 mutasjon enn i colorectal karsinom celler som var IDH1 vill-type (figur 1A). Denne forskjellen var kvantifisert ved bildeanalyse av monokromatisk lys photomicrographs (figur 1B). 12

Et annet illustrerer eksempel metabolske kartlegging eksperimenter er vist i figur 2, som er et bilde av en kryostaten del av musen hjernen som ble injisert med menneskelig glioblastom celler. IDH1/2 er den viktigste NADPH leverandøren i hjernen og dens aktivitet er upregulated vill-type IDH1/2 glioblastom, mens NADPH produksjonskapasitet på IDH1/2 er mye lavere i hjernen til gnagere. 11 Figur 2A viser forskjellen mellom de høye NADP+-avhengige IDH1/2 aktivitet i menneskelig glioblastom celler og den lave NADP+-avhengige IDH1/2 aktivitet i sunne mus hjernen. IDH1/2 aktivitet er kvantifisert som µmol NADPH produksjon per mL av vev per minutt i figur 2B.

Den enzymatiske reaksjonen av IDH1/2 er relativt enkelt, men laktat dehydrogenase (LDH) er en mer komplisert enzym komplekse. LDH konverterer reversibel konverteringen fra laktat til pyruvate med samtidig reduksjon nad+ NADH eller omvendt. Tilgjengeligheten av laktat og pyruvate og sammensetningen av LDH enzymet komplekse bestemmer om laktat primært konverteres til pyruvate (som er katalysert av LDH-B og gir NADH) eller om pyruvate er hovedsakelig konverteres til laktat (som er katalysert av LDH-A og forbruker NADH). 13 metabolske kartlegging eksperimenter kan visualisere aktiviteten av LDH-B reaksjonen, men de er "blind" for aktiviteten av LDH-en reaksjon fordi NADH produksjon ikke oppstår og som en konsekvens nitroBT reduseres ikke til formazan. Figur 3 viser NAD+-avhengige LDH aktivitet (dvs. konvertering av laktat i pyruvate) i menneskelige hjerne seksjoner i fravær av substrat (figur 3A), i nærvær av en høy konsentrasjon av laktat (figur 3B ), i nærvær av 6 mM laktat (Figur 3 c) og i nærvær av en lav konsentrasjon av laktat og en høyere konsentrasjon av pyruvate (figur 3D). Resultatene av disse eksperimentene illustrere metabolske kartlegging tilstrekkelig fanger som NAD+-avhengige LDH aktivitet i vev deler avhenger av laktat og pyruvate i reaksjon medium.

Figure 1

Figur 1 . NADP+-avhengige IDH1/2 aktivitet av menneskelig colorectal karsinom celler. (A) representant monokromatisk lys photomicrographs HCT116 menneskelige colorectal karsinom celler etter farging for NADP+-avhengige IDH1/2 aktivitet mot 1-10 mM isocitrate og 0,8 mM NADP+. Skalere barer = 50 µm. (B) en kvantifisering av absorbansen av blå formazan produsert fra nitroBT av NADP+-avhengige IDH1/2 aktivitet per celle vises med bruk av monokromatisk lys i (A) og bildeanalyse. Forkortelser: IDH1WT/WT, isocitrate dehydrogenase 1 vill-type; IDH1WT/MUT, isocitrate dehydrogenase 1 muterte. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2

Figur 2 . NADP+-avhengige IDH1/2 aktivitet av menneskelig glioblastom prøver. (A) representant photomicrograph i en mus hjernen inndeling som inneholder sunne mus hjernen (h) og en menneskelig glioblastom svulst xenograft (t) etter farging for NADP+-avhengige IDH1/2 aktivitet i nærvær av 0,8 mM NADP+ og 2 mM isocitrate. Skala bar = 200 µm (B) enzym aktivitet kvantifisering av musen hjernen (h) og menneskelig glioblastom xenograft (t) vises i (A) bruke lov Lambert-øl. Feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3

Figur 3 . NAD+-avhengige laktat dehydrogenase (LDH) aktivitet av menneskelige hjerne prøver. Representative photomicrographs føljetong deler av hjernen prøver etter farging for NAD+-avhengige LDH aktivitet (A) mot kontroll forhold (i fravær substrat og pyruvate, 3 mM NAD+ bare) (B) laktat i fravær av pyruvate og (D) mot 6 mM laktat i nærvær av 18 mM pyruvate, konkurrentenes hemmere av laktat-til-pyruvate reaksjon mot 150 mM laktat i fravær av pyruvate (C) mot 6 mM. Skala bar = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Enzym: G6PDH LDH SDH MDH IDH1 IDH2 IDH3 6PGD GDH
PVA 18% i 100 mM fosfatbuffer 1 mL; pH = 7.4 1 mL;  pH = 7.4 1 mL;  pH = 8.0 1 mL; pH = 7.4 1 mL; pH = 7.4 1 mL; pH = 7.4 1 mL; pH = 7.4 1 mL; pH = 8.0 1 mL; pH = 8.0
5 mM NitroBT 5 mg/40 µL blanding 5 mg/40 µL blanding 5 mg/40 µL blanding 5 mg/40 µL blanding 5 mg/40 µL blanding 5 mg/40 µL blanding 5 mg/40 µL blanding 5 mg/40 µL blanding 5 mg/40 µL blanding
5 mM NaN3  10 ΜL 10 ΜL 10 ΜL 10 ΜL 10 ΜL 10 ΜL 10 ΜL 10 ΜL
5 mM MgCl2 10 ΜL 10 ΜL 10 ΜL 10 ΜL 10 ΜL 10 ΜL
3 mM NAD+ 10 ΜL 10 ΜL 10 ΜL
0,8 mM NADP 10 ΜL 10 ΜL 10 ΜL 10 ΜL 10 ΜL
2 mM ADP 10 ΜL
substrat 10 mM glukose-6-fosfat 150 mM laktat 50 mM succinate 100 mM eplesyre 2 mM isocitrate 2 mM isocitrate 2 mM isocitrate 10 mM 6-phospho-galactonate 10 mM Glutaminsyre
0.32 mM mPMS 10 ΜL 10 ΜL 10 ΜL 10 ΜL 10 ΜL
0.2 mM PMS 10 ΜL 10 ΜL 10 ΜL 10 ΜL
Inkubasjon varighet 5 min 30 min 60 min 60 min 30 min 30 min 30 min 10 min 30 min

Tabell 1. Skjematisk oversikt over metabolske kartlegging protokollen for dehydrogenases. Forkortelser: ADP, adenosindifosfat; (m) PMS (metoksy)-5-methylphenazinium metyl sulfate; nitroBT, nitro tetrazolium blå klorid; G6PDH, glukose-6-fosfat dehydrogenase; LDH, laktat dehydrogenase; SDH, succinate dehydrogenase; MDH, malate dehydrogenase; IDH, isocitrate dehydrogenase; 6PGD, 6-phosphogluconate dehydrogenase; GDH, glutamat dehydrogenase.

Discussion

Forskning på cellenes stoffskifte opplever for tiden en renessanse fordi forskere innser nå at metabolsk effekter er avgjørende for patogenesen og behandling av mange sykdommer. 1 videre metabolske forskning er hjulpet av en økt tilgjengelighet av teknikker som gir dette feltet av forskning med mer verktøy enn noensinne, inkludert massespektrometri, radioisotopic merking og kjernefysiske magnetisk resonans massespektrometri. Metabolsk kartlegging er på ingen måte en teknikken, men dens evne til å gi informasjon på aktiviteten av enzymer i en nesten sant-til-naturen gjør denne teknikken mer aktuell enn noensinne. 2

Kofaktorer NAD+ og NADP+ finnes i alle levende celler, som angir at dehydrogenases oppsto tidlig i utviklingen og har nøkkelroller i cellenes stoffskifte. 14 , 15 for tiden finnes 523 enzym-katalysert reaksjoner som er klassifisert som dehydrogenases og skje over alle arter. 16 teoretisk aktiviteten til alle forskjellige dehydrogenase reaksjoner kan separat undersøkes ved å tilpasse metabolske kartlegging protokollen beskrevet her. Hver enzymatiske reaksjonen er unik substrat og kofaktorer som kreves for sin virksomhet. Derfor kan aktiviteten til hver den enzymatiske reaksjonen bestemmes ved hjelp av en metabolsk kartlegging eksperiment med tilstrekkelig substrat og kofaktorer i reaksjon medium. Men noen enzym isoformene varierer i sine subcellular lokalisering, f.eks en isoformen gir en reaksjon i cytoplasma mens en annen isoformen funksjoner i mitokondrier. Et godt eksempel er IDH1 og IDH2, som tidligere er cytoplasmatiske og sistnevnte er mitokondrie og som er to ulike proteiner som er kodet av to ulike gener. 11 1-metoksy-5-methylphenazinium methylsulfate (metoksy-PMS) og 5-methylphenazinium methylsulfate (PMS) kan begge brukes som elektron bærer disse eksperimentene. Tidligere går ikke mitokondrie membraner, gjør sistnevnte. Derfor bør undersøkelser på mitokondrie enzymer (f.eks IDH2) bruke PMS mens undersøkelser på cytosolic enzymer (f.eks IDH1) bør bruke mPMS.

Som med mange teknikker, varianter av denne protokollen, som bruker ulike typer tetrazolium salter, unntatt tillegg av PMS og Natriumazid, ved hjelp av en vandig montering medium, og varierende inkubasjon og skylling ganger, eksisterer og fungerer like bra. Anvendelsen av metabolske kartlegging med tetrazolium salter er ikke begrenset til dehydrogenases. Med små modifikasjoner til protokollen, den kan også brukes for vurdering av aktiviteten av enzymer som fungerer direkte over en dehydrogenase i en metabolsk sti. Vi har tidligere beskrevet dette prinsippet for glutaminase enzymet,17 som fungerer direkte over glutamat dehydrogenase i glutaminolysis veien. 18 i teorien er det samme prinsippet kan brukes på andre enzymer som funksjonen direkte nedstrøms eller over en dehydrogenase f.eks aconitase, som ligger direkte oppstrøms av IDH2 og IDH3 i tricarboxylic syre (TCA) syklus. En annen enkel variant av konsentrasjonen beskrevet i tabell 1 er ved å gjøre inkubasjon middels ampuller med ulike konsentrasjoner substrat, kofaktor og/eller inhibitor. Dette tillater generering av dose-aktivitet kurver som en funksjon av underlaget, kofaktor og/eller hemming konsentrasjon.

Teknisk sett, metabolske kartlegging eksperimenter Letter ikke objektive observasjoner i situ enzym aktivitet, fordi forskere har å velge en substrat og kofaktor konsentrasjon som ikke gjenspeiler de substrat og kofaktor nivåene som er tilstede i situ. Videre bruk av tyktflytende 18% PVA i reaksjon medium tjener til å holde makromolekyler intakt, sted og conformation men forbyr effektiv spredningen av lav molekylvekt reagenser gjennom reaksjon. 3 , 5 derfor bestemt enzym aktiviteter i eksperimenter beskrevet her bruker supraphysiological substrat konsentrasjoner reflekterer ikke i vivo situasjonen på en gitt substrat konsentrasjon, men er egnet for intra eksperimentelle sammenligninger. Dermed er utfallet av metabolsk kartlegging eksperimenter produksjonskapasiteten (maksimal aktivitet) en enzymatiske reaksjonen i sammenheng substrat og kofaktor nivåene som er tilstede i situ. Videre gir bruk av ulike konsentrasjoner av underlaget og/eller kofaktorer og flere eksempler upartisk sammenligning av maksimal kapasitet (VMaks) og affinitet (Km) av et enzym for substrat/kofaktor i cellen forberedelser , vev eller vev regioner. Disse parameterne er resultatet av enzym protein uttrykk, post-translasjonell modifikasjoner og effekten av en overfylt microenvironment på aktiviteten av enzymer. Derfor er metabolske kartlegging fortsatt en bedre refleksjon av enzym aktivitet enn eksperimenter som bestemme protein uttrykk eller renset enzym aktivitet i vitro.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

R.J.M. støttes av en AMC PhD stipend. Denne forskningen ble støttet av den hollandske Kreftforeningen (KWF grant UVA 2014-6839). Forfatterne takker Dr. A. Jonker for hans hjelp med skrivingen av protokollen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt Sigma-Aldrich A2754
D-Glucose 6-phosphate sodium salt Sigma-Aldrich G7879
Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4) Merck Millipore 106559
di-Sodium succinate Sigma-Aldrich W327700
DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate Sigma-Aldrich I1252 
D-Malic acid Sigma-Aldrich 2300
Glycerol Gelatin Sigma-Aldrich GG1
L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G1251
Lithium 6-phospho-D-galactonate Sigma-Aldrich 55962
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
methoxy-Phenazine methosulfate Serva 28966.01
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich N0505 
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Sigma-Aldrich NADP-RO
Nitrotetrazolium Blue chloride Sigma-Aldrich N6876
Phenazine methosulfate Serva 32030.01
Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed Sigma-Aldrich P1763
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Merck Millipore 104873
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Sodium L-lactate Sigma-Aldrich L7022
Bandpass filter Edmund optics https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/
Grey-step wedge Stouffer Industries http://www.stouffer.net/TransPage.htm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metab. 23 (1), 27-47 (2016).
  2. Van Noorden, C. J. Imaging enzymes at work: metabolic mapping by enzyme histochemistry. J Histochem Cytochem. 58 (6), 481-497 (2010).
  3. Mcmanus, L. M., Mitchell, R. N. Pathobiology of Human Disease. , Elsevier. 3760-3774 (2014).
  4. Chieco, P., Jonker, A., De Boer, B. A., Ruijter, J. M., Van Noorden, C. J. Image cytometry: protocols for 2D and 3D quantification in microscopic images. Prog Histochem Cytochem. 47 (4), 211-333 (2013).
  5. Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. Enzyme histochemistry : a laboratory manual of current methods. , Oxford University Press, Royal Microscopical Society. (1992).
  6. Van Noorden, C. J. F., Butcher, R. G. Histochemistry, theoretical and applied. Vol 3.: enzyme histochemistry. Stoward, P. J., Pearse, A. G. E. , Churchill Livingstone. 355-432 (1991).
  7. Van Noorden, C. J., Tas, J., Vogels, I. M. Cytophotometry of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual cells. Histochem J. 15 (6), 583-599 (1983).
  8. Butcher, R. G. The measurement in tissue sections of the two formazans derived from nitroblue tetrazolium in dehydrogenase reactions. Histochem J. 10 (6), 739-744 (1978).
  9. Matsumoto, B. Cell biological applications of confocal microscopy. , Elsevier. (2002).
  10. Errington, R. J., White, N. S. Measuring dynamic cell volume in situ by confocal microscopy. Methods Mol Biol. 122, 315-340 (1999).
  11. Molenaar, R. J., Radivoyevitch, T., Maciejewski, J. P., van Noorden, C. J., Bleeker, F. E. The driver and passenger effects of isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations in oncogenesis and survival prolongation. Biochim Biophys Acta. 1846 (2), 326-341 (2014).
  12. Molenaar, R. J., et al. Radioprotection of IDH1-Mutated Cancer Cells by the IDH1-Mutant Inhibitor AGI-5198. Cancer Res. 75 (22), 4790-4802 (2015).
  13. Khurshed, M., Molenaar, R. J., Lenting, K., Leenders, W. P., van Noorden, C. J. F. In silico gene expression analysis reveals glycolysis and acetate anaplerosis in IDH1 wild-type glioma and lactate and glutamate anaplerosis in IDH1-mutated glioma. Oncotarget. 8 (30), 49165-49177 (2017).
  14. Alberts, B. Molecular biology of the cell. , Sixth, Garland Science, Taylor and Francis Group. (2015).
  15. Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, G. J., Stryer, L. Biochemistry. , Eighth edition, W.HFreeman & Company, a Macmillan Education Imprint. (2015).
  16. Webb, E. C. International Union of Biochemistry and Molecular Biology. Enzyme nomenclature 1992 : recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes. , Published for the International Union of Biochemistry and Molecular Biology by Academic Press (1992).
  17. Botman, D., Tigchelaar, W., Van Noorden, C. J. Determination of Phosphate-activated Glutaminase Activity and Its Kinetics in Mouse Tissues using Metabolic Mapping (Quantitative Enzyme Histochemistry). J Histochem Cytochem. 62 (11), 813-826 (2014).
  18. van Lith, S. A., et al. Glutamate as chemotactic fuel for diffuse glioma cells: are they glutamate suckers? Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 66-74 (2014).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 135 kvantitativ enzym aktivitet histochemistry cytochemistry dehydrogenase NAD+NADP+NADH NADPH
Metabolsk kartlegging: Kvantitative enzymet Cytochemistry og Histochemistry å bestemme aktiviteten til Dehydrogenases i celler og vev
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Molenaar, R. J., Khurshed, M., Hira, … More

Molenaar, R. J., Khurshed, M., Hira, V. V. V., Van Noorden, C. J. F. Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (135), e56843, doi:10.3791/56843 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter