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Biology

16S rRNA 増幅配列による糞便の微生物評価ガイドのプロトコル

doi: 10.3791/56845 Published: March 19, 2018

Summary

本稿では、高スループット 16S rRNA 増幅シーケンスの詳細な標準化されたプロトコルについて説明します。プロトコルには、データ分析を通じて糞便サンプル コレクションから統合、制服を着た、実現可能な安価なプロトコルが導入されています。このプロトコルには、厳格な基準とサンプルの多数の分析といくつかのコントロールができます。

Abstract

人間の腸内マイクロバイ損傷から細胞を保護する上で、エネルギーと栄養分の処理に、免疫を促進する上で中心的な役割を果たしています。健全な細菌叢の組成 (dysbiosis) と考えられるものからの逸脱は、病的な状態につながる重要な機能を損なう可能性があります。最近、継続的な研究努力は微生物組成と人間の健康と病気の間の関連付けのキャラクタリゼーション向かっていた。

高スループット シーケンス技術の進歩は、腸内細菌の組成の特性を有効にします。16S rRNA 増幅配列には散弾銃の配列が含まれます。16S rRNA 増幅シーケンスを使用して、ショットガン ・ シークエンシング法遺伝子の予言と機能アノテーションに関する追加情報を提供しますが、分類学的組成をプロファイルします。16S rRNA 遺伝子の可変領域のターゲット シーケンスのメソッドを使用しての利点は、ショットガン ・ シークエンシング法と比較して大幅に低コストです。16S rRNA 遺伝子配列の差異は、異なる分類群の個々 のサンプル内の定量化微生物指紋として使用されます。

主要な国際的な取り組みは 16S rRNA 増幅配列のための標準を入隊しています。ただし、いくつかの研究は、バッチの効果によって引き起こされる変化の一般的な原因を報告します。サンプル コレクションの制服を着たプロトコルは、この効果を最小限に抑えるため、処理、およびシーケンスを実装する必要があります。このプロトコルは、糞便のサンプル コレクションからデータ解析に広く使用されているプロトコルの統合を提案します。このプロトコルには、同時処理および V4 領域の PCR の拡大と共に、糞便の多数の DNA 抽出できるよう、柱のないダイレクト PCR アプローチが含まれています。さらに、プロトコル解析パイプラインをについて説明し、QIIME (QIIME 2 バージョン 2017.7.0 と DADA2) の最新バージョンを使用してスクリプトを提供します。このステップバイ ステップのプロトコルは、堅牢な生殖、使いやすい、詳細な方法で 16S rRNA 増幅シーケンスの使用を開始するのに興味のある方をガイドする対象です。

Introduction

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力を注いではマイクロバイ多様性と違いと健康および病理学的条件における個体間の類似点をキャプチャの別の側面としての豊かさを理解するためになされました。年齢2,3、地理学4、ライフ スタイル5,6、および病気5腸内細菌の叢の組成に関連付けられていることが示されたが、多くの条件や人口がまだ完全特徴とします。最近、治療への応用7,8,9マイクロバイを変更できることが報告されています。したがって、いろいろな生理的条件と微生物の組成の関係に追加の洞察力は、潜在的な将来の変更の最適化への第一歩です。

伝統的な微生物培養法低利回り10,11, に制限は、細菌がいずれかのバイナリの状態として概念化、腸内に存在しない、または。ハイスループット DNA ベースのシーケンスは、微生物生態学、微生物のコミュニティのすべてのメンバーのキャプチャを有効にするをもたらしました。ただし、シーケンスは、長さと質に残る正確な分類割り当て12への重要な障壁を読み取る。さらに、高スループットに基づいて実験の測定は非生物学的または非科学的な変数13によって影響を受ける、バッチの効果に苦しむことがあります。近年、アメリカの腸プロジェクト、アメリカ合衆国 (米国) 人間マイクロバイ プロジェクト、およびイギリス (英国) の MetaHIT プロジェクトを含む人間のマイクロバイを勉強するいくつかのプログラムを設けています。これらの取り組みは、彼らのアプローチに一貫性の欠如のため容易に対等ではないデータの膨大な量を生成しています。さまざまな国際人間マイクロバイ コンソーシアム、国際人間マイクロバイ基準プロジェクトと米国商務省標準技術局 (NIST) などの国際プロジェクト14 これらの問題の一部に対処しようとしています。、信頼性の高い生殖の結果の達成を可能にする必要がありますマイクロバイ測定のための基準を開発しました。ここで説明は 16S rRNA 高スループット シーケンス (seq 16S) 開始データ分析を通じて糞便サンプルのコレクションからのいくつかの広く使用されている方法15,16の統合されたプロトコルです。プロトコル記述列無料 PCR アプローチ、植物 DNA16の直接抽出用に設計された、高品質で比較的短時間でサンプル増幅 DNA 糞便の多数の同時処理を有効にする対象のシーケンスの共通プラットホームを微生物可変 V4 領域のシーケンス。このプロトコルは、堅牢な生殖、使いやすい、詳細な方法で 16S rRNA 増幅シーケンスの使用を開始するのに興味がある重要なコントロールを使用して科学者のガイドを目指しています。ガイドと詳細なステップバイ ステップ プロトコルを持つバッチ効果を最小限に抑えることができるし、ラボ間比較可能なシーケンス結果がこのようになります。

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Protocol

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シバ ローカル研究倫理委員会の研究のための倫理的な承認が付与され、関連するガイドラインと規制に従ってすべての方法を行った。プロトコルは、患者の同意の例外を受け取ったローカル倫理審査委員会から使用された糞便材料から、すでに提出された微生物学コア以外の年齢、個人の患者情報なし臨床精密検査の一部として性別、および微生物の結果。書かれた、健常者からインフォームド コンセントを得たし、治験審査委員会承認研究。これらのサンプルのいくつかは、以前の分析1で既に含まれています。

1. 検体の取扱い

  1. 収集、約 5 mm2スミア (大体鉛筆の消しゴムのサイズ) テストで滅菌綿棒で新鮮な糞便サンプルから管 (材料の表を参照してください)。-80 ° C 24 h 内で糞便を含むすべての綿棒を格納します。糞便の綿棒は、さらなる処理までそこに残ることができます。

2. DNA の抽出

  1. 室温で抽出し、希釈のソリューションを解凍 (材料の表を参照してください)。
  2. 転送空 2 mL コレクションに糞便の綿棒チューブ (材料の表を参照してください)。最小交差汚染と管閉鎖を有効にするきれいなはさみを使用して切断することによって綿棒スティック サイズを調整します。糞便の綿棒とミックスする渦を含む各コレクション チューブに抽出液の 250 μ L を追加します。
  3. 沸騰水浴中で 10 分間のサンプルを加熱 (95-100° C)。各サンプルと混合する渦に 250 μ L の希釈液を追加します。
  4. DNA を抽出し、4 ° C で綿棒を含む 2 mL チューブに格納します。

3. PCR およびライブラリの準備

3.1 と 3.2 の手順、テンプレートと私アンプリコン無料環境クリーンで PCR のワークステーションで作業します。

  1. プライマー (表 1) によると、バーコードのラベルを付けます。50 μ M 濃度、-20 ° C でストアに二重蒸留水 (DDW) で各プライマーを希釈します。
  2. PCR の反作用の 96 ウェル プレートを使用します。各プレートは、別のインデックスのプライマーでタグ付けされて 32 の異なるサンプルを含めることができます。前方のプライマーおよび室温 32 逆プライマーを解凍し、5 μ M に希釈します。
  3. (各ウェルの最終的なボリュームは 20 μ l になります) 100 の反応の 5 μ M 前方プライマー、1 mL 2 X PCR マスター ミックス、および 400 μ L DDW の 100 μ L を混合することによって PCR 反応混合物を準備します。この PCR ミックスの 15 μ L を各ウェル (96 ウェルの合計) に入れてください。3 さまざまな坑井 (トリプリケートで 32 の異なるプライマーは、96 ウェルの合計を与える) に各 5 μ M の逆インデックス付きプライマーの 1 μ L を追加します。
  4. 前 PCR 専用ゾーンのテンプレート、無料、フリー、私アンプリコン、クリーン ベンチを意味反応混合物に各抽出した DNA サンプルの 4 μ L を追加 (各抽出された DNA サンプルを 3 通で増幅-96 ウェル プレートあたり 32 サンプル)。
  5. 次の設定で PCR を実行: 初期変性 94 ° C、3 分。変性 94 ° C で 1 分、55 ° C 1 分と 1 分の 72 ° C で拡張子で焼鈍 35 サイクルが続く10 分のための 72 ° C で最終的な拡張子。
  6. ポスト PCR 専用ゾーンとして定義されます、別のベンチの単一の容積の管 (サンプルあたり 60 μ L) に各帳票の PCR の反作用を組み合わせます。
  7. PCR 産物の品質を評価、エチジウム ブロマイド染色 1% の agarose のゲルの各組み合わせ PCR 反応の 4 μ L を実行します。260 の UV 波長 [nm、正 amplicons 375-425 bp の期待されるバンド サイズで表示されます。以降の手順でこれらの産物のみが表示されます。
    注: 各サンプル帳票、意味 3 別の PCR の反作用で各サンプルを増幅することで増幅されています。スケール アップしません。

4. ライブラリの定量化とクリーニング

  1. すべての PCR のサンプルのモル濃度プールを得るために二本鎖 DNA によってそれぞれの増幅を定量化 (dsDNA 定量化試薬) 蛍光核酸染色 (材料の表を参照)、大規模な同時定量に適してサンプルの量。
    注: 私アンプリコンのサイズの範囲は曖昧なため、ナノグラムの実際の量はモル濃度を読み込む使用します。
  2. 単一生殖不能の管に各サンプルの組み合わせ 500 ng。ミックスする渦。
  3. エチジウム ブロマイド染色 1% アガロースゲルでプールされたライブラリの 200 μ L を実行します。製造元の指示に従ってゲル抽出キットを使用してゲルから 375-425 bp バンドを抽出 (材料表参照) 80 μ L DDW でプールされたライブラリを溶出し、。
    注: プールされたライブラリは、宿主の DNA から非特異的増幅製品を減らすために選択したサイズをする必要があります。
  4. 製造元の指示に従ってキットの検出感度が高い dsDNA を使用して最終的なライブラリ濃度の測定 (材料の表を参照してください)。製造元の指示に従って DNA ライブラリの高感度分離分析キットを使用してライブラリの正確なサイズを測定 (材料の表を参照してください)。

5. シーケンス

  1. 20% コントロール ライブラリの追加 19 にプールされたライブラリを希釈 (材料の表を参照)、シーケンス コンピューター プロトコルに従って。
  2. シーケンス、使用カスタム デザイン無料 (表 1参照) V4 増幅プライマーでプライマーを参照してください。
  3. 追加のバーコードを読み取り使用 3 カスタム設計されたシーケンス プライマー (表 1参照) や、メーカーの仕様によると、各方向の長さで基地の 175 のペアエンド リードを生成します。
  4. シークエンシング マシンを実行し、製造元のプロトコルに従って FASTQ ファイルを取得します。

6 データ処理

  1. 一緒にステッチし、QIIME 2 2017.7.0 バージョン17で実装されたデータのキュレーション パイプラインで重複するペアエンド FASTQ ファイルを処理します。サンプルの特定のバーコードによると読み取りをデマルチプレックスします。
  2. 品質管理とシーケンスのバリアント (SVs) 検出するため DADA218を使用します。2 以上の予想されるエラーと破棄を読み取り最後 5' から 3' 末端から 13 基地と 15 で読み取りが切り捨てられます。識別し、コンセンサスを用いたキメラを削除-キメラが個別にサンプルで検出され、シーケンス サンプルの十分な割合でキメラが見つかりましたが削除されます。
  3. 合うナイーブベイズ識別器を用いた SVs 分類学的分類を実行し、2013 年 8 月に訓練 99% のアイデンティティ Greengenes データベース6175 の長い読み取りと設定フォワード/リバースのプライマー。
  4. 2,146 の系列の深さにすべてのサンプルを希薄にします。
  5. サンプル サイズの影響を避けるために、希薄サンプル (サンプル多様性19,20) の間 β 多様性測定のため加重 UniFrac を使用します。
  6. 主座標分析 (PCoA) を実行するのに結果の距離行列を使用します。
    注: データ処理のスクリプトおよびマッピング ファイル (補足資料 12) の補足資料として提供されます。

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Representative Results

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プロトコルの模式図を図 1に示します。

前向きが疑われる伝染性下痢症入院患者から便のサンプルを収集しました。これらのサンプルは、された前述12 月と 2015 年 5 月間のシェバ医療センターで臨床微生物学研究室に送信されました。便のサンプルを受けた臨床微生物学研究室で実行される従来の微生物学的文化と並行して広範な高スループット 16S seq。また、健康成人の糞便の比較されました。

この分析の焦点は、データ、および代表的な QIIME217から得られた出力結果表示の品質管理に関するでした。当初、6 否定的なコントロールのサンプル シーケンス成果の品質管理を含む検討した: i) PCR テンプレートなし、ii) 抽出と希釈溶液に清潔で滅菌綿棒で PCR および iii) 混合抽出と希釈の PCRソリューション。すべての否定的な制御サンプルが ≤118 合計読み込み (平均 29 シーケンス)、マイコ プラズマ分類群、その他のすべての試料を分析した中から主に総平均を示した表 2ショー読み取り 10622.57 (±1211.34 標準エラー) のないマイコ プラズマを読む主なサンプルの品質制御を渡されました。

それぞれが同じ便のサンプルに由来が異なるリバース バーコード プライマーと別のライブラリの準備を経て 16 サンプルはポジティブ コントロールとして使用されました。これらの 16 のサンプルは、臨床微生物学研究室、および否定的な文化を持つものとして報告された 8 によって報告された赤痢菌サルモネラカンピロバクターの肯定的な文化と 8 を含まれています。門レベルで領域プロットを図 2に示します。同じ便のサンプルに由来が異なるリバース バーコード プライマーと別のライブラリの準備を経てサンプルを示して非常に一貫性のある相対的な豊かさ (マントルピース門レベルの分類の相対的な豊富の重複の間テスト値シミュレーション p 値 = 1 × 10-04 9999 複製に基づく)。

入力データの次元を削減、主座標分析 (PCoA) は、サンプルの分離と類似性を視覚的に探索する UniFrac マトリックスに使用されました。図 3 aで、同じ元便のサンプルから起源を持つが、異なるライブラリの準備を経てシーケンスのサンプルは同じ着色されます。確かに、それらは比較的 PCoA のプロットに密接に位置する (重複 PC1 PC2 間マントルピース テスト値シミュレートされた p 値 = 1e 04 9999 複製に基づく)。さらに、本研究のサンプル間の加重平均の unifrac ベータ多様性距離、0.706、2 つの重複の間の平均距離は 0.235 (Wilcoxon の順位和は p 値をテスト 10-11x 4.205 を =)。カンピロバクターサルモネラ赤痢菌の enteropathogens の肯定的な文化をだったサンプルが大幅に異なる PC1 値を示した興味深いことに、(Wilcoxon の順位和は p 値をテスト = 0.011) 試料と比較して培養結果を負します。図 3 bは、同じ PCoA プロットを示していますが、今のサンプルはプロテオ バクテリアの相対的な豊かさによって彩られます。高プロテオ バクテリアの豊富なサンプルが大幅に異なる PC1 値 (スピアマン相関 r =-0.533, p 値 = 0.000975)。これらの結果は、入院患者がプロテオ バクテリア門1からイチイの深遠な増加をあるこのデータの以前の分析と一致しています。ここで我々 は、PC1 はプロテオ バクテリアの豊富な文化陽性検体の健全なサンプルと共に、他の側に主クラスタ リング PC1 軸と文化否定的なサンプルの 1 つの側面に大抵クラスタ リングと相関していることを示した。

Figure 1
図 1: 微生物個体に糞便からフローチャート1)サンプル処理: 左、糞便は滅菌綿棒チューブで収集されます。右、2 ml チューブ、およびストレージの閉鎖を有効にするのには切断して綿棒の棒のサイズが調整されます。2) DNA の抽出: 直接 PCR 列無料アプローチによる DNA を抽出します。3)ライブラリの準備: 左、4 μ L の DNA を抽出し、フォワード/リバース-インデックス プライマーで増幅されます。各逆プライマーには、12 の基本バーコードが含まれています。各サンプルは 3 通で増幅されます。96 ウェル プレートには、32 の異なるバーコードが含まれています。右、1 つのボリュームの管に各バーコード帳票を組み合わせます。96 ウェル プレートには、96 の異なるバーコードが含まれています。4)ライブラリの定量化: amplicons 検体のスクリーニング上部パネルが 1% アガロースゲルのエチジウム ブロマイド染色で検出されました。下のパネルは、単一のライブラリ プールに各サンプルから 500 ng 私アンプリコンの等モル濃度に到達する肯定的な産物の定量化。5)ライブラリ浄化: 上部パネル、プールされたライブラリはサイズ選択の精製抽出したゲル。下のパネル、ライブラリの正確なサイズと濃度を測定します。6)シーケンス: プールされたライブラリの高スループット シーケンス。7) 16S rRNA 増幅微生物生態学のバイオ情報パイプラインによってシーケンス データを分析します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 同じ便のサンプルから起源を持つが、異なるライブラリの準備を経てサンプル間の一貫性のある相対的な豊かさ。示されているように、サンプルあたり門レベルの分類の相対的な豊かさが表示されます。異なる逆バーコード プライマーと 3 健常者のそれぞれが別のライブラリの準備 (重複 1 と 2) を行った疑いのある感染性の下痢で入院患者から得られた 16 糞便に対して相対的な豊かさを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 系統発生の多様性が同じ便のサンプルから起源を持つが、異なるライブラリの準備を経てサンプルの一貫した結果を表示します。入力データの次元を削減する主座標分析 (PCoA) は、サンプル分離と類似性を視覚的に探索する UniFrac マトリックスに使用されました。2 つのサンプル間の距離は、そのマイクロバイ組成の違いを表します。(A) 加重 UniFrac PCoA のプロットします。各ポイントは、単一のシーケンスされたサンプルを表します。同じ色同じ元便のサンプルからサンプルに。正方形、三角形1、および別のシーケンス実行1 から健康な成人の負の文化と入院患者が入院患者臨床微生物学1によって報告された肯定的な便培養からサンプルが付きます円でいっぱいでマークされます。今、(B) と同じ PCoA は、サンプルはプロテオ バクテリアの彼らの相対的な豊かさに着色されたとおり。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

プライマー名 プライマー シーケンス プライマー説明
前方のプライマー AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC - TATGGTAATT - GT の-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA 5' アダプター シーケンス - プライマー パッドを転送 - 転送プライマー リンカー - 前方のプライマー
逆にインデックス プライマー CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT - 次 - AGTCAGTCAG - CC - GACTACHVGGGTWTCTAAT 逆に 3' アダプター シーケンス - ゴレイ バーコード - 逆プライマー パッド - 逆プライマー リンカー - 逆プライマーの補完
読み取り 1 配列のプライマー TATGGTAATT - GT の - GTGCCAGCMGCCGCGGTAA プライマー パッドを転送 - 転送プライマー リンカー - 前方のプライマー
読み取り 2 配列のプライマー AGTCAGTCAG - CC - GGACTACHVGGGTWTCTAAT 逆プライマー パッド - 逆プライマー リンカー - 逆プライマー
インデックス シーケンス入門 ATTAGAWACCCBDGTAGTCC - ゴールデン グローブ - CTGACTGACT 逆プライマー パッドの逆プライマー - 逆プライマー リンカーの逆の補数 - 逆の補数の逆の補数

表 1: プライマー リスト。

サンプル 読み取りポスト数
初期の品質管理
QIIME
抽出と希釈溶液-1 にきれいな綿棒に PCR 118
抽出と希釈溶液-2 にきれいな綿棒に PCR 39
PCR テンプレート-1 なし 0
PCR テンプレート-2 なし 0
抽出と希釈ソリューション ミックス - 1 に PCR 16
抽出と希釈ソリューション ミックス - 2 に PCR 0
サンプル (平均 ± 標準誤差) 10622.57 ± 1211.34

テーブル 2: 否定的なコントロール、および糞便の読み取りの数。

補足材料 1: データ処理スクリプトこのファイルをダウンロードするここをクリックしてください

補足材料 2: マッピング ファイルこのファイルをダウンロードするここをクリックしてください

補足材料 3: プライマー スキームこのファイルをダウンロードするここをクリックしてください

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Discussion

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16S rRNA 増幅とメタゲノム ショットガン ・ シークエンシング法は、臨床微生物学アプリケーション21,-2223で人気を得ています。これらのテクニック、人為的・非人為的分類群、病原性菌の能力をより正確にモデルの感染を識別するために相対的な豊かさについてのデータを提供することをキャプチャする能力を向上に有利であります。指紋の24を。マイクロバイ研究分野の進歩は、様々 なアプローチに一貫性の欠如のため容易に対等ではないデータの膨大な量を生成しています。近年、いくつかのコンソーシアムは、これらの問題のいくつかに対処しようとしています。このプロトコルは次地球マイクロバイ プロジェクト (EMP) と同様のライブラリの準備です。ただし、追加、解析パイプラインを通じて糞便サンプルからの DNA 抽出の詳細なステップバイ ステップ プロトコルです。

以前は、糞便健常者以外入院と入院患者が疑われる伝染性の下痢と伝統的な文化の結果からの微生物の組成パターンを特徴付ける 16S rRNA 配列を使用されています。その解析の結果は、入院患者ではあるプロテオ バクテリア門1からイチイの深遠な増加を示した。ここで説明は 16S rRNA 遺伝子増幅配列植物 DNA16の抽出は元々 直接の PCR 列無料のアプローチを使用して広く使用されている手法の統合されたプロトコルです。このアプローチを効率的かつ高スループット 16S rRNA シーケンスに適したサンプルの数が多いから 16S rRNA 遺伝子の V4 の可変領域を対象と質の良い増幅 DNA ライブラリをすぐに抽出します。

これは、DNA ベースのシーケンスのメソッドは、好気性生物そして嫌気性微生物群集の個々 の糞便サンプルで現在のデータを取得します。プロトコルは、初期に設計された15 16S rRNA 遺伝子の V4 地域に対してプライマーを採用しました。重要なは、反転増幅プライマーは、各レーンの15まで 2,167 異なるサンプルのプールをサポートする 12 の基本バーコード シーケンスを含めます。転送増幅プライマーには (表 1および補足材料 3) シーケンス プラットフォーム25ペアエンド シーケンスをサポートするアダプター地域の 9 つの余分な基地が含まれます。このアプローチを有効に処理するライブラリは、10622.57 ± 1211.34 (平均 ± 標準誤差) 読み取りサンプル 1 〜 30 ドルの費用でサンプルごとの実行している深さ 1 車線でシーケンス処理された 250 の糞便で構成されます。

品質管理を確保するため次の否定的なコントロールの使用をおすすめします。i)、ii の DNA のテンプレートなし PCR) きれいな生殖不能の綿棒および iii から抽出した DNA の PCR) に PCR 混合抽出と希釈のソリューションです。ポジティブ コントロールとして、同じ便のサンプルから始まりましたが、以前の実行から異なる逆バーコード プライマーとサンプル別のライブラリの準備を経て内部品質管理するサンプルなどをお勧めします。注記のうち、使用するその他の省略可能なポジティブ コントロール、NIST によって提供されるそれらのマイクロバイ測定規格です。平均読み取りマイナス コントロール対応、実際糞便 (表 1) と比較すると著しく低いマイコ プラズマ種から主にで構成されていた。我々 はさらに同じ糞便由来のそれぞれが別のライブラリの準備 (図 3) を経てサンプルを使用して得られた結果を配列の整合性を示した。この結果はまた、統合された手法を使用する場合はクロスコンタミネーション サンプル間を確認します。

このプロトコルでは多数のサンプルの分析に統合された制服を着た、実現可能なプロトコルを紹介します。このプロトコルは、重要なコントロールを使用してのデータ解析、糞便のコレクションから堅牢な生殖、使いやすい、安価な詳細な方法で 16S rRNA 増幅シーケンスの使用を開始するのに興味がある科学者のガイドを目指しています。この標準化された詳細なガイドのプロトコルを使用してと、バッチの効果を最小限に抑える可能性があります別のラボ間比較可能なシーケンス結果を許可します。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この作品は、(許可番号 41/11) - コア ・ プログラム、大腸炎の組織 (ECCO) とイスラエル科学財団 (グラント第 908/15) ヨーロッパのクローンの部分で支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primers Integrated DNA Technologies (IDT)
Extraction solution Sigma-Aldrich E7526
Dilution solution Sigma-Aldrich D5688
Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit KAPABIOSYSTEMS KK2601 PCR Master mix
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kit Invitrogen P7589 dsDNA quantify reagent
MinElute Gel extraction kit Qiagen 28606
Agarose Amresco 0710-250G
Ultra Pure Water Dnase and Rnase Free Biological Industries 01-866-1A
Qubit dsDNA HS assay kit Molecular probes Q32854 dsDNA detecting kit
High Sensitivity D1000 Agilent Technologies Screen Tape 5067-5582 separation and analysis
Screen Tape Assay Agilent Technologies Reagents 5067-5583 for DNA libraries
PhiX Control v3 Illumina 15017666 control library
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) Illumina MS-102-2003
Ethidium Bromide Amresco E406-10mL-TAM
2 mL collection tubes SARSTEDT 72.695.400 Safe Seal collection tubes
Plastic stick swab in PP test tube STERILE INTERIOR 23117
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
PCR Machine Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler
Sequncing Machine Illumina Miseq
PCR workstation Biosan UV-cleaner
scissors
vortexer Scientific Industries Vortex-Genie 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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16S rRNA 増幅配列による糞便の微生物評価ガイドのプロトコル
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Di Segni, A., Braun, T., BenShoshan, M., Farage Barhom, S., Glick Saar, E., Cesarkas, K., Squires, J. E., Keller, N., Haberman, Y. Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing. J. Vis. Exp. (133), e56845, doi:10.3791/56845 (2018).More

Di Segni, A., Braun, T., BenShoshan, M., Farage Barhom, S., Glick Saar, E., Cesarkas, K., Squires, J. E., Keller, N., Haberman, Y. Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing. J. Vis. Exp. (133), e56845, doi:10.3791/56845 (2018).

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