Summary
Aqui, apresentamos um protocolo que pode ser usado para microscopicamente Visualizar e quantificar a atividade de desidrogenases em células e tecidos e sua cinética, função e Localização subcellular.
Abstract
Metabolismo celular alterado é uma marca registrada de muitas doenças, incluindo câncer, doenças cardiovasculares e infecções. As unidades motoras metabólicas das células são enzimas e sua atividade é fortemente regulamentada em muitos níveis, incluindo o transcriptional, estabilidade do mRNA, nível translacional, borne-translational e funcional. Este complexo Regulamento significa que convencionais ensaios quantitativos ou de imagem, tais como quantitativos mRNA experimentos, borrões ocidentais e imuno-histoquímica, produzem informações incompletas sobre a atividade final de enzimas, sua função e/ou sua localização subcellular. Citoquímica quantitativa enzimática e histoquímica (i.e., mapeamento metabólica) mostram informações detalhadas na atividade enzimática em situ e sua cinética, função e Localização subcellular numa situação quase verdadeiro-à-natureza.
Descreveremos um protocolo para detectar a atividade de desidrogenases, que são enzimas que realizam as reações redox para reduzir cofactores como NAD(P)+ e FAD. Secções de tecidos e células são incubadas em um meio que é específico para a atividade enzimática de uma desidrogenase. Posteriormente, a desidrogenase que é objecto de investigação executa sua atividade enzimática em seu site subcellular. Em uma reação química com o meio de reação, isso gera, em última análise formazan cor azul no local da atividade da desidrogenase. Absorvância da formazan é, portanto, uma medida direta da atividade da desidrogenase e pode ser quantificada usando análise de microscopia e imagem luz monocromática. O aspecto quantitativo do presente protocolo permite que pesquisadores desenhar conclusões estatísticas destes ensaios.
Além de estudos observacionais, esta técnica pode ser usada para estudos de inibição de enzimas específicas. Neste contexto, estudos beneficiar as vantagens da verdadeiro-à-natureza de mapeamento metabólica, dando resultados em situ que pode ser fisiologicamente mais relevante do que em vitro estudos de inibição enzimática. Ao todo, mapeamento metabólico é uma técnica indispensável para estudar o metabolismo a nível celular ou tecido. A técnica é fácil de adotar, fornece informações metabólicas em profundidade, abrangentes e integradas e permite rápida análise quantitativa.
Introduction
Um pilar essencial da fisiologia celular é o metabolismo. Metabolismo fornece as células com a energia necessária para todos os processos fisiológicos, fornece os blocos de construção para biossíntese macromolecular e regula a homeostase celular com respeito a produtos residuais, moléculas tóxicas e a desmontagem e reciclagem de componentes celulares desnecessários ou disfuncionais. As enzimas catalisam quase todas vitais celulares reações químicas e são, portanto, as unidades motoras na fisiologia das células. 1 , 2
A atividade das enzimas é fortemente regulamentada em muitos níveis e, portanto, quantitativa enzima histoquímica e Citoquímica (também chamado de mapeamento metabólico) é o método preferido para estudar a atividade de enzima em situ. A nível transcricional, expressão gênica no mRNA é regulada. O efeito do Regulamento da transcrição pode ser determinado usando ensaios quantitativos de mRNA, como Microarrays do sequenciamento de RNA direto ou ensaios de mRNA qualitativa, tais como a hibridização in situ , que dá informações sobre o celular (sub) Localização de moléculas de mRNA. Isto torna possível apreciar diferenças relativas em atividade transcricional entre as células. No entanto, a interpretação e validade destes ensaios de mRNA com relação a atividade metabólica é complicado porque o regulamento também ocorre no nível de mRNA, onde sequência e estabilidade das moléculas de mRNA são editados depois que é transcrito do DNA. Esta edição regula proteína isoform Tradução e quantidade de tradução de proteínas para os ribossomas. Além disso, o processo de tradução de proteínas é controlado e em última análise, afeta a atividade e, portanto, a expressão da enzima. Os efeitos combinados dos passos regulamentares acima mencionados podem ser apreciados utilizando ensaios de expressão quantitativa de proteína, como a mancha ocidental Microarrays do lisado de proteína de fase reversa ou ensaios de expressão qualitativa da proteína, tais como imunocitoquímica e imuno-histoquímica, mas essas técnicas não conseguem incorporar efeitos regulamentares a jusante como modificação pós-traducional de proteínas e o Regulamento funcional de enzimas no seu microambiente lotado. Além disso, a expressão de uma enzima mal pode correlacionar com sua atividade, para que as medições da atividade de uma enzima purificada em células ou tecidos homogenates ou em soluções diluídas são amplamente utilizadas para estudos de atividade enzimática. No entanto, estas experiências não replicar a influência de um citoplasma compartimentada lotada ou organela sobre a atividade de uma enzima. Além disso, determinar a quantidade ou a localização da expressão do mRNA ou enzima todas as técnicas acima mencionadas, mas são incapazes de dar uma informação completa sobre os dois desses aspectos da expressão da enzima, e muito menos a integração deste informações com determinações de atividade enzimática. 2 , 3 , 4
Mapeamento metabólico permite a apreciação de todas as variáveis acima mencionadas que determinam a atividade de uma enzima. Além disso, o mapeamento metabólico é uma forma de célula viva ou imagem de tecido com células e tecidos que são mantidos intactos durante a análise para gerar uma situação de quase verdadeiro-à-natureza para gerar dados de atividade de enzimas. Ela produz imagens que facilitam a apreciação ambos detalhada da localização da actividade enzimática, bem como robusta quantificação da atividade da enzima dentro de um compartimento da célula ou tecido. 3 , 4 os protocolos descritos aqui para metabólico mapeamento da atividade de desidrogenases são baseados sobre o manual de laboratório de todos os métodos histoquímicos de enzima disponível,5 nos princípios da histoquímica enzimática quantitativa,6 e na análise de imagens de mapeamento metabólico quantitativo. 4
Desidrogenases são enzimas que realizam as reações redox para reduzir canônicos cofactores como NAD+,+ de NADP e FAD a NADH, NADPH e DANIII2, respectivamente. Células intactas ou criostato cortes histologicos que não são quimicamente fixas são incubados em um meio de reação que contém, entre outros reagentes, o substrato e cofatores de uma desidrogenase específica e um sal de tetrazólio. Posteriormente, essa desidrogenase executa sua atividade catalítica e reduz, por exemplo,+ de NADP a NADPH. Através de uma transportadora de elétrons, 2 moléculas de NADPH em última análise, reduzem 1 molécula de sal de tetrazólio semi incolor solúvel em água em molécula 1 formazan de azul insolúvel em água que precipita-se imediatamente no site da desidrogenase. Portanto, a absorvância de formazan precipitado é uma medida direta da atividade local de uma desidrogenase e pode ser observada usando microscopia de luz ou quantificados utilizando análise de microscopia e imagem luz monocromática. O aspecto quantitativo do presente protocolo permite que pesquisadores desenhar conclusões estatísticas destes ensaios. Além disso, esta quantificação facilita a determinação em situ parâmetros de cinética enzimática, tais como a atividade máxima da enzima (Vmax) e a afinidade de um substrato para uma enzima (Km). 3 , 4 , 5 , 6
Ao planejar um experimento de mapeamento metabólica, é importante perceber que, por experiência, um máximo de 50 lâminas de vidro com preparações da pilha aderente ou cortes de tecido são recomendados para minimizar os atrasos de tempo durante a incubação a fim de obter consistente resultados. É possível processar mais slides e/ou composições médias quando estes passos de protocolo são realizados cooperativamente por mais de um experimentador. Além disso, alguns variabilidade existente entre as experiências. Portanto, experiências idênticas devem ser repetidas pelo menos 3 vezes com cytospins de cada preparação de célula ou seções de cada amostra de tecido e controlos adequados devem ser incluídos em cada experimento. Prepare sempre um meio de incubação de controle na ausência de substrato mas na presença de cofatores para controle para coloração de atividade de enzima inespecífica. Os resultados mais representativos são obtidos em experimentos onde concentrações de substrato/cofator diferentes são aplicadas para cortes de tecido ou preparações da pilha da mesma amostra, para que o experimentador pode realizar análises do uso de cinética enzimática curvas dose-atividade.
Protocol
Este protocolo segue as diretrizes sobre o uso do material humano do Conselho de revisão médica-ético do centro médico acadêmico.
1. preparação de células ou cortes de tecido
- Células
- Trypsinize células de pratos de cultura usando 1 mL de 0,25% do trypsin-EDTA por 5 min a 37 ° C em uma placa de Petri de 10 mm e trazer as células em suspensão de 50.000-200.000 cels/mL, dependendo do tamanho das células de 37 ° C.
- Anexe a 200 µ l de suspensão de células em lâminas de microscopia usando cytospin funis em um cytocentrifuge a 20 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Secar ao ar livre o cytospins por 24 horas à temperatura ambiente. Isso não afeta a atividade de desidrogenase. 5
- Cortes de tecido
- Extraia o tecido de pacientes ou animais de acordo com autorizações de éticas. 10 mm3 de tecido é suficiente para várias experiências.
- Colocar as peças de tecido em frascos de plástico pequena 2ml exalada e snap-congelar os frascos contendo o pedaço de tecido em nitrogênio líquido.
- Armazene os frascos contendo pedaços de tecido −80 ° C até o processamento adicional.
- Use um meio gelatinosa denominado temperatura de corte ideal (OCT) para montar a amostra de tecido em um mandril que congela até-20 ° C a-25 ° C, rapidamente, para que a água não pode formar cristais.
- Use um criostato para corte e primeira guarnição do bloco para o nível desejado (idealmente de metade da largura de uma microscopia de vidro slide, por exemplo, 5 x 5 mm).
- Após o corte, use pincéis e uma placa anti-roll para impedir que as seções de ondulação para cima.
- Cortar amostras de tecido em seções de 6-10 µm de espessura em uma velocidade lenta mas constante (1 s por seção). Quando uma seção corretamente é cortada, permanece plana na faca micrótomo sob a placa anti-roll.
- Pegue 1-3 seções sobre lâminas de vidro microscópica e armazenar −80 ° C até o uso. O número de seções preparadas depende do tamanho da amostra de tecido e a espessura desejada das seções.
2. a enzima Histo/Citoquímica para desidrogenases solúveis
- Preparar o amortecedor da reação.
- Preparar 100 mL de tampão fosfato do pH correto (ver tabela 1; cada enzima tem um pH ideal em que sua atividade é a mais alta). Por exemplo, misture soluções de 0,1 M KH2PO4 (ácido) e 0,1 M NA2HPO4 (básico) até que seja feita uma reserva com o pH correto.
- 18 g de álcool polivinílico (PVA) pese o tampão fosfato sob uma coifa como PVA é empoeirada e tóxicos.
- Dissolver a 18% w/v PVA no tampão fosfato a 100 ° C pelo aquecimento do buffer au bain marie (Coloque a garrafa de vidro em água fervente) e mexendo até o PVA é completamente dissolvido. A solução será então, transparente com pequenas bolhas causadas pela agitação. Normalmente requer ~ 15 min para o PVA dissolver.
Nota: A 18% w/v PVA em tampão fosfato é viscoso e podem ser transferido aos tubos de tampão de reação 15ml usando uma pipeta de largura. Armazenamento de curto prazo de 18% p/v PVA em tampão fosfato deve ocorrer no armazenamento a longo prazo (até 2 semanas) e ≥ 40 ° C em ≥ 60 ° C. 250 µ l de 18% p/v PVA em tampão fosfato é normalmente necessário para uma preparação de cytospin, enquanto 500 µ l é necessário para uma secção de tecido.
- Dissolver a 18% w/v PVA no tampão fosfato a 100 ° C pelo aquecimento do buffer au bain marie (Coloque a garrafa de vidro em água fervente) e mexendo até o PVA é completamente dissolvido. A solução será então, transparente com pequenas bolhas causadas pela agitação. Normalmente requer ~ 15 min para o PVA dissolver.
- Prepare a solução de sal (nitroBT) de tetrazólio. Para cada 1 mL de meio de incubação, 40 µ l de solução de nitroBT é necessário, que consiste de 5 mg de nitroBT (um pó amarelo) dissolvido em uma mistura de 20 µ l dimetilformamida (DMF) e 20 µ l de etanol, que será uma solução transparente amarela clara.
Nota: Porque a estabilidade do nitroBT é menor do que todos os reagentes necessários, é aconselhável preparar a solução de estoque nitroBT última e dissolver o nitroBT no meio de reação primeiro.- Dissolver nitroBT em DMF e etanol aquecendo-o em um frasco de vidro durante um curto período de tempo (~ 10 s) usando um bico de Bunsen. Agitar o frasco durante o aquecimento e não deixe o frasco muito tempo na chama para evitar a evaporação.
- Faça 10% solução nitroBT extra para permitir a evaporação da DMF e etanol durante o processo de dissolução.
- Escudo do elétron transportadoras Fenazina methosulfate (PMS) ou (1-metoxi)-mídia de methosulfate (mPMS) e incubação de Fenazina contendo m(PMS) de luz direta envolvendo papel alumínio ao redor do frasco de armazenamento de vidro.
- Preparar soluções reagentes de acordo com a tabela 1 , dissolvendo-os em água destilada H2O. Alguns reagentes perecer rapidamente, então, prepará-los tão pouco antes a experiência possível. Manter soluções reagente no gelo ou a 4 ° C até o uso.
- Preparar a mídia de incubação, conforme mostrado na tabela 1 e homogeneizar a solução depois de cada passo por agitação suave. Evite a geração de bolhas de ar no meio de incubação agitando continuamente e mantendo a espátula abaixo da superfície do meio de incubação, agitando.
- Aplicação de meio de incubação para cortes de tecido
- Microscopia de pre-quente desliza com cytospins ou cortes histologicos anexados a 37 ° C em uma câmara de incubação de imuno-histoquímica de 15 min. Mergulhe a parte inferior da câmara de incubação de imuno-histoquímica com água morna para manter uma temperatura constante na incubadora.
- Cuidadosamente, quebre ou serrar pipetas Pasteur na transição do estreito para a parte mais larga. Pipetas de Pasteur regulares são demasiado estreitas para aspirar o meio de incubação viscoso, assim que este passo é necessário tornar Pasteur pipetas larga o suficiente para a aspiração do meio de incubação.
- Aplica 250-500 µ l do meio de incubação adequado a cada preparação da pilha ou a seção de tecido em lâminas de microscopia usando a parte mais larga de uma pipeta Pasteur.
- Use a ponta da pipeta para distribuída homogeneamente com o meio de incubação. Desconsidere as bolhas de ar pequeno no meio de incubação, porque estas flutuam à superfície e não irão interferir com a reação enzimática na seção preparação ou tecido celular do slide de microscopia.
- Incubar as preparações da pilha ou seções de tecido sobre as lâminas de microscopia em uma incubadora de 37 ° C (por exemplo, uma incubadora de cultura de tecido) para uma duração predeterminada, dependendo da cinética enzimática e sua expressão em preparação uma célula específica ou tecido (tabela 1). Manter a tampa da câmara de incubação de imuno-histoquímica fechada para manter um ambiente húmido para evitar que o amortecedor da reação da secagem.
- Lavar as lâminas de microscopia
- Toque fora meio de incubação em excesso em um lenço.
- Mecanicamente, enxague no meio de incubação, pelas lâminas de microscopia em 60 ° C tampão fosfato, pH 5,3, movendo as lâminas de microscopia, subindo e descendo no buffer. Isso interrompe a reação enzimática.
- Lave as lâminas de microscopia, mantendo-os em 60 ° C tampão fosfato, pH 5,3 por 20 min.
- Mecanicamente, lave as lâminas de microscopia na água da torneira de 60 ° C.
- Lave as lâminas de microscopia, mantendo-os em água de torneira de 60 ° C por 20 min.
- Deixe a água e slides arrefecer lentamente misturando temperatura água da torneira com água da torneira de 60 ° C ao longo de 1 minuto.
- Execute uma etapa de lavagem mecânica final na água da temperatura de água destilada.
- Coloque o Cytospins manchado ou cortes de tecido em lâminas de microscopia
- Pré-aquecer um slide mais quente em 50-60 ° C.
- Cuidadosamente, secar o lado posterior das lâminas de microscopia usando uma toalha de papel e colocá-los no slide mais quente para secar o lado superior do slide microscopia.
- Quando os slides estiverem secos, coloque preparações da pilha ou cortes de tecido em lâminas de microscopia utilizando as lamelas e o meio de montagem de geleia de glicerol.
- Salvar as preparações da pilha ou lâminas de microscopia de secções de tecido no escuro em um refrigerador a 4 ° C ou proceder imediatamente com a aquisição de imagens.
3. aquisição de imagem
- Ganho de gravar imagens com uma câmera de CCD monocromática científica com faixa dinâmica suficiente (pelo menos 8 bits, mas de preferência 10- ou 12 bits), fixadas e uma resposta linear.
- Selecione um objetivo adequado (20 X de X-63 para cytospins) e 10-63 X para cortes de tecido.
- Reduza o brilho estreitando o diafragma de campo para que seja um pouco maior que o campo de visão.
- Uso de luz monocromática, aplicando um filtro de inferência de ampla bandpass nm 10 perto do comprimento de onda isobestic do formazan precipitado7 em combinação com um bloqueio de infravermelho filtro (ver Tabela de materiais).
Nota: A absorvância máxima isobestic de nitroBT é em 585 nm. - Otimizar a iluminação para garantir que toda a cinza nível gama da câmera é usada (ou seja, definir o nível de iluminação para que a iluminação máxima é alcançada sem excesso de exposição durante a gravação de uma lâmina de microscópio em branco).
- Calibre os valores medidos níveis de cinza de absorvância conhecida (ou densidade óptica [OD]). Para este fim, captura imagens de escala de cinza pelo menos 10 etapas diferentes de um slide de calibração ou passo tablet com valores conhecidos de OD (consulte a etapa 4.1.1), ambos comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais) ou medir um tablet de passo Cunha escala de cinzentos feitos sob medida por um densitophotometer e utilização dos resultados para calibrar medidos cinzenta valores para os valores de absorvância conhecido.
- Captura de fotomicrografias de células ou cortes de tecido de interesse.
4. análise de imagens
- Antes da análise de imagem, calibre o software ImageJ para medições de absorvância.
- Medir a absorvância (OD) de fotomicrografias de pelo menos 10 áreas de calibração com parâmetros conhecidos absorvância no tablet de slide ou etapa de calibração com valores conhecidos de OD. No ImageJ, use Analyze → medida menu ou tecla de atalho Ctrl + M para medir uma área selecionada.
- Iniciar o procedimento de calibração de absorvância por vai analisar → calibração. Escolha a função "Rodbard (NIH Image)". Na coluna da esquerda da janela que se abre, os resultados de medições de nível cinzas de cada passo do tablet slide/passo da calibração realizada em 4.1.1 já estão presentes. Se não, copiá-los a partir da tela de resultados do ImageJ. Na coluna à direita, insira cada correspondente valor de absorvância conhecido como impresso sobre o certificado que você recebeu com o tablet passo calibrado. Marque as caixas "calibração Global" e "Trama do Show" e pressione "Okey".
- Para controle de qualidade, certificar-se de que o R2 da função Rodbard é > 0,99. Se for < 0,99, verifique se os slides de calibração foram fotografados e medidos corretamente e se os parâmetros de absorvância conhecidos foram inseridos corretamente.
- ImageJ agora é calibrado até você fechar o programa (daí "Calibração Global"). Para as medidas de absorbância, uma sessão de ImageJ calibrada sempre converte que a absorbância observada significa para valores entre 0 e 1, onde 0 e 1 são as assíntotas de zero e completo absorvância, respectivamente.
- Para cytospins, selecione > 100 células únicas de forma aleatória. Para cortes de tecido, selecione um ou mais campos de interesse de um comprimento fixo e largura em todas as seções.
- Projeto uma varredura sobre as fotomicrografias para auxiliar em seleções de célula imparcial. No ImageJ, projetar uma grade sobre uma imagem através do menu Plugins → Analyze → grade.
- No ImageJ, use a ferramenta elíptica para selecionar células únicas e use a ferramenta retângulo para selecionar regiões de tecido.
- Medir a absorvância e a área das regiões de tecido ou células selecionadas. A densidade óptica e área são chamados de "Quer dizer" e "Área" no ImageJ resultados da planilha, respectivamente.
Nota: A absorvância total de uma região de célula ou tecido (se você tiver selecionado várias regiões de tecido com tamanhos diferentes) é igual à soma de todas as absorvâncias pixel separadas. Se uma célula é fotografada por 1000 pixels, então a absorção total é dada pela soma das absorvâncias 1000 e a absorvância média é dada pelo total de absorvância/1000. Esse procedimento também evita erro distributivos. - Determinar a absorbância total média de > 30 células ou regiões de tecido da lâmina de controle, que contém uma amostra que foi exposta para controlar meio de incubação na ausência de substrato mas na presença de cofactores. Absorvância este controle é usado para controle para coloração de atividade de enzima inespecífica e artefatos de absorvância induzida pelas lâminas de microscopia usadas, médio, lamínula ou microscópio de montagem.
- Subtrai a absorvância média do controle de todas as medidas de absorbância total de amostras que foram expostas ao meio de incubação com a mesma concentração de cofator (mas diferentes concentrações de substrato e/ou inibidor). Isto dá a absorvância total corrigida de uma região da célula ou tecido.
- Estatisticamente, compare as absorvâncias de totais médias corrigidas usando teste T de Student ou teste de ANOVA One-Way, dependendo do seu projeto experimental.
- Formazan absorbância pode ser convertida em atividade de enzima (substrato µmol convertido por mL / min) usando a lei de Lambert-Beer: c=A/(є×d), onde c é a concentração de formazan no meio de reação, A é a absorvância medida no ImageJ após calibração; Є é o coeficiente de extinção do formazan (16.000 em 585 nm)8 e d é a luz viajando a distância, que é igual à célula média espessura ou a espessura de corte de seção nominal (6-10 µm neste protocolo).
Nota: Após a secagem, a espessura de corte de tecido diminui ~ 50% da espessura do corte da seção nominal, mas isso não se reflete no cálculo acima, porque a espessura nominal de corte é biologicamente mais relevantes. A célula média espessura e dimensões da esfera de célula preparados aderiram a lâminas de vidro de microscopia podem ser determinadas usando microscopia confocal ou microscopia de campo amplo, para os quais protocolos podem ser encontrados em outros lugares. 9 , 10
Representative Results
Vários protocolos para preparar meio de incubação são mostrados para investigar a atividade de uma desidrogenase específica. Para cada desidrogenase, dissolver os reagentes listados na solução de PVA, mantendo uma temperatura de pelo menos 37 ° C. Os reagentes devem ser dissolvidos na ordem listada na tabela, ou seja, nitroBT sempre é dissolvido primeiro e (m) PMS sempre é dissolvido última. Cada 5 mg de nitroBT é dissolvido na mistura de 40 µ l (20 etanol µ l + 20 µ l dimetilformamida). Todos os volumes são por 1 mL de solução PVA 18%, que pode ser usada para manchar ~ 2 cortes histologicos ou preparações da pilha ~ 4 placas de vidro. NitroBT, NAD+, NADP+, soluções ADP e substrato devem ser feitas na hora. NaN3, MgCl2 e (m) PMS soluções podem ser armazenadas a 4 ° C por um mês. 18% PVA dissolvido em fosfato de reserva pode ser armazenada a 60 ° C durante 2 semanas. O pH da solução de 18% PVA pode ser definido usando diferentes composições da dihidrogenofosfato de potássio 0,1 M (KH2PO4) e buffers de fosfato (NA2HPO4) de hidrogênio de dissódico 0,1 M. Os períodos de incubação mostrado fornecem bons pontos de partida, mas os períodos de incubação ideal dependem da espécie, o tipo de tecido e a preservação do tecido. Em geral, preparações da pilha devem ser incubadas em mais do que para obter um nível semelhante de produção formazan cortes histologicos.
Selvagem-tipo isocitrato desidrogenase 1 e 2 (IDH1/2) catalisar a conversão de isocitrato a α-cetoglutarato (αKG), com concomitante redução de+ de NADP a NADPH no citoplasma e mitocôndrias, respectivamente. Estas enzimas recentemente tem atraído interesse porque IDH1/2 mutações ocorrem em vários tipos de câncer humano, incluindo câncer cerebral primária (glioblastoma) e câncer colorretal e oferecem uma oportunidade única para demonstrar as possibilidades de mapeamento metabólico. Mutações IDH1 desativar IDH1 atividade de enzima do selvagem-tipo e também induzir uma atividade enzimática-neo que leva à produção e à acumulação subsequente do oncometabolite D-2-Hidroxiglutarato (D-2 HG),11 , que é discutido em outra parte em detalhe. 12 mapeamento metabólica experimentos mostraram que+de NADP-dependente IDH1/2 atividade foi significativamente menor em células de carcinoma colorretal com uma batido em heterozigotos IDH1 mutação do que em células de carcinoma colorrectal que foram IDH1 selvagem-tipo (figura 1A). Esta diferença foi quantificada por análise de imagem de fotomicrografias de luz monocromáticas (figura 1B). 12
Outro exemplo ilustrativo de experimentos de mapeamento metabólica é mostrado na Figura 2, que é uma imagem de uma seção do criostato do cérebro de rato que foi injetado com células de glioblastoma humano. IDH1/2 é o mais importante fornecedor de NADPH no cérebro humano e sua atividade é upregulated em selvagem-tipo IDH1/2 glioblastoma, considerando a capacidade de produção de NADPH de IDH1/2 é muito mais baixa no cérebro de roedores. 11 Figura 2A mostra a diferença entre o NADP alta+-dependente IDH1/2 atividade em células de glioblastoma humano e o NADP baixa+-dependente IDH1/2 atividade no cérebro de rato saudável. IDH1/2 atividade é quantificada como produção de NADPH µmol / mL de tecido por minuto na Figura 2B.
A reação enzimática da IDH1/2 é relativamente simples, mas o lactato desidrogenase (LDH) é uma enzima mais complicada complexa. LDH converte a conversão reversível do lactato a piruvato, com concomitante redução do NAD+ para NADH ou vice-versa. A disponibilidade de lactato e piruvato e a composição da enzima LDH complexa dita se lactato é primeiramente convertido em piruvato (que é catalisado por LDH-B e produz NADH) ou se o piruvato é primeiramente convertido para lactato (que é catalisada por LDH-A e consome NADH). Experimentos de mapeamento metabólica 13 são capazes de visualizar a atividade da reação LDH-B, mas eles são "cegos" para a atividade da LDH-A reação, porque não ocorre produção de NADH e consequentemente nitroBT não é reduzido a formazan. A Figura 3 mostra o NAD+-dependente atividade LDH (ou seja, a conversão de lactato em piruvato) no cérebro humano seções na ausência de substrato (Figura 3A), na presença de alta concentração de lactato (Figura 3B ), na presença de lactato de 6 mM (Figura 3) e na presença de uma baixa concentração de lactato e uma maior concentração de piruvato (Figura 3D). Os resultados dessas experiências ilustram metabólica mapeamento adequadamente que capta o NAD+-dependente atividade LDH em seções do tecido depende da disponibilidade de lactato e piruvato no meio de reação.
Figura 1 . +De NADP-dependente IDH1/2 atividade de células de carcinoma colorectal humana. (A) representante monocromático luz fotomicrografias de células de carcinoma colorectal humana HCT116 depois da coloração para NADP+-dependente atividade IDH1/2 contra 1-10mm NADP isocitrato e 0,8 mM+. Barras de escala = 50 µm. (B) uma quantificação da absorvância do formazan azul produzida a partir de nitroBT por+de NADP-dependente IDH1/2 atividade por célula é mostrado com o uso de luz monocromática em (A) e análise de imagem. Abreviaturas: IDH1WT/WT, isocitrato desidrogenase 1 selvagem-tipo; IDH1WT/MUT, isocitrato desidrogenase 1 mutado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . +De NADP-dependente IDH1/2 atividade de amostras de glioblastoma humano. (A) representante fotomicrografia de uma seção de cérebro de rato que contém o cérebro de rato saudável (h) e um transplante de tumor glioblastoma humano (t) depois da coloração para NADP+-dependente IDH1/2 atividade na presença de 0.8 NADP mM+ e 2mm isocitrato. Barra de escala = 200 µm (B) quantificação de atividade de enzima das áreas do cérebro de rato (h) e glioblastoma humano xenoenxertos (t) mostrada em (A) usando a lei de Lambert-Beer. Barras de erro representam desvios-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . NAD+-dependente lactato desidrogenase (LDH) atividade de amostras de cérebro humano. Representante fotomicrografias das seções seriais de amostras de cérebro humano depois da coloração para NAD+-atividade LDH dependente (A) contra condições de controle (no substrato de ausência e piruvato, 3mm NAD+ somente) (B) contra 150 mM lactato na ausência de piruvato (C) contra 6 mM lactato na ausência de piruvato e (D) contra lactato de 6 mM na presença de piruvato de 18mm, inibidor da reação de lactato para piruvato-produto competitivo. Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Enzima: | G6PDH | LDH | SDH | MDH | IDH1 | IDH2 | IDH3 | 6PGD | GDH |
| PVA 18% em tampão fosfato de 100mm | 1 mL; pH = 7,4 | 1 mL; pH = 7,4 | 1 mL; pH = 8.0 | 1 mL; pH = 7,4 | 1 mL; pH = 7,4 | 1 mL; pH = 7,4 | 1 mL; pH = 7,4 | 1 mL; pH = 8.0 | 1 mL; pH = 8.0 |
| 5 mM NitroBT | mistura de 5 mg/40 µ l | mistura de 5 mg/40 µ l | mistura de 5 mg/40 µ l | mistura de 5 mg/40 µ l | mistura de 5 mg/40 µ l | mistura de 5 mg/40 µ l | mistura de 5 mg/40 µ l | mistura de 5 mg/40 µ l | mistura de 5 mg/40 µ l |
| 5 mM NaN3 | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | |
| 5 mM MgCl2 | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | |||
| 3 mM NAD+ | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | ||||||
| 0,8 mM NADP | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | ||||
| 2mm ADP | 10 Μ l | ||||||||
| substrato | 10 mM de glicose-6-fosfato | lactato de 150 mM | succinato de 50mm | ácido málico 100mm | isocitrato 2mm | isocitrato 2mm | isocitrato 2mm | 10 mM 6-fosfo-galactonate | ácido glutâmico de 10 mM |
| mPMS 0,32 mM | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | ||||
| PMS de 0.2 mM | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | 10 Μ l | |||||
| Duração da incubação | 5 min | 30 min | 60 min | 60 min | 30 min | 30 min | 30 min | 10 min | 30 min |
Tabela 1. Visão esquemática do protocolo de mapeamento metabólica por desidrogenases. Abreviaturas: ADP, difosfato de adenosina; (m) PMS (metoxi) -5-metil sulfato de methylphenazinium; nitroBT, cloreto de tetrazólio azul de nitro; G6PDH, glicose-6-fosfato desidrogenase; LDH, lactato desidrogenase; SDH, Succinato desidrogenase; MDH, malato desidrogenase; IDH, isocitrato desidrogenase; 6PGD, 6-phosphogluconate desidrogenase; GDH, glutamato desidrogenase.
Discussion
Pesquisa sobre o metabolismo celular está experimentando atualmente um renascimento porque pesquisadores percebem agora que os efeitos metabólicos são cruciais para a patogênese e o tratamento de muitas doenças. 1 além disso, a pesquisa metabólica é auxiliado por um crescente disponibilidade de técnicas que fornecem este campo de pesquisa com ferramentas mais do que nunca, incluindo a espectrometria de massa, marcação de rotulagem e espectrometria de ressonância magnética nuclear. Mapeamento metabólico não é uma técnica nova, mas sua capacidade de dar informação integrada sobre a atividade de enzimas em uma situação de quase verdadeiro-à-natureza faz com que esta técnica mais relevante do que nunca. 2
Os cofatores NAD+ e NADP+ são encontrados em todas as células vivas, o que indica que a desidrogenases surgiram muito cedo durante a evolução e tem papéis-chave no metabolismo celular. 14 , 15 -atualmente, existem 523 reações catalisadas por enzimas que são classificadas como desidrogenases e ocorrerem através de todas as espécies. 16 teoricamente, a atividade de todas as reacções diferentes desidrogenase pode ser separadamente investigada pelos ajustes do protocolo de mapeamento metabólico descrito aqui. Cada reação enzimática é exclusiva por meio do substrato e co-fatores que são necessários para a sua actividade. Portanto, a atividade de cada reação enzimática pode ser determinada usando um experimento de mapeamento metabólica com o substrato adequado e cofactores no meio de reação. No entanto, algumas isoformas da enzima diferem na sua localização subcellular, por exemplo, uma isoforma catalisa uma reação no citoplasma, Considerando que outra isoforma funções nas mitocôndrias. Um exemplo notável é IDH1 e IDH2, dos quais o primeiro é citoplasmático e o último é mitocondrial e que são duas diferentes proteínas codificadas por dois genes diferentes. 11 1-metoxi-5-methylphenazinium methylsulfate (metoxi-PMS) e 5-methylphenazinium methylsulfate (PMS) podem ser usados como carreadoras de elétrons para estes experimentos. O ex não passa as membranas mitocondriais, este faz. Portanto, investigações sobre enzimas mitocondriais (por exemplo, IDH2) devem usar PMS Considerando que investigações sobre citosólica enzimas (por exemplo, IDH1) devem usar mPMS.
Tal como acontece com muitas técnicas, variações do presente protocolo, como o uso de diferentes tipos de sais de tetrazólio, excluindo a adição de PMS e azida de sódio, usando um meio de montagem aquoso e variando de incubação e lavagem vezes, existe e pode funcionar igualmente bem. O aplicativo de mapeamento metabólico com sais de tetrazólio não está limitado a desidrogenases. Com pequenas modificações no protocolo, pode também ser usada para a avaliação da atividade das enzimas que funcionam diretamente a montante de uma desidrogenase em uma via metabólica. Descrevemos anteriormente este princípio para a enzima glutaminase,17 , que funciona diretamente a montante da glutamato desidrogenase na via glutaminolysis. 18 em teoria, o mesmo princípio pode ser aplicado a outras enzimas que ciclo de função diretamente a jusante ou montante de uma desidrogenase por exemplo aconitase, que se encontra diretamente a montante do IDH2 e IDH3 no ácido tricarboxílico (TCA). Outra variação simples das concentrações descritas na tabela 1 é por meio de frascos médio de incubação com várias concentrações de substrato, cofator e/ou inibidor. Isto permite a geração de curvas dose-atividade em função da concentração de substrato, cofator e/ou inibição.
Tecnicamente falando, metabólica experimentos de mapeamento não facilitar observações imparciais da atividade da enzima em situ , porque os pesquisadores têm de escolher uma concentração de substrato e cofator que pode não refletir os níveis de substrato e cofator que estão presentes em situ. Além disso, o uso de viscoso 18% PVA no meio de reação serve para manter macromoléculas intactas, no lugar e na conformação, mas proíbe a difusão efetiva de reagentes de baixos peso molecular através do meio de reação. 3 , 5 portanto, as atividades de determinada enzima nos experimentos descritos aqui que usam concentrações de substrato suprafisiológicas não refletem a situação no vivo em uma concentração de determinado substrato, mas são adequados para comparações intra experimentais. Assim, o resultado de experimentos de mapeamento metabólica é a capacidade de produção (atividade máxima) de uma reação enzimática no contexto dos níveis substrato e cofator que estão presentes em situ. Além disso, o uso de várias concentrações de substrato e/ou cofactores e amostras múltiplas permite comparação imparcial da capacidade de produção máxima (Vmax) e afinidade (Km) de uma enzima de um substrato/cofator em preparações da pilha , tecidos ou regiões do tecido. Esses parâmetros são o resultado da soma da expressão da proteína de enzima, modificações borne-translational e o efeito de um microambiente lotado na atividade de enzimas. Portanto, mapeamento metabólico é ainda uma melhor reflexão da atividade da enzima do que experimentos que determine a expressão da proteína ou purificada enzima atividade em vitro.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
R.J.M. é suportado por uma bolsa de doutoramento de AMC. Esta pesquisa foi apoiada pela sociedade holandesa de câncer (grant KWF UVA 2014-6839). Os autores agradecer Dr. A. Jonker por sua ajuda com a escrita do protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| D-Glucose 6-phosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | G7879 | |
| Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4) | Merck Millipore | 106559 | |
| di-Sodium succinate | Sigma-Aldrich | W327700 | |
| DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | I1252 | |
| D-Malic acid | Sigma-Aldrich | 2300 | |
| Glycerol Gelatin | Sigma-Aldrich | GG1 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| Lithium 6-phospho-D-galactonate | Sigma-Aldrich | 55962 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| methoxy-Phenazine methosulfate | Serva | 28966.01 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N0505 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | NADP-RO | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Phenazine methosulfate | Serva | 32030.01 | |
| Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed | Sigma-Aldrich | P1763 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck Millipore | 104873 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Bandpass filter | Edmund optics | https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/ | |
| Grey-step wedge | Stouffer Industries | http://www.stouffer.net/TransPage.htm |
References
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