Summary
Aquí, presentamos un protocolo que puede utilizarse para visualizar microscópicamente y cuantificar la actividad de Deshidrogenasas en las células y tejidos y su cinética, función y localización subcelular.
Abstract
Metabolismo celular alterado es una de muchas enfermedades, incluyendo cáncer, enfermedades cardiovasculares y la infección. Las unidades motoras metabólicas de las células son las enzimas y su actividad es regulada pesadamente en muchos niveles, incluyendo el transcripcional, estabilidad del mRNA, nivel traduccional, poste-de translación y funcional. Presente Reglamento complejo significa que ensayos cuantitativos o proyección de imagen convencionales, como cuantitativa mRNA experimentos, Western Blots e inmunohistoquímica, dan información incompleta con respecto a la última actividad de las enzimas, su función o su localización subcelular. Citoquímica enzimática cuantitativa e histoquímica (es decir, mapeo metabólico) muestran información detallada sobre en situ la actividad enzimática y su cinética, función y localización subcelular en una situación casi verdadero a la naturaleza.
Se describe un protocolo para detectar la actividad de Deshidrogenasas, que son las enzimas que llevan a cabo las reacciones redox para reducir cofactores FAD como quinona+ . Secciones de tejido y las células se incuban en un medio que es específico para la actividad enzimática de una deshidrogenasa. Posteriormente, la deshidrogenasa que es objeto de investigación realiza su actividad enzimática en su sitio subcelular. En una reacción química con el medio de reacción, esto en última instancia genera precipitado de color azul en el sitio de la actividad de la deshidrogenasa. La absorbancia de formazán por lo tanto es una medida directa de la actividad de la deshidrogenasa y puede ser cuantificada mediante el análisis de microscopía e imagen luz monocromático. El aspecto cuantitativo de este protocolo permite a los investigadores extraer conclusiones estadísticas de estos ensayos.
Además de los estudios observacionales, esta técnica puede utilizarse para estudios de inhibición de enzimas específicas. En este contexto, los estudios se benefician de las ventajas de la verdadero-a-naturaleza de mapeo metabólico, dando en situ los resultados que puede ser fisiológicamente más relevante que en vitro estudios de inhibición de la enzima. En total, mapeo metabólico es una técnica indispensable para el estudio de metabolismo a nivel celular o tejido. La técnica es fácil de adoptar, proporciona información metabólica profunda, integral e integrada y permite un análisis cuantitativo rápido.
Introduction
Un pilar esencial de la fisiología celular es el metabolismo. Metabolismo proporciona la energía necesaria para todos los procesos fisiológicos de las células, proporciona los bloques de edificio para biosíntesis macromolecular y regula la homeostasis celular con respecto a los productos de desecho, moléculas tóxicas y el desmontaje y reciclaje de componentes celulares innecesarios o disfuncionales. Las enzimas catalizan las reacciones químicas celulares vitales casi todos y por lo tanto las unidades motoras en la fisiología de las células. 1 , 2
La actividad de las enzimas es regulada firmemente en muchos niveles y por lo tanto la enzima cuantitativa histoquímica y citoquímica (también llamada mapeo metabólico) es el método preferido para el estudio de actividad enzimática in situ. A nivel transcripcional, la expresión del gen en ARNm está regulada. El efecto de la regulación de la transcripción puede ser determinado mediante ensayos de mRNA cuantitativos, tales como microarrays o secuencia de RNA directa o cualitativa análisis de mRNA, como la hibridación in situ que da la información en el celular (secundario) localización de las moléculas de mRNA. Esto permite apreciar las diferencias relativas en la actividad transcripcional entre las células. Sin embargo, la interpretación y validez de estos análisis de mRNA con respecto a la actividad metabólica es complicado porque la regulación se produce también a nivel de mRNA, en secuencia y la estabilidad de las moléculas de mRNA son editados después se transcribe de la DNA. Esta edición regula la traducción de la isoforma de la proteína y la cantidad de traducción de proteínas en los ribosomas. Además, el proceso de traducción de proteínas está controlado y en última instancia afecta la actividad y por lo tanto la expresión de la enzima. Los efectos combinados de los pasos reglamentarios mencionados pueden apreciarse mediante ensayos de expresión cuantitativa de la proteína, como el Western Blotting o microarrays lisado de proteínas de fase inversa o ensayos de expresión cualitativa de la proteína, tales como immunocytochemistry y la inmunohistoquímica, pero estas técnicas no incorporar efectos de regulación aguas abajo como modificación post-translacional de las proteínas y la regulación funcional de las enzimas en su microambiente llena de gente. Por otra parte, la expresión de una enzima mal puede correlacionar con su actividad, por lo que las mediciones de actividad de una enzima purificada en homogenados de tejido o célula o en soluciones diluidas son ampliamente utilizadas para estudios de actividad de la enzima. Sin embargo, estos experimentos no replicar la influencia de un citoplasma compartimentado atestado o un organelo en la actividad de una enzima. Además, todas las técnicas mencionadas determinan la cantidad o la localización de la expresión de mRNA o de la enzima, pero son incapaces de dar la información completa en ambos de estos aspectos de expresión de la enzima, por no hablar de la integración de este información con las determinaciones de actividad enzimática. 2 , 3 , 4
Asignación de metabólica permite la apreciación de todas las variables mencionadas que determinan la actividad de una enzima. Es más, mapeo metabólico es una forma de vida celular o tisular con células y tejidos que se mantienen intactos durante el análisis para generar una situación de casi verdadero a la naturaleza para generar datos de actividad de las enzimas. Produce imágenes que facilitan tanto la apreciación detallada de la ubicación de la actividad enzimática así como robusta cuantificación de la actividad enzimática dentro de un compartimiento de la célula o tejido. 3 , 4 los protocolos descritos aquí para mapas metabólicos de la actividad de Deshidrogenasas se basan en el manual de laboratorio de todos los métodos histoquímicos de enzima disponible, en los principios de histoquímica de la enzima cuantitativos,6 y5 Análisis de imagen de mapeo metabólico cuantitativa. 4
Deshidrogenasas son enzimas que llevan a cabo las reacciones redox para reducir canónicos cofactores tales como NAD++ de NADP y FAD a NADH, NADPH y FADH2, respectivamente. Las células intactas o secciones de tejido de criostato que químicamente no son fijos se incuban en un medio de reacción que contiene, entre otros reactivos, el sustrato y cofactores de una deshidrogenasa específica y una sal de tetrazolio. Posteriormente, eso dehydrogenase realiza su actividad catalítica y reduce, por ejemplo,+ de NADP a NADPH. Través de un portador de electrones, 2 moléculas de NADPH reducen 1 molécula de sal de tetrazolio incoloro y soluble en agua en la molécula 1 formazán azul de insoluble en agua que se precipita inmediatamente en el sitio de la deshidrogenasa. Por lo tanto, la absorbencia del precipitado precipitado es una medida directa de la actividad local de una deshidrogenasa y puede ser observada mediante microscopía o cuantificada mediante el análisis de microscopía e imagen luz monocromático. El aspecto cuantitativo de este protocolo permite a los investigadores extraer conclusiones estadísticas de estos ensayos. Además, esta cuantificación facilita la determinación de en situ parámetros cinéticos de la enzima como la actividad enzimática máxima (Vmax) y la afinidad de un sustrato para una enzima (Km). 3 , 4 , 5 , 6
Al planear un experimento de mapeo metabólico, es importante tener en cuenta que por experimento, se recomienda un máximo de 50 portaobjetos con preparados de células adherentes o secciones de tejido para minimizar retrasos durante la incubación para obtener constantes resultados. Es posible procesar más diapositivas o composiciones medio cuando estos pasos del Protocolo se llevan a cabo conjuntamente por más de un experimentador. Además, existe una cierta variabilidad entre experimentos. Por lo tanto, idénticos experimentos deben repetirse al menos 3 veces con cytospins de cada preparación de células o secciones de cada muestra de tejido y los controles adecuados deben incluirse en cada experimento. Siempre preparar un medio de incubación control en ausencia de sustrato, pero en presencia de cofactores a control para la tinción de actividad de enzimas no específicas. Los resultados más representativos se obtienen en experimentos donde las concentraciones de sustrato/cofactor diferentes se aplican a secciones de tejidos o preparaciones celulares de la misma muestra, para que el experimentador pueda realizar los análisis de enzima cinética utilizando curvas de dosis-actividad.
Protocol
Este protocolo sigue las pautas sobre el uso de material humano de la Junta de revisión de ética médica del centro médico académico.
1. preparación de células o de tejido
- Células
- Trypsinize las células de los platos de la cultura usando 1 mL de tripsina-EDTA 0.25% por 5 min a 37 ° C en una placa de Petri de 10 mm y traer las células en una suspensión de 37 ° C de 50.000-200.000 células/mL, dependiendo del tamaño de las células.
- Colocar 200 μL de la suspensión de células en portaobjetos de microscopía en embudos de cytospin Citocentrifuga 20 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Deje secar al aire los cytospins durante 24 h a temperatura ambiente. Esto no afecta la actividad de la deshidrogenasa. 5
- Secciones de tejido
- Extraer tejido de pacientes o animales según permisos de éticas. 10 mm3 de tejido es suficiente para experimentos múltiples.
- Poner las piezas de tejido en frascos plásticos pequeños ventilado 2 mL y snap-congelar los frascos con el trozo de tejido en nitrógeno líquido.
- Almacenar los frascos que contienen piezas de tejido en el ° C −80 hasta la transformación posterior.
- Utilice un medio gelatinoso que se denomina temperatura de corte óptima (OCT) para montar la muestra de tejido en un mandril que se congela hasta-20 ° C a-25 ° C rápidamente, para que el agua no puede formar cristales.
- Uso de un criostato para corte y primero recortar el bloque hasta el nivel deseado (idealmente la mitad del ancho de un microscopio de vidrio diapositiva, por ejemplo 5 x 5 mm).
- Al seccionamiento, usar cepillos y una placa estabilizadora para impedir que las secciones que se encrespa hacia arriba.
- Cortar muestras de tejido en secciones de 6-10 μm de grosor a una velocidad lenta pero constante (1 s por sección). Cuando una sección se corta correctamente, queda plano sobre la cuchilla de micrótomo debajo de la placa estabilizadora.
- Levante 1-3 secciones en un portaobjetos microscópico y almacenar a −80 ° C hasta su uso. El número de cortes depende del tamaño de la muestra de tejido y el grosor deseado de las secciones.
2. enzima Histo/citoquímica de Deshidrogenasas solubles
- Preparación de Buffer de reacción.
- Preparar 100 mL de tampón fosfato de pH correcta (ver tabla 1; cada enzima tiene un pH óptimo en el cual su actividad es el más alto). Por ejemplo, mezclar soluciones de 0,1 M KH2PO4 (ácido) y 0.1 M NA2HPO4 (básico) hasta un tampón con el pH correcto.
- Pesar 18 g de alcohol de polivinilo (PVA) en el tampón fosfato bajo una campana de humos como el PVA es polvo y tóxicos.
- El 18% w/v PVA en el tampón de fosfato a 100 ° C se disuelven calentando la solución au bain marie (poner la botella de cristal en agua hirviendo) y revolviendo hasta que el PVA se haya disuelto completamente. La solución será entonces, transparente, con pequeñas burbujas de aire que son causadas por la agitación. Por lo general requiere ~ 15 min para el PVA disolver.
Nota: El 18% w/v PVA en tampón fosfato es viscoso y puede ser transferido a tubos de tampón de reacción de 15 mL con una pipeta de amplia. Almacenamiento a corto plazo 18% w/v PVA en tampón fosfato debe ocurrir a ≥ 40 ° C y almacenamiento a largo plazo (hasta 2 semanas) a ≥ 60 ° C. 250 μl de 18% w/v PVA en tampón fosfato es típicamente necesario para una preparación de cytospin, mientras que 500 μl se requiere para una sección de tejido.
- El 18% w/v PVA en el tampón de fosfato a 100 ° C se disuelven calentando la solución au bain marie (poner la botella de cristal en agua hirviendo) y revolviendo hasta que el PVA se haya disuelto completamente. La solución será entonces, transparente, con pequeñas burbujas de aire que son causadas por la agitación. Por lo general requiere ~ 15 min para el PVA disolver.
- Preparar solución de tetrazolio sal (nitroBT). Por cada 1 mL de medio de incubación, 40 μl de solución de nitroBT es necesario, que consta de 5 mg de nitroBT (un polvo amarillo) disuelto en una mezcla de 20 μl dimetilformamida (DMF) y 20 μl de etanol, que será una solución transparente amarillo clara.
Nota: Debido a la estabilidad del nitroBT es el más bajo de todos los reactivos necesarios, se recomienda preparar la solución nitroBT último y disolver primero la nitroBT en el medio de reacción.- Disolver nitroBT en DMF y etanol calentando en un frasco de vidrio durante un corto período de tiempo (~ 10 s) utilizando un mechero Bunsen. Agitar el frasco durante el calentamiento y no deje el frasco mucho tiempo en la llama para evitar la evaporación.
- Hacer 10% solución nitroBT extra para permitir la evaporación del DMF y etanol durante el proceso de disolución.
- Escudo de los electrones portadores phenazine methosulfate (PMS) o (1-metoxi)-phenazine methosulfate (mPMS) e incubación los medios de comunicación que contiene m(PMS) de luz directa envolviendo papel de aluminio alrededor de la cubeta de almacenamiento de vidrio.
- Preparar soluciones de reactivos según la tabla 1 mediante la disolución en agua destilada H2O. Algunos reactivos perecen rápidamente, para prepararlos como poco antes de la experiencia posible. No soluciones reactivo en hielo o a 4 ° C hasta su uso.
- Preparar medios de incubación como se muestra en la tabla 1 y homogeneizar la solución después de cada paso por agitación suave. Removiendo continuamente y mantener la espátula debajo de la superficie del medio de incubación removiendo para evitar la generación de burbujas de aire en el medio de incubación.
- Aplicación del medio de incubación para las secciones de tejido
- Microscopía de pre-warm diapositivas con cytospins o secciones de tejido Unidas a 37 ° C en una cámara de incubación immunohistochemistry para 15 minutos sumergen la parte inferior de la cámara de incubación de la inmunohistoquímica con agua tibia para mantener una temperatura constante en el incubadora.
- Con cuidado romper o sierra de Pipetas Pasteur en la transición desde el estrecho a la parte ancha. Pipetas Pasteur regulares son demasiado angostas para aspirar el medio de incubación viscoso, así que este paso es necesario para hacer Pasteur pipetas suficientemente amplio como para la aspiración del medio de incubación.
- Aplicar 250-500 μl del medio de incubación adecuados a cada preparación de la célula o tejido sección en portaobjetos de microscopía con la parte ancha de una pipeta Pasteur.
- Utilice la punta de pipeta para estirar uniformemente el medio de incubación. No pequeñas burbujas de aire en el medio de incubación, porque estos flotarán a la superficie y no interferirá con la reacción enzimática en la sección de preparación o tejido de células sobre el portaobjetos de microscopía.
- Incubar las secciones de tejido sobre el portaobjetos de microscopía en una incubadora de 37 ° C (por ejemplo, una incubadora de cultivo de tejidos) o preparaciones celulares para una duración previamente especificada, dependiendo de la cinética de la enzima y su expresión en una preparación particular de la célula o tejido (tabla 1). Mantenga la tapa de la cámara de incubación immunohistochemistry cerrada para mantener un ambiente húmedo para evitar el buffer de reacción de la desecación.
- Lavar los portaobjetos de microscopía
- Tap off medio de incubación excesiva de un tejido.
- Mecánicamente aclara el medio de incubación de los portaobjetos de microscopía en 60 ° C de tampón fosfato, pH 5.3, moviendo arriba y abajo los portaobjetos de microscopía en el búfer. Esto detiene la reacción enzimática.
- Lave los portaobjetos de microscopía por mantenerlos en 60 ° C de tampón fosfato, pH 5.3 por 20 min.
- Mecánicamente, lave los portaobjetos de microscopía en agua de 60 ° C.
- Lave los portaobjetos de microscopía por mantenerlos en agua de 60 ° C por 20 min.
- Deje que el agua y toboganes enfríen mezclando lentamente temperatura agua del grifo con agua del grifo de 60 ° C durante 1 minuto.
- Realizar un lavado mecánico final paso en agua a temperatura ambiente agua destilada.
- Adjuntar los Cytospins manchada o secciones de tejido en portaobjetos de microscopía
- Caliente previamente una diapositiva más caliente a 50-60 ° C.
- Cuidadosamente la parte posterior de los portaobjetos de microscopía utilizando una toalla de papel en seco y coloque en la diapositiva calentador para secar la parte superior de la diapositiva del microscopio.
- Cuando estén secas las diapositivas, incluir preparaciones celulares o secciones de tejido en portaobjetos de microscopía con cubreobjetos y medio de montaje de jalea de glicerol.
- Guardar las preparaciones celulares o portaobjetos de microscopía de secciones de tejido en la oscuridad en un refrigerador a 4 ° C o proceder inmediatamente con la adquisición de la imagen.
3. adquisición de la imagen
- Grabar imágenes con una cámara de CCD monocroma científica con suficiente rango dinámico (por lo menos 8 bits pero preferiblemente 10 bits o 12 bits), fijadas de ganancia y una respuesta lineal.
- Seleccione un objetivo apropiado (20 X X-63 de cytospins) y 10-63 X para las secciones de tejido.
- Reducir el resplandor reduciendo el diafragma de campo para que sea ligeramente más grande que el campo de visión.
- Uso de luz monocromática mediante la aplicación de un filtro de inferencia de amplia banda nm 10 cerca de la longitud de onda de isobestic de precipitado precipitado7 en combinación con un infrarrojo de bloqueo del filtro (véase Tabla de materiales).
Nota: La absorbancia máxima isobestic de nitroBT es a 585 nm. - Optimizar la iluminación para asegurar que se utiliza toda la gama nivel gris de la cámara (es decir, establecer el nivel de iluminación iluminación máxima es lograr sin exponer demasiado al grabar un portaobjetos de microscopio en blanco).
- Calibrar los valores medidos los niveles de grises a absorbancia conocida (o densidad óptica [OD]). Para ello, captura imágenes en escala de grises de al menos 10 diferentes pasos de una diapositiva de calibración o tableta con valores conocidos de OD (ver paso 4.1.1), ya sea comercialmente disponible (ver la Tabla de materiales) o medir una tableta de paso cuña de grises por encargo por un densitophotometer y usar los resultados para calibrar medidos gris valores de absorbancia conocida.
- Captura de fotomicrografías de células o secciones de tejido de interés.
4. Análisis de la imagen
- Antes del análisis de imagen, calibrar el software ImageJ para medidas de absorbancia.
- Medir la absorbancia (OD) de fotomicrografías de al menos 10 áreas de calibración con parámetros absorbancia conocida en la tableta de diapositiva o paso de calibración con valores conocidos de OD. En ImageJ, utilice el menú de analizar → medida o combinación de teclas Ctrl + M para medir un área seleccionada.
- Iniciar el procedimiento de calibración de absorbancia por ir a Analyze → calibración. Seleccione la función "Rodbard (NIH Image)". En la columna izquierda de la ventana que se abre, ya están presentes los resultados de mediciones de nivel gris de cada paso de la tableta de diapositiva/paso de calibración realizado en 4.1.1. Si no, copiar desde la pantalla de resultados de ImageJ. En la columna derecha, escriba cada valor correspondiente de absorbancia conocida como impreso en el certificado que recibió con la tableta de paso calibradas. Marque las casillas "calibración Global" y "Mostrar terreno" y pulse "OK".
- Control de calidad, asegúrese de que el R2 de la función de Rodbard > 0,99. Si es < 0.99, compruebe si las diapositivas de calibración fueron fotografiadas y medidas correctamente y si los parámetros absorbancia conocida fueron ingresados correctamente.
- ImageJ está ahora calibrado hasta que cierre el programa (por lo tanto "Calibración Global"). Para las mediciones de absorbancia, una sesión de ImageJ calibrada siempre convierte que la absorbancia observada significa valores entre 0 y 1, donde 0 y 1 son asíntotas de cero y completa absorción, respectivamente.
- Para cytospins, seleccione > 100 células de forma aleatoria. Para las secciones de tejido, seleccione uno o más campos de interés de una longitud fija y anchura en todas las secciones.
- Proyecto de una trama sobre microfotografías para ayudar en la selección imparcial de la célula. En ImageJ, proyecto una cuadrícula sobre una imagen a través del menú de Plugins → analizar → red.
- En ImageJ, utilice la herramienta elíptica para seleccionar celdas individuales y utilice la herramienta Rectángulo para seleccionar regiones de tejido.
- Medir la absorbancia y el área de las celdas seleccionadas o regiones de tejido. La densidad óptica y la zona se llaman "Significa" y "Zona" en el ImageJ resultados de hoja de cálculo, respectivamente.
Nota: La absorbancia total de una región tisular o celular (si ha seleccionado varias regiones de tejido de diferentes tamaños) es igual a la suma de todos absorbancia píxeles separados. Si una célula es reflejada por 1000 píxeles, entonces la absorbancia total está dada por la suma de 1000 absorbancia y la absorbancia media está dada por la absorbancia total/1000. Este procedimiento también evita errores de distribución. - Determinar la absorbancia total media de > 30 células o regiones de tejido de las diapositivas del control, que contiene una muestra que se expuso para controlar el medio de incubación en la ausencia de sustrato, pero en presencia de cofactores. Esta absorbancia de control es control para tinción de actividad de enzima inespecífica y artefactos de absorción inducida por las diapositivas usadas microscopia, montaje medio, cubreobjetos o microscopio.
- Restar la absorbancia del medio del control de todas las medidas de absorbancia total de muestras que fueron expuestas al medio de incubación con la misma concentración de cofactor (pero diferentes concentraciones de sustrato o inhibidor). De este modo la absorbancia corregida total de una región de la célula o tejido.
- Comparar estadísticamente las absorbancias promedio de total corregidas utilizando la prueba T o prueba ANOVA unidireccional, dependiendo de su diseño experimental.
- Absorbencia del precipitado se puede convertir en actividad de enzima (sustrato μmol convertido por mL por min) utilizando la ley de Lambert-Beer: c=A/(є×d), donde c es la concentración del precipitado en el medio de reacción, A es la absorbancia medida en ImageJ después de la calibración; Є es el coeficiente de extinción de formazán (16.000, a 585 nm)8 y d es la luz que viaja a distancia, que es igual a la célula promedio grueso o espesor de corte de sección nominal (6-10 μm en este protocolo).
Nota: Después de secar, el espesor de la sección de tejido disminuye 50% el espesor de corte nominal de la sección, pero esto no se refleja en el cálculo por encima porque el espesor de corte nominal de la sección es biológicamente más relevantes. La célula promedio espesor y dimensiones de la esfera de preparates adherido al portaobjetos de microscopía celular pueden ser determinados mediante microscopía confocal o microscopía de amplio campo, para que los protocolos se pueden encontrar en otros lugares. 9 , 10
Representative Results
Se muestran varios protocolos para preparar el medio de incubación para investigar la actividad de una deshidrogenasa particular. Para cada deshidrogenasa, disolver los reactivos enumerados en la solución PVA manteniendo una temperatura de menos de 37 ° C. Deben disolver los reactivos en el orden indicado en la tabla, es decir, nitroBT siempre se disuelve primero y (m) PMS se disuelve siempre última. Cada 5 mg de nitroBT se disuelve en 40 μl mezclar (20 μl etanol + 20 μl dimetilformamida). Todos los volúmenes están por 1 mL de solución PVA 18%, que se puede utilizar para manchar ~ 2 secciones de tejidos o preparaciones de ~ 4 celulares en portaobjetos de vidrio. NitroBT, NAD+, NADP+, soluciones ADP y sustrato deben hacerse recién. NaN3, MgCl2 y (m) PMS soluciones pueden almacenarse a 4 ° C durante un mes. 18% PVA disuelto en fosfato buffer puede almacenarse a 60 ° C durante 2 semanas. El pH de la solución PVA 18% puede configurarse con diferentes composiciones de dihidrógenofosfato de potasio de 0,1 M (KH2PO4) los búferes de 0.1 M disodio hidrógeno fosfato (NA2HPO4). Los períodos de incubación indicado proporcionan buenos puntos de partida, pero los períodos de incubación óptima dependen de la especie, el tipo de tejido y la preservación del tejido. En general, preparaciones celulares deben ser incubadas ya que las secciones de tejido para obtener un nivel similar de la producción de formazán.
Tipo salvaje Isocitrato deshidrogenasa 1 y 2 (IDH1/2) catalizan la conversión del isocitrato en α-cetoglutarato (αKG) con reducción concomitante de la+ de NADP a NADPH en el citoplasma y las mitocondrias, respectivamente. Estas enzimas han despertado recientemente interés porque IDH1/2 mutaciones ocurren en varios tipos de cáncer, incluyendo cáncer primario del cerebro (glioblastoma) y el cáncer colorrectal y ofrecen una oportunidad única para demostrar las posibilidades de Mapeo metabólico. Mutaciones de IDH1 desactivar la actividad de la enzima de tipo salvaje de IDH1 y también inducir una actividad neo-enzimático que conduce a la producción y la acumulación subsiguiente de la oncometabolite D-2-hydroxyglutarate (D-2 HG),11 que es discutido en otras partes en detalle. 12 mapeo metabólicas experimentos demostraron eso NADP+-dependiente IDH1/2 actividad fue significativamente menor en las células del carcinoma colorrectal con una golpeado en IDH1 mutación heterozigótica que en células de carcinoma colorrectal que fueron IDH1 tipo salvaje (figura 1A). Esta diferencia se cuantificó por análisis de imagen de microfotografías de luz monocromáticas (figura 1B). 12
Otro ejemplo ilustrativo de los experimentos de mapeo metabólico se muestra en la figura 2, que es una imagen de una sección de criostato de cerebro de ratón que fueron inyectado con células de glioblastoma humano. IDH1/2 es el más importante proveedor de NADPH en cerebro humano y su actividad es upregulated en glioblastoma de IDH1/2 de tipo salvaje, mientras que la capacidad de producción de NADPH de IDH1/2 es mucho menor en los cerebros de los roedores. 11 Figura 2A muestra la diferencia entre la alta NADP+-dependiente IDH1/2 actividad en células de glioblastoma humano y el NADP baja+-dependiente IDH1/2 actividad en cerebro de ratón sano. Actividad de IDH1/2 se cuantifica como la producción de NADPH μmol / mL de tejido por minuto en la figura 2B.
La reacción enzimática de IDH1/2 es relativamente sencilla, pero el lactato deshidrogenasa (LDH) es una enzima más complicada complejo. LDH convierte la conversión reversible de lactato a piruvato con la concomitante reducción de NAD+ a NADH o viceversa. La disponibilidad de lactato y piruvato y la composición de la enzima LDH complejo dicta si lactato es sobre todo convertirse en piruvato (que es catalizada por la LDH-B y produce NADH) o si piruvato se convierte principalmente para el lactato (que es catalizada por la LDH-A y consume NADH). Experimentos de mapeo metabólico 13 son capaces de visualizar la actividad de la reacción de la LDH-B, pero son "ciegos" a la actividad de la reacción de la LDH-A porque no ocurre producción de NADH y como consecuencia de ello nitroBT no se reduce a formazán. La figura 3 muestra el NAD+-dependiente de actividad LDH (es decir, la conversión de lactato a piruvato) en cerebro humano secciones en ausencia de sustrato (Figura 3A), en presencia de una alta concentración de lactato (figura 3B ), en presencia de lactato 6 mM (figura 3) y en presencia de una baja concentración de lactato y una concentración superior de piruvato (figura 3D). Los resultados de estos experimentos ilustran metabólica mapeo adecuadamente capta que el NAD+-dependiente de actividad de la LDH en secciones del tejido depende de la disponibilidad de lactato y piruvato en el medio de reacción.
Figura 1 . +De NADP-dependiente IDH1/2 actividad de las células del carcinoma colorrectal humano. (A) representante monocromático luz fotomicrografías de células de carcinoma colorrectal humano HCT116 después de la tinción para el NADP+-actividad dependiente de IDH1/2 contra 1-10 mM isocitrato y 0,8 mM NADP+. Barras de escala = 50 μm. (B) cuantificación de la absorbancia del formazán azul producida a partir de nitroBT por NADP+-actividad dependiente de IDH1/2 por la célula aparece con el uso de luz monocromática en (A) y análisis de imagen. Siglas: IDH1WT/WT, Isocitrato deshidrogenasa 1 tipo salvaje; IDH1WT/MUT, Isocitrato deshidrogenasa 1 mutado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . +De NADP-dependiente IDH1/2 actividad de las muestras de glioblastoma humano. (A) representante microfotografía de una sección del cerebro del ratón que contiene el cerebro de ratón sano (h) y un xenoinjerto tumoral de glioblastoma humano (t) después de la tinción para el NADP+-dependiente IDH1/2 actividad en presencia de 0.8 NADP+ de mM y 2 mM isocitrato. Barra de escala = 200 μm (B) cuantificación de actividad de enzima de áreas del cerebro de ratón (h) y xenoinjerto de glioblastoma humano (t) se muestra en (A) utilizando la ley de Lambert-Beer. Barras de error representan desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . +De NAD-dependiente lactato deshidrogenasa (LDH) actividad de muestras de cerebro humano. Microfotografías representativas de secciones seriadas de las muestras de cerebro humano después de la tinción para NAD+-dependiente de actividad de la LDH (A) contra condiciones de control (en el sustrato de la ausencia y del piruvato, 3 mM NAD+ sólo) (B) contra 150 mM lactato en ausencia de piruvato (C) contra 6 mM lactato en ausencia de piruvato y (D) contra 6 mM lactato en presencia de piruvato de 18 mM, el inhibidor competitivo producto de la reacción de lactato a piruvato. Barra de escala = 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Enzima: | G6PDH | LDH | SDH | MDH | IDH1 | IDH2 | IDH3 | 6PGD | GDH |
| PVA 18% en 100 mM de tampón fosfato | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 8.0 | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 7.4 | 1 mL; pH = 8.0 | 1 mL; pH = 8.0 |
| 5 mM NitroBT | 5 mg/40 μl mezclar | 5 mg/40 μl mezclar | 5 mg/40 μl mezclar | 5 mg/40 μl mezclar | 5 mg/40 μl mezclar | 5 mg/40 μl mezclar | 5 mg/40 μl mezclar | 5 mg/40 μl mezclar | 5 mg/40 μl mezclar |
| 5 mM NaN3 | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | |
| 5 mM MgCl2 | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | |||
| 3 mM NAD+ | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | ||||||
| 0,8 mM NADP | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | ||||
| 2 mM de ADP | 10 ΜL | ||||||||
| sustrato | 10 mM glucosa-6-fosfato | lactato de 150 mM | succinato de 50 mM | ácido málico de 100 mM | 2 mM isocitrato | 2 mM isocitrato | 2 mM isocitrato | 10 mM 6-fosfo-galactonate | ácido glutámico 10 mM |
| mPMS 0,32 mM | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | ||||
| 0,2 mM PMS | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | 10 ΜL | |||||
| Duración de la incubación | 5 min | 30 min | 60 min | 60 min | 30 min | 30 min | 30 min | 10 min | 30 min |
Tabla 1. Descripción esquemática del protocolo mapeo metabólico de Deshidrogenasas. Abreviaturas: ADP, difosfato de adenosina; (m) PMS (metoxi) -5-methylphenazinium sulfato de metilo; nitroBT, nitro azul de tetrazolio cloruro; G6PDH, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa; LDH, lactato deshidrogenasa; Sado, Succinato deshidrogenasa; MDH, malato deshidrogenasa; IDH, Isocitrato deshidrogenasa; 6PGD, 6-fosfogluconato deshidrogenasa; GDH, la glutamato deshidrogenasa.
Discussion
Investigación sobre el metabolismo celular está experimentando actualmente un renacimiento porque los investigadores se dan cuenta ahora que los efectos metabólicos son cruciales para la patogenesia y el tratamiento de muchas enfermedades. 1 además, investigación metabólica es ayudado por una mayor disponibilidad de técnicas que proporcionan este campo de investigación con más herramientas que nunca, incluyendo espectrometría de masas, etiquetado radioisotópica y espectrometría de resonancia magnética nuclear. Mapeo metabólico no es una técnica nueva, pero su capacidad para dar información integrada en la actividad de las enzimas en una situación casi verdadero a la naturaleza hace esta técnica más relevante que nunca. 2
Los cofactores NAD+ y NADP+ se encuentran en todas las células vivas, que indica que Deshidrogenasas se presentaron muy temprano durante la evolución y tienen un papel clave en el metabolismo celular. 14 , 15 existen 523 reacciones enzima-catalizadas que se clasifican como Deshidrogenasas y ocurren a través de todas las especies. 16 en teoría, la actividad de todas las reacciones de diferentes deshidrogenasa puede ser por separado investigada afinando el protocolo mapeo metabólico descrito aquí. Cada reacción enzimática es el único mediante el sustrato y cofactores necesarios para su actividad. Por lo tanto, la actividad de cada reacción enzimática puede ser determinada mediante un experimento de mapeo metabólico con el adecuado sustrato y cofactores en el medio de reacción. Sin embargo, algunas isoformas de la enzima difieren en su localización subcelular, por ejemplo, una isoforma cataliza una reacción en el citoplasma mientras que la otra isoforma funciona en la mitocondria. Un ejemplo notable es IDH1 y IDH2, de los cuales el primero es citoplásmico y mitocondrial es el último y que son dos diferentes proteínas codificadas por dos genes diferentes. 11 methylsulfate de 1-metoxi-5-methylphenazinium (metoxi-PMS) y 5-methylphenazinium methylsulfate (SPM) pueden tanto utilizar como portadores de electrones para estos experimentos. El primero no pasa las membranas mitocondriales, el último no. Por lo tanto, las investigaciones sobre las enzimas mitocondriales (e.g. IDH2) deben usar PMS Considerando que las investigaciones sobre las enzimas citosólicas (e.g. IDH1) deben utilizar mPMS.
Como con muchas técnicas, variaciones de este protocolo, como el uso de diferentes tipos de sales de tetrazolio, excepto la adición de PMS y la azida de sodio, utilizando un medio de montaje acuoso y variando la incubación y lavado veces, y pueden funcionar igualmente bien. La aplicación de mapeo metabólico con sales de tetrazolio no se limita a Deshidrogenasas. Con pequeñas modificaciones en el protocolo, también puede ser utilizado para la evaluación de la actividad de enzimas que funcionan directamente aguas arriba de una deshidrogenasa en una vía metabólica. Anteriormente hemos descrito este principio para la enzima glutaminasa,17 que funciona directamente aguas arriba de la glutamato deshidrogenasa de la vía glutaminolysis. 18 en teoría, el mismo principio puede aplicarse a otras enzimas eso ciclo de la función directamente aguas abajo o aguas arriba de una deshidrogenasa por ejemplo aconitase, que se encuentra directamente arriba del IDH2 y IDH3 en el ácido tricarboxílico (TCA). Otra simple variación de las concentraciones descritas en la tabla 1 es por medio de hacer frascos medio incubación con diferentes concentraciones de sustrato, cofactor o inhibidor. Esto permite la generación de curvas de actividad de la dosis en función de la concentración de sustrato, cofactor o inhibición.
Técnicamente hablando, metabólicas experimentos de mapeo no facilitan observaciones imparciales de en situ la actividad enzimática, ya que los investigadores tienen que elegir una concentración de sustrato y cofactor que puede no reflejar los niveles de sustrato y cofactor están presentes en situ. Además, el uso de la viscosa 18% PVA en el medio de reacción sirve para mantener intacta, macromoléculas y en conformación, pero prohíbe la difusión eficaz de bajo peso molecular reactivos a través del medio de reacción. 3 , 5 por lo tanto, las actividades de determinada enzima en los experimentos descritos aquí que las concentraciones de sustrato supraphysiological no reflejan la situación en vivo a una concentración de sustrato determinada pero son adecuados para comparaciones de la experimentales. Así, el resultado de los experimentos de mapeo metabólico es la capacidad de producción (máxima actividad) de una reacción enzimática en el contexto de los niveles de sustrato y cofactor que está presente in situ. Por otra parte, el uso de múltiples muestras y varias concentraciones de sustrato y cofactores permite comparación imparcial de la capacidad de producción máxima (Vmax) y la afinidad (Km) de una enzima por un sustrato/cofactor en preparaciones celulares , tejidos o regiones de tejido. Estos parámetros son el resultado de la suma de la expresión de la proteína enzimática, modificaciones poste-de translación y el efecto de un microambiente concurrido en la actividad de las enzimas. Por lo tanto, mapeo metabólico es todavía un mejor reflejo de la actividad enzimática que experimentos que determinan la expresión de la proteína o purificado enzimático actividad en vitro.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
R.J.M. es apoyado por una beca de doctorado de AMC. Esta investigación fue apoyada por la sociedad holandesa del cáncer (subvención a KWF UVA 2014-6839). Los autores agradecen a Dr. A. Jonker por su ayuda con la redacción del protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| D-Glucose 6-phosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | G7879 | |
| Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4) | Merck Millipore | 106559 | |
| di-Sodium succinate | Sigma-Aldrich | W327700 | |
| DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | I1252 | |
| D-Malic acid | Sigma-Aldrich | 2300 | |
| Glycerol Gelatin | Sigma-Aldrich | GG1 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| Lithium 6-phospho-D-galactonate | Sigma-Aldrich | 55962 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| methoxy-Phenazine methosulfate | Serva | 28966.01 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N0505 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | NADP-RO | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Phenazine methosulfate | Serva | 32030.01 | |
| Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed | Sigma-Aldrich | P1763 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck Millipore | 104873 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| Bandpass filter | Edmund optics | https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/ | |
| Grey-step wedge | Stouffer Industries | http://www.stouffer.net/TransPage.htm |
References
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