Summary
İletişim kuralı küçük molekül lipid ligand phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) ile arıtılmış hEAG1 iyon kanal protein etkileşimleri açıklar. Ölçüm BLI roman küçük molekül iyon kanal ligand tarama için potansiyel bir yöntem olabilir gösterir.
Abstract
Biyo-katman Interferometry (BLI) tahlil protein-protein ve protein-küçük molekül etkileşimleri ölçmek için değerli bir araçtır. Burada, ilk romanı bu etiket içermeyen teknik uygulanması insan EAG1 etkileşiminin çalışma için tarif (hEAG1) kanal proteinler küçük molekül PIP2. hEAG1 kanal potansiyel terapötik hedef olarak onun anormal overexpression kanserler ve birkaç işlev kazanç mutasyonlar nörolojik hastalıklar bazı türleri dahil nedeniyle kabul edilmiştir. HEAG1 kanal proteinler bir memeli istikrarlı ifade sisteminden saflaştırılmış ve PIP2 BLI tarafından etkileşim ölçülür. HEAG1 protein ve PIP2 arasında bağ Kinetik başarılı ölçümü BLI tahlil iyon kanal Farmakoloji roman küçük molekül ligand tarama için kullanılan bir potansiyel yüksek üretilen iş yaklaşımı göstermektedir.
Introduction
Hücre yüzey erişilebilir iyon kanal proteinler küçük moleküller ile hedefleme ligand tarama ve biyolojik ilaç keşif1,2,3için muazzam bir potansiyel sunmaktadır. Böylece, uygun bir araç iyon kanal ve küçük moleküller ve onların karşılık gelen işlev arasındaki etkileşimi eğitimi için gereklidir. Yama-kelepçe kayıt iyon kanal fonksiyonel tahlil bir eşsiz ve yeri doldurulamaz teknik olmak kanıtlanmıştır. Ancak, diğer teknolojiler gerektirir küçük moleküller doğrudan iyon kanalları hedef olup olmadığını belirleme. Geleneksel olarak, radyoaktif ligand bağlayıcı tahlil onun hedef iyon kanal protein arasındaki küçük molekül bağı Kinetik gözlemlemek için kullanıldı. Ancak, bu tekniğin kullanımı onun gereksinimi nedeniyle radyoaktif etiketleme ve algılama sınırlıdır. Ayrıca, çalışma odasında küçük ligand etiketlemek için önkoşul adım onun iyon kanalları bilinen belirli ligand olmadan birçok türleri kullanarak engeller. Bazı etiket içermeyen teknikleri NMR spektroskopisi, x-ışını kırınım, microscale thermophoresis (MST)4 ve yüzey plasmon rezonans (SPR) gibi protein-küçük molekül etkileşimleri ölçmek için kullanılmaktadır. Ama bu tür deneyleri genellikle zorluk nedeniyle tam uzunlukta protein, düşük çözünürlüklü dynamics, iş hızı düşük ve yüksek maliyet5almak için yeterli bilgileri sağlayamaz. Bu tekniklerin aksine, biyo-katman Interferometry (BLI) protein-küçük molekül etkileşimleri küçük miktarlarda protein örnek yüzeylerinde immobilizing tarafından tespit için bu sakıncaları üstesinden gelmek için yeni bir etiket içermeyen metodoloji olarak ortaya çıkıyor Biyoalgılayıcı ve optik değiştirme ölçme sinyalleri6,7. Umut verici bir Biyoalgılayıcı platform olarak alma tekniği zaten küçük moleküller arasındaki etkileşimin doğal su ile bir insan monoklonal antikoru CR80208 gibi çözünebilir proteinler gözlemlemek için gerçekleştirilir ve detaylı tahlil yordamı bildirilmiştir bir Önceki madde9. Her ne kadar yeni tedavi hedefleri keşif için iyon kanal protein anahtar rolü kabul edilmiştir, BLI üzerinde dayalı iyon kanal proteini-küçük molekül etkileşim tahlil tarif değil.
İnsan eter à go- kanalları (hEAG1) kanser hücrelerinin ve merkezi sinir sistemi birçok kanser ve nöronal bozuklukları10,11, kanal a potansiyel terapötik hedef kılan çeşitli dile getirdi 12,13,14. Laboratuarımızın Elektrofizyolojik çalışmada phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) hEAG1 kanal15üzerinde inhibitör etkisi onaylamıştır. İyon kanal proteini-küçük molekül bileşik etkileşimi özellikle belirli ligandlar eksik kanalları için diğer türleri için bir model olarak alma tekniği kullanarak hEAG1 ile etkileşim olabilir doğrudan PIP2 test sonuçlarımız temel. Saçınıza tahlil talimatlara hEAG1 protein biotinylated hazırlanan ve onları etkisiz hale streptavidin (SA) yüzeyinde Biyoalgılayıcı ipuçları etkileşim tarafından onları PIP2 çözümleri arasında doğrudan kendi bağlama gözlemlemek için takip protein ve lipit. HEAG1 protein kaplı yüzey, yüzey tabakasının kalınlığı PIP2 eki artırır sonra hangi doğrudan spektral shift ilişkili olan ve gerçek zamanlı16' ölçülebilir. Bağlama Kinetik Derneği adım olumlu bir kayma ve ayrılma adım negatif bir kayma nedeniyle belirlenebilir. Bu ilkeye göre biz vitro fonksiyonel durumunu korumak için benzeşme arıtma yöntemini kullanarak fonksiyonel hEAG1 iyon kanal proteini HEK-239T istikrarlı ifade sistemden arıtılmış sonra bağlama Kinetik ölçülen farklı konsantrasyon2PIP ve Elektrofizyolojik ölçümleri15dakika içinde gözlemlediği gibi bir semblable Kinetik veri vermiştir. Saçınıza sonuçlarından ve Elektrofizyolojik ölçümler arasındaki yakın ilişkiyi ilk kez BLI uygunluğu iyon kanal membran protein-küçük molekül etkileşim için uygun bir analitik araç olarak göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: bir pCDH lentiviral plazmid DNA dizisini distal C-terminus bir bayrak ile hEAG1 ardından HEK-293T hücreleri içeren transfecting tarafından sürekli olarak bayrak öğesini hEAG1 kanal proteini ifade HEK-293T hücre satırı oluşturulur puromisindir dayanıklı seçimi daha önce15açıklandığı gibi.
1. benzeşme arıtma bayrak öğesini hEAG1 kanal protein HEK-293T hücrelerden
- Stabil sıvı azot hEAG1 kanalları sıcak suya (37 ° C) hızlı bir şekilde ifade hücreleri çözülme. Hücreleri (yaklaşık 5 x 106 hücre dondurulmuş) bir 10 cm tabak içinde tohum. Hücren de çalışsın geceleme Dulbecco'nın modifiye kartal (DMEM) orta 8 mL % 10 fetal sığır serum (FBS), 100 adet/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 4 mM L-glutamin ile desteklenmiş ve orta ertesi gün değişti.
- Bu HEK-293T hücrelerinin GFP floresan hücreleri yüksek oranda stabil kodlamayla sistemdeki hEAG1 kanalları hızlı emin olmak için floresan mikroskop kullanarak kontrol edin. Katlanarak büyüyen hücreleri % 0.25 tripsin 1dk oda sıcaklığında ve thenadd 2 mL serum içeren kültür sıvı sindirim sona erdirmek için 1 mL ile trypsinize. Hücre süspansiyon, 400 μL tam DMEM orta 15 mL içeren bir 15 cm çanak aktarın. Toplam dört 15 cm yemekleri hazırlamak.
-
Bu hücreler hücreleri yaklaşık %90 ulaştığında kültür 2-3 gün sonra hasat confluency.
- Büyüme orta hücrelerdeki kaldırmak ve tamponlanmış fosfat ile iki kez 4 mL serum fizyolojik yıkayın (1 x PBS, pH 7.4 =).
- PBS yıkandıktan sonra atın.
- Hücreleri hücre kazıma ve transfer 1 mL alıntı hücrelerle 15 mL tüp içine pipet kullanarak 2 mL 1 x PBS için her yemeğin içine kazı.
- Hücre süspansiyon vasıl 420 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi
- Dikkatle boşaltmak ve süpernatant atın.
- Buz ve girdap iyice lysate her 10 min 30 dk için hücre Pelet lizis arabellek (10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl2, 10 mM NaCl, %1 NP-40, pH 7,0, içerdiği tam proteaz inhibitörü) toplam 4 ml resuspend.
- Hücre lysate, 12.000 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi
- Süpernatant 5 mL tüp aktarmak ve buz için acele kullanma üstünde tutun.
-
Anti-bayrak M2 benzeşme reçine hazırlayın.
- İyice (% 50 süspansiyon mağaza arabelleği olarak sağlanan) reçine Anti-bayrak M2 benzeşme jel şişe bir tek tip Süspansiyon Jel boncuklar olduğundan emin olmak için nazik INVERSION tarafından askıya alma.
- Hemen 400 μL süspansiyon, bir soğutulmuş 1,5 mL tüp aktarın.
- Süspansiyon için 30 s 8, 000 x g 4 ° C'de santrifüj kapasitesi ve dikkatle mağaza arabellek yıkamayı süpernatant atın.
- 500 μL 1 x PBS için reçine ekleyin ve 1 mL pipet ile Pelet askıya alma. Süspansiyon için 30 s 8, 000 x g 4 ° C'de santrifüj kapasitesi ve süpernatant PBS dikkatli atın. Bunlar tekrar saklı arabellek temizlemek için yıkama adım.
- Adım 1.3.8 reçine pelet pelet askıya alma ve süspansiyon için yeni bir soğutulmuş 5 mL tüp aktarmak için hazırlanmış 500 μL protein özü süpernatant ekleyin. Tekrar yok jel boncuklar sol emin olmak için bu adımı yineleyin. Sol protein özü karışıma ekleyin.
- Bir shaker 4 ° C'de bayrak füzyon protein yakalamak için 8 rpm'de gecede karışımı kuluçkaya.
- Karışımı 10 dk 1, 000 x g 4 ° C'de için 12 h kuluçka sonra santrifüj kapasitesi
- Süpernatant atın ve Pelet üç kez 1 x PBS 500 μL ile yıkayın. Buz için acele kullanma tutun.
-
3 x bayrağı peptid elüsyon bayrak hEAG1 protein.
- 3 X bayrağı elüsyon çözüm hazırlamak. 3 X bayrağı peptid 500 μL stok çözelti içinde erimesi (0.5 M Tris-HCl, 1 M NaCl, pH 7,5 =), 8 μg/μL bir konsantrasyon.
- 10 μL 3 bayrak elüsyon çözüm x 200 ng/μL son konsantrasyonu çözüm olarak PBS 390 μL için ekleyin.
- 3 x bayrağı elüsyon çözüm 400 μL 1.8 adımda hazırlanan jel boncuklar ekleyin.
- Örneği için 4 ° C'de 2 h 8 devirde shaker'kuluçkaya
- Reçine 30 santrifüj kapasitesi s 8, 000 x g.
- Süpernatant temiz 1.5 mL tüp aktarın ve acil kullanım için 4 ° C'de depolayın.
2. konsantrasyon tahlil ve saf bayrak onay füzyon hEAG1 BCA Protein tahlil Kit ve Western Blot tarafından
- Saf protein üretimi'nın öğretim göre BCA protein tahlil seti kullanarak konsantrasyonu belirlemek.
- Batı analiz için 30 μL örnek faiz protein yukarıda açıklanan15bir anti-bayrak antikor kullanarak saf edilmiştir onaylamak için kullanın.
3. BLI tahlil için Biotin ile arıtılmış kanal Protein etiketleme
- 5 mg/mL PBS biotin hisse senedi çözümde hazırlayın. Her test (iki biyosensörler) için tercih edilir bir N-terminal biotinylation PBS saf protein elde etmek için 20 μg saf protein bir 3 kat molar fazlalığı biyotin ekleyin.
- Örnek için en az 30 dakika buzda karanlıkta kuluçkaya.
- Örnek seyreltme (SD) arabellek hazırlamak: PBS ile %0,02 polysorbate 20 ve %0,1 sığır serum albumin (BSA, pH 7,4).
- Ultrafiltrasyon arıtılmış kanal proteini arabellek SD arabelleğe değiştirmek için gerçekleştirin. İlişkisiz biotin Ultrafiltrasyon aygıt 30 kDa molekül ağırlığı kesim ile kullanarak, SD arabelleği ekleyerek ve örneği 12.000'centrifuging kaldırmak için 4 ° C'de 10 dakika g x
- Ultrafiltrate Ultrafiltrasyon aygıt, santrifüj tüpü çıkarması 200 μL SD arabellek filtre cihazın içine ekleyin ve örneği 4 ° C'de 10 dakika için 12.000 x g'centrifuging Bu işlem en az üç kez tekrarlayın.
- Değiş tokuş arabellek toplamak için örnek, tersine eklemek filtre aygıt 1,5 mL tüp ve onları 4 ° C'de 5 min için 2.000 x g, centrifuging Örnek için acele kullanma buz üzerinde tutun.
4. tahlil için PIP2 çözüm hazırlanması
- PIP2 (1 mM) hisse senedi çözüm deiyonize H2O buz gibi yukarıda açıklanan17üzerinde 30 dk sonicating hazırlayın. Çözüm cam şişeleri-20 ° C'de depolayın ve hemen önce deneyler son konsantrasyonları tarafından dinç vortexing oranında seyreltin.
5. BLI tahlil
- Ekipman açmak ve makine ekipman en az 30 dk önce Saçınıza çalışma için prewarm için "hazır" devlet olduğunu onaylamak için "araç durumu" penceresini denetleyin.
- Kapıyı enstrümanın veri toplama yazılım açmadan önce kapalı olduğundan emin olun ve "Yeni Kinetik deney" Deneme Sihirbazı'nda seçtiğiniz.
- 96-şey plaka üzerinde yanında doğru tıkırtı arabellek, yük ve örnek seçmek için kullanılacak kuyu tanımlayın. Örnek kuyular için biotinylated bayrağını füzyon hEAG1 protein konsantrasyonu birimi olarak giriş molar (10 μg, 0.09 mikron).
- Temel yükleme, dernek ve ayrılma, dahil olmak üzere tahlil adımları tanımlar. Bir tahlil adım seçin ve çift tıkırtı üstünde belgili tanımlık anılan sıraya göre sütun. Tahlil tanımının bir yinelenen denetim algılayıcılar için ayarlanır. Devir/dakika 1000 ayarlayın. Temel adım 1 dakika ve 5-10dk yükleme, dernek ve ayrılma, sırasıyla seçin. Oda sıcaklığında (yaklaşık 24 ° C) testi gerçekleştirmek.
Not: İki ana yordam vardır: biotinylated kanal proteini sensörlere yükleme ve küçük molekül bileşikler ile etkileşim raporlaması. Sürekli olarak devam (temel, yükleme, temel, dernek ve ayrılma). Alternatif olarak, onlar ayrı ayrı ilk yükleme bölüm ne zaman başarısız test bileşikler israf önlemek için devam. - Sensörler içeren ve "dolgu" algılayıcı sensör tepsisinde konumlarını belirtmek için tıklatın sütunlar'ı tıklatın.
- Hataları için kontrol edin ve bunları düzeltmek için geri dönmek için tüm planlı adımları gözden geçirin.
- Veri dosyalarının konumunu belirleyip tahlil başlatmak için "Go" düğmesini tıklatın.
Not: Bu adımı yapılırsa, o zaman "deney başlangıç gecikmeli" ayarı atlanması sensörler için en az 10 dk içinde SD tampon, prewetted. Eğer değilse, sensörler prewetting önce 600 s gecikme ayarlayın. - Tepsiyi alt kısmında siyah bir 96-şey plaka koymak ve plaka oturtmak için tepsi çentiği plaka A1 köşesine yerleştirin. Sensörler yüklemek kuyular için tahlil arabelleği iyi başına 200 μL satır A 2 wells ve satır B 96-şey plaka 2 kuyu içine ekleyin.
- Başka bir siyah 96-şey plaka örnek plaka olarak hazırlamak ve kuyular 200 μL SD arabellekte satır B ile satır sırasında adım 5.3 programlamada atanmış olarak A Denetim veya biotinylated hEAG1 protein çözüm (10 μg) doldurun.
Not: kabarcıklar tanıtan kaçının. - Aç kapıyı enstrümanın ve sensör tepsisini yerleştirin ve plaka sırasıyla sol ve sağ plaka yuvasına örnek. Sensör tepsi ve örnek plaka konumlandırılmış doğru sol plaka sahibi ve üzerinde sağ plaka sahibi sağ üst köşesinde "A1" marker şeklini temel kontrol edin. Kapıyı kapatın ve tahlil başlatın.
6. veri analizi
- Veri analiz yazılımı açın ve tahlil veri içeren klasör yüklemek. "İşleme menü arayüzü almak için işleme" tıklatın ve renkli ham Kinetik eğrileri görebilirsiniz.
- Adım 1altında: "Veri seçimi", "Sensör seçimi"'i tıklatın. Üzerinde "sensör Kaset #1", sensör wells ile SD tampon sualtındaki sadece tıklatın ve "Algılayıcı türünü değiştir" "Referans sensör" için sağ tıklatın. Üzerinde ' örnek plaka harita ", tüm non-spesifik bağlama kuyuları belirlemek ve"İyi türünü değiştir""Referans de"için sağ tıklatın.
- Kutusunda önce adım 2 "çıkarma" kene ve "Çift Kişilik başvuru" yu.
- Adım3: "Y ekseni Hizala", "Temeli" hizalama adım seçin. "Zaman aralığının" son 10 girin s o temellerin (yani dan: 0.1: 59.8).
- Adım4: "Arası adım düzeltme", seçin "hizalama satır taban çizgisine" sinyal vardiya Derneği ve ayrılma adımlar arasında en aza indirmek için.
- Adım5: "İşlem", çoğu durumda Çetinkaya-deniyordun süzme işlevi seçin ve "İşlem veri" devam edin.
- Daha fazla adım 7'de başka bir yazılım kullanarak veri analiz ham verileri kaydetmek: "Save Results".
-
Tıklatın "analiz | Eğri uydurma".
- "Adım için analiz için", seçmek "Derneği | Ayrılma". "Modeli", 1: 1'i seçin.
Not: çünkü bizim orijinal verileri de donatılmış ve uygun altında üzerinden olasılığını kaçınılması biz 1:1 model seçin 1:2 ya da 2:1 model yüksek özgürlüklerini nedeniyle. Ama diğer seçenekler burada mevcuttur ve uygun farklı bağlama modelleri analit için diğer uygun analiz için seçilebilir. - İçin "uygun", Global (tam) seçin. "Group By için", "Renk" seçeneğini seçmek. "Rmax bağlantısız tarafından maksimal sinyal yanıt (Rmax) bağımsız uygun izin duyumsal-e doğru" seçin.
- "Uygun eğrileri!" tıklatın doğrusal olmayan regresyon analizi başlatmak için. Hill denklem ve tek Üstel fonksiyon bizim çalışmada kullanılmıştır.
- Tıklatın "veri ihracat | Raporu Kaydet"sonuçları uygun kaydetmek için. Veya tıklatın "veri ihracat | Uygun sonuçlar verme"diğer yazılımlar ile daha fazla grafik ve veri analiz için ham veri kurtarmak için.
- "Adım için analiz için", seçmek "Derneği | Ayrılma". "Modeli", 1: 1'i seçin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz HEK-293T hücreleri stabil overexpressed hEAG1 bayrak füzyon hEAG1 kanal protein saf. Bu füzyon proteinin işlevini yama-kelepçe yöntemi kullanılarak kanıtlanmıştır ve kalite ve saf protein özgüllüğü Western blot (şekil 1) tarafından onaylanır. Arıtılmış kanal proteini biotinylated lipidler (PIP2) ile bir etkileşim tahlil gerçekleştirmek için gerçek zamanlı BLI tahlil kullanmaktır. Saçınıza bağlama tahlil yapılandırma Şekil 2' de gösterilmiştir. HEAG1 ve PIP2 arasında tipik bağlama eğrisi şekil 3' te gösterilmiştir. Bu durumda, 3 mikron PIP2 (PIP2 yapılandırmasına ek şekil 1' de gösterilen) PBS arabellekte çözünmüş ve sinyal non-spesifik bağlama (çıkarmak için bir çift başvuru çıkarma protokolü kullanılarak analiz sensör ve PIP2arasında bağlama), (biotinylated hEAG1 protein ve PBS arasındaki etkileşimi) arka plan ve sensör değişkenlik tarafından neden drift (sensör ve PBS arasında bağ) sinyal. Ve bağlama izleme genel olarak uygun ve iyi uygun bindirme (ek Şekil 2) gösterilir. Ayrıca, proteinler PIP2farklı konsantrasyonlarda kuluçka tarafından PIP2 saf hEAG1 kanalına karmaşık bağlama Kinetik ölçüyoruz. Analiz sonra biz hangi15Elektrofizyolojik ölçümler elde ŞA50 değeri benzer bir ayrılma sabit (Kd) değeri 0.35 ±0.04 mikron, olsun. Bu sonuçlar BLI tahlil iyon kanal membran protein ve yağlar etkileşim analizi için uygun olduğunu gösterdi.
Şekil 1: ifade, fonksiyon ve özgüllük rekombinant hEAG1 protein yanında GFP düşsel, HEK-293T hücrelerden tanımlaması patch kelepçe ve western blot, sırasıyla. (A) istikrarlı ifade hEAG1 HEK-293T sistemi başarıyla kurulduğunda monoklonal puromisindir dayanıklı seçimden sonra transfection ile hEAG1-pCDH lentivirus sistem tarafından GFP ifade neredeyse tüm hücrelerdeki kanıtladığı gibi. (B) nabız (üst) protokol ve gelen bir temsilcisi bütün hücreli yama-A. istikrarlı bir hücrede hEAG1 kanallardan kayıt kelepçe geçerli izleri üst üste Akım voltaj-80 holding gerilimi depolarize tarafından elde edildi 70 mV mV 10 adım ile mV-80 için repolarization tarafından takip mV. Hücreleri15daha önce açıklandığı gibi çözümleri kayıt normal K+ kanalda inkübe. Voltaj bağımlı dışa potasyum akımları fonksiyonel hEAG1 kanalları son derece HEK293T hücrelerde ifade edilir öneririz. (C) Western blot hEAG1 kanal protein saf protein örneklerinden. Anti-bayrak antikor ~ 110 kDa, bir tam uzunlukta bayrak öğesini hEAG1 kanal ifade gösteren bir tek protein grup tanır. Bu rakam 1 c Han ve ark. değiştirildi 15. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: BLI bağlama tahlil Protokolü gösteren bir şematik diyagramı. Dört sensörler paralel biotinylated kanallı proteinler veya çözünmüş onların SD arabellek kanal proteinler ve başvuruları yüklemek için kullanılır. Bundan sonra bu dört sensörler faz Derneği ve fosfolipitler veya onun çözüm arabellek ayırma algılamak için tahlil için transfer edilir. Kanal proteinler, fosfolipitler ve arabellek konumlarını belirtildiği gibi renkte görünür. Yatay kırmızı noktalı çizgi BLI çalışmanın iki önemli adımları gösterir: aşama ve etkileşim tahlil aşama yükleme. Bu Şekil 2 Han ve ark. değiştirildi 15. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: ekran yakalar ham veri ve işlenen verileri tipik bir BLI çalışmada gösterilen. (A)tipik yükleme ve denge eğrileri denge adım gösterilen (60 s) SD-tampon (satır taban çizgisi), yükleme adım hEAG1 proteinler (yükleme) ve başvuru eğrisi ile equilibrated ve hEAG1 proteinler ile (yükleme), aynı anda yüklü iki bireysel sensör ipuçları ölçümü. (B) sensörleri lipid çözümden arabellek çözüm için tahlil işleminde aktarma dikey kırmızı çizgilerle gösterilir. (C) optik orijinal sinyalleri Çift Kişilik başvuru çıkarma işleme sonra dernek ve ayrılma aşamaları, non-spesifik bağlama sinyalleri çıkartmak için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: HEAG1 kanal proteini PIP2ile doğrudan etkileşim gösterilen BLI tahlil gelen sonuçlar. (A)ekran yakalama hEAG1 protein bağlayıcı PIP2 ham veri konsantrasyon-bağımlılık şekilde gösterilen (0.03-3 mikron). PIP2 birikmiş konsantrasyonları biyosensörler veri izlemeler için karşılık gelen gösterilir. (B) temsilcisi bir tahlil PIP2 farklı konsantrasyonlarda görme duyusuyla ilgili girişim değişiklikleri gösteren ham veri işleme. (C) eğrisi farklı PIP2 konsantrasyonları etkileşimi denge ayrılma sabitleri (Kd) belirlenmesi için ölçülen optik parazit sinyal tepe değeri elde edilen Hill denklem tam anlamıyla uyum hEAG1 kanal protein ve PIP2 arasında (n = 3). Şekil 4B ve 4 C Han ve ark. değiştirildi 15. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek şekil 1: uzun zincirli phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) yapılandırmasını. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.
Ek Şekil 2: ekran yakalama şekil 3 BLI testin üzerinden monte düzeninin. Veri işlenir ve donatılmış ve yalnýzca Derneği ve ayrılma aşamalar gösterilir. İşlenmiş veri eğri mavi ve doğrusal olmayan uydurma eğrisi kırmızı. Uyum iyiliği: R2 X2 0.984789 = 0.019109 =. Maksimal bağlama parametre (Rmax) 0.2875 = nm (± 0,0006). Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Membran iyon kanalları üzerinden %13 insan hastalıkları, kardiyovasküler ve nörolojik bozukluklar18de dahil olmak üzere çeşitli tedavi için şu anda bilinen ilaçların birincil tedavi hedefi olarak doğrulanmıştır. Yama-kelepçe, kayıt iyon kanalları ile küçük moleküller, fonksiyonel ölçmek için altın standart yaygın olarak kullanılan iyon kanal ligandlar için eleme. Ancak, küçük molekül diğer proteinler ve kanal ile etkileşim hücreler arası yollar üzerinde hareket olabilir çünkü böyle Elektrofizyolojik yaklaşımlar küçük moleküller bağlar olup olmadığını doğrudan kanal veya değil19, gösteremiyor. Yaygın olarak kullanılan radyoaktif ligand bağlayıcı tahlil ve diğer sık kullanılan etiket içermeyen Biyoalgılayıcı yöntemleri ile karşılaştırıldığında, BLI göreli basit düzenleme, sınırsız Derneği faz, yüksek tahlil tasarım daha yakın için boyunca açısından önemli avantajlara sahiptir ın-vivo sistem ve immobilize protein (birkaç μg) ve az miktarda ihtiyaç Kinetik veri5,6,20ilgili ayrıntılı bilgiler sağlayabilir.
Sonuna kadar vivo içinde durum benzetimi yapmak için biz fonksiyonel hEAG1 kanal proteinler memeli dan stabil saf ifade sistem. Arıtma ve overexpressed iyon kanal proteini yapisan memeli hücrelerinden tanımlaması için kolay ve etkin bir protokol sunulmuştur. Membran proteinlerinin başarılı arıtma için bazı önemli ipuçları: 1) arıtma işlemi ölçekli aşağı veya ölçekli-up faiz proteinler ifade zenginliği memeli ifade sistemlerinde; göre olabilir 2) biz ticari seti ve arıtma protokolünü kullanarak anti-bayrak benzeşme boncuk ile bu proteinin arıtma kolaylaştırmak için hEAG1 kanal C terminus sırasında bayrak etiket erimiş. Elektrofizyolojik bir ölçüm füzyon bayrak bu kanal15fonksiyonu üzerinde hiçbir etkisi gösterdi; 3) kuluçka Anti-bayrak boncuk ve protein özü gecede 4° C'de hafifçe sallayarak ile karışımı bayrak füzyon protein yakalamak için yararlıdır; 4) kullanarak benzeşme arıtma, biz yeterli hEAG1 iyon kanal protein % 90 hücrenin üstündeki dört 15 cm yemekleri ile bir kez tahlil işlemlerinde confluency alabilirsiniz.
Saf hEAG1 kanal biotinylated fazlalığı biyotin (3-10 kat) kullanarak ve SD arabelleği daha fazla BLI tahlil için çözüm önbellekle alışverişi proteinlerdir. Fazlalığı biyotin sonuna kadar Biyoalgılayıcı ipuçları yüzeyi kaplı verimliliğini artırmak için membran kanal proteini değiştirebilirsiniz ve BSA ve Polysorbate 20 düşük konsantrasyonlarda içeren SD tahlil arabellek nonspesifik bağlama9en aza indirebilirsiniz. Bu anahtar işlemleri devam rağmen ideal olmayan etkileşimleri hala özellikle sigara özellikle SA sensörler ve sonucu yüzeye bağlı küçük molekül yüksek konsantrasyon ile bağlama çalışma işlemi sırasında oluşabilir şekil 4Agösterilen siyanür eğri olarak yanlış pozitif etkileşim. Böylece, bir çift başvuru çıkarma protokol sensör ve küçük molekül, küçük molekül solüsyonu, biotinylated hEAG1 protein arasındaki etkileşimler de dahil olmak üzere özel olmayan bağlamaları çıkararak güvenilir sonuçlar elde etmek hala gereklidir ve Algılayıcılar küçük molekül solüsyonu geçirin. Bu Çift Kişilik başvuru çıkarma işlemi dört biyosensörler ihtiyacı bir kez tahlil. İki biyosensörler biotinylated zar proteinleri ve devam etmeden etkileşim tahlil küçük molekül ve onun tampon ile kaplı. Diğer iki sensörleri SD tampon ve küçük molekül ve onun tampon ile etkileşim ile ıslak olacak. Sadece etkileşim membran protein Biyoalgılayıcı immobilize ve küçük molekül olumlu sinyal ve üç etkileşim sinyalleri çalışma dinlenme denetimleri (Şekil 2) gösterilir. Bu yordamı kullanarak, şekil 3 ve şekil 4, gösterildiği gibi bizim sonuçları açıkça hEAG1 kanal proteinler ve PIP2 arasında güçlü etkileşim göstermek ve konsantrasyon-bağımlılık profili göster. Bu bizim ölçümdeki bazı sınırlamaları vardır işaret gerekir. Örneğin, dağıtılan ve arıtılmış kanal proteini bağlayan bazı diğer membran lipidler vardır. Ayrıca, hala belli değil olup özgün biçimi ve etkinlik bağlantılı saf protein tutmak. Onlar protein ile etkileşim sırasında küçük molekül lipidler gerçek yapılandırmaları ölçmek çok zordur. Ayrıntılı işlemler bilinmeyen olmasına rağmen bizim çalışma göstermek bağlama Kinetik BLI tarafından roman BLI uygulama için iyon kanal proteini-küçük molekül etkileşiminde yapar Elektrofizyolojik kayıt elde tutarlı bir takıma giren bir şekilde.
Özet olarak, bizim çalışma bu onun ligandlar ile doğrudan etkileşim algılamaya memeli ifade sistemi işlevsel membran protein arındırıcı tarafından güvenilir bir strateji olduğunu doğrular. ALMA başarılı uygulama membran protein-küçük molekül etkileşim için iyon kanal ilaç keşif küçük molekül tarama ve mekanizması keşif kolaylaştıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bu eser biyo-ID Center ve tıp ve mühendislik (YG2016QN66), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31271217) ve ulusal temel araştırma programı Çin (2014CB910304) SJTU disiplinler arası araştırma fonu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose Medium | HyClone | SH30243.01 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | HyClone | SH30256.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 1697550 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430599 | 150 mm X 25 mm |
| Nonidet P-40 Substitute | Amresco | E109 | |
| Sodium chloride | BBI Life Sciences | A610476 | |
| Potassium chloride | BBI Life Sciences | A610440 | |
| Bovine Serum Albumin | BBI Life Sciences | A600332 | |
| Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate | BBI Life Sciences | A600560 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| 3x FLAG peptide | Sigma | F4799 | |
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | |
| Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin | ThermoFisher | 21338 | |
| Centrifugal Machine | ThermoFisher | 75004250 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | ThermoScientific | 318120 | |
| Ultrafiltration device | MILLIPORE | UFC503008 | NMWL of 30 kDa |
| phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) | Sigma | P9763 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody | Sigma | F1804 | 1:2000 dilution |
| goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | 1:5000 dilution |
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0010 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04693159001 | |
| Amersham Imager 600 Imaging System | GE Healthcare Bio-Sciences | ||
| Western blot system | BIO-RAD |
References
- Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery. Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
- van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics. J. Med. Chem. 44 (9), 1313-1333 (2001).
- Papo, N., Shai, Y. Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: Differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides. Biochemistry. 42 (2), 458-466 (2003).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100-106 (2010).
- Fechner, P., et al. Size does matter! Label-free detection of small molecule-protein interaction. Anal. Bioanal. Chem. 406 (17), 4033-4051 (2014).
- Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of Bio-Layer Interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J. Pharm. Biomed. Anal. 72, 150-154 (2013).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25 (7), 669-676 (2011).
- Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects. J. Vis. Exp. (84), e51383 (2014).
- Occhiodoro, T., et al. Cloning of a human ether-a-go-go potassium channel expressed in myoblasts at the onset of fusion. Febs Lett. 434 (1-2), 177-182 (1988).
- Pardo, L. A., Stuhmer, W. Eag1: An emerging oncological target. Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).
- Simons, C., et al. Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy. Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).
- Kortum, F., et al. Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome. Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).
- Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System. Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).
- Han, B., et al. Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations. Sci. Rep. 6, (2016).
- Do, T., et al. A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins. PREP. 60 (2), 147-150 (2008).
- Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides. J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Suh, B. C., Hille, B. PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why? Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55659 (2017).
