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Biology

16S rRNA-Amplicon अनुक्रमण द्वारा मल माइक्रोबियल लक्षण वर्णन के लिए निर्देशित प्रोटोकॉल

Published: March 19, 2018 doi: 10.3791/56845
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1,3, 1,4
1Sheba Medical Center, 2Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, 3Ariel University, 4Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Summary

इस पांडुलिपि उच्च प्रवाह 16S rRNA-amplicon अनुक्रमण का एक विस्तृत मानकीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन है । प्रोटोकॉल एक एकीकृत, वर्दीधारी, साध्य, और सस्ती प्रोटोकॉल का परिचय डेटा विश्लेषण के माध्यम से मल नमूना संग्रह से शुरू । इस प्रोटोकॉल कठोर मानकों और कई नियंत्रण के साथ नमूनों की बड़ी संख्या के विश्लेषण में सक्षम बनाता है ।

Abstract

मानव आंत्र microbiome कोशिकाओं की चोट से बचाने में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है, ऊर्जा और पोषक तत्वों प्रसंस्करण में, और प्रतिरक्षा को बढ़ावा देने में । क्या एक स्वस्थ microbiota संरचना (dysbiosis) माना जाता है से विचलन महत्वपूर्ण रोग की स्थिति के लिए अग्रणी कार्यों ख़राब कर सकते हैं । हाल ही में और चल रहे अनुसंधान के प्रयास माइक्रोबियल संरचना और मानव स्वास्थ्य और रोग के बीच संघों के लक्षण वर्णन की ओर निर्देशित किया गया है ।

उच्च प्रवाह अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों में अग्रिम आंत माइक्रोबियल संरचना के लक्षण वर्णन सक्षम करें । इन विधियों में 16S rRNA-amplicon sequencing और शॉटगन अनुक्रमण शामिल हैं । शॉटगन अनुक्रमण जीन भविष्यवाणियों और कार्यात्मक एनोटेशन के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है, जबकि 16S rRNA-amplicon अनुक्रमण प्रोफ़ाइल taxonomical संरचना करने के लिए प्रयोग किया जाता है । 16S rRNA जीन चर क्षेत्र के एक लक्षित अनुक्रमण विधि का उपयोग करने में एक फायदा यह शॉटगन अनुक्रमण की तुलना में काफी कम लागत है । अनुक्रम 16S rRNA जीन में अंतर की पहचान करने के लिए एक माइक्रोबियल फिंगरप्रिंट के रूप में इस्तेमाल कर रहे है और एक व्यक्ति के नमूने के भीतर अलग taxa यों ।

प्रमुख अंतरराष्ट्रीय प्रयासों 16S rRNA-amplicon अनुक्रमण के लिए मानकों को सूचीबद्ध किया है । हालांकि, कई अध्ययनों बैच प्रभाव के कारण भिन्नता का एक सामान्य स्रोत रिपोर्ट । इस प्रभाव को कम करने के लिए, नमूना संग्रह, संसाधन और sequencing के लिए वर्दीधारी प्रोटोकॉल कार्यांवित किया जाना चाहिए । यह प्रोटोकॉल मल नमूना संग्रह से डेटा विश्लेषण करने के लिए शुरू मोटे तौर पर इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के एकीकरण का प्रस्ताव है । इस प्रोटोकॉल एक स्तंभ मुक्त, प्रत्यक्ष-पीसीआर दृष्टिकोण है कि एक साथ हैंडलिंग और मल नमूनों की बड़ी संख्या के डीएनए निष्कर्षण, V4 क्षेत्र की पीसीआर प्रवर्धन के साथ सक्षम बनाता है शामिल हैं । इसके अलावा, प्रोटोकॉल विश्लेषण पाइपलाइन का वर्णन करता है और QIIME (QIIME 2 संस्करण 2017.7.0 और DADA2) के नवीनतम संस्करण का उपयोग कर एक स्क्रिप्ट प्रदान करता है । यह कदम दर कदम प्रोटोकॉल एक मजबूत, प्रजनन, प्रयोग करने में आसान, विस्तृत तरीका में 16S rRNA-amplicon अनुक्रमण के उपयोग की शुरुआत में रुचि रखने वालों के मार्गदर्शन के उद्देश्य से है ।

Introduction

केंद्रित प्रयासों को बेहतर microbiome विविधता और बहुतायत समझ में किया गया है, अंतर और स्वस्थ और रोग की स्थिति में व्यक्तियों के बीच समानता पर कब्जा करने का एक और पहलू के रूप में । आयु2,3, भूगोल4, जीवन शैली5,6, और बीमारी5 आंत microbiome की संरचना के साथ जुड़े होना दिखाया गया है, लेकिन कई शर्तों और आबादी अभी तक पूरी तरह से नहीं किया गया है विशेषता. हाल ही में यह बताया गया है कि microbiome चिकित्सीय अनुप्रयोगों7,8,9के लिए संशोधित किया जा सकता है । इसलिए, विभिंन शारीरिक स्थितियों और माइक्रोबियल संरचना के बीच संबंधों में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि संभावित भविष्य के संशोधनों के अनुकूलन की ओर पहला कदम है ।

पारंपरिक माइक्रोबियल संस्कृति के तरीकों कम पैदावार10,11द्वारा सीमित हैं, और एक द्विआधारी राज्य जहां एक जीवाणु या नहीं आंत में मौजूद है के रूप में धारणा है । उच्च-प्रवाह डीएनए आधारित अनुक्रमण माइक्रोबियल समुदाय के सभी सदस्यों के कब्जे को सक्षम करने, सूक्ष्म जीवाणु पारिस्थितिकी क्रांति की है । हालांकि, अनुक्रम पढ़ें लंबाई और गुणवत्ता सटीक वर्गीकरण असाइनमेंट12के लिए महत्वपूर्ण बाधाओं रहते हैं । इसके अलावा, उच्च प्रवाह आधारित प्रयोगों बैच प्रभाव, जहां माप गैर जैविक या गैर वैज्ञानिक चर13से प्रभावित कर रहे हैं से पीड़ित हो सकता है । हाल के वर्षों में, अमेरिकी आंत परियोजना, संयुक्त राज्य अमेरिका (यूएस) मानव microbiome परियोजना, और यूनाइटेड किंगडम (यूके) MetaHIT परियोजना सहित मानव microbiome का अध्ययन करने के लिए कई कार्यक्रमों की स्थापना की गई है । इन पहलों डेटा है कि आसानी से उनके दृष्टिकोण में निरंतरता की कमी के कारण तुलनीय नहीं कर रहे है की विशाल मात्रा में उत्पंन किया है । अंतरराष्ट्रीय मानव Microbiome कंसोर्टियम, अंतरराष्ट्रीय मानव Microbiome मानक परियोजना, और राष्ट्रीय मानक और प्रौद्योगिकी संस्थान (NIST) के रूप में अंतरराष्ट्रीय परियोजनाओं की एक किस्म इन मुद्दों में से कुछ को संबोधित करने का प्रयास किया14 , और microbiome मापन के लिए विकसित मानक जो विश्वसनीय प्रजनन परिणामों की उपलब्धि को सक्षम करना चाहिए. यहां वर्णित कई मोटे तौर पर इस्तेमाल किया तरीकों की एक एकीकृत प्रोटोकॉल15,16 16S rRNA उच्च प्रवाह अनुक्रमण (16S-seq) डेटा विश्लेषण के माध्यम से मल नमूना संग्रह से शुरू करने के लिए है । प्रोटोकॉल एक कॉलम मुक्त पीसीआर दृष्टिकोण, मूलतः संयंत्र डीएनए के प्रत्यक्ष निष्कर्षण के लिए डिजाइन16का वर्णन, एक अपेक्षाकृत कम समय में मल नमूनों की बड़ी संख्या के एक साथ निपटने के लिए उच्च गुणवत्ता के साथ परिवर्धित डीएनए को सक्षम करने के लिए लक्षित एक आम अनुक्रमण मंच पर माइक्रोबियल चर V4 क्षेत्र के sequencing । इस प्रोटोकॉल के लिए एक मजबूत, प्रजनन, प्रयोग करने में आसान, विस्तृत तरीका, महत्वपूर्ण नियंत्रण का उपयोग करने में 16S rRNA-amplicon अनुक्रमण के उपयोग की शुरुआत में रुचि वैज्ञानिकों गाइड करना है । एक निर्देशित और विस्तृत कदम दर कदम प्रोटोकॉल बैच प्रभाव को कम करने और इस प्रकार प्रयोगशालाओं के बीच और अधिक तुलनीय अनुक्रमण परिणाम की अनुमति देगा कर सकते हैं ।

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Protocol

अध्ययन के लिए नैतिक अनुमोदन शबा स्थानीय अनुसंधान नैतिकता समिति द्वारा प्रदान किया गया था और सभी तरीकों को प्रासंगिक दिशानिर्देशों और विनियमों के अनुसार किया गया था । प्रोटोकॉल स्थानीय एथिकल रिव्यू बोर्ड से एक रोगी सहमति अपवाद प्राप्त है, के बाद से मल सामग्री का इस्तेमाल किया गया है कि पहले से ही नैदानिक workup के भाग के रूप में माइक्रोबायोलॉजी कोर को प्रस्तुत किया गया और पहचाने जाने योग्य रोगी उंर के अलावा अंय जानकारी के बिना, लिंग, और माइक्रोबियल परिणाम । लिखित, सूचित सहमति स्वस्थ स्वयंसेवकों से प्राप्त किया गया था और संस्थागत समीक्षा बोर्ड ने अध्ययन को मंजूरी दे दी. उन नमूनों में से कुछ को पहले से ही किसी पिछले विश्लेषण1में शामिल किया गया है ।

1. नमूना हैंडलिंग

  1. एक परीक्षण ट्यूब में एक बाँझ झाड़ू के साथ एक ताजा मल नमूना से एक लगभग 5 मिमी2 धब्बा (लगभग एक पेंसिल रबड़ के आकार) ले लीजिए ( सामग्री की तालिकादेखें) । 24 घंटे के भीतर-80 डिग्री सेल्सियस पर मल नमूने युक्त सभी झाड़ू स्टोर. मल झाड़ू वहां आगे प्रसंस्करण तक रह सकते हैं ।

2. डीएनए निष्कर्षण

  1. गल निष्कर्षण और कमरे के तापमान पर कमजोर पड़ने समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  2. एक खाली 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में मल झाड़ू हस्तांतरण ( सामग्री की तालिकादेखें) । यह एक साफ कैंची का उपयोग करने के लिए न्यूनतम पार-संदूषण के साथ ट्यूब बंद सक्षम काटने से झाड़ू छड़ी आकार को समायोजित करें । मिश्रण करने के लिए मल झाड़ू और भंवर युक्त प्रत्येक संग्रह ट्यूब के लिए निष्कर्षण समाधान के 250 μL जोड़ें ।
  3. एक उबलते पानी स्नान में 10 मिनट के लिए नमूनों गर्मी (95-100 ° c) । मिश्रण करने के लिए प्रत्येक नमूना और भंवर के लिए कमजोर पड़ने समाधान के 250 μL जोड़ें ।
  4. 2 मिलीलीटर 4 डिग्री सेल्सियस पर निकाले डीएनए और झाड़ू युक्त ट्यूब की दुकान ।

3. पीसीआर और लाइब्रेरी की तैयारी

कदम 3.1 और 3.2 के लिए, एक पीसीआर कार्य केंद्र है कि स्वच्छ, टेंपलेट और amplicon मुक्त वातावरण प्रदान करता है में काम करते हैं ।

  1. लेबल प्राइमरों (तालिका 1) उनके बारकोड के अनुसार । डबल आसुत जल में प्रत्येक पुस्तक पतला (DDW) एक 50 माइक्रोन एकाग्रता और दुकान पर-20 डिग्री सेल्सियस के लिए ।
  2. पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए एक 96-well प्लेट का उपयोग करें । प्रत्येक प्लेट 32 अलग-अलग सूचकांक प्राइमरों द्वारा टैग कर रहे हैं, जो ३२ विभिन्न नमूनों में शामिल कर सकते हैं । आगे प्राइमर और कमरे के तापमान पर 32 रिवर्स प्राइमरों गल और उंहें 5 माइक्रोन को पतला ।
  3. पीसीआर रिएक्शन तैयार करें 100 प्रतिक्रियाओं के लिए घोला जा सकता है (प्रत्येक कुआं में अंतिम मात्रा 20 μl होगा) 5 माइक्रोन फॉरवर्ड प्राइमर, 1 एमएल 2x पीसीआर मास्टर मिक्स, और 400 μl DDW के 100 μl मिश्रण से । प्रत्येक कुआं (कुल 96 कुओं) में इस पीसीआर मिक्स के 15 μL रखें । जोड़ें 1 μL प्रत्येक 5 माइक्रोन रिवर्स अनुक्रमित प्राइमरी के लिए 3 अलग कुओं (triplicates में 32 अलग प्राइमरों 96 कुओं की कुल देता है) ।
  4. एक पूर्व-पीसीआर समर्पित क्षेत्र में, एक स्वच्छ पीठ है कि टेंपलेट और amplicon मुक्त अर्थ है, प्रत्येक निकाले डीएनए नमूने के 4 μL की प्रतिक्रिया के मिश्रण को जोड़ने (प्रत्येक निकाले डीएनए नमूने तपसिल में परिलक्षित-96-अच्छी प्लेट प्रति 32 नमूने है) ।
  5. निंनलिखित सेटिंग्स के साथ पीसीआर भागो: 3 मिनट के लिए 94 ° c के प्रारंभिक विकार; 1 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर विकार के 35 चक्र द्वारा पीछा किया, 1 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार; और 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक अंतिम विस्तार ।
  6. एक अलग बेंच पर, जो एक पोस्ट-पीसीआर समर्पित क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया जाएगा, एक एकल मात्रा ट्यूब (नमूना प्रति 60 μL) में प्रत्येक तपसिल पीसीआर प्रतिक्रिया गठबंधन ।
  7. पीसीआर amplicons की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए, एक ethidium ब्रोमाइड-सना हुआ 1% agarose जेल पर प्रत्येक संयुक्त-पीसीआर प्रतिक्रिया के 4 μL चलाते हैं । 260 एनएम के यूवी तरंग दैर्ध्य के तहत, सकारात्मक amplicons 375-425 बीपी की उंमीद बैंड आकार में दिखाई देगा । केवल इन amplicons को बाद के चरणों में शामिल किया जाएगा ।
    नोट: प्रत्येक नमूना तपसिल में परिलक्षित होता है, जिसका अर्थ है कि प्रत्येक नमूना 3 अलग पीसीआर प्रतिक्रियाओं में परिलक्षित होता है. बड़े पैमाने पर मत करो ।

4. पुस्तकालय ठहराव और सफाई

  1. आदेश में सभी पीसीआर नमूनों की एक equimolar एकाग्रता पूल पाने के लिए, एक डबल असहाय डीएनए द्वारा प्रत्येक amplicon यों तो बढ़ाता है (dsDNA यों तो एजेंट) फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग ( सामग्री की तालिकादेखें), एक बड़े के एक साथ ठहराव के लिए उपयुक्त नमूनों की राशि ।
    नोट: के बाद से amplicon का आकार सीमा गोलमोल है, nanograms में वास्तविक मात्रा एक equimolar एकाग्रता लोड करने के लिए उपयोग किया जाता है ।
  2. एक एकल, बाँझ ट्यूब में प्रत्येक नमूने के एनजी 500 का मिश्रण । भंवर मिश्रण करने के लिए ।
  3. एक Ethidium ब्रोमाइड-सना हुआ 1% agarose जेल पर परित लाइब्रेरी के 200 μL चलाते हैं । ( सामग्री की तालिकादेखें)) निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर जेल से 375 – 425 बीपी बैंड निकालें और 80 μL DDW में pooled पुस्तकालय elute ।
    नोट: पूल किया गया पुस्तकालय मेजबान डीएनए से गैर विशिष्ट प्रवर्धन उत्पादों को कम करने के लिए चयनित आकार होना चाहिए ।
  4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक अति संवेदनशील dsDNA का पता लगाने किट का उपयोग कर अंतिम पुस्तकालय एकाग्रता को मापने ( सामग्री की तालिकादेखें). निर्माता के निर्देशों के अनुसार डीएनए पुस्तकालयों के लिए एक अति संवेदनशील जुदाई और विश्लेषण किट का उपयोग कर सटीक पुस्तकालय आकार को मापने ( सामग्री की तालिकादेखें).

5. अनुक्रमण

  1. 20% नियंत्रण पुस्तकालय ( सामग्री की तालिकादेखें), sequencing मशीन प्रोटोकॉल के अनुसार के साथ 7 बजे के लिए परित पुस्तकालय पतला ।
  2. अनुक्रमण के लिए, V4 प्रवर्धन प्राइमरों के लिए मानार्थ रहे हैं कि पढ़ने के लिए कस्टम डिजाइन का उपयोग करें ( तालिका 1देखें).
  3. एक अतिरिक्त चक्र में बारकोड पढ़ता है कि एक तीसरे कस्टम डिजाइन अनुक्रमण प्राइमर का उपयोग करें ( तालिका 1देखें) और प्रत्येक दिशा में लंबाई में 175 ठिकानों के युग्मित-अंत पढ़ता उत्पन्न करता है, निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार.
  4. sequencing मशीन चलाएँ और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार FASTQ फ़ाइलें प्राप्त करें ।

6. डाटा प्रोसेसिंग

  1. एक साथ सिलाई और एक डेटा उपचारात्मक पाइप लाइन में QIIME 2 संस्करण 2017.7.017में कार्यांवित में अतिव्यापी युग्मित अंत FASTQ फ़ाइलों की प्रक्रिया । मल्टीप्लेक्स में नमूना विशिष्ट बारकोड के अनुसार पढ़ता है ।
  2. गुणवत्ता नियंत्रण और अनुक्रम भिन्नता (SVs) का पता लगाने के लिए18 DADA2 का उपयोग करें । से 13 ठिकानों पर पढ़ता है 3 ' अंत और 15 कुर्सियां से 5 ' अंत में, 2 से अधिक अपेक्षित त्रुटियों के साथ पढ़ता छोड़ें । आम सहमति विधि का उपयोग करके chimeras को पहचानें और निकालें — chimeras नमूनों में व्यक्तिगत रूप से पाए जाते हैं, और नमूनों के पर्याप्त अंश में chimeric पाया गया अनुक्रम निकाल दिए जाते हैं ।
  3. SVs वर्गीकरण वर्गीकरण एक नादान Bayes फिट वर्गीकारक, अगस्त २०१३ ९९% पहचान Greengenes डेटाबेस 6 पर प्रशिक्षित का उपयोग कर, 175 लंबे समय के लिए पढ़ता है और आगे/
  4. सभी नमूनों को २,१४६ जुगाड़ की गहराई तक Rarefy ।
  5. β-विविधता (नमूना विविधता19,20) rarefied नमूनों पर, एक नमूना आकार प्रभाव से बचने के लिए के बीच माप के लिए unभारित UniFrac का उपयोग करें ।
  6. एक प्रमुख निर्देशांक विश्लेषण (PCoA) करने के लिए परिणामी दूरस्थ मैट्रिक्स का उपयोग करें ।
    नोट: डेटा प्रोसेसिंग स्क्रिप्ट और मानचित्रण फ़ाइलें अनुपूरक सामग्री के रूप में प्रदान की जाती है (अनुपूरक सामग्री 1 और 2) ।

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Representative Results

प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चित्रण चित्रा 1में दिखाया गया है ।

हमने संभावित रूप से संदिग्ध संक्रामक दस्त के साथ अस्पताल में भर्ती रोगियों से मल नमूने एकत्र किया है । उन नमूनों को फरवरी और मई 2015 के बीच शबा मेडिकल सेंटर में क्लिनिकल माइक्रोबायोलॉजी लैब में प्रस्तुत किया गया था, जैसा कि पहले1बताया गया था. स्टूल नमूने पारंपरिक सूक्ष्मजीवविज्ञानी संस्कृति के अधीन थे नैदानिक सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया और व्यापक रेंज उच्च प्रवाह 16S-seq समानांतर में । इसके अलावा, स्वस्थ वयस्कों से स्टूल नमूने तुलना के लिए अनुक्रम थे ।

इस विश्लेषण में, ध्यान डेटा की गुणवत्ता नियंत्रण पर था, और QIIME2 से प्राप्त उत्पादन के प्रतिनिधि परिणाम दिखाएँ17. शुरू में, अनुक्रमण परिणाम 6 नकारात्मक नियंत्रण नमूनों में हासिल सहित गुणवत्ता नियंत्रण के लिए समीक्षा की गई: i) बिना टेंपलेट पीसीआर, द्वितीय) निकासी और कमजोर पड़ने समाधान में स्वच्छ और बाँझ झाड़ू पर पीसीआर, और iii) मिश्रित निष्कर्षण और कमजोर पड़ने पर पीसीआर समाधान. तालिका 2 से पता चलता है कि सभी नकारात्मक नियंत्रण नमूने ≤ था 118 कुल पढ़ता है (29 दृश्यों का औसत), मुख्य रूप से माइकोप्लाज्मा taxa से, जबकि अन्य सभी नमूनों का विश्लेषण किया पता चला मतलब कुल १०६२२.५७ की पुस्तकें (± १२११.३४ मानक त्रुटि) और कोई माइकोप्लाज्मा पढ़ें मुख्य नमूनों की गुणवत्ता नियंत्रण पारित कर दिया ।

सोलह नमूने है कि प्रत्येक एक ही स्टूल नमूना से उत्पंन लेकिन अलग रिवर्स बारकोड प्राइमरों के साथ विभिंन पुस्तकालय तैयारी के माध्यम से चला गया सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । उन 16 नमूनों कैम्पिलोबैक्टर, साल्मोनेला, या शिगेला कि नैदानिक सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशाला द्वारा सूचित किया गया था, और 8 कि नकारात्मक संस्कृतियों होने के रूप में सूचित किया गया के लिए सकारात्मक संस्कृतियों के साथ 8 शामिल थे । संघ स्तर पर एक क्षेत्र भूखंड चित्रा 2में दिखाया गया है । नमूने है कि एक ही स्टूल नमूना से उत्पंन लेकिन अलग रिवर्स बारकोड प्राइमरों के साथ विभिंन पुस्तकालय की तैयारी के माध्यम से चला गया बहुत सुसंगत सापेक्ष बहुतायत शो (जाति स्तर वर्गीकरण सापेक्ष बहुतायत के डुप्लिकेट के बीच Mantel परीक्षण मान नकली p-मान = 1 x 10-04 9999 प्रतिकृति के आधार पर) ।

प्रिंसिपल निर्देशांक विश्लेषण (PCoA), जो इनपुट डेटा की आयामीता को कम करता है, UniFrac मैट्रिक्स पर इस्तेमाल किया गया था नेत्रहीन नमूना जुदाई और समानता का पता लगाने के लिए. चित्रा 3ए में, एक ही मूल स्टूल नमूना से उत्पंन नमूनों कि अनुक्रम, लेकिन अलग पुस्तकालय की तैयारी के माध्यम से चला गया एक ही रंग का है । दरअसल, उन PCoA भूखंड में अपेक्षाकृत बारीकी से स्थित है (डुप्लिकेट के बीच Mantel परीक्षण PC1 PC2 मूल्यों नकली पी मूल्य = 1e-04 के आधार पर 9999 दोहराने) । इसके अलावा, इस अध्ययन में नमूनों के बीच औसत भारित unifrac बीटा विविधता दूरी ०.७०६ है, जबकि दो डुप्लिकेट के बीच औसत दूरी ०.२३५ है (Wilcoxon रैंक राशि परीक्षण p-value = ४.२०५ x 10-11) । दिलचस्प है, नमूनों कि कैम्पिलोबैक्टर, साल्मोनेला, या शिगेला enteropathogens के लिए सकारात्मक संस्कृति थे काफी अलग PC1 मूल्यों (Wilcoxon रैंक राशि परीक्षण पी-मूल्य = ०.०११) के साथ नमूनों की तुलना में दिखाया नकारात्मक संस्कृति परिणाम । चित्र बी एक ही PCoA भूखंड से पता चलता है, लेकिन अब नमूने Proteobacteria के सापेक्ष बहुतायत से रंग का है । उच्च Proteobacteria बहुतायत के साथ नमूनों काफी अलग PC1 मूल्यों था (स्पीमरन सहसंबंध आर =-०.५३३, पी-मूल्य = ०.०००९७५) । उन परिणामों के इस डेटा के पिछले विश्लेषण के अनुरूप हैं, जहां अस्पताल में भर्ती रोगियों Proteobacteria जाति1से taxa में गहरा बढ़ता है । यहां हमें पता चला कि PC1 Proteobacteria बहुतायत के साथ संबंधित है, संस्कृति सकारात्मक नमूनों के साथ ज्यादातर PC1 धुरी और संस्कृति के एक तरफ नकारात्मक नमूनों में ज्यादातर दूसरी तरफ clustering, स्वस्थ नमूनों के साथ एक साथ ।

Figure 1
चित्र 1 : मल नमूनों से सापेक्ष माइक्रोबियल बहुतायत के लिए प्रवाह चार्ट । 1) नमूना हैंडलिंग: वाम, मल के नमूने एक बाँझ झाड़ू ट्यूब में एकत्र कर रहे हैं. सही, झाड़ू छड़ी आकार 2ml ट्यूब के बंद करने के लिए सक्षम करने के लिए काटने के द्वारा समायोजित किया जाता है, और भंडारण. 2) डीएनए निष्कर्षण: डीएनए प्रत्यक्ष पीसीआर कॉलम-मुक्त दृष्टिकोण द्वारा निकाला जाता है । 3) पुस्तकालय तैयारी: वाम, 4 μL निकाली डीएनए के आगे के साथ परिलक्षित होता है/ प्रत्येक रिवर्स प्राइमर एक 12 आधार बारकोड शामिल हैं । प्रत्येक नमूना तपसिल में परिलक्षित होता है । एक 96-अच्छी तरह से थाली 32 अलग बारकोड शामिल हैं । ठीक है, एक एकल मात्रा ट्यूब में प्रत्येक बारकोड तपसिल गठबंधन । एक 96-अच्छी तरह से थाली 96 अलग बारकोड शामिल हैं । 4) पुस्तकालय ठहराव: ऊपरी पैनल, सकारात्मक नमूनों के लिए स्क्रीनिंग, amplicons Ethidium ब्रोमाइड-सना हुआ 1% agarose जेल पर पाए गए । लोअर पैनल, ठहराव सकारात्मक amplicons के equimolar एकाग्रता तक पहुंचने के लिए एक एकल पुस्तकालय पूल में 500 एनजी amplicon प्रत्येक नमूने से । 5) पुस्तकालय शुद्धि: ऊपरी पैनल, परित पुस्तकालय आकार चयन और शुद्धि के लिए निकाला जेल है । निचले पैनल, पुस्तकालय सटीक आकार और एकाग्रता मापा जाता है । 6) sequencing: पूलिंग लायब्रेरी का उच्च-प्रवाह अनुक्रमण । 7) sequencing डेटा 16S rRNA-amplicon माइक्रोबियल पारिस्थितिकी के लिए एक bioinformatic पाइपलाइन द्वारा विश्लेषण किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : नमूने है कि एक ही स्टूल नमूने से उत्पंन के बीच सुसंगत सापेक्ष बहुतायत लेकिन विभिंन पुस्तकालय तैयारी के माध्यम से चला गया । वर्गीकरण जाति स्तर पर सापेक्ष बहुतायत दर्शाई के रूप में प्रति नमूना दिखाया गया है । सापेक्ष बहुतायत 16 मल संदिग्ध संक्रामक दस्त के साथ अस्पताल में भर्ती रोगियों से प्राप्त नमूनों के लिए दिखाया गया है कि प्रत्येक विभिन्न पुस्तकालय तैयारी के माध्यम से चला गया (डुप्लिकेट 1 और 2) अलग रिवर्स बारकोड प्राइमरों और 3 स्वस्थ नियंत्रण के साथ. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : वंशावली विविधता नमूने है कि एक ही स्टूल नमूना से उत्पंन के लिए सुसंगत परिणाम दिखाने के लिए, लेकिन विभिंन पुस्तकालय की तैयारी के माध्यम से चला गया । प्रिंसिपल निर्देशांक विश्लेषण (PCoA) इनपुट डेटा की आयामी कम कर देता है कि नेत्रहीन नमूना जुदाई और समानता का पता लगाने के लिए UniFrac मैट्रिक्स पर इस्तेमाल किया गया था. दो नमूनों के बीच की दूरी उनकी microbiome रचना में अंतर का प्रतिनिधित्व करती है. (क) वेट UniFrac PCoA प्लाट. प्रत्येक बिंदु एक एकल अनुक्रम नमूना का प्रतिनिधित्व करता है । नमूने एक ही मूल स्टूल नमूना से उत्पंन एक ही रंग के हैं । नैदानिक सूक्ष्म जीव विज्ञान द्वारा सूचित सकारात्मक मल संस्कृति के साथ अस्पताल में भर्ती रोगियों से नमूने1 वर्गों द्वारा चिह्नित कर रहे हैं, संस्कृति के साथ रोगियों को अस्पताल में नकारात्मक त्रिकोण में1, और एक अलग sequencing से स्वस्थ वयस्कों1 भागो घेरे में भरे हुए चिह्नित हैं । (ख) एक में के रूप में एक ही PCoA, लेकिन नमूने अब Proteobacteria के अपने रिश्तेदार बहुतायत से रंग का है, के रूप में संकेत दिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्राइमरी का नाम प्राइमरी सीक्वेंस प्राइमर विवरण
फॉरवर्ड प्राइमर AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-TATGGTAATT-GT-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA 5 ' अनुकूलक अनुक्रम-फॉरवर्ड प्राइमर पैड-फॉरवर्ड प्राइमर linker-आगे प्राइमर
रिवर्स सूचकांक प्राइमर CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-XXXXXXXXXXXX-AGTCAGTCAG-CC-GACTACHVGGGTWTCTAAT 3 ' एडाप्टर अनुक्रम के पूरक रिवर्स-Golay बारकोड-रिवर्स प्राइमर पैड रिवर्स प्राइमर linker-रिवर्स प्राइमर
पढ़ें 1 sequencing प्राइमर TATGGTAATT-GT-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA फॉरवर्ड प्राइमरी पैड-फॉरवर्ड प्राइमरी लिंकर-फॉरवर्ड प्राइमरी
2 sequencing प्राइमर पढ़ें AGTCAGTCAG-CC-GGACTACHVGGGTWTCTAAT रिवर्स प्राइमरी पैड-रिवर्स प्राइमर लिंकर-रिवर्स प्राइमर
सूचकांक अनुक्रम प्राइमर ATTAGAWACCCBDGTAGTCC-जीजी-CTGACTGACT रिवर्स प्राइमर के विपरीत पूरक-रिवर्स प्राइमर linker के पूरक रिवर्स रिवर्स प्राइमर पैड के पूरक रिवर्स

तालिका 1: प्राइमर सूची ।

नमूना पुस्तकें पोस्ट की संख्या
प्रारंभिक गुणवत्ता नियंत्रण में
QIIME
निकासी और कमजोर पड़ने समाधान में साफ झाड़ू पर पीसीआर-1 118
निकासी और कमजोर पड़ने समाधान में साफ झाड़ू पर पीसीआर-2 39
बिना टेम्पलेट के पीसीआर-1 0
बिना खाके के पीसीआर-2 0
निष्कर्षण और कमजोर पड़ने समाधान पर पीसीआर mix-1 16
निष्कर्षण और कमजोर पड़ने समाधान पर पीसीआर mix-2 0
नमूने (± मानक त्रुटि मतलब है) १०६२२.५७ ± १२११.३४

तालिका 2: नकारात्मक नियंत्रण के लिए और मल नमूनों के लिए पढ़ता की संख्या ।

अनुपूरक सामग्री 1: डेटा संसाधन स्क्रिप्ट. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक सामग्री 2: मैपिंग फ़ाइल. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक सामग्री 3: प्राइमरी योजना । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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Discussion

16S rRNA-amplicon और metagenomics शॉटगन अनुक्रमण नैदानिक सूक्ष्म जीव विज्ञान अनुप्रयोगोंके21,22, 23में लोकप्रियता हासिल की है । इन तकनीकों को अपने में वृद्धि culturable और गैर culturable taxa पर कब्जा करने की क्षमता में लाभप्रद रहे हैं, रोगजनक इनोक्युलम के सापेक्ष बहुतायत के बारे में डेटा प्रदान करने, और उनके लिए और अधिक ठीक एक polymicrobial संक्रामक की पहचान करने की क्षमता फ़िंगरप्रिंट24. microbiome अनुसंधान के क्षेत्र में अग्रिम डेटा है कि आसानी से विभिंन दृष्टिकोण में निरंतरता की कमी के कारण तुलनीय नहीं कर रहे है की विशाल मात्रा में उत्पंन किया है । हाल के वर्षों में, कई संघ इन मुद्दों में से कुछ का पता करने का प्रयास किया है । इस प्रोटोकॉल पृथ्वी microbiome परियोजना (EMP) के रूप में इसी तरह की पुस्तकालय तैयारी का अनुसरण करता है । हालांकि, जोड़ा गया है एक विस्तृत कदम-दर-कदम के लिए डीएनए निष्कर्षण के माध्यम से मल के नमूनों के माध्यम से विश्लेषण पाइप लाइन ।

पहले, 16S rRNA अनुक्रमण स्वस्थ गैर अस्पताल में भर्ती विषयों और संदिग्ध संक्रामक दस्त के साथ अस्पताल में भर्ती रोगियों से मल के नमूनों की माइक्रोबियल संरचना पैटर्न की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया है, और पारंपरिक संस्कृति के परिणाम के लिए । कि विश्लेषण से परिणाम से पता चला कि अस्पताल में भर्ती रोगियों Proteobacteria जाति1से taxa में गहरा बढ़ता है । यहां वर्णित 16S rRNA जीन amplicon अनुक्रमण प्रत्यक्ष पीसीआर कॉलम-मुक्त दृष्टिकोण है कि मूल रूप से संयंत्र डीएनए के निष्कर्षण के लिए डिजाइन किया गया था का उपयोग कर के लिए मोटे तौर पर इस्तेमाल किया तरीकों का एक एकीकृत प्रोटोकॉल है16। इस दृष्टिकोण कुशलतापूर्वक और जल्दी से अच्छी गुणवत्ता वाले प्रवर्धित डीएनए पुस्तकालयों 16S rRNA जीन के V4 चर क्षेत्र उच्च प्रवाह 16S rRNA अनुक्रमण के लिए उपयुक्त नमूनों की एक बड़ी संख्या से लक्ष्यीकरण निकालने कर सकते हैं ।

इस के रूप में एक डीएनए आधारित अनुक्रमण विधि है, दोनों aerobes और anaerobes माइक्रोबियल समुदायों पर एक व्यक्ति मल नमूना में मौजूद डेटा प्राप्त कर रहे हैं । प्रोटोकॉल प्राइमरों कि मूलतः 16S rRNA जीन के V4 क्षेत्र के खिलाफ15 डिजाइन किए गए अपनाया । महत्वपूर्ण बात, रिवर्स प्रवर्धन प्राइमर एक बारह आधार बारकोड अनुक्रम है कि अप करने के लिए २,१६७ प्रत्येक लेन में विभिंन नमूनों की पूलिंग का समर्थन करता है15। आगे प्रवर्धन प्राइमर एडाप्टर क्षेत्र में नौ अतिरिक्त कुर्सियां अनुक्रमण मंच25 (तालिका 1 और अनुपूरक सामग्री 3) पर युग्मित अंत अनुक्रमण का समर्थन भी शामिल है । यह दृष्टिकोण एक लेन पर १०६२२.५७ ± १२११.३४ (± मानक त्रुटि मतलब) प्रति नमूना ~ 30 डॉलर की लागत से पढ़ता था कि 250 मल नमूनों से बना एक पुस्तकालय से निपटने के लिए सक्षम है ।

गुणवत्ता नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए, हम निम्न ऋणात्मक नियंत्रणों का उपयोग करने का सुझाव देते हैं; i) डीएनए के बिना पीसीआर टेंपलेट, द्वितीय) डीएनए पर पीसीआर एक साफ बाँझ झाड़ू से निकाली, और iii) मिश्रित निष्कर्षण और कमजोर पड़ने समाधान पर पीसीआर । सकारात्मक नियंत्रण के लिए के रूप में, हम एक ही स्टूल नमूना से उत्पंन नमूनों सहित अनुशंसा करते हैं, लेकिन आंतरिक गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में पिछले रन से अलग रिवर्स बारकोड प्राइमरों और नमूनों के साथ अलग पुस्तकालय तैयारी के माध्यम से चला गया । नोट की, अन्य वैकल्पिक सकारात्मक नियंत्रण का इस्तेमाल किया जा करने के लिए उन microbiome माप मानकों NIST द्वारा प्रदान कर रहे हैं. औसत नकारात्मक नियंत्रण के लिए कवरेज पढ़ता वास्तविक मल नमूनों की तुलना में उल्लेखनीय कम है (तालिका 1) और मुख्य रूप से माइकोप्लाज्मा taxa से बना था । हम आगे sequencing नमूने है कि प्रत्येक एक ही मल सामग्री से उत्पंन का उपयोग कर प्राप्त की निरंतरता दिखाया, लेकिन है कि अलग पुस्तकालय की तैयारी के माध्यम से चला गया (चित्रा 3) । यह परिणाम भी पुष्टि करता है कि, जब हमारे एकीकृत विधि का उपयोग कर, वहां नमूने के बीच कोई पार संदूषण है ।

इस प्रोटोकॉल में हम एक एकीकृत वर्दीधारी, व्यवहार्य प्रोटोकॉल लागू करने के लिए नमूनों की बड़ी संख्या का विश्लेषण । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य महत्वपूर्ण नियंत्रण का उपयोग करते हुए, मल संग्रह से डेटा विश्लेषण करने के लिए एक मजबूत, प्रजनन, उपयोग में आसान, सस्ती, विस्तृत तरीका में 16S rRNA-amplicon अनुक्रमण के उपयोग की शुरुआत करने में रुचि वैज्ञानिकों का मार्गदर्शन करना है । इस मानकीकृत विस्तृत निर्देशित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, बैच प्रभाव को कम करने और विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच और अधिक तुलनीय अनुक्रमण परिणामों की अनुमति हो सकती है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम I-कोर कार्यक्रम (अनुदान सं 41/11), इज़राइल विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान सं 908/15), और यूरोपीय Crohn और कोलाइटिस संगठन (ECCO) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primers Integrated DNA Technologies (IDT)
Extraction solution Sigma-Aldrich E7526
Dilution solution Sigma-Aldrich D5688
Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit KAPABIOSYSTEMS KK2601 PCR Master mix
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kit Invitrogen P7589 dsDNA quantify reagent
MinElute Gel extraction kit Qiagen 28606
Agarose Amresco 0710-250G
Ultra Pure Water Dnase and Rnase Free Biological Industries 01-866-1A
Qubit dsDNA HS assay kit Molecular probes Q32854 dsDNA detecting kit
High Sensitivity D1000 Agilent Technologies Screen Tape 5067-5582 separation and analysis
Screen Tape Assay Agilent Technologies Reagents 5067-5583 for DNA libraries
PhiX Control v3 Illumina 15017666 control library
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) Illumina MS-102-2003
Ethidium Bromide Amresco E406-10mL-TAM
2 mL collection tubes SARSTEDT 72.695.400 Safe Seal collection tubes
Plastic stick swab in PP test tube STERILE INTERIOR 23117
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
PCR Machine Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler
Sequncing Machine Illumina Miseq
PCR workstation Biosan UV-cleaner
scissors
vortexer Scientific Industries Vortex-Genie 2

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References

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जीव विज्ञान अंक 133 Microbiome 16S rRNA अनुक्रमण अगली पीढ़ी अनुक्रमण V4 चर क्षेत्र मल के नमूने पुस्तकालय की तैयारी
16S rRNA-Amplicon अनुक्रमण द्वारा मल माइक्रोबियल लक्षण वर्णन के लिए निर्देशित प्रोटोकॉल
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Di Segni, A., Braun, T., BenShoshan, M., Farage Barhom, S., Glick Saar, E., Cesarkas, K., Squires, J. E., Keller, N., Haberman, Y. Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing. J. Vis. Exp. (133), e56845, doi:10.3791/56845 (2018).

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