Overview
Diálisis es una técnica común utilizada en bioquímica para separar moléculas basadas en difusión. En este procedimiento, una membrana semipermeable permite el movimiento de ciertas moléculas basado en el tamaño. Este método puede ser aplicado a la remoción de búfer, conocida como la desalación, o intercambiando buffer moléculas o iones de una solución proteica.
Este video cubre los principios de la diálisis junto con un procedimiento general. repasan varias aplicaciones de la diálisis, incluyendo la eliminación de reactivos degradados después de ultracentrifugación, quitando detergente después de una proteína de membrana extracción y la reconstitución de proteínas cambiando el ambiente de solución.
muestras bioquímicas suelen tienen concentraciones de tampón alta que pueden interrumpir el procesamiento descendente y análisis. La diálisis es una técnica común y económica utilizada para separar moléculas basadas en difusión. El método utiliza una membrana semipermeable que permite el movimiento de ciertos componentes, basado en el tamaño. Este video le mostrará los conceptos de diálisis, un procedimiento general y algunas de sus aplicaciones en bioquímica.
el aspecto más importante de la diálisis es una membrana semipermeable que tiene poros que imponen un peso molecular de corte, permitiendo que las moléculas por debajo de un cierto tamaño para pasar a través. Por ejemplo, una membrana k 10 generalmente conserva las moléculas más grandes que 10 kilodaltons. Sin embargo, el corte de peso molecular no es un límite discreto o precisa. La membrana contiene típicamente una amplia gama de tamaños de poro, por lo que una pequeña fracción de las moléculas cerca de la corte puede perderse.
Ya que el corte de peso molecular se define mediante proteínas globulares, moléculas lineales de masa similar, como el DNA o el RNA, puede deslizarse a través de. Membranas por lo general se eligen una mitad a un tercio del peso molecular de la molécula deseada.
Para realizar el procedimiento, una muestra se coloca en la membrana, que a su vez se agrega a un gran volumen de solución, llamado el dializado. Con el tiempo, moléculas más pequeñas se difundirán libremente a través de la membrana entre la muestra y el dializado, mientras que las biomoléculas más grandes se llevan a cabo dentro de. La diálisis es un proceso lento. Es común para permitir que se ejecute durante la noche, o incluso a través de varios días.
Si el dializado es agua pura, la concentración total del tampón disminuirá, un proceso conocido como la desalación. Si la solución contiene otras partículas pequeñas, algunas se moverán en la muestra, a cambio de buffer. Porque la diálisis es un proceso de equilibrio, el dializado puede actualizar varias veces para desplazar otras moléculas pequeñas. Una vez que el proceso de la muestra es nuevamente recogida para su posterior procesamiento.
Ahora que te ' he visto los fundamentos de la diálisis, dejó ' s echa un vistazo a un procedimiento general.
antes de comenzar el procedimiento, la membrana se presoaked en el dializado. Esto hace más fácil de usar y conservantes. Una vez listos, la muestra se recoge normalmente con una jeringa y luego se agrega al contenedor de diálisis. Esto puede ser tubería desnuda, o dentro de un cassette. Exceso de aire se quita de la instalación de diálisis para maximizar la muestra ' superficie s con la membrana. La configuración se coloca en el dializado con agitación para maximizar la difusión. Debe flotar para no inhibir agitación.
El dializado se cambia a intervalos pertinentes como se alcanza el equilibrio entre la muestra y del dializado. Después del último cambio, la reacción se deja típicamente para funcionar durante la noche. Después de un período de tiempo suficiente, el buffer libre - intercambiada muestra o se retira de la cassette. Una vez recogida, la muestra puede ser analizada o la tramitación, según la naturaleza del experimento.
ahora que ' ve vieron un procedimiento de diálisis general, que ' s ver algunas de las formas de esta técnica se utiliza en bioquímica.
Gradientes de densidad deson una forma común para separar muestras biológicas complejas. Este concepto basa en la distribución en pequeñas partículas, generalmente sacarosa o cesio los iones del cloruro. Una vez finalizada, estos reactivos normalmente es necesario retirar antes de que se puede procesar la muestra recogida. Diálisis, es posible utilizar la muestra purificada para futuros análisis.
Ciertas proteínas se encuentran dentro de una célula ' bicapa de lípido s y son generalmente estudiaron por entremezcla en vesículas lipídicas esféricas conocidas como liposomas. Las proteínas y los lípidos se extraen primero con un detergente. Diálisis se puede utilizar para quitar lentamente el detergente, formando proteoliposomes.
Después de la purificación, algunas proteínas son mal o desnaturalizadas, conduce a una pérdida en la funcionalidad. Los compuestos que causan estos cambios en la estructura pueden ser removidos con diálisis, llevando a la reforma del funcionamiento de los analitos.
te ' ve a Miró JoVE ' s video en diálisis. Ahora usted debe entender este método basado en la difusión, un procedimiento experimental simple y el uso de esta técnica.
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