Summary
ويصف هذه المخطوطة بروتوكول موحد مفصلة لتسلسل الرنا الريباسي amplicon الفائق 16S. ويدخل البروتوكول بروتوكولا المتكاملة ويرتدون الزي العسكري ومجدية وغير مكلفة بدءاً من جمع عينات البراز من خلال تحليل البيانات. ويتيح هذا البروتوكول تحليل عدد كبير من العينات مع المعايير الصارمة والعديد من عناصر التحكم.
Abstract
ميكروبيومي المعوية البشرية تلعب دوراً مركزياً في حماية الخلايا من الضرر، وفي تجهيز الطاقة والمواد الغذائية، وفي تعزيز الحصانة. خروج ما يعتبر تكوين صحي الحجمية (ديسبيوسيس) قد تنال من الوظائف الحيوية مما يؤدي إلى ظروف مرضية. تم توجيه جهود البحوث الحديثة والجارية نحو توصيف الرابطات بين تكوين الجراثيم وصحة الإنسان والمرض.
التقدم في تكنولوجيا التسلسل الفائق تمكين خصائص تكوين القناة الهضمية الجرثومية. وتشمل هذه الأساليب تسلسل الرنا الريباسي amplicon 16S وتسلسل بندقية. يستخدم تسلسل الرنا الريباسي amplicon 16S التشكيل الجانبي التكوين تصنيفية، بينما التسلسل بندقية يوفر معلومات إضافية حول التنبؤات الجينات والشرح الوظيفي. هو ميزة في استخدام أسلوب تسلسل مستهدفة من منطقة متغير مورثة الرنا الريباسي 16S تكلفة أقل بكثير مقارنة بتسلسل بندقية. اختلاف تسلسل الجين الرنا الريباسي 16S تستخدم كبصمات الأصابع الميكروبية لتعريف وتحديد كمية الأصناف المختلفة داخل نموذج فردية.
جندت الجهود الدولية الرئيسية المعايير لتسلسل الرنا الريباسي amplicon 16S. ومع ذلك، العديد من الدراسات تقرير مصدر مشترك للتباينات الناجمة عن تأثير دفعة. لتقليل هذا التأثير، يرتدون الزي العسكري بروتوكولات لجمع العينات، المعالجة، وتسلسل يجب أن تنفذ. ويقترح هذا البروتوكول دمج البروتوكولات المستخدمة على نطاق واسع بدءاً من جمع عينات البراز لتحليل البيانات. ويشمل هذا البروتوكول نهج مباشر-بكر خالية من الأعمدة، التي تمكن من معالجة متزامنة واستخراج الحمض النووي لعدد كبير من عينات البراز، جنبا إلى جنب مع [بكر] تضخيم المنطقة V4. وبالإضافة إلى ذلك، يصف خط الأنابيب تحليل البروتوكول ويوفر برنامج نصي باستخدام أحدث إصدار من قييمي (قييمي 2 النسخة 2017.7.0 و DADA2). ويهدف هذا البروتوكول خطوة بخطوة لتوجيه الراغبين في بدء استخدام تسلسل الرنا الريباسي amplicon 16S بطريقة قوية، والإنجاب، وسهلة الاستخدام، ومفصلة.
Introduction
كما بذلت جهود مركزة لتحسين فهم التنوع ميكروبيومي والوفرة، كجانب آخر من التقاط الاختلاف والتشابه بين الأفراد في ظروف صحية ومرضية. 2،سن3والجغرافيا4، نمط الحياة5،6، والمرض5 عرضت أن تكون مقترنة بتكوين ميكروبيومي القناة الهضمية، ولكن العديد من الشروط والسكان لم تماما وتتميز. مؤخرا قد أفيد أنه يمكن تعديل ميكروبيومي للتطبيقات العلاجية7،،من89. ولذلك، أفكاراً إضافية في العلاقة بين مختلف الظروف الفسيولوجية وتكوين الجراثيم هو الخطوة الأولى نحو الاستغلال الأمثل للتعديلات المستقبلية المحتملة.
الأساليب التقليدية الثقافة الميكروبية محدودة بسبب انخفاض حجم الغلة10،11، وتصور كدولة ثنائية فيها بكتيريا أما الموجودة في القناة الهضمية أو لا. تسلسل الحمض النووي القائم الفائق ثورة الإيكولوجيا الميكروبية، تمكن القبض على جميع أعضاء المجتمع الميكروبية. ومع ذلك، قراءة تسلسل طول ونوعية ما زالت حواجز كبيرة أمام تصنيف دقيق التعيين12. وعلاوة على ذلك، قد تعاني الفائق استناداً إلى تجارب من آثار دفعة، حيث تتأثر القياسات بالمتغيرات غير البيولوجية أو غير العلمية13. في السنوات الأخيرة، وضعت عدة برامج لدراسة ميكروبيومي البشري، بما في ذلك المشروع "الأمريكي القناة الهضمية"، وهذا المشروع ميكروبيومي البشرية في "الولايات المتحدة" (الولايات المتحدة)، ومشروع ميتاهيت "المملكة المتحدة" (المملكة المتحدة). وقد ولدت هذه المبادرات كميات هائلة من البيانات التي لا يمكن مقارنتها بسهولة بسبب الافتقار إلى الاتساق في النهج التي تتبعها. حاولت مجموعة متنوعة من مشاريع دولية مثل الاتحاد الدولي ميكروبيومي البشرية، والمشروع "المعايير الدولية ميكروبيومي البشرية"، والمعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا (NIST) لمعالجة بعض هذه القضايا14 ، ووضعت معايير لقياسات ميكروبيومي التي ينبغي أن تمكن من تحقيق النتائج الإنجابية يمكن الاعتماد عليها. الموصوفة هنا بروتوكول متكامل عن الأساليب المستخدمة على نطاق واسع عدة15،16 ل 16S الرنا الريباسي الفائق التسلسل (16-seq) بدءاً من جمع عينات البراز من خلال تحليل البيانات. البروتوكول يصف نهج بكر خالية من الأعمدة، صممت في الأصل لاستخراج مباشرة من النبات الحمض الخلوي الصبغي16، تمكين المعالجة متزامنة من إعداد كبيرة من البراز العينات في فترة زمنية قصيرة نسبيا ذات جودة عالية تضخيم الحمض النووي لاستهداف ترتيب المنطقة V4 المتغير الميكروبية على منصة تسلسل مشتركة. ويهدف هذا البروتوكول إلى توجيه العلماء المهتمين في بدء استخدام تسلسل الرنا الريباسي amplicon 16S بطريقة قوية، والإنجاب، وسهلة الاستخدام، ومفصلة، باستخدام عناصر هامة. وجود بروتوكول المصحوبة بمرشدين ومفصلة خطوة بخطوة يمكن تقليل تأثير دفعة وهكذا سوف تسمح نتائج التسلسل أكثر قابلية للمقارنة بين مختبرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
منحت الموافقة الأخلاقية للدراسة من "اللجنة المحلية لأخلاقيات البحوث شيبا" وأجريت جميع الأساليب وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة والأنظمة. الواردة البروتوكول باستثناء موافقة مريض من "مجلس المراجعة الأخلاقية" المحلية، منذ المواد البرازية التي استخدمت كانت قدمت بالفعل إلى قلب الأحياء الدقيقة كجزء من workup السريرية ودون معلومات المريض شخصية عدا العمر، بين الجنسين، والنتائج الميكروبية. كتب، كان الحصول على الموافقة المستنيرة من المتطوعين صحية ووافق "المجلس الاستعراض المؤسسي" الدراسة. بعض من تلك العينات قد أدرجت بالفعل في تحليل سابق1.
1-نموذج معالجة
- جمع حوالي 5 مم2 لطاخة (حجم ممحاة قلم الرصاص تقريبا) من عينة البراز الطازج مع مسحه معقمة في اختبار أنبوب (انظر الجدول للمواد). تخزين جميع مسحات تحتوي على عينات البراز في-80 درجة مئوية خلال 24 ساعة. مسحات البراز يمكن أن يبقى هناك حتى مزيد من المعالجة.
2. استخراج الحمض النووي
- ذوبان الجليد استخراج وتمييع الحلول في درجة حرارة الغرفة (انظر الجدول للمواد).
- نقل أنبوب مسحه البراز إلى مجموعة فارغة 2 مل (انظر الجدول للمواد). ضبط حجم عصا مسحه بقطع من استخدام مقصات نظيفة لتمكين إغلاق أنبوب مع التلوث عبر الحد الأدنى. إضافة 250 ميكروليتر من استخراج الحل لكل أنبوبة جمع تتضمن مسحه البراز ودوامه لمزيج.
- الحرارة العينات لمدة 10 دقائق في حمام الماء مغلي (95 – 100درجة مئوية). إضافة 250 ميكروليتر من تمييع الحل لكل عينة ودوامه المزيج.
- تخزين أنابيب 2 مل تحتوي على الحمض النووي المستخرج والمسحة في 4 درجات مئوية.
3-بكر وإعداد المكتبة
لخطوات 3.1 و 3.2، العمل في محطة عمل PCR نظيفة، ويوفر بيئة خالية من قالب وأمبليكون.
- قم بتسمية كبسولة تفجير (الجدول 1) وفقا لما الباركود. تمييع كل التمهيدي في المياه المقطرة مزدوجة (دو) إلى 50 ميكرومتر تركيز ومخزن في-20 درجة مئوية.
- استخدام لوح 96-جيدا لردود الفعل PCR. يمكن أن تحتوي كل لوحة على عينات مختلفة 32، التي هي معلم من 32 فهرس مختلف الإشعال. ذوبان الجليد التمهيدي إلى الأمام والإشعال عكس 32 في درجة حرارة الغرفة وتمييع لهم إلى 5 ميكرومترات.
- إعداد يمزج تفاعل PCR لردود الفعل 100 (ستكون وحدة التخزين النهائي في كل بئر 20 ميكروليتر) عن طريق خلط 100 ميكروليتر من 5 ميكرومترات التمهيدي إلى الأمام ومزيج سيد بكر X 1 مل 2 ميكروليتر 400 دو. وضع 15 ميكروليتر من هذا المزيج بكر في كل بئر (مجموع الآبار 96). إضافة ميكروليتر 1 من كل 5 ميكرومترات عكس التمهيدي المفهرسة إلى 3 آبار مختلفة (32 كبسولة تفجير مختلفة في تريبليكاتيس يعطي مجموعة آبار 96).
- في منطقة مخصصة قبل-بكر، مقعد نظيفة هو القالب و amplicon مجاناً، بمعنى إضافة ميكروليتر 4 لكل عينة الحمض النووي المستخرج للخلائط رد فعل (كل عينة الحمض النووي المستخرج يتم تضخيمه في ثلاث نسخ – 32 عينات كل لوح 96-جيدا).
- تشغيل PCR مع الإعدادات التالية: تمسخ الأولى 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ تليها دورات 35 من تمسخ في 94 درجة مئوية لمدة دقيقة 1، الصلب في 55 درجة مئوية، 1 دقيقة، والتمديد في 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة؛ وتمديد نهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- على مقاعد البدلاء مختلفة، التي سيتم تعريفها بأنها منطقة بكر وظيفة مخصصة، تجمع بين كل تفاعل PCR ثلاث في أنبوب حجم واحد (ميكروليتر 60 كل عينة).
- لتقييم نوعية أمبليكونس بكر، قم بتشغيل ميكروليتر 4 لكل تفاعل PCR جنبا إلى جنب على اثيديوم بروميد الملون 1% [اغروس] هلام. تحت الأشعة فوق البنفسجية للطول الموجي من 260 nm، أمبليكونس الإيجابية ستظهر في على حجم فرقة المتوقعة من شركة بريتيش بتروليوم 375 – 425. وستدرج هذه أمبليكونس فقط في الخطوات اللاحقة.
ملاحظة: يتم تضخيمه كل عينة في ثلاث، معنى أن كل عينة يتم تضخيمه في 3 ردود PCR مختلفة. عدم رفع مستوى.
4-مكتبة القياس الكمي والتنظيف
- من أجل الحصول على بركة اكويمولار تركيز جميع العينات بكر، التحديد الكمي لكل أمبليكون من الحمض النووي مزدوج الذين تقطعت بهم السبل (دسدنا كمياً الكاشف) وصمة الفلورسنت الحمض النووي (انظر الجدول للمواد)، مناسبة للقياس الكمي المتزامنة كبيرة كمية من العينات.
ملاحظة: نظراً لحجم مجموعة من أمبليكون لبس، يتم استخدام المبلغ الفعلي في نانوجرام لتحميل بتركيز اكويمولار. - ضم 500 نانوغرام لكل عينة في أنبوب واحد، عقيمة. دوامة المزيج.
- تشغيل 200 ميكروليتر من المكتبة مجمعة على اثيديوم بروميد الملون 1% [اغروس] هلام. استخراج العصابات bp 375 – 425 من الجل باستخدام مجموعة أدوات استخراج جل وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد) والوت المكتبة مجمعة في 80 ميكروليتر دو.
ملاحظة: يجب أن يكون مكتبة المجمعة الحجم المحدد للحد من منتجات التضخيم غير محددة من المضيف الحمض النووي. - قياس تركيز مكتبة النهائي دسدنا حساسة للغاية الكشف عن مجموعة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة باستخدام (انظر الجدول للمواد). قياس حجم مكتبة دقيقة باستخدام مجموعة أدوات الفصل والتحليل حساسة للغاية لمكتبات الحمض النووي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد).
5-التسلسل
- تمييع مكتبة المجمعة إلى 07:00 م مع إضافة مكتبة التحكم 20% (انظر الجدول للمواد)، ووفقا لبروتوكول جهاز التسلسل.
- للتسلسل، اقرأ استخدام مخصص تصميم الإشعال التي مجانية للإشعال التضخيم V4 (انظر الجدول 1).
- دورة (انظر الجدول 1) التمهيدي تسلسل مخصصة مصممة باستخدام ثالث أن يقرأ الباركود في إضافية ويولد يقرأ إقران نهاية القواعد 175 في الطول في كل اتجاه، وفقا لمواصفات الشركة المصنعة.
- تشغيل جهاز التسلسل، والحصول على ملفات فستق وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
6-معالجة البيانات
- غرزة معا، ومعالجة الملفات فستق نهاية إقران المتداخلة في خط أنابيب curation بيانات التي نفذت في الإصدار 2017.7.0 كيم 217. ديمولتيبليكس على ما يلي وفقا لنموذج محدد الرموز الشريطية.
- استخدام DADA218 لمراقبة الجودة والتسلسل في الكشف عن البديل (SVs). اقتطاع ما يلي في القواعد 13 من النهاية 3 'وقواعد 15 من 5' نهاية، تجاهل يقرأ مع الأخطاء المتوقعة أكثر من 2. تحديد وإزالة التركيبات استخدام أسلوب توافق الآراء – الكشف عن التركيبات في عينات فردية، ويتم إزالة تسلسل العثور على تشيميريك في جزء كاف من العينات.
- إجراء تصنيف تصنيفية SVs استخدام مصنف "بايز ساذج" مزودة، تدريب على 2013 أغسطس الهوية 99% جرينجينيس قواعد البيانات،6ل 175 طويلة يقرأ والإمام/عكس التمهيدي تعيين.
- راريفي جميع العينات إلى عمق تسلسل 2,146.
- استخدام "أونيفراك غير مرجحة" لقياس التنوع β (بين العينة التنوع19،20) على عينات مخلخل، لتجنب تأثير حجم عينة.
- استخدام مصفوفة المسافة الناتجة لإجراء تحليل إحداثيات رئيسية (بكوا).
ملاحظة: يتم توفير ملفات البرنامج النصي ورسم الخرائط ذات الصلة معالجة البيانات كمواد تكميلية (التكميلي المواد 1 و 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد في الشكل 1مثالاً تخطيطي للبروتوكول.
قد جمعنا مقدما عينات البراز من المرضى في المستشفيات مع الإسهال المعدية المشتبه فيهم. وقدمت هذه العينات إلى "مختبر الميكروبيولوجيا السريرية" في مركز شيبا الطبي بين شباط/فبراير وأيار/مايو عام 2015، كما هو موضح سابقا1. تعرض عينات البراز لثقافة الميكروبيولوجية التقليدية التي تجري في "مختبر الميكروبيولوجيا السريرية" وواسعة النطاق الفائق 16S seq في نفس الوقت. وباﻹضافة إلى ذلك، كانت متسلسلة عينات البراز من البالغين الأصحاء للمقارنة.
وفي هذا التحليل، كان التركيز على مراقبة جودة البيانات، وإظهار نتائج تمثيلية للإخراج التي تم الحصول عليها من QIIME217. في البداية، تم استعراض تسلسل النتائج المحققة في 6 عينات مراقبة سلبية لمراقبة الجودة بما في ذلك: ط) بكر دون قالب، والثاني) بكر على مسحات معقمة ونظيفة في استخراج وتمييع الحل، والثالث) بكر في استخراج مختلطة وتمييع الحلول. يبين الجدول 2 أن جميع عينات ضبط سلبي دي وان وان إيت مجموع ما يلي: (في المتوسط 29 متواليات) أساسا من الأنواع ميكوبلازما، بينما الأخرى جميع العينات التي تم تحليلها أظهرت يعني مجموع يقرأ 10622.57 (±1211.34 الخطأ القياسي) وليس القراءة مفطورة مرت مراقبة جودة العينات الرئيسية.
واستخدمت عينات ستة عشر أن كل نشأت من نفس العينة البراز ولكن ذهبت من خلال إعداد مكتبة مختلفة مع الإشعال المراقب عكس مختلفة كعناصر إيجابية. وشملت تلك العينات 16 8 مع الثقافات الإيجابية السلمونيلة، العطيفةأو دوسنتاريا التي تم الإبلاغ عنها من قبل مختبر الميكروبيولوجيا السريرية، و 8 التي تم الإبلاغ عنها كوجود الثقافات السلبية. قطعة أرض منطقة على مستوى يعج يرد في الشكل 2. العينات التي نشأت من نفس العينة البراز ولكن ذهبت من خلال إعداد مكتبة مختلفة مع الإشعال المراقب عكس مختلفة تظهر الوفرة النسبية متسقة للغاية (اختبار رف بين تكرارات وفرة النسبية التصنيفية مستوى الأسرة في اللغات القيم محاكاة قيمة p = 1 × 10-04 استناداً إلى 9999 replicates).
تحليل الإحداثيات الرئيسية (بكوا)، مما يقلل من أبعاد لإدخال البيانات، استخدم في المصفوفة أونيفراك لاستكشاف بصريا الفصل عينة والتشابه. في الشكل 3 ألف، يتم تلوين العينات المتتابعة التي نشأت من نفس العينة البراز الأصلي ولكن ذهبت من خلال إعداد مكتبة مختلفة نفس. والواقع أن تلك تقع نسبيا عن كثب في هذه المؤامرة بكوا (اختبار رف بين التكرارات PC1 PC2 تقدر قيمة p محاكاة = 1e-04 استناداً إلى 9999 replicates). وباﻹضافة إلى ذلك، بيتا أونيفراك غير مرجحة متوسط المسافة التنوع بين العينات في هذه الدراسة هو 0.706، بينما متوسط المسافة بين نسختين 0.235 (اختبار مجموع الرتب الرتبي قيمة p = 4.205 × 10-11). من المثير للاهتمام، أظهرت العينات التي كانت ثقافة إيجابية بالنسبة انتيروباثوجينس السلمونيلة، العطيفةأو دوسنتاريا اختلافاً PC1 القيم (مجموع رتبة الرتبي اختبار قيمة p = 0.011) بالمقارنة مع عينات نتائج الثقافة السلبية. ويبين الشكل 3B المؤامرة بكوا نفس ولكن الآن يتم تلوين العينات بالوفرة النسبية بروتيوباكتيريا. عينات مع ارتفاع بروتيوباكتيريا وفرة قد تختلف اختلافاً كبيرا PC1 القيم (سبيرمان الارتباط r =-0.533، قيمة p = 0.000975). تلك النتائج التي تتفق مع التحليل السابق لهذه البيانات، حيث يكون المرضى في المستشفيات الزيادات عميقة في الأصناف من الأسرة في اللغات بروتيوباكتيريا1. هنا أظهرنا أن PC1 يرتبط ارتباطاً بوفرة بروتيوباكتيريا، مع عينات إيجابية الثقافة تجميع معظمها على جانب واحد من PC1 المحور وثقافة سلبية العينات تجميع معظمها على الجانب الآخر، جنبا إلى جنب مع عينات سليمة.
الشكل 1 : مخطط تدفق من عينات البراز للوفرة النسبية الميكروبية. 1) التعامل مع العينة: ترك، هي جمع عينات البراز في أنبوب مسحه معقمة. إلى اليمين، يتم ضبط حجم عصا مسحه بقطع لتمكين إغلاق أنبوب 2 مل، والتخزين. 2) استخراج الحمض النووي: يتم استخراج الحمض النووي بنهج خالية من الأعمدة بكر مباشرة. 3) إعداد المكتبة: ترك، 4 ميكروليتر من الحمض النووي المستخرج يتم تضخيمه مع الإشعال إلى الأمام/عكس-فهرس. كل التمهيدي عكس يحتوي على رمز شريطي قاعدة 12. يتم تضخيمه كل عينة في ثلاث نسخ. لوحة 96-جيدا يحتوي على الرموز الشريطية مختلفة 32. الحق، والجمع بين كل الباركود ثلاث في أنبوب حجم واحد. لوحة 96-جيدا يحتوي على الرموز الشريطية مختلفة 96. 4) مكتبة القياس الكمي: تم الكشف عن لوحة علوية، فحص لعينات إيجابية، أمبليكونس على اثيديوم بروميد الملون 1% [اغروس] هلام. لوحة أقل، التحديد الكمي أمبليكونس الإيجابية للوصول إلى تركيز اكويمولار 500 نانوغرام أمبليكون من كل عينة في بركة مكتبة واحدة. 5) تنقية المكتبة: لوحة علوية، المكتبة مجمعة من جل المستخرجة لتحديد حجم وتنقية. يتم قياس لوحة أقل وحجم المكتبة بالضبط والتركيز. 6) التسلسل: التسلسل الفائق لمكتبة المجمعة. 7) ويتم تحليل البيانات التسلسل بخط أنابيب بيوينفورماتيك للإيكولوجيا الميكروبية الرنا الريباسي amplicon 16S. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الوفرة النسبية متسقة بين العينات التي نشأت من نفس العينة البراز ولكن ذهبت من خلال إعداد مكتبة مختلفة- ويرد كل عينة التصنيفية الوفرة النسبية على مستوى الأسرة في اللغات كما هو مبين. يتم إظهار الوفرة النسبية لعينات البراز 16 التي تم الحصول عليها من المرضى في المستشفيات مع الإسهال المعدية يشتبه في أن كل ذهبت من خلال إعداد مكتبة مختلفة (مكرر 1 و 2) مع المراقب عكس مختلف أجهزة الإشعال وضوابط صحية 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : إظهار التنوع النشوء والتطور نتائج متسقة للعينات التي نشأت من نفس العينة البراز ولكن ذهبت من خلال إعداد مكتبة مختلفة- استخدم تحليل الإحداثيات الرئيسية (بكوا) الذي يقلل من أبعاد لإدخال البيانات في المصفوفة أونيفراك لاستكشاف بصريا الفصل عينة والتشابه. وتمثل المسافة بين عينتين الفرق في تكوينها ميكروبيومي. ارسم بكوا أونيفراك "غير مرجحة" (A). ويمثل كل نقطة عينة متسلسلة واحدة. يتم تلوين العينات التي نشأت من نفس العينة البراز الأصلي نفسه. عينات من المرضى في المستشفيات مع ثقافة إيجابية البراز عنها الميكروبيولوجيا السريرية1 تميزت بالساحات، المرضى في المستشفيات مع الثقافة السلبية في مثلثات1، والبالغين الأصحاء من تشغيل تسلسل منفصلة1 تتسم بشغلها في الدوائر. (ب) بكوا نفسه كما هو الحال في، ولكن عينات الآن الملونة بهذه الوفرة النسبية بروتيوباكتيريا، كما هو مبين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| اسم الدليل | تسلسل التمهيدي | الوصف التمهيدي |
| التمهيدي إلى الأمام | آتجاتاكجكجاككاككجاجاتكتاكاك-تاتجتات-جي تي-جتجككاجكمجككجكجتا | الأمام لوح التمهيدي 5 ' تسلسل محول--إعادة توجيه رابط التمهيدي-التمهيدي إلى الأمام |
| عكس مؤشر التمهيدي | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجات--CC فريد--أجتكاجتكاج--جاكتاتشفججتوتكتات | عكس تكملة 3 ' المحول تسلسل-غولي الباركود-التمهيدي عكس الوسادة-رابط عكس التمهيدي-عكس التمهيدي |
| 1 قراءة التسلسل التمهيدي | تاتجتات-جي تي-جتجككاجكمجككجكجتا | إلى الأمام لوح التمهيدي--إعادة توجيه رابط التمهيدي-التمهيدي إلى الأمام |
| 2 قراءة التسلسل التمهيدي | أجتكاجتكاج-سي سي-جاكتاتشفججتوتكتات | عكس التمهيدي لوح-رابط عكس التمهيدي-عكس التمهيدي |
| مؤشر تسلسل التمهيدي | كتجاكتجاكت أتاجاواكككبدجتاجتكك-زز- | تكملة عكس لعكس التمهيدي-تكملة عكس لعكس التمهيدي رابط-تكملة عكس لوحة عكس التمهيدي |
الجدول 1: قائمة التمهيدي.
| عينة | عدد من الوظائف ما يلي: مراقبة الجودة الأولية في كيم |
| بكر على مسحات نظيفة في استخراج وتمييع الحل-1 | 118 |
| بكر على مسحات نظيفة في استخراج وتمييع الحل-2 | 39 |
| بكر دون قالب-1 | 0 |
| بكر دون قالب-2 | 0 |
| بكر على استخراج وتمييع حلول ميكس-1 | 16 |
| بكر على استخراج وتمييع حلول ميكس-2 | 0 |
| عينات (يعني ± الخطأ القياسي) | 10622.57 ± 1211.34 |
الجدول 2: عدد من القراءات لعناصر سلبية وعينات البراز.
التكميلية مادة 1: تجهيز البيانات النصي اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
2 المواد التكميلية: ملف التعيين. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
3 مواد تكميلية: المخطط التمهيدي. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
16S الرنا الريباسي-أمبليكون وتسلسل بندقية metagenomics اكتسبت شعبية في الميكروبيولوجيا السريرية التطبيقات21،22,23. هذه التقنيات مفيدة في زيادة القدرة على التقاط الأصناف كولتورابل وغير كولتورابل، توفير بيانات عن الوفرة النسبية للعدوى المسببة للمرض، وقدرتهم على تحديد أكثر دقة أنه المعدية بصمات الأصابع24. وقد ولدت أوجه التقدم في مجال البحوث ميكروبيومي كميات هائلة من البيانات التي لا يمكن مقارنتها بسهولة بسبب الافتقار إلى الاتساق في النهج المختلفة. وفي السنوات الأخيرة، حاولت عدة اتحادات لمعالجة بعض هذه القضايا. ويتبع هذا البروتوكول إعداد مكتبة مماثلة كمشروع ميكروبيومي الأرض (EMP). ومع ذلك، أضيف بروتوكول مفصلة خطوة بخطوة لاستخراج الحمض النووي من عينات البراز من خلال خط أنابيب التحاليل.
وقد استخدمت سابقا، تسلسل الرنا الريباسي 16S لتوصيف أنماط تكوين الجرثومية لعينات البراز من الأصحاء غير المستشفيات والمرضى في المستشفيات مع الإسهال المعدية المشتبه فيها، وإلى نتائج الثقافة التقليدية. أظهرت النتائج من هذا التحليل أن المرضى في المستشفيات الزيادات عميقة في الأصناف من الأسرة في اللغات بروتيوباكتيريا1. الموصوفة هنا هو بروتوكول متكامل من الطرق المستخدمة على نطاق واسع لتسلسل amplicon الجينات الرنا الريباسي استخدام النهج خالية من الأعمدة PCR المباشرة التي كانت مصممة أصلاً لاستخراج الحمض النووي16محطة 16S. هذا النهج يمكن أن كفاءة وسرعة لاستخراج الجيد تضخيم الحمض النووي مكتبات استهداف منطقة المتغير V4 الجينات الرنا الريباسي 16S من عدد كبير من عينات مناسبة لتسلسل الرنا الريباسي الفائق 16S.
وهذا أسلوب تسلسل القائم على الحمض النووي، يتم الحصول على بيانات عن المجتمعات الميكروبية aerobes واللاهوائيات الموجودة في نموذج البراز فردية. اعتماد البروتوكول الإشعال التي كانت مصممة أصلاً15 ضد منطقة V4 الجينات الرنا الريباسي 16S. الأهم من ذلك، تتضمن التمهيدي التضخيم عكس تسلسل باركود قاعدة الإثني عشر التي تدعم تجميع عينات مختلفة تصل إلى 2,167 في كل حارة15. التمهيدي التضخيم إلى الأمام يتضمن تسع قواعد إضافية في منطقة محول دعم التسلسل نهاية الاقتران على منصة التسلسل25 (الجدول 1 و 3 مواد تكميلية). تمكين هذا النهج معالجة مكتبة مؤلفة من 250 من عينات البراز التي كانت متسلسلة في حارة واحدة بعمق 10622.57 ± 1211.34 (يعني ± الخطأ القياسي) ما يلي: كل عينة بتكلفة قدرها ~ 30 دولاراً للعينة قيد تشغيل.
لضمان مراقبة الجودة، فإننا نقترح استخدام عناصر التحكم التالية السلبية؛ ط) بكر دون قالب الحمض النووي، ثانيا) بكر على الحمض النووي المستخرج من مسحه معقمة نظيفة، وثالثاً) مختلطة PCR في استخراج وتمييع الحل. أما بالنسبة لعناصر إيجابية، ونحن نوصي بما في ذلك النماذج التي نشأت من نفس العينة البراز ولكن ذهبت من خلال إعداد مكتبة مختلفة مع المراقب عكس مختلف أجهزة الإشعال وعينات من التشغيلات السابقة كمراقبة الجودة الداخلية. تجدر الإشارة، بعناصر تحكم أخرى إيجابية الاختياري لاستخدامها معايير قياس ميكروبيومي تلك المقدمة من نيست. يقرأ المتوسط التغطية لعناصر سلبية أقل بشكل ملحوظ بالمقارنة مع عينات البراز الفعلية (الجدول 1)، وكانت تتألف أساسا من الأنواع ميكوبلازما. واظهرنا زيادة اتساق تسلسل النتائج المتحصل عليها باستخدام عينات كل نشأت من نفس مادة البراز ولكن أن ذهبت من خلال إعداد مكتبة مختلفة (الشكل 3). وتؤكد هذه النتيجة أيضا أنه عند استخدام أسلوب متكامل لدينا، هناك لا تلوث الصليب بين العينات.
في هذا البروتوكول نقدم بروتوكولا يرتدون الزي الرسمي، وأمكن متكامل لتحليل عدد كبير من العينات. ويهدف هذا البروتوكول إلى توجيه العلماء المهتمين في بدء استخدام تسلسل الرنا الريباسي amplicon 16S بطريقة قوية، الإنجابية، سهلة الاستخدام، وغير مكلفة، ومفصلة من جمع البراز لتحليل البيانات، باستخدام عناصر هامة. استخدام هذا البروتوكول إرشادية تفصيلية موحدة، يمكن التقليل من الآثار دفعة وتسمح نتائج التسلسل أكثر قابلية للمقارنة بين مختبرات مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
بتأييد هذا العمل جزئيا بالبرنامج الأساسية (المنح رقم 41/11)، ومؤسسة العلوم إسرائيل (منحة رقم 908/15)، وكرون الأوروبية والمنظمة التهاب القولون (إيكو).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Extraction solution | Sigma-Aldrich | E7526 | |
| Dilution solution | Sigma-Aldrich | D5688 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPABIOSYSTEMS | KK2601 | PCR Master mix |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kit | Invitrogen | P7589 | dsDNA quantify reagent |
| MinElute Gel extraction kit | Qiagen | 28606 | |
| Agarose | Amresco | 0710-250G | |
| Ultra Pure Water Dnase and Rnase Free | Biological Industries | 01-866-1A | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Molecular probes | Q32854 | dsDNA detecting kit |
| High Sensitivity D1000 | Agilent Technologies | Screen Tape 5067-5582 | separation and analysis |
| Screen Tape Assay | Agilent Technologies | Reagents 5067-5583 | for DNA libraries |
| PhiX Control v3 | Illumina | 15017666 | control library |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | E406-10mL-TAM | |
| 2 mL collection tubes | SARSTEDT | 72.695.400 | Safe Seal collection tubes |
| Plastic stick swab in PP test tube | STERILE INTERIOR | 23117 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR Machine | Applied Biosystems | 2720 Thermal Cycler | |
| Sequncing Machine | Illumina | Miseq | |
| PCR workstation | Biosan | UV-cleaner | |
| scissors | |||
| vortexer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
References
- Braun, T., et al. Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis. Scientific Reports. 7, 1088 (2017).
- De Filippo, C., et al. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).
- Yatsunenko, T., et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature. 486, 222-227 (2012).
- Rodriguez, J. M., et al. The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life. Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050 (2015).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).
- Bakken, J. S., et al. Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).
- Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea. Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).
- Nood, E. V., et al. Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).
- Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. Value of stool cultures. The Lancet. 316, 413-416 (1980).
- Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. New concepts in diagnostics for infectious diarrhea. Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).
- Bokulich, N. A., et al. Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing. Nature Methods. 10, 57-59 (2013).
- Leek, J. T., et al. Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data. Nature Reviews Genetics. 11, (2010).
- Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. Create a global microbiome effort. Nature. 526, 631-634 (2015).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. PNAS. 108, 4516-4522 (2011).
- Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities. PloS One. 7, (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).
- Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).
- Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PloS One. 10, e0117617 (2015).
- Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing. ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).
- Salipante, S. J., et al. Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections. PloS One. 8, e65226 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).
