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Biochemistry

Capturer la cinétique de l’Interaction d’une protéine canal ionique avec petites molécules par le dosage de l’interférométrie Bio-couche

Published: March 7, 2018 doi: 10.3791/56846
Automatic Translation
1, 2, 1, 3
1Department of General Surgery, Tongren Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Key Laboratory of Systems Biomedicine (Ministry of Education), Institute of Systems Biomedicine, Shanghai Jiao Tong University, 3Hongqiao International Institute of Medicine, Tongren Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

Summary

Le protocole ici décrit les interactions de protéine purifiée hEAG1 de canal ionique avec la petite molécule lipidique ligand phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2). La mesure démontre que BLI pourrait être une méthode potentielle pour le dépistage de nouvelles petites molécules ion canal ligand.

Abstract

L’essai de l’interférométrie (BLI) bio-couche est un outil précieux pour la mesure des protéines et des interactions entre protéines à petites molécules. Nous décrivons ici tout d’abord l’application de cette nouvelle technique exempte d’étiquette pour étudier l’interaction des humains EAG1 protéines de canal (hEAG1) avec la petite molécule PIP2. canal de hEAG1 a été reconnu comme cible thérapeutique potentielle en raison de son aberrante surexpression dans les cancers et des mutations de gain de fonction un peu impliqués dans certains types de maladies neurologiques. Nous avons purifié hEAG1 protéines de canal d’un système d’expression stable chez les mammifères et mesuré l’interaction avec PIP2 par BLI. La mesure efficace de la cinétique de la liaison entre la protéine hEAG1 et PIP2 montre que le dosage BLI est une approche de haut débit potentielle utilisée pour le dépistage de nouvelles petites molécules ligand en pharmacologie des canaux ioniques.

Introduction

Ciblant les protéines de canal cellulaire ion surface accessible avec petites molécules offre un énorme potentiel pour le dépistage de ligand et découverte de médicaments biologiques1,2,3. Ainsi, un outil approprié est nécessaire pour l’étude de l’interaction entre les canaux ioniques et de petites molécules et de leur fonction correspondante. L’enregistrement de patch-clamp a été démontrée pour être une technique unique et irremplaçable dans test fonctionnel de canal ionique. Toutefois, déterminer si les petites molécules ciblent directement les canaux ioniques nécessitent des autres technologies. Traditionnellement, l’essai de liaison du ligand radioactif a été utilisé pour observer les cinétiques de liaison entre les petites molécules et de sa protéine cible de canal ionique. Cependant, l’utilisation de cette technique est limitée en raison de son exigence de marquage radioactif et la détection. Par ailleurs, l’étape préalable d’étiqueter le petit ligand dans l’étude empêche son utilisation dans de nombreux types de canaux ioniques sans ligand spécifique connu. Certaines techniques d’étiquette comme NMR spectroscopy, diffraction des rayons x, a petite Echelle thermophorèse (MST)4 et résonance plasmonique de surface (SPR) ont été utilisés pour mesurer les interactions de protéine-petite molécule. Mais ces types d’analyses habituellement ne peut pas fournir l’information requise en raison de la difficulté à obtenir la protéine pleine longueur, la faible résolution des dynamique, faible débit et le coût élevé de5. Contrairement à ces techniques, bio-couche interférométrie (BLI) s’impose comme une roman méthodologie exempte d’étiquette pour surmonter ces inconvénients pour la détection des interactions de protéine-petite molécule par un échantillon de protéines en petites quantités sur les surfaces de l’immobilisation Biocapteur et mesurer le changement d’optique des signaux6,7. Comme une plateforme de biocapteurs prometteur, technique de BLI est déjà effectuée pour observer l’interaction de petites molécules avec de l’eau naturelle des protéines solubles comme un anticorps monoclonal humain CR80208 et la procédure de test détaillée a été rapportée chez un précédent article9. Bien que le rôle clé de protéine canal ionique pour une nouvelle découverte de cibles thérapeutiques a été reconnu, le dosage d’interaction de protéine-petite molécule canal d’ion basée sur BLI n’a pas été décrite.

L’homme l’éther à Go-Go canaux (hEAG1) est exprimés dans divers types de cellules cancéreuses et du système nerveux central qui en fait la canal cible thérapeutique potentielle a de nombreux cancers et troubles neuronaux10,11, 12,13,14. L’étude électrophysiologique dans notre laboratoire a confirmé l’effet inhibiteur du phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) le hEAG1 canal15. Selon nos résultats, essais PIP2 directement l’interaction avec le hEAG1 en utilisant BLI technique peut être un modèle pour d’autres types d’interaction composé de molécule de protéine de petit canal ionique spécialement pour ces chaînes manquent des ligands spécifiques. Conformément aux instructions de dosage BLI, nous avons préparé biotinylé protéines hEAG1 et eux immobilisé sur la surface de streptavidine (SA) conseils de biocapteurs ont suivis par interaction aux solutions2 PIP pour observer leur liaison directe entre le les protéines et les lipides. Après que la fixation de PIP2 sur la surface recouverte de hEAG1 protéine, l’épaisseur de la couche sur la surface augmente, qui met en corrélation le décalage spectral directement et peut être mesurée en temps réel16. La cinétique de liaison peut être déterminée en raison d’un changement positif dans l’étape de l’association et un déplacement négatif à l’étape de dissociation. Selon ce principe, nous purifiée de la protéine de canal ionique hEAG1 fonctionnelle du système d’expression stable HEK-239T en utilisant la méthode de purification d’affinité pour maintenir l’État fonctionnelle in vitro , puis mesuré les cinétiques de liaison de différente concentration PIP2et donné une semblable données cinétiques tel qu’observé dans des mesures électrophysiologiques,15. L’étroite correspondance entre les résultats de la BLI et mesures électrophysiologiques démontrent pour la première fois la pertinence du BLI comme un outil d’analyse approprié pour l’interaction protéine-petite molécule ion canal membranaire.

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Protocol

Remarque : La lignée de cellules HEK-293 t exprimant continuellement FLAG-le tag hEAG1 protéine du canal est construite par transfectants un plasmide LENTIVIRAUX pCDH contenant la séquence d’ADN de hEAG1 avec un drapeau à l’extrémité C-terminale distale dans les cellules HEK-293 t suivie par la résistant à la puromycine sélection décrite précédemment15.

1. affinity Purification de drapeau-le tag hEAG1 canal protéique des cellules HEK-293 t

  1. Décongelez les cellules exprimant de manière stable des chaînes de hEAG1 de l’azote liquide dans l’eau chaude (37 ° C) rapidement. Les cellules (environ 5 x 106 congelés des cellules) des graines dans un plat de 10 cm. Croissance de la cellule pendant la nuit dans modifiée de l’aigle de Dulbecco (DMEM) additionné de sérum bovin fœtal de 8 mL 10 % (FBS), 100 unités/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 4 mM de L-glutamine et changé le milieu le lendemain.
  2. Vérifier la fluorescence GFP de ces cellules HEK-293 t en utilisant un microscope à fluorescence pour s’assurer que le pourcentage élevé de cellules stablement express hEAG1 canaux dans le système de culture. Exponentiellement trypsinize les cellules en croissance avec 1 mL de 0,25 % de trypsine pendant 1 min à température ambiante et thenadd 2 mL de milieu de culture contenant du sérum de mettre fin à la digestion. Transférer 400 ml de suspension cellulaire dans un plat de 15 cm contenant 15 mL de milieu DMEM complet. Préparer quatre plats de 15 cm au total.
  3. La récolte de ces cellules après 2 – 3 jours culture lorsque les cellules atteignent environ 90 % confluence.
    1. Enlever le milieu de croissance des cellules et laver deux fois avec 4 mL de tampon phosphate salin (1 x PBS, pH = 7,4).
    2. Éliminez le PBS après lavage.
    3. Racler les cellules dans PBS 1 x 2 mL pour chaque plat à l’aide de gratter de la cellule et le transfert des cellules grattées avec 1 mL pipette dans un tube de 15 mL.
    4. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 420 x g à 4 ° C.
    5. Décanter et éliminer le surnageant.
    6. Resuspendre le culot cellulaire au total 4 mL de tampon de lyse (10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 1 % NP-40, pH 7.0, inhibiteur de la protéase complet confinée) pendant 30 minutes sur la glace et vortex soigneusement le lysat toutes les 10 min.
    7. Centrifuger la cellule lysate pendant 10 min à 12 000 x g à 4 ° C.
    8. Transférer le surnageant dans un tube de 5 mL et gardez-le sur la glace pour une utilisation immédiate.
  4. Préparer la résine Anti-Flag M2.
    1. Bien suspendre la résine (fournie sous forme de suspension dans un tampon magasin 50 %) par inversion douce pour s’assurer que la bouteille de gel d’Anti-Flag M2 affinité est une suspension uniforme de billes de gel.
    2. Transférer immédiatement 400 μl de suspension dans un tube réfrigéré 1,5 mL.
    3. Centrifuger la suspension pendant 30 s à 8, 000 x g à 4 ° C et éliminer le liquide surnageant avec soin de laver le tampon du magasin.
    4. Ajouter 500 μL 1 x PBS à la résine et suspendre le culot avec pipette 1 mL. Centrifuger la suspension pendant 30 s à 8, 000 x g à 4 ° C et jeter le surnageant PBS avec soin. Répétez ces pas de lavage pour effacer la mémoire tampon stockée.
  5. Ajouter 500 μl protéine extrait de surnageant préparé à l’étape 1.3.8 à la pastille de résine pour suspendre le culot et transférer la suspension dans un nouveau tube réfrigéré 5 mL. Répétez cette étape pour s’assurer ne billes de gel à gauche. Ajouter l’extrait de protéine gauche au mélange.
  6. Incuber le mélange toute la nuit sur un agitateur à 8 tr/min à 4 ° C pour capturer la protéine de fusion de drapeau.
  7. Centrifuger le mélange après 12 h d’incubation à 10 min à 1, 000 x g à 4 ° C.
  8. Jeter le surnageant et laver le culot trois fois avec 500 μl de PBS 1 x. Gardez-le sur la glace pour une utilisation immédiate.
  9. Protéine d’élution le drapeau hEAG1 avec 3 x peptide de drapeau.
    1. Préparer la solution d’élution 3 X FLAG. Dissoudre 3 peptide X FLAG dans la solution mère de 500 μL (0,5 M 1 M NaCl, Tris-HCl pH = 7,5) à une concentration de 8 μg/μL.
    2. Ajouter 10 μL de 3 x solution d’élution drapeau à 390 μL de PBS comme une solution de concentration finale de 200 ng/μl.
    3. Ajouter 400 ml de solution d’élution du pavillon de 3 x pour les billes de gel préparés à l’étape 1.8.
    4. Incuber l’échantillon à l’agitateur à 8 tr/min pendant 2 h à 4 ° C.
    5. Centrifuger la résine pendant 30 s à 8, 000 x g.
    6. Transférer le surnageant dans un tube de frais 1,5 mL et conserver à 4 ° C pour une utilisation immédiate.

2. concentration dosage et Confirmation du drapeau purifiée Fusion hEAG1 par BCA Protein Assay Kit et Western Blotting

  1. Déterminer la concentration de protéine purifiée à l’aide de la trousse de dosage de protéine BCA selon les instructions du fabricant.
  2. Utiliser 30 μL échantillon pour analyse occidentale pour confirmer que la protéine d’intérêt avait été purifiée en utilisant un anticorps anti-drapeau comme décrit précédemment15.

3. étiquetage la protéine purifiée de canal avec de la biotine pour le dosage BLI

  1. Préparer 5 mg/mL solution biotine dans du PBS. Pour chaque test (deux biocapteurs), ajouter un excès molaire 3 fois de biotine à 20 μg purifiée de protéines pour atteindre une préférable biotinylation N-terminale de la protéine purifiée dans du PBS.
  2. Incuber l’échantillon dans l’obscurité sur la glace pendant au moins 30 min.
  3. Préparer le tampon de dilution (SD) : PBS avec 0,02 % polysorbate 20 et 0,1 % albumine sérique bovine (BSA, pH 7,4).
  4. Effectuer l’ultrafiltration pour modifier la mémoire tampon de la protéine purifiée canal au tampon de SD. Retirez la biotine indépendante en utilisant le dispositif de l’ultrafiltration avec seuil de poids moléculaire de 30 kDa, ajoutant de la mémoire tampon de SD et centrifugation de l’échantillon à 12 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.
  5. Retirez l’ultrafiltrate le tube à centrifuger de dispositif d’ultrafiltration, ajouter 200 μL de tampon de SD dans le dispositif de filtration et de centrifugation de l’échantillon à 12 000 x g pendant 10 min à 4° C. Répétez cette opération au moins trois fois.
  6. Pour collecter la mémoire tampon échangée, échantillon, inversé Insérez le périphérique de filtre dans un tube de 1,5 mL et eux centrifugation à 2 000 g, pendant 5 min à 4 ° C. Conserver l’échantillon sur la glace pour une utilisation immédiate.

4. préparation de la Solution2 PIP pour dosage

  1. Préparer la solution de PIP2 (1 mM) dans désionisée H2O par sonification pendant 30 min sur glace comme décrit précédemment17. Conserver la solution dans des flacons en verre à-20 ° C et le diluer pour les concentrations finales immédiatement avant les expériences par agitation vigoureuse.

5. BLI Assay

  1. Allumez l’appareil et vérifier la fenêtre « statut d’instrument » pour confirmer que la machine est à l’état « prêt » à préchauffer l’appareil au moins pendant 30 min avant l’étude BLI.
  2. Assurez-vous que la porte de l’instrument est fermée avant d’ouvrir le logiciel d’Acquisition de données et sur la « nouvelle expérience cinétique » dans l’Assistant de l’expérience.
  3. Définir les puits à utiliser sur la plaque à 96 puits par clic droit choisir tampon, charge et échantillon. Pour les puits d’échantillon, l’unité de concentration de protéine de hEAG1 biotinylé drapeau fusion devrait être entrée comme molaire (10 μg, 0,09 μM).
  4. Définir les étapes de test, y compris chargement, association et dissociation de base. Choisissez une étape de test et cliquez deux fois sur la colonne respective. Un double de la définition de dosage est défini pour les capteurs de contrôle. Définir le nombre de tours que 1000. Choisissez 1 min pour l’étape de base à 5 – 10 min pour le chargement, association et dissociation, respectivement. Effectuer l’essai à température ambiante (environ 24 ° C).
    Remarque : Il existe deux méthodes principales : la protéine du canal biotinylé aux capteurs de chargement et analyse de l’interaction avec les petites molécules. Ils peuvent être procédés en continu (base, chargement, baseline, association et dissociation). Alternativement, ils peuvent être traitées séparément pour ne pas gaspiller les composés d’essai lorsque le premier chargement partie infructueuse.
  5. Cliquez sur les colonnes qui contiennent les capteurs, puis cliquez sur le « remplissage » pour indiquer l’emplacement des capteurs dans le plateau de la sonde.
  6. Examiner des mesures tout planifiés pour vérifier pour les erreurs et de revenir en arrière pour y remédier.
  7. Définir l’emplacement des fichiers de données et cliquez sur « Go » pour démarrer le test.
    Remarque : Les capteurs doivent prewetted pendant au moins 10 min dans un tampon de la SD, si cette étape n’a été faite, alors le paramètre « Retardé le début de l’expérience » doit être ignoré. Si ce n’est pas le cas, définissez un délai s 600 avant humidifié les capteurs.
  8. Mettre une plaque à 96 puits noire dans le fond du bac et insérer le coin A1 de la plaque dans l’encoche située sur le plateau de la plaque de siège. Pour les puits charger les capteurs, 200 μL de tampon / puits ajouter dans 2 puits à la ligne A et 2 puits à la ligne B de la plaque à 96 puits.
  9. Préparer une autre plaque à 96 puits noire comme la plaque d’échantillon et remplir les puits avec 200 μL SD de tampon à la ligne B sous contrôle ou biotinylé hEAG1 solution de protéine (10 μg) à la ligne A attribué lors de la programmation à l’étape 5.3.
    NOTE : Éviter l’introduction de bulles.
  10. Ouvrir la porte de l’instrument et insérez le plateau sonde et plaque l’échantillon dans le porte-plaque droite et gauche, respectivement. Vérifier que la plaque de plateau et échantillon de capteur sont positionnés correctement en fonction de la forme du support de plaque gauche et le marqueur « A1 » dans le coin supérieur droit du titulaire de la plaque de droite. Fermer la porte et commencez le test.

6. analyse de données

  1. Ouvrez le logiciel d’analyse de données et le dossier contenant les données de test de charge. Cliquez sur « Processing » pour entrer dans l’interface du menu traitement et nous pouvons voir les courbes de cinétiques bruts colorés.
  2. Sous étape 1: « La sélection de données », cliquez sur « Sélection de capteur ». Sur le « capteur plateau #1 », cliquez sur les puits de capteur seulement humidifiée avec du tampon de SD et faites un clic droit de « Modifier le Type de capteur » à « Capteur de référence ». Sur la ' carte de plaque échantillon », désigner tous les puits de non-spécifiques et faites un clic droit de « Changement bien Type » pour « Référence bien ».
  3. Cocher dans la boîte avant de « Soustraction » de l’étape 2 et le point « Double référence ».
  4. À l’étape 3: « Aligner Y Axis », sélectionnez « De base » comme l’étape de l’alignement. Pour « Plage horaire », entrer dans les 10 derniers s de cette ligne de base (c'est-à-dire de : 0,1 à : 59,8).
  5. À l’étape 4: « inter-Étape Correction », sélectionnez « Aligner à ligne de base » pour minimiser les déplacements de signal entre les étapes de l’association et de dissociation.
  6. À l’étape 5: « Processus », sélectionnez la fonction de filtrage Savitzky-Golay dans la plupart des cas et procéder « Traiter les données ».
  7. Enregistrer les données brutes pour une analyse ultérieure données à l’aide d’autres logiciels à l’étape 7 : « Enregistrer les résultats ».
  8. Cliquez sur « analyse | Ajustement de courbe ».
    1. « Étape à analyser », choisissez « Association | Dissociation ». Pour le « Modèle », sélectionnez 1:1.
      Remarque : nous choisissons 1:1 modèle car il monté bien sur nos données d’origine et d’éviter la possibilité de sur raccord sous 1 / 2 ou 2:1 modèle en raison de leur plus grande liberté. Mais les autres options sont disponibles ici et peuvent être convenablement choisies pour toute autre analyse de montage pour les modèles de liaison différente de l’analyte.
    2. « Raccord », choisissez Global (complet). Pour « Group By », sélectionnez « Couleur ». Sélectionnez « Rmax non-liés par capteur » pour permettre un montage indépendant de la réponse de signal maximal (Rmax).
    3. Cliquez sur « Fit courbes ! » pour commencer l’analyse de régression non linéaire. Équation de Hill et de la fonction exponentielle simple ont été utilisés dans notre étude.
    4. Cliquez sur « exporter des données | Enregistrer le rapport » pour sauver la mise en place des résultats. Ou cliquez sur « exporter des données | Exporter les résultats de l’ajustage de précision » pour enregistrer les données brutes pour l’analyse de données et de graphiques supplémentaires avec d’autres logiciels.

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Representative Results

Nous avons purifié la protéine de canal de hEAG1 de fusion drapeau de hEAG1 stablement surexprimée de cellules HEK-293 t. La fonction de cette protéine de fusion a été démontrée en utilisant la méthode de patch clamp et la qualité et la spécificité de la protéine purifiée sont confirmées par Western blot (Figure 1). La protéine purifiée de canal est biotinylé pour effectuer une analyse de l’interaction avec les lipides (PIP2) à l’aide de l’analyse en temps réel de BLI. La configuration de test de liaison BLI est illustrée à la Figure 2. Une courbe typique de liaison entre hEAG1 et PIP2 est illustrée à la Figure 3. Dans ce cas, 3 μM PIP2 est dissous dans la solution tampon PBS (la configuration de PIP2 apparaît complémentaire Figure1), et le signal est analysé en utilisant un protocole de soustraction double référence à soustraire la liaison non spécifique (la liaison entre capteur et PIP2), background (l’interaction entre la protéine hEAG1 biotinylé et PBS) et dérive (la liaison entre le capteur et PBS) causée par la variabilité de capteur de signaux. Et la trace de la liaison est à l’échelle mondiale s’adapter et montrée une superposition bien ajustée (complémentaire Figure 2). En outre, nous mesurons les cinétiques de liaison de la PIP2 sur le canal de hEAG1 purifié complex en incubant les protéines à différentes concentrations de PIP2. Après analyse, nous obtenons une valeur de (Kd) constante de dissociation de 0,35 ±0.04 μM, qui est similaire à la valeur de50 IC obtenue par des mesures électrophysiologiques15. Ces résultats ont démontré que le dosage BLI est approprié pour ion channel membrane protéines et lipides analyse des interactions.

Figure 1
Figure 1 : Identification de l’expression, fonction et spécificité de la protéine recombinante hEAG1 des cellules HEK-293 t par imagerie de la GFP, patch clamp et tache occidentale, respectivement. (A) le système de HEK-293 t hEAG1 expression stable est établie avec succès par anticorps monoclonaux résistant à la puromycine sélection après la transfection avec système de lentivirus hEAG1-pCDH exprimée par l’expression de la GFP dans presque toutes les cellules. Impulsion (B) du protocole (en haut) et superposé actuels traces d’un représentant cellule entière patch clamp enregistrement de canaux hEAG1 dans une cellule stable à l’a. Le courant est provoqué par la dépolarisation des tensions de la tension de tenue de -80 mV à 70 mV avec l’étape de 10 mV suivie de repolarisation à -80 mV. Les cellules sont incubées dans la voie normale de K+ enregistrement des solutions comme décrit plus haut15. Les courants de potassium vers l’extérieur de voltage-dépendants suggèrent que les chaînes fonctionnelles hEAG1 sont fortement exprimés dans les cellules HEK293T. (C) la tache occidentale de protéine canal hEAG1 des échantillons de protéine purifiée. L’anticorps anti-drapeau reconnaît une seule bande protéique de ~ 110 kDa, démontrant une pleine longueur d’expression des canaux drapeau-le tag hEAG1. Cette Figure 1 a été modifié par Han et al. 15. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : un schéma montrant le protocole d’essai de liaison BLI. Quatre capteurs sont utilisés en parallèle en protéines biotinylées-canal ou leur tampon SD dissous pour charger les protéines de canal et les références. Après cela, ces quatre capteurs sont transférés pour l’essai de phase pour détecter l’association et dissociation avec sa solution de tampon ou de phospholipides. Les positions des protéines-canaux, phospholipides et tampon sont de couleur comme indiqué. Horizontal rouge en pointillés indique les deux principales étapes de l’étude BLI : chargement phase et phase de test d’interaction. Cette Figure 2 a été modifié par Han et al. 15. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : captures d’écran montrant les données brutes et les données traitées dans une étude BLI typique. Courbes de charge et équilibrage typique (A) montrant l’étape d’équilibration (60 s) avec SD-tampon (de base), l’étape de chargement avec les protéines de l’hEAG1 (chargement) et la courbe de référence équilibrées et chargé avec des protéines de hEAG1 (chargement), simultanées mesure des deux extrémités du capteur individuel. (B) les lignes verticales rouges indiquent le transfert des capteurs de la solution de lipides à la solution tampon pendant le fonctionnement du test. (C) l’original optique des signaux lors des phases d’association et de dissociation après le traitement de la soustraction de la double référence à soustraire les signaux non-spécifiques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Résulte de dosage BLI montrant les protéines de canal hEAG1 interagissant directement avec PIP2. Capture d’écran (A) montrant les données brutes de liaison aux protéines hEAG1 avec PIP2 à la manière de concentration-dépendance (0,03 – 3 μM). Les concentrations accumulées de PIP2 dénotée correspondant à des traces de données des biocapteurs. (B) le traitement des données brutes montrant les changements en interférence optique en différentes concentrations de PIP2 lors d’un test représentatif. (C) courbe cadre avec l’équation de Hill, obtenue à partir de la valeur de crête du signal des interférences optiques mesurée à différentes concentrations de2 PIP pour déterminer les constantes de dissociation d’équilibre (Kd) de l’interaction entre la protéine canal hEAG1 et PIP2 (n = 3). La Figure 4 b et 4C ont été modifiés de Han et al. 15. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaire Figure 1 : la configuration de longue chaîne phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

Supplémentaire Figure 2 : capture d’écran de la superposition équipée de l’essai BLI de la Figure 3. Les données sont traitées et montées et affichées seulement les phases d’Association et de Dissociation. La courbe de données traitées est bleue et la courbe de montage non linéaire est rouge. Qualité de l’ajustement : R2 = 0.984789, X2 = 0.019109. Le paramètre de liaison maximale (Rmax) = 0,2875 nm (± 0.0006). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

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Discussion

Canaux ioniques membranaires ont été vérifiées comme les principales cibles thérapeutiques de plus de 13 % des médicaments connus pour le traitement d’une variété de maladies humaines, y compris les troubles cardiovasculaires et neurologiques,18. Patch-clamp de l’enregistrement, la méthode de référence pour mesurer le fonctionnement des canaux ioniques à petites molécules, a été utilisée pour les ligands de canal d’ion de dépistage. Cependant, ces approches électrophysiologiques ne peuvent démontrer que les petites molécules se lie au canal directement ou pas19, car la petite molécule pourrait agir sur d’autres protéines ou voies intercellulaires qui interagissent avec le canal. Par rapport à l’essai de liaison du ligand radioactif et autres méthodes couramment utilisées biocapteur exempte d’étiquette employé couramment, BLI a des avantages significatifs en termes de disposition simple relative, la phase d’association sans restriction, haut dans l’ensemble, conception de dosage plus près à le système in vivo et a besoin d’une petite quantité de protéines immobilisées (quelques μg) et il peuvent fournir un aperçu détaillé de données cinétiques5,6,20.

Afin de simuler les au maximum la situation in vivo , nous avons purifié les protéines de canal hEAG1 fonctionnelle de la mammifère stablement système d’expression. Un protocole simple et efficace pour purification et identification de la protéine de canal d’ion surexprimée des cellules mammifères adhérentes est présenté. Quelques conseils importants pour la réussite purification des protéines membranaires sont : 1) le processus de purification peut être réduite ou mise à l’échelle en place selon l’abondance de l’expression des protéines d’intérêt dans des systèmes d’expression chez les mammifères ; 2) nous avons fusionné une étiquette d’indicateur sur la partie C terminale du canal de hEAG1 pour faciliter la purification de cette protéine avec des billes d’Anti-Flag d’affinité en utilisant le protocole commercial de kit et de purification. Une mesure électrophysiologique a démontré que la fusion drapeau n’a aucun effet sur la fonction de ce canal15; 3) incubation du mélange de perles Anti-Flag et extrait de protéine durant la nuit à 4° C en agitant doucement est utile pour la capture de la protéine de fusion drapeau ; 4) à l’aide de la purification d’affinité, nous pouvons obtenir assez protéine de canal d’ion hEAG1 de quatre plats de 15 cm avec au-dessus de 90 % de cellules confluency pour une fois les processus de test.

Les protéines de canal hEAG1 purifiée sont biotinylated en utilisant excès biotine (3-10 fois) et en échangeant la solution tampon avec un tampon SD pour le dosage BLI supplémentaire. La biotine excès peut modifier au maximum la protéine membranaire de canal pour augmenter l’efficacité enduite sur la surface des conseils de biocapteur et le tampon de SD contenant de faibles concentrations de BSA et de Polysorbate 20 peut réduire au minimum la liaison non spécifique9. En dépit de procéder à ces opérations, les interactions non idéal pourraient subsistent surtout lors de l’exécution d’une étude de liaison avec la forte concentration de petites molécules, qui pouvaient non spécifiquement lié à la surface de capteurs de SA et résultat le interaction de faux-positifs comme la courbe de cyanine illustrée à la Figure 4 a. Ainsi, un protocole de soustraction double référence est toujours nécessaire d’obtenir des résultats fiables en soustrayant les liaisons non spécifiques, y compris les interactions entre le capteur et la petite molécule, protéine hEAG1 biotinylé avec solution de petites molécules, et capteurs avec solution de petites molécules. Cette opération de soustraction double référence nécessite quatre biocapteurs de dosage pour une fois. Deux biocapteurs seront enduits biotinylé protéines de la membrane et le traitement de l’interaction de dosage avec petite molécule et sa mémoire tampon. Les deux autres capteurs seront mouillées avec tampon de SD et d’interagir avec les petites molécules et de sa mémoire tampon. Seule l’interaction de la protéine membranaire immobilisé biocapteur et petites molécules montre le signal positif et le reste de l’interaction de trois signaux travaux que les contrôles (Figure 2). En utilisant cette procédure, comme le montre la Figure 3 et Figure 4, nos résultats clairement démontrent la forte interaction entre les protéines de canal de hEAG1 et PIP2 et montrent un profil de concentration-dépendance. Il doit souligner qu’il y a plusieurs limites à notre mesure. Par exemple, il y a quelques autres lipides membranaires qui pourraient lier à la protéine purifiée de canal. En outre, il n’est pas encore clair que si la protéine purifiée ancrée garder leur conformation et leur activité initiale. Il est très difficile de mesurer les configurations réelles des lipides de petite molécule lorsqu’ils interagissent avec les protéines. Bien que les processus détaillés sont inconnues, notre étude montrent que la cinétique de la liaison par BLI sont conformes à celles résultant d’un enregistrement électrophysiologique, ce qui en fait la demande de BLI roman d’interaction de protéine-petite molécule canal ion dans un manière complémentaire.

En résumé, notre étude confirme que c’est une stratégie fiable de purification de la protéine de la membrane fonctionnelles du système d’expression chez les mammifères pour détecter l’interaction directe avec ses ligands. L’application réussie de BLI pour interaction de protéine-petite molécule membranaire facilitera l’exploration de dépistage et mécanisme de petites molécules dans la découverte de médicaments pour le canal ionique.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par Bio-ID Center et SJTU fonds interdisciplinaire de recherche en médecine et ingénierie (YG2016QN66), Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31271217) et National base Research Programme of China (2014CB910304).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/High Glucose Medium HyClone SH30243.01
Phosphate Buffered Saline (1x) HyClone SH30256.01
Fetal Bovine Serum Gibco 10270
Penicillin/Streptomycin Gibco 1697550
Cell Culture Dish Corning 430599 150 mm X 25 mm
Nonidet P-40 Substitute Amresco E109
Sodium chloride BBI Life Sciences A610476
Potassium chloride BBI Life Sciences A610440
Bovine Serum Albumin BBI Life Sciences A600332
Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate BBI Life Sciences A600560
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma A2220
3x FLAG peptide Sigma F4799
Octet-RED96 Pall/FortéBio 30-5048
Data Acquisition software Pall/FortéBio Version 7.1
Data Analysis software Pall/FortéBio Version 7.1
Biosensor/Streptavidin Pall/FortéBio 18-5019
Microtiter plate Greiner Bio-one 655209
Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin ThermoFisher 21338
Centrifugal Machine ThermoFisher 75004250
PageRuler Prestained Protein Ladder ThermoScientific 318120
Ultrafiltration device MILLIPORE UFC503008 NMWL of 30 kDa
phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) Sigma P9763
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody Sigma F1804 1:2000 dilution
goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody Santa Cruz Biotechnology sc-2005 1:5000 dilution
Enhanced BCA Protein Assay Kit Beyotime P0010
Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche 04693159001
Amersham Imager 600 Imaging System GE Healthcare Bio-Sciences
Western blot system BIO-RAD

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References

  1. Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery. Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
  2. van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics. J. Med. Chem. 44 (9), 1313-1333 (2001).
  3. Papo, N., Shai, Y. Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: Differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides. Biochemistry. 42 (2), 458-466 (2003).
  4. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100-106 (2010).
  5. Fechner, P., et al. Size does matter! Label-free detection of small molecule-protein interaction. Anal. Bioanal. Chem. 406 (17), 4033-4051 (2014).
  6. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of Bio-Layer Interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J. Pharm. Biomed. Anal. 72, 150-154 (2013).
  7. Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25 (7), 669-676 (2011).
  8. Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
  9. Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects. J. Vis. Exp. (84), e51383 (2014).
  10. Occhiodoro, T., et al. Cloning of a human ether-a-go-go potassium channel expressed in myoblasts at the onset of fusion. Febs Lett. 434 (1-2), 177-182 (1988).
  11. Pardo, L. A., Stuhmer, W. Eag1: An emerging oncological target. Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).
  12. Simons, C., et al. Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy. Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).
  13. Kortum, F., et al. Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome. Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).
  14. Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System. Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).
  15. Han, B., et al. Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations. Sci. Rep. 6, (2016).
  16. Do, T., et al. A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins. PREP. 60 (2), 147-150 (2008).
  17. Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides. J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).
  18. Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
  19. Suh, B. C., Hille, B. PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why? Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).
  20. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55659 (2017).

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Biochimie numéro 133 Bio-couche interférométrie (BLI) protéine de canal ionique petite molécule purification d’affinité de protéine système d’expression stable chez les mammifères EAG1 humaine (hEAG1) canal la découverte de médicaments cibles thérapeutiques dépistage de ligand
Capturer la cinétique de l’Interaction d’une protéine canal ionique avec petites molécules par le dosage de l’interférométrie Bio-couche
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Han, B., Zhang, M., Sun, P., Hou, S. Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay. J. Vis. Exp. (133), e56846, doi:10.3791/56846 (2018).

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