Summary
Здесь мы представляем протокол, который может использоваться для микроскопически визуализации и количественной оценки деятельности дегидрогеназ в клетках и тканях и его кинетики, функции и субцеллюлярные локализации.
Abstract
Изменены клеточного метаболизма является отличительной чертой многих заболеваний, включая рак, сердечно-сосудистые заболевания и инфекции. Метаболические двигательных единиц клеток являются ферменты и их деятельность в значительной степени регулируются на многих уровнях, в том числе транскрипционный анализ, стабильность мРНК, переводческая, столб-поступательные и функциональном уровне. Этот комплекс правил означает, что обычных анализов количественных или изображений, такие количественные мРНК эксперименты, западных помарок и иммуногистохимии, дают неполную информацию о конечной деятельности ферментов, их функции и/или их локализация внутриклеточных. Количественные фермента цитохимии и гистохимии (т.е. метаболические картирование) Показать подробную информацию на в situ ферментативную активность и кинетики, функции и внутриклеточных локализации в ситуации почти true к природе.
Мы описываем протокол для обнаружения деятельности дегидрогеназ, которые являются ферменты, которые выполняют окислительно-восстановительных реакций для уменьшения кофакторов NAD(P)+ и Увлечением. Клетки и ткани секции инкубируют в среде, характерная для ферментативной активности одной дегидрогеназы. Впоследствии дегидрогеназа, которое является предметом расследования выполняет свою ферментативную активность внутриклеточных сайта. В химические реакции с реакцией среды это в конечном итоге создает Формазаны синего цвета на сайте дегидрогеназа деятельности. Формазаны поглощение поэтому прямая мера дегидрогеназа деятельности и может быть определена количественно с помощью монохроматического света микроскопии и изображения анализа. Количественный аспект настоящего протокола позволяет исследователям статистические выводы из этих анализов.
Помимо обсервационных исследований этот метод может использоваться для ингибирования исследования специфических ферментов. В этом контексте, исследования выгоду от true природа преимущества метаболических сопоставления, давая результаты на местах , что может быть физиологически более актуальным, чем в vitro исследования Ингибирование фермента. В целом метаболические сопоставление является незаменимым техника для изучения метаболизма на уровне сотовых или ткани. Техника легко принять, обеспечивает углубленного, всестороннего и комплексного метаболической информации и позволяет быстрый количественный анализ.
Introduction
Важным краеугольным камнем клеточной физиологии — метаболизма. Метаболизм обеспечивает клетки с энергией, необходимой для всех физиологических процессов, обеспечивает строительные блоки для высокомолекулярных биосинтез и регулирует клеточного гомеостаза в отношении отходов, токсичные молекулы и разборку и Утилизация ненужных или неблагополучных клеточных компонентов. Ферменты катализируют почти всех жизненно важных клеточных химических реакций и, следовательно, двигательных единиц в физиологии клетки. 1 , 2
Активность ферментов жестко регулируется на многих уровнях и поэтому гистохимии количественных фермента и цитохимии (также называется метаболических отображение) является предпочтительным методом для изучения активности фермента в situ. На уровне транскрипционный анализ экспрессии генов в мРНК регулируется. Эффект регуляции транскрипции можно определить с помощью количественных анализов мРНК, например microarrays или прямой последовательности РНК или качественных анализов мРНК, например гибридизации in situ , которая дает информацию о сотовых (суб) Локализация молекул мРНК. Это делает возможным оценить относительные различия между ячейками транскрипционный анализ активности. Однако толкования и действия этих анализов мРНК в отношении метаболической активности осложняется тем, что регулирование также происходит на уровне мРНК, где последовательность и стабильность молекул мРНК изменяются после того, как он транскрибируется из ДНК. Это редактирование регулирует белок изоформы перевод и перевод количество белка в рибосомах. Кроме того процесс перевода белков контролируется и в конечном итоге влияет на фермент выражение и поэтому деятельность. Совокупное воздействие вышеупомянутые нормативные меры могут быть оценены с помощью анализов выражение количественных белка, такие как западный Blotting обратная фаза lysate microarrays протеина или качественного белка выражение анализов, таких как иммуноцитохимии и иммуногистохимии, но эти методы не включать течению регулирования эффекты, такие как столб-поступательные изменения белков и функциональное регулирование ферментов в их переполненном микроокружения. Кроме того выражение фермента может слабо коррелирует с своей деятельности, так что измерений активности очищенный фермента в гомогенатах клетки или ткани или в разбавленных растворах широко используются для исследования активности фермента. Однако эти эксперименты не реплицировать влияние переполненном разобщенным цитоплазмы или органеллы на активность фермента. Кроме того все вышеупомянутые методы определения количества или локализации выражение mRNA или фермента, но неспособны дать всеобъемлющую информацию на обоих этих аспектов фермента выражение, не говоря уже об интеграции этого Информация с определения активности фермента. 2 , 3 , 4
Метаболические картирование позволяет признательность всех вышеупомянутых переменных, которые определяют активность фермента. Более того метаболические сопоставление является формой живой клетки или ткани изображений с клеток и тканей, которые сохранились во время анализа для создания ситуации почти true к природе для создания данных активности ферментов. Он производит изображения, которые облегчают подробные признательность расположение ферментативной активности, а также надежной количественной оценки активности ферментов в отсеке клетки или ткани. 3 , 4 протоколы, описанные здесь для метаболических картирование деятельности дегидрогеназ основаны на лабораторных руководства всех доступных энзима гистохимические методы,5 на принципах количественного фермента гистохимии,6 и на анализ изображений количественные метаболических сопоставления. 4
Дегидрогеназ являются ферменты, которые выполняют окислительно-восстановительных реакций для уменьшения канонические кофакторов NAD+, NADP+ и Причуды NADH, NADPH и ГВС2, соответственно. Нетронутым клеток или криостата разделов ткани, которые не являются фиксированными химически инкубируют в реакции среды, которая содержит, среди других реагентов, субстрат и кофакторы конкретных дегидрогеназы и tetrazolium соли. Впоследствии что дегидрогеназа выполняет свою каталитическую активность и уменьшает, например, NADP+ до NADPH. Через перевозчика электрона 2 NADPH молекул в конечном итоге сократить 1 водорастворимый полу бесцветная tetrazolium соли молекулы в 1 водонерастворимых синий Формазаны молекула, которая сразу же осаждается на сайте дегидрогеназы. Таким образом поглощения осажденный Формазаны является прямой мерой местной деятельности дегидрогеназы и можно наблюдать с помощью световой микроскопии или количественно с помощью монохроматического света микроскопии и изображения анализа. Количественный аспект настоящего протокола позволяет исследователям статистические выводы из этих анализов. Кроме того эта количественная оценка облегчает определение в situ кинетическая фермента параметров, таких как максимальное ферментативной активности (VМакс) и близость субстрат для фермента (mK). 3 , 4 , 5 , 6
При планировании эксперимента метаболических сопоставления, важно понимать, что за эксперимент, максимум 50 стекла слайды с приставшей клеток препаратов или разделов ткани рекомендуется свести к минимуму время задержки во время инкубации для получения последовательной результаты. Это можно обрабатывать более слайды и/или средних композиции, когда эти шаги протокола совместно осуществляется более чем одном экспериментатор. Кроме того некоторые изменчивость существует между экспериментов. Таким образом идентичные эксперименты должны проводиться по крайней мере 3 раза с cytospins от подготовки каждой ячейки или разделы из каждого образца ткани и соответствующие элементы управления должны быть включены в каждом эксперименте. Всегда готовить средство управления инкубации в отсутствие субстрата, но в присутствии кофакторов для управления для окрашивания активность фермента неспецифические. Наиболее представительных результатов в экспериментах где концентрации различных субстрата/кофактор применяются к разделов ткани или клетки препаратов из того же образца, так, что экспериментатор можно выполнить анализ с помощью Кинетика энзима доза активность кривых.
Protocol
Этот протокол руководящими указаниями по использованию человеческого материала лечебно-этических обзора Совета академического медицинского центра.
1. Подготовка клетки или ткани секций
- Клетки
- Trypsinize клетки от культуры блюда с использованием 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА на 5 минут при 37 ° C в 10 мм Петри и принести клеток в суспензии 37 ° C 50 000-200 000 клеток/мл, в зависимости от размера ячейки.
- Прикрепите 200 мкл суспензии клеток микроскопии слайды с помощью воронки cytospin в cytocentrifuge на 20 x g 5 мин при комнатной температуре.
- Воздушно-сухой cytospins для 24 ч при комнатной температуре. Это не влияет на активность дегидрогеназы. 5
- Разделах ткани
- Экстракт тканей от пациентов или животных согласно этическим разрешений. 3 10 мм ткани достаточно для нескольких экспериментов.
- Положите кусочки ткани в пластиковые флаконы небольшие вентилируемые 2 мл и оснастки заморозить флакон, содержащий кусочек ткани в жидком азоте.
- Храните флаконах, содержащих кусочки ткани в −80 ° C до дальнейшей обработки.
- Используйте гель как средство под названием оптимального раскроя температуры (OCT) для установки образца ткани на патрон, который замерзает до-20 ° C до-25 ° C быстро, таким образом, чтобы вода не образуют кристаллы.
- Используйте криостат для резки и первая обрезка блока до желаемого уровня (в идеале половину ширины микроскопии стекла слайд, например 5 x 5 мм).
- После разрезания, используйте кисти и пластина уголка для предотвращения разделы керлинг вверх.
- Вырезать образцы тканей в 6-10 мкм толстые секции на медленный, но постоянной скорости (1 s в каждой секции). Когда раздел правильно вырезать, он остается плашмя на микротомных ножей под пластину уголка.
- Подобрать разделы 1-3 на микроскопические стеклянные слайды и хранить в −80 ° C до использования. Количество разделов, подготовленных зависит от размера образца ткани и требуемой толщины секций.
2. фермент Histo/цитохимии для растворимых дегидрогеназ
- Подготовка реакции буфера.
- Подготовка 100 мл фосфатного буфера правильным рН (см. Таблица 1; каждый фермент имеет оптимальный рН, в котором его деятельность является самым высоким). Например смесь растворов 0,1 М х2PO4 (кислой) и 0,1 М NA2HPO4 (основные) до тех пор, пока буфер с правильного pH производится.
- Весить 18 g поливиниловый спирт (PVA) в фосфатного буфера под вытяжного шкафа, как ПВА пыльной и токсичных.
- Распустить 18% w/v ПВА в фосфатного буфера при 100 ° C потепления в буфер au bain Мари (положить стеклянная бутылка в кипящей воде) и помешивая, до тех пор, пока полностью не растворится ПВА. Решение будет затем, прозрачный, с небольшой воздушных пузырьков, которые вызваны перемешивания. Это обычно требует ~ 15 мин для PVA распустить.
Примечание: 18% w/v ПВА в фосфатного буфера вязкой и могут быть переданы 15 мл реакции буфера труб с использованием широкого пипетки. Краткосрочного хранения 18% w/v ПВА в фосфатного буфера должно происходить при ≥40 ° C и длительного хранения (до 2 недель) ≥ 60 ° C. 250 мкл 18% w/v ПВА в фосфатного буфера обычно требуется для приготовления cytospin, в то время как для ткани секции требуется 500 мкл.
- Распустить 18% w/v ПВА в фосфатного буфера при 100 ° C потепления в буфер au bain Мари (положить стеклянная бутылка в кипящей воде) и помешивая, до тех пор, пока полностью не растворится ПВА. Решение будет затем, прозрачный, с небольшой воздушных пузырьков, которые вызваны перемешивания. Это обычно требует ~ 15 мин для PVA распустить.
- Готовят раствор tetrazolium соли (nitroBT). Для каждого 1 мл средний инкубационный, требуется 40 мкл раствора nitroBT, состоящий из 5 мг nitroBT (желтый порошок) растворяют в смеси 20 мкл диметилформамид (DMF) и 20 мкл этанола, который будет светло желтый прозрачный раствор.
Примечание: Поскольку стабильность nitroBT-это самый низкий из всех необходимых реактивов, рекомендуется подготовить Стоковый раствор nitroBT последний и сначала растворяются nitroBT в реакции среды.- Растворяют nitroBT в DMF и этанола путем нагревать его в стеклянный пузырек в течение короткого периода времени (~ 10 s) с помощью горелки Бунзена. Встряхнуть флакон во время нагревания и не оставляйте флакона слишком долго в пламени для предотвращения испарения.
- Сделать 10% дополнительных nitroBT решение для испарения DMF и этанола в процессе растворения.
- Щит электрона перевозчиков мембранотропного порфириновых (PMS) или (1-метокси)-мембранотропного порфириновых (МПМ) и инкубации СМИ, содержащие m(PMS) от прямого света, завернув фольги вокруг стекла флакона хранения.
- Подготовка реагента решения согласно таблице 1 , растворяя их в дистиллированной H2O. Некоторые реагенты быстро погибнуть, чтобы подготовить их как незадолго до этого эксперимента как можно. Держать реагент решения на льду или на 4 ° C до использования.
- Подготовить инкубации СМИ, как показано в таблице 1 и однородный раствор после каждого шага, нежное перемешивании. Избегайте поколение воздушных пузырьков в средстве для инкубации, постоянно помешивая и сохраняя шпатель под поверхностью средство инкубации помешивая.
- Применяя инкубации среднего для разделов ткани
- Предварительно теплой микроскопии слайды с cytospins или разделов ткани придает при 37 ° C в камеру иммуногистохимия инкубации 15 мин погружаться в нижней части камеры инкубации иммуногистохимии с теплой водой, чтобы поддерживать постоянную температуру в инкубатор.
- Тщательно перерыв или отпиливают пипетки Пастера на переход от узкой широкой части. Регулярных пипетки Пастера являются слишком узкими, чтобы аспирационная вязкой инкубации среды, поэтому этот шаг, чтобы сделать Пастер пипетки, достаточно широкий для аспирации средство инкубации.
- 250-500 мкл соответствующего инкубации среды применить к каждой подготовка клетки или ткани секции по микроскопии слайды с помощью широкой части пипетки Пастера.
- Используйте наконечник пипетки равномерно разложить средство инкубации. Игнорировать небольшие воздушные пузыри в среде инкубации, потому что они будут плавать на поверхности и не будет вмешиваться с ферментативной реакции в разделе Подготовка или ткани клеток на слайде микроскопии.
- Инкубируйте предварительно указанный период времени, в зависимости от того Ферментативная кинетика и ее выражение в конкретной ячейке подготовки клетки препаратов или разделах ткани на слайдах микроскопии в инкубатор 37 ° C (например инкубатор культуры ткани) или ткани (Таблица 1). Держите крышку камеры инкубации иммуногистохимии, закрыт для поддержания влажной среде для предотвращения реакции буфера от высыхания.
- Стиральная микроскопии слайды
- Кран среднего избыток инкубации на ткани.
- Механически смыть средство инкубации из микроскопии слайды в 60 ° C фосфатного буфера, рН 5.3, перемещая микроскопии слайды вверх и вниз в буфере. Это останавливает ферментативной реакции.
- Вымойте микроскопии слайды, держа их в 60 ° C фосфатного буфера, рН 5.3 за 20 мин.
- Механически мыть микроскопии слайды в 60 ° C водопроводной воды.
- Вымойте микроскопии слайды, держа их в 60 ° C водопроводной воды за 20 мин.
- Пусть вода и слайды остыть, медленно смешивая водопроводной водой комнатной температуры с водопроводной воды 60 ° C в течение 1 минуты.
- Выполните шаг окончательной механической стиральная в комнатной температуре дистиллированной воды.
- Заключите окрашенных Cytospins или разделов ткани на слайдах микроскопии
- Предварительно теплой слайд теплее на 50-60 ° C.
- Тщательно высушить на обратной стороне микроскопии слайды с помощью бумажным полотенцем и разместить их на слайд с подогревом для просушки в верхней части слайда микроскопии.
- Когда сухой слайды, заключите клеток препаратов или разделов ткани на слайдах микроскопии с использованием глицерол желе монтажа средних и coverslips.
- Сохраните препаратов клетки или ткани разделы микроскопии слайды в темноте в холодильнике при температуре 4 ° C или немедленно с приобретением изображений.
3. изображение приобретение
- Запись изображения с научной Монохромная CCD-камера с достаточно динамический диапазон (по крайней мере 8-разрядные но желательно 10-битный или 12-бит), фиксированной прибыли и линейным откликом.
- Выбор правильной цели (20 X X-63 для cytospins) и 10-63 X для разделов ткани.
- Уменьшить блики, сужая поле диафрагмы, так что это немного больше, чем поле зрения.
- Использование монохроматического света, применяя 10 Нм широкий полосовой фильтр вывода, возле isobestic волны Формазаны осадок7 в сочетании с инфракрасного блокирования фильтра (см. Таблицу материалов).
Примечание: Максимальная isobestic поглощения nitroBT находится в 585 нм. - Оптимизировать освещение для того, чтобы гарантировать, что весь диапазон серых уровня камеры используется (то есть, установить уровень освещенности так что максимальное освещение достигается не пересвечивая при записи пустым микроскопа).
- Калибровка измеренные уровни серого известных поглощения (или оптической плотности [ОД]) значения. С этой целью захвата изображений серой шкалы по крайней мере 10 различных этапов калибровки слайда или шаг планшет с известными ОД значения (см. шаг 4.1.1), либо коммерчески доступных (см. Таблицу материалов) или измерить таблетки шаг клина по индивидуальному заказу серой шкалы, densitophotometer и использовать результаты для калибровки измерений серый значения известных поглощения значениям.
- Захват микрофотографиями клеток или тканей интересующие разделы.
4. анализ
- До анализа изображений калибровки ImageJ программное обеспечение для измерения оптической плотности.
- Измерьте absorbance (OD) микрофотографиями, по крайней мере 10 областей калибровки с параметрами известных поглощения в калибровки слайд или шаг таблетки с известными значениями ОД. В ImageJ Используйте анализ → мера меню или клавишами Ctrl + M для измерения выбранной области.
- Начало процедуры калибровки поглощения, перейдя в анализ → калибровка. Выберите функцию «Rodbard (NIH Image)». В левой колонке окна, которое открывается результаты серых уровня измерений от каждого шага калибровки слайд/шаг планшета в 4.1.1 уже присутствуют. Если нет, то скопируйте их из окна Результаты ImageJ. В правой колонке введите каждое соответствующее значение известных поглощения, напечатанной на сертификате, который вы получили с таблеткой калиброванные шаг. Тикать коробки «глобальные калибровка» и «Показать сюжет» и нажмите «OK».
- Для контроля качества, убедитесь, что это R2 Rodbard функции > 0.99. Если это < 0.99, проверить ли калибровки слайды были сфотографированы и правильно измерить и ли параметры известных поглощения были введены правильно.
- ImageJ теперь откалиброван до тех пор, пока вы закрыть программу (отсюда «Глобальные калибровка»). Для измерения оптической плотности калиброванный ImageJ сеанса всегда преобразует наблюдаемых поглощение означает значения между 0 и 1, где 0 и 1 являются асимптоты ноль и полное поглощение, соответственно.
- Cytospins, выберите > 100 одиночных камер в случайном порядке. Для разделов ткани выберите одно или несколько полей фиксированной длины и ширины во всех разделах.
- Проект растровых над микрофотографиями, для оказания помощи в беспристрастной ячейки выборки. В ImageJ проецирования изображения через плагины меню сетки → → сетку.
- В ImageJ эллиптической инструмент позволяет выбрать отдельные ячейки и использовать инструмент прямоугольник для выбора ткани регионов.
- Измерение поглощения и область выделенных ячеек или ткани регионов. Оптической плотности и области называются «Означает» и «Район» в ImageJ результаты таблицы, соответственно.
Примечание: Общее поглощение клетки или ткани региона (если вы выбрали несколько регионов ткани с различными размерами) равен сумме всех отдельный пиксель absorbances. Если ячейка образы x 1000 пикселей, затем общее поглощение дается на сумму 1000 absorbances и среднее поглощение дается общее поглощение/1000. Эта процедура также позволяет избежать распределения ошибок. - Определить среднее общее поглощение из > 30 клетки или ткани регионов от управления слайды, который содержит образец, который был разоблачен для управления среднего инкубации в отсутствие субстрата, но в присутствии кофакторов. Поглощения этот элемент управления используется для управления для окрашивания активность фермента неспецифической и поглощения артефактов, вызванных используется микроскопии слайды, монтаж среднего, крышка выскальзования или Микроскоп.
- Вычтите средний управления поглощения от всех измерений полного поглощения образцов, которые были подвержены средний инкубационный с такой же концентрации кофактора (но разные концентрации субстрата и/или ингибитора). Это дает исправленные общее поглощение клетки или ткани региона.
- Статистически Сравните средний исправленные всего absorbances, используя T-тест студента или односторонним теста ANOVA, в зависимости от вашего экспериментальный дизайн.
- Формазаны поглощения могут быть преобразованы в фермента активности (мкмоль преобразованы субстрата мл / мин) с использованием закон Lambert-пиво: c=A/(є×d), где c является концентрация Формазаны в среде реакции, является измерений оптической плотности в ImageJ после калибровки; Є – Коэффициент вымирания Формазаны (16.000 на 585 нм)8 и d является свет, путешествия расстояние, которая равна в среднем клетки толщина или номинальную толщина резки (6-10 мкм в этом протоколе).
Примечание: После высыхания, толщина среза ткани уменьшается ~ 50% от толщины резки номинальную, но это не отражено в расчет выше потому что толщина резки номинальную биологически наиболее актуальными. Средняя ячейка толщины и размеры области ячейки, которую фольгированных придерживаться микроскопии стеклянных скольжениях может определяться с помощью конфокальной микроскопии или микроскопия поля, для которого протоколы можно найти в других местах. 9 , 10
Representative Results
Несколько протоколов подготовить средний инкубационный указаны для расследования деятельности конкретного дегидрогеназы. Для каждого дегидрогеназа Растворите перечисленных реагентов в ПВА решения при сохранении температуре по крайней мере 37 ° C. Реагентов должен быть расторгнут в порядке, указанном в таблице, т.е. nitroBT сначала всегда растворяется и (m) PMS последний всегда растворяется. Каждый 5 мг nitroBT растворяется в 40 мкл микс (20 мкл этанол + 20 мкл диметилформамид). Все тома, на 1 мл раствора 18% ПВА, которое может использоваться для пятно ~ 2 разделах ткани или ~ 4 ячейки препаратов на стеклянных вставках. NitroBT, NAD+, NADP+, АДФ и субстрат решения следует включить свежие. NaN3, MgCl2 и (m) PMS решения могут храниться при температуре 4 ° C на один месяц. 18% ПВА растворяют в фосфат буфер может храниться при температуре 60 ° C в течение 2 недель. РН раствора ПВА 18% можно задать с помощью различных композиций 0,1 М калия дигидрогенфосфат (KH2PO4) и 0,1 М водорода динатрия фосфат (NA2HPO4) буферов. Показано инкубационных периодов обеспечивают хорошие отправные точки, но оптимальных инкубационных периодов зависит от вида, типа ткани и сохранению ткани. В общем клетки препаратов следует инкубировали дольше, чем разделов ткани для получения аналогичного уровня производства Формазаны.
Дегидрогеназа одичал типа isocitrate 1 и 2 (IDH1/2) катализировать преобразование isocitrate в альфа-кетоглютарата (αKG) с сопутствующей сокращения NADP+ до NADPH в цитоплазме и митохондрии, соответственно. Эти ферменты недавно привлекли интерес, потому что IDH1/2 мутации происходят в различные типы человеческого рака, включая рак первичного мозга (глиобластома) и колоректального рака и предлагают уникальную возможность продемонстрировать возможности метаболические сопоставления. IDH1 перегласовок отключить активность фермента одичал типа IDH1 и также побудить нео Ферментативная активность, что приводит к производству и последующее накопление oncometabolite D-2-hydroxyglutarate (D-2 HG),11 , которая является подробно обсуждаются в других местах. 12 метаболических сопоставления эксперименты показали, что NADP+-зависимой IDH1/2 деятельность была значительно ниже в колоректальные карциномы клетки с постучал в гетерозиготных IDH1 мутация чем в колоректальные карциномы клетки, которые были IDH1 одичал типа (рис. 1A). Эта разница была количественно оценена путем анализа изображений микрофотографиями монохроматического света (рис. 1B). 12
Еще один пример иллюстрирующий метаболических сопоставления экспериментов показано на Рисунок 2, который является изображение части криостата мозга мыши, который был впрыснут с клеток глиобластомы человека. IDH1/2 является наиболее важным поставщиком НАДФН в человеческий мозг, и его деятельность является upregulated в одичал тип IDH1/2 глиобластома, в то время как NADPH производственные мощности IDH1/2 намного ниже мозги грызунов. 11 Рисунок 2A показывает разницу между высокой NADP+-зависимой IDH1/2 активность клеток глиобластомы человека и низкой NADP+-зависимой IDH1/2 активность в мозге здоровой мыши. IDH1/2 деятельность количественно как производство NADPH мкмоль / мл ткани в минуту на рисунке 2B.
Ферментативной реакции IDH1/2 относительно проста, но Лактатдегидрогеназа (LDH) является более сложным ферментного комплекса. LDH преобразует обратимое преобразование от лактата пирувата с сопутствующей сокращения NAD+ NADH или наоборот. Наличие лактата и пирувата и состав ЛДГ ферментного комплекса диктует ли лактат главным образом преобразуется пирувата (которая является катализатором ЛДГ-B и дает NADH) или ли пируват главным образом преобразуется в лактат (который является катализируемой ЛДГ-A и потребляет NADH). 13 метаболических сопоставления эксперименты способны визуализировать активность ЛДГ-B реакции, но они являются «слепой» на активность ЛДГ-A реакции, потому что производство NADH не происходит, и как следствие nitroBT не сводится к Формазаны. Рисунок 3 показывает NAD+-зависит от активности ЛДГ (т.е. преобразование лактата в пирувата) в мозге человека разделы в отсутствие субстрата (Рисунок 3А), в присутствии высокой концентрации лактата (рисунок 3B ), в присутствии лактат 6 мм (рис. 3 c), так и в присутствии низкой концентрации лактата и пирувата (рис. 3D) более высокую концентрацию. Результаты этих экспериментов свидетельствуют о метаболических сопоставления адекватно отражает что NAD+-зависимых активность ЛДГ в разделах ткани зависит от наличия лактата и пирувата в реакции среды.
Рисунок 1 . NADP+-зависимой IDH1/2 активность клеток человека колоректального рака. (A) представитель монохроматического света микрофотографиями HCT116 человека колоректальный рак клеток после окрашивания для NADP+-зависимых активности IDH1/2 против 1-10 мм isocitrate и 0,8 мм NADP+. Масштаб баров = 50 µm. (B) количественную оценку поглощения синий Формазаны производится из nitroBT с NADP+-зависимой IDH1/2 деятельность на ячейку отображается с использованием монохроматического света в (A) и анализа изображений. Сокращения: IDH1Вт/Вт, isocitrate дегидрогеназа 1 одичал типа; IDH1WT/MUT, isocitrate дегидрогеназа 1 мутировали. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . NADP+-зависимой IDH1/2 деятельность человека глиобластома образцов. Представитель микрофотография (A) раздела мозга мыши, содержащего здоровой мыши мозга (h) и глиобластомы человека опухоли Ксенотрансплантат (t) после окрашивания для NADP+-зависимой IDH1/2 активности в присутствии 0,8 NADP мм+ и isocitrate 2 мм. Шкалы бар = 200 мкм (B) фермента деятельности количественной оценки областей мозга мыши (h) и глиобластомы человека Ксенотрансплантат (t) показано в () с использованием закон Lambert-пиво. Планки погрешностей представляют стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . NAD+-зависимых Лактатдегидрогеназа (LDH) активность образцов человеческого мозга. Представитель микрофотографиями последовательных секций образцов человеческого мозга после окрашивания для NAD+-зависимых активность ЛДГ (A) против контроля условий (в отсутствие субстрата и пирувата, 3 мм NAD+ только) (B) против 150 мм лактата в отсутствие пирувата (C) против 6 мм лактата в отсутствие пируват и (D) против 6 мм лактата в присутствии 18 мм пируват, ингибитор конкурентоспособной продукции лактата и пирувата реакции. Шкалы бар = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Фермента: | G6PDH | MD) | SDH | MDH | IDH1 | IDH2 | IDH3 | 6PGD | GDH |
| ПВА 18% в 100 мм фосфатного буфера | 1 мл; pH = 7,4 | 1 мл; pH = 7,4 | 1 мл; pH = 8.0 | 1 мл; pH = 7,4 | 1 мл; pH = 7,4 | 1 мл; pH = 7,4 | 1 мл; pH = 7,4 | 1 мл; pH = 8.0 | 1 мл; pH = 8.0 |
| 5 мм NitroBT | 5 мг/40 мкл микс | 5 мг/40 мкл микс | 5 мг/40 мкл микс | 5 мг/40 мкл микс | 5 мг/40 мкл микс | 5 мг/40 мкл микс | 5 мг/40 мкл микс | 5 мг/40 мкл микс | 5 мг/40 мкл микс |
| 5 мм НАН3 | 10 МКЛ | 10 МКЛ | 10 МКЛ | 10 МКЛ | 10 МКЛ | 10 МКЛ | 10 МКЛ | 10 МКЛ | |
| 5 мм MgCl2 | 10 МКЛ | 10 МКЛ | 10 МКЛ | 10 МКЛ | 10 МКЛ | 10 МКЛ | |||
| 3 мм NAD+ | 10 МКЛ | 10 МКЛ | 10 МКЛ | ||||||
| 0,8 мм NADP | 10 МКЛ | 10 МКЛ | 10 МКЛ | 10 МКЛ | 10 МКЛ | ||||
| 2 мм ADP | 10 МКЛ | ||||||||
| субстрат | 10 мм глюкозо-6-фосфат | Лактат 150 мм | 50 мм сукцината | яблочная кислота 100 мм | 2 мм isocitrate | 2 мм isocitrate | 2 мм isocitrate | 10 мм 6-фосфо galactonate | Глутаминовая кислота 10 мм |
| МПМ 0,32 мм | 10 МКЛ | 10 МКЛ | 10 МКЛ | 10 МКЛ | 10 МКЛ | ||||
| 0,2 мм PMS | 10 МКЛ | 10 МКЛ | 10 МКЛ | 10 МКЛ | |||||
| Длительность инкубации | 5 мин | 30 мин. | 60 мин | 60 мин | 30 мин. | 30 мин. | 30 мин. | 10 мин | 30 мин. |
Таблицы 1. Схематический обзор метаболических сопоставления протокола для дегидрогеназ. Аббревиатуры: ADP, аденозин дифосфат; (m) PMS (метокси) -5-methylphenazinium метил сульфат; nitroBT, nitro tetrazolium синий хлорид; G6PDH, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы; ЛДГ, лактатдегидрогеназа; SDH, сукцинатдегидрогеназы; MDH, малат дегидрогеназа; IDH, isocitrate дегидрогеназа; 6PGD, 6-phosphogluconate дегидрогеназа; GDH, глютамат дегидрогеназы.
Discussion
Исследование клеточного метаболизма в настоящее время переживает ренессанс потому что исследователи понимают теперь, что метаболические эффекты имеют решающее значение для патогенеза и лечения многих заболеваний. 1 Кроме того, метаболизм исследования способствовало увеличение доступности методов, которые обеспечивают это поле исследований с больше средств, чем когда-либо, включая масс-спектрометрии, радиоизотопный маркировки и спектрометрии ядерного магнитного резонанса. Метаболические сопоставление методика отнюдь не роман, но ее способность дать комплексной информации о деятельности ферментов в ситуации почти true природа делает этот метод более актуальным, чем когда-либо. 2
Кофакторы NAD+ и NADP+ встречаются во всех живых клетках, которые указывают, что дегидрогеназ возникли очень рано в процессе эволюции и играют ключевую роль в клеточный метаболизм. 14 , 15 в настоящее время, есть 523 фермента катализируемой реакции, которые классифицируются как дегидрогеназ и происходят во всех видов. 16 теоретически, деятельность всех различных дегидрогеназа реакций можно отдельно расследоваться настройки метаболических сопоставления протокола, описанных здесь. Каждый ферментативной реакции является уникальным с помощью субстрата и кофакторов, которые необходимы для своей деятельности. Таким образом деятельность каждого ферментативной реакции может быть определена метаболических сопоставления эксперимент с помощью адекватных субстрата и кофакторы в реакции среды. Однако некоторые изоформы ферментов отличаются в их субцеллюлярные локализации, например один изоформы катализирует реакцию в цитоплазме, тогда как другой изоформы функции в митохондриях. Ярким примером является IDH1 и IDH2, из которых первый цитоплазматических и последний митохондриальных и которые являются два различных белков, кодируемых два различных генов. 11 1-метокси-5-methylphenazinium methylsulfate (метокси PMS) и 5-methylphenazinium methylsulfate (PMS) может использоваться как переносчики электронов для этих экспериментов. Бывший не проходит митохондриальных мембран, последний делает. Таким образом расследования на митохондриальных ферментов (например IDH2) следует использовать PMS, в то время как исследования на цитозольной ферментов (например IDH1) следует использовать МП.
Как с много методов, вариации этого протокола, например с использованием различных видов соли tetrazolium, за исключением добавления PMS и азид натрия, используя водный монтажа средних и различной инкубации и полоскания раз, существуют и могут работать одинаково хорошо. Дегидрогеназ применение метаболической сопоставления с tetrazolium соли не ограничен. С небольшими изменениями к протоколу, он может также использоваться для оценки активности ферментов, которые действуют непосредственно вверх по течению от дегидрогеназа в метаболический путь. Мы уже описали этот принцип для фермента glutaminase,17 , в которой функционирует непосредственно вверх по течению от глутамата дегидрогеназа в пути glutaminolysis. 18 в теории, тот же принцип может применяться для других ферментов, которые прямо вниз или вверх по течению от дегидрогеназа например aconitase, которая находится непосредственно перед IDH2 и IDH3 в трикарбоновой кислоты (TCA) функция цикла. Еще один простой вариации концентраций, описанных в таблице 1 — путем инкубации средних флаконов с различных концентраций субстрата, кофактора или ингибитор. Это позволяет поколение доза активность кривых в зависимости от концентрации субстрата, кофактора или торможение.
Технически говоря, метаболические сопоставления эксперименты не облегчают беспристрастного наблюдения в situ ферментативной активности, потому что исследователи должны выбрать субстрат и кофакторы концентрации, которая может не отражать уровне субстрата и кофакторы которые являются настоящей в situ. Кроме того использование вязких 18%, ПВА в реакции среды служит для держать макромолекул нетронутыми, в месте и в конформации, но запрещает эффективного распространения низкого молекулярного веса реагентов посредством реакции. 3 , 5 таким образом, определяется ферментативной активности в эксперименты, описанные здесь, которые используют supraphysiological концентрации субстрата не отражает ситуацию в естественных условиях в концентрации данного субстрата, но подходят для внутри экспериментальное сравнение. Таким образом результаты экспериментов метаболических сопоставления является производственная мощность (максимальная активность) ферментативные реакции в контексте субстрата и кофакторы уровней, которые являются настоящей в situ. Кроме того использование различных концентраций субстрата и/или кофакторов и несколько образцов позволяет объективное сравнение максимальная производственная мощность (VМакс) и сходство (mK) фермент для субстрата/кофактора в ячейке препараты , тканей или тканей регионов. Эти параметры являются результатом сумме ферментных белков, столб-поступательные изменения и воздействие переполненных микроокружения на активность ферментов. Таким образом метаболические сопоставление по-прежнему лучше отражает активность фермента чем эксперименты, которые определить выражение протеина или очищенного фермента активность в пробирке.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
R.J.M. поддерживается AMC PhD стипендии. Это исследование было поддержано голландского общества рака (KWF Грант UVA 2014-6839). Авторы благодарят д-р A. Jonker за его помощь в написании протокола.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| D-Glucose 6-phosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | G7879 | |
| Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4) | Merck Millipore | 106559 | |
| di-Sodium succinate | Sigma-Aldrich | W327700 | |
| DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | I1252 | |
| D-Malic acid | Sigma-Aldrich | 2300 | |
| Glycerol Gelatin | Sigma-Aldrich | GG1 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| Lithium 6-phospho-D-galactonate | Sigma-Aldrich | 55962 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| methoxy-Phenazine methosulfate | Serva | 28966.01 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N0505 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | NADP-RO | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Phenazine methosulfate | Serva | 32030.01 | |
| Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed | Sigma-Aldrich | P1763 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck Millipore | 104873 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Bandpass filter | Edmund optics | https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/ | |
| Grey-step wedge | Stouffer Industries | http://www.stouffer.net/TransPage.htm |
References
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metab. 23 (1), 27-47 (2016).
- Van Noorden, C. J. Imaging enzymes at work: metabolic mapping by enzyme histochemistry. J Histochem Cytochem. 58 (6), 481-497 (2010).
- Mcmanus, L. M., Mitchell, R. N. Pathobiology of Human Disease. , Elsevier. 3760-3774 (2014).
- Chieco, P., Jonker, A., De Boer, B. A., Ruijter, J. M., Van Noorden, C. J. Image cytometry: protocols for 2D and 3D quantification in microscopic images. Prog Histochem Cytochem. 47 (4), 211-333 (2013).
- Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. Enzyme histochemistry : a laboratory manual of current methods. , Oxford University Press, Royal Microscopical Society. (1992).
- Van Noorden, C. J. F., Butcher, R. G. Histochemistry, theoretical and applied. Vol 3.: enzyme histochemistry. Stoward, P. J., Pearse, A. G. E. , Churchill Livingstone. 355-432 (1991).
- Van Noorden, C. J., Tas, J., Vogels, I. M. Cytophotometry of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual cells. Histochem J. 15 (6), 583-599 (1983).
- Butcher, R. G. The measurement in tissue sections of the two formazans derived from nitroblue tetrazolium in dehydrogenase reactions. Histochem J. 10 (6), 739-744 (1978).
- Matsumoto, B. Cell biological applications of confocal microscopy. , Elsevier. (2002).
- Errington, R. J., White, N. S. Measuring dynamic cell volume in situ by confocal microscopy. Methods Mol Biol. 122, 315-340 (1999).
- Molenaar, R. J., Radivoyevitch, T., Maciejewski, J. P., van Noorden, C. J., Bleeker, F. E. The driver and passenger effects of isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations in oncogenesis and survival prolongation. Biochim Biophys Acta. 1846 (2), 326-341 (2014).
- Molenaar, R. J., et al. Radioprotection of IDH1-Mutated Cancer Cells by the IDH1-Mutant Inhibitor AGI-5198. Cancer Res. 75 (22), 4790-4802 (2015).
- Khurshed, M., Molenaar, R. J., Lenting, K., Leenders, W. P., van Noorden, C. J. F. In silico gene expression analysis reveals glycolysis and acetate anaplerosis in IDH1 wild-type glioma and lactate and glutamate anaplerosis in IDH1-mutated glioma. Oncotarget. 8 (30), 49165-49177 (2017).
- Alberts, B. Molecular biology of the cell. , Sixth, Garland Science, Taylor and Francis Group. (2015).
- Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, G. J., Stryer, L. Biochemistry. , Eighth edition, W.HFreeman & Company, a Macmillan Education Imprint. (2015).
- Webb, E. C. International Union of Biochemistry and Molecular Biology. Enzyme nomenclature 1992 : recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes. , Published for the International Union of Biochemistry and Molecular Biology by Academic Press (1992).
- Botman, D., Tigchelaar, W., Van Noorden, C. J. Determination of Phosphate-activated Glutaminase Activity and Its Kinetics in Mouse Tissues using Metabolic Mapping (Quantitative Enzyme Histochemistry). J Histochem Cytochem. 62 (11), 813-826 (2014).
- van Lith, S. A., et al. Glutamate as chemotactic fuel for diffuse glioma cells: are they glutamate suckers? Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 66-74 (2014).
