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Biology

Cynomolgus बंदरों में प्लाज्मा MicroRNA स्तर के निरपेक्ष ठहराव, मात्रात्मक वास्तविक समय रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर का उपयोग

Published: February 12, 2018 doi: 10.3791/56850
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Medicinal Safety Research Laboratories, Daiichi Sankyo Co., Ltd.

Summary

इस रिपोर्ट में प्लाज्मा miRNA के निरपेक्ष स्तर को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन, मात्रात्मक वास्तविक समय रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर के साथ या बिना पूर्व प्रवर्धन का उपयोग कर. इस प्रोटोकॉल प्लाज्मा miRNAs की मात्रा की बेहतर समझ affords और विभिंन अध्ययनों या प्रयोगशालाओं से इसी डेटा के गुणात्मक मूल्यांकन की अनुमति देता है ।

Abstract

RT-qPCR व्यक्तिगत लक्ष्य miRNAs का आकलन करने के लिए सबसे आम तरीकों में से एक है. MiRNAs स्तर आम तौर पर एक संदर्भ नमूने के सापेक्ष मापा जाता है । यह दृष्टिकोण लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति के स्तर में शारीरिक परिवर्तन की जांच के लिए उपयुक्त है । हालांकि, निरपेक्ष ठहराव बेहतर सांख्यिकीय विश्लेषण का उपयोग जीन अभिव्यक्ति के स्तर के एक व्यापक आकलन के लिए अच्छा है । निरपेक्ष ठहराव अभी भी आम उपयोग में नहीं है । इस रिपोर्ट के साथ या पूर्व प्रवर्धन के बिना RT-qPCR का उपयोग कर, प्लाज्मा miRNA के निरपेक्ष स्तर को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है ।

EDTA-प्लाज्मा के एक निश्चित मात्रा (२०० µ एल) सचेत cynomolgus बंदरों की ऊरु नस (n = ५०) से एकत्र रक्त से तैयार किया गया था । कुल आरएनए वाणिज्यिक उपलब्ध प्रणाली का उपयोग कर निकाला गया था. प्लाज्मा miRNAs जांच-आधारित आरटी-qPCR परख जो miRNA-विशिष्ट फॉरवर्ड/रिवर्स पीसीआर प्राइमर और जांच द्वारा quantified थे । मानक curves निरपेक्ष ठहराव के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिंथेटिक आरएनए oligonucleotides का उपयोग कर उत्पंन किया गया । एक सिंथेटिक cel-मीर-२३८ सामान्यीकरण और गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए एक बाहरी नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. miRNAs कि ठहराव चक्र (सीक्यू) ३५ ऊपर मूल्यों दिखाया पहले qPCR कदम से पहले परिवर्धित थे ।

इनमें से 8 miRNAs की जांच की, मीर-१२२, मीर-133a, और मीर-१९२ पूर्व प्रवर्धन के बिना detectable थे, जबकि मीर-1, मीर-२०६, और मीर-499a की आवश्यकता पूर्व उनके कम अभिव्यक्ति के स्तर के प्रवर्धन । पूर्व-प्रवर्धन के बाद भी मीर-208a और मीर-208 बी का पता नहीं लगा. नमूना प्रसंस्करण दक्षता नुकीला cel-मीर-२३८ के सीक्यू मूल्यों द्वारा मूल्यांकन किया गया था । इस परख विधि में, तकनीकी भिन्नता से कम 3 गुना होने का अनुमान था और ठहराव (LLOQ) की निचली सीमा थी 102 कॉपी/µ l, अधिकांश के लिए जांच की miRNAs.

इस प्रोटोकॉल प्लाज्मा miRNAs की मात्रा का एक बेहतर अनुमान प्रदान करता है, और विभिंन अध्ययनों से इसी डेटा के गुणवत्ता मूल्यांकन की अनुमति देता है । शरीर के तरल पदार्थ में miRNAs की कम संख्या को ध्यान में रखते हुए, पूर्व प्रवर्धन खराब व्यक्त miRNAs का पता लगाने को बढ़ाने के लिए उपयोगी है ।

Introduction

अध्ययन की बढ़ती संख्या निदान और कैंसर का निदान, या निगरानी और नैदानिक और नैदानिक अध्ययन में अन्य बीमारियों का पता लगाने के लिए के रूप में microRNAs (miRNAs) की खोज कर रहा है1,2,3 . मात्रात्मक वास्तविक समय रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर (RT-qPCR) सबसे आम तरीकों में से एक है व्यक्तिगत लक्ष्य miRNAs का आकलन करते थे, क्योंकि इस तकनीक microarray4 और आरएनए अनुक्रमण आधारित प्लेटफार्मों5से अधिक संवेदनशील है । सामांय में, miRNA व्यंजक ΔCq विधि6का उपयोग करते हुए संदर्भ नमूने के सापेक्ष मापा जाता है । यह दृष्टिकोण लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति स्तर में शारीरिक परिवर्तन की जांच के लिए उपयुक्त है । हालांकि, परिचालित miRNAs के सापेक्ष ठहराव उनकी छोटी मात्रा के कारण सीमित उपयोगिता है । इसके अतिरिक्त, तकनीकी भिन्नता से विभिन्न अध्ययनों से परिणामों की तुलना करना कठिन हो जाता है, क्योंकि विभिन्न प्रयोगशालाओं ने आरटी-qPCR प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को अलग तरह से अनुकूलित कर देते हैं, जो असंगत या यहां तक कि विरोधाभासी परिणामों की ओर जाता है अलग पढ़ाई7.

उपर्युक्त चिंताओं को ध्यान में रखते हुए, निरपेक्ष ठहराव शरीर के तरल पदार्थ में miRNAs की छोटी मात्रा के आकलन के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है । निरपेक्ष ठहराव विधि सिंथेटिक आरएनए oligonucleotides के ज्ञात सांद्रता से उत्पन्न मानक वक्र का उपयोग करता है जो इसी लक्ष्य miRNA8के अनुक्रम में समरूप होते हैं । स्वास्थ्य और पर्यावरण विज्ञान संस्थान (HESI) जीनोमिक्स पर तकनीकी समिति ने हाल ही में व्यापक अध्ययन का आयोजन किया प्लाज्मा miRNAs के पूर्ण मापन के परिणामों की तुलना, कई परीक्षण साइटों के पार । परिणाम से पता चला कि miRNAs के निरपेक्ष quantitation के लिए एक मानक प्रोटोकॉल का उपयोग एकाधिक परीक्षण साइटों9भर में तुलनीय परिणाम प्राप्त किया. RT-qPCR परख वर्तमान अध्ययन में वर्णित विधि लगभग HESI के मानक प्रोटोकॉल है, जो कई miRNA लक्ष्य के मल्टीप्लेक्स विश्लेषण भी शामिल है, और पूर्व प्रवर्धन के लिए कम अभिव्यक्ति miRNAs का पता लगाने सहायता के समान है ।

इस अध्ययन में जागरूक cynomolgus बंदरों की ऊरु नस (n = ५०) से एकत्र रक्त से तैयार EDTA-प्लाज्मा की एक निश्चित मात्रा (२०० µ l) को10प्रयोग किया गया । निंनलिखित प्रोटोकॉल प्लाज्मा नमूनों की तैयारी के लिए प्रक्रिया का वर्णन, miRNA के निष्कर्षण, और आरटी-qPCR, पूर्व वर्धन सहित । इससे भी महत्वपूर्ण बात, प्रोटोकॉल के बारे में अतिरिक्त तकनीकी जानकारी शामिल किया गया है, ताकि नमूनों में लक्ष्य miRNAs की मात्रा एक अच्छी तरह से योग्य प्रक्रिया के साथ संयोजन में मान्य किया जा सकता है. सबसे पहले, प्रत्येक miRNA के मानक वक्र अपने व्यक्तिगत पहचान रेंज, जैविक नमूनों में इसके ठहराव से पहले के लिए मांय किया गया था । दूसरा, वर्तमान पद्धति की गुणवत्ता व्यापक एक बाहरी नियंत्रण के सीक्यू मूल्यों के माध्यम से मूल्यांकन किया गया था (cel-मीर-२३८) । इसलिए, इस मंच पैदावार विभिंन अध्ययनों या प्रयोगशालाओं से परिणाम की तुलना के लिए और अधिक जानकारीपूर्ण और विश्वसनीय डेटा ।

8 miRNAs की प्रोफाइल परख विधि से प्रतिनिधि परिणाम के रूप में इस रिपोर्ट में शामिल किया गया है यहां वर्णित है । इन miRNAs को जिगर (मीर-१२२ और मीर-१९२) को ऊतक की चोट से जुड़े संभावित सुरक्षा वाले मार्क्स के रूप में प्रस्तावित किया गया है, दिल (मीर-1, मीर-208a, मीर-208 बी, और मीर-499a), और कंकाल की मांसपेशी (मीर-133a और मीर-२०६) कुतर और मनुष्यों में 3, 11,12,13.

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Protocol

डायची Sankyo कं, लिमिटेड के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा सभी प्रयोगों को अनुमोदित किया गया ।

1. नमूना तैयारी

  1. EDTA 2k-ट्यूब युक्त में cynomolgus बंदरों के ऊरु नस से रक्त (कम से ०.५ मिलीलीटर) ले लीजिए ।
    नोट: साइट्रेट और हेपरिन स्वीकार्य नहीं है क्योंकि इन anticoagulants बाद पीसीआर14,15बाधित ।
  2. संग्रह के 2 घंटे के भीतर प्लाज्मा अलगाव के लिए बर्फ और प्रक्रिया पर तुरंत एकत्र नमूनों प्लेस ।
  3. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १०,००० x g पर नमूने केंद्रापसारक ।
  4. एक 2 मिलीलीटर microtube में supernatant स्थानांतरण, 4 ° c पर १६,००० x g पर केंद्रापसारक के बाद 5 मिनट के लिए सेल मलबे और अवशिष्ट प्लेटलेट्स को दूर करने के लिए ।
    नोट: miRNAs के ठहराव प्लेटलेट प्रदूषित16से काफी प्रभावित हो सकते हैं ।
  5. प्लेस २०० µ एल ताजा 2 मिलीलीटर में supernatant के aliquots-microtubes, और स्टोर पर-८० ° c उपयोग तक ।
    नोट: प्रत्येक नमूने की एक निश्चित मात्रा आरएनए निष्कर्षण के लिए प्रयोग किया जाता है; इसलिए, aliquot की मात्रा सटीक होना चाहिए ।

2. आरएनए निष्कर्षण

  1. गल बर्फ पर जमे हुए नमूनों (१.५ कदम से) ।
    1. आरएनए निष्कर्षण के दौरान बर्फ पर नमूना ठंडा रखें । चिल lysis रिएजेंट और बर्फ पर क्लोरोफॉर्म से पहले का उपयोग करें ।
  2. lysis रिएजेंट के 5 खंड (१००० µ एल) जोड़ें, phenol और guanidine isothiocyanate के monophasic समाधान युक्त, नमूना (२०० µ एल) के लिए, और 1 मिनट के लिए भंवर द्वारा जोरदार मिश्रण ।
  3. 5 एनएम सिंथेटिक Caenorhabditis एलिगेंस miRNA (Syn-cel-µ-238-3p) के 5 एल जोड़ें ।
  4. क्लोरोफॉर्म के 1 खंड (२०० µ एल) जोड़ें, और 1 मिनट के लिए भंवर द्वारा जोरदार मिश्रण ।
  5. 2 से 3 मिनट के लिए बर्फ पर रखो, और फिर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १२,००० x g पर नमूने केंद्रापसारक ।
  6. एक नए microtube के लिए जलीय चरण सावधानी से स्थानांतरण ।
    नोट: कार्बनिक चरण (लाल) या चरण (सफेद) के किसी भी स्थानांतरण नहीं है । जलीय चरण एकत्र की मात्रा हैंडलिंग विसंगति से बचने के लिए एक समान होना चाहिए, जो वृद्धि हुई तकनीकी भिन्नता में परिणाम. जलीय इस प्रोटोकॉल में स्थानांतरित चरण की सामांय राशि ६५० µ एल था ।
  7. इथेनॉल के १.५ खंड (९७५ µ एल) जोड़ें, और अच्छी तरह से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण ।
  8. एक इसी कॉलम और अनुकूलक, वैक्यूम manifolds का उपयोग कर 3 मिनट के लिए निर्वात सुखाने के बाद में नमूना हस्तांतरण । नमूना वॉल्यूम ७०० µ l से अधिक है, तो शेष समाधान को संसाधित करने के लिए इस चरण को दोहराएँ ।
    नोट: स्तंभ-आधारित आरएनए अलगाव वैक्यूम और केंद्रापसारक विधि के साथ संगत है ।
  9. स्तंभ के लिए इथेनॉल के २०० µ एल जोड़ें, 1 मिनट के लिए वैक्यूम सुखाने के बाद.
  10. स्तंभ, वैक्यूम सुखाने के बाद 2 मिनट के लिए RWT बफर के ८०० µ एल जोड़ें ।
  11. स्तंभ, वैक्यूम सुखाने के बाद 2 मिनट के लिए RPE बफर के ८०० µ एल जोड़ें ।
  12. चरण २.११ दोहराएँ ।
  13. स्तंभ के लिए इथेनॉल के ३०० µ एल जोड़ें, 1 मिनट के लिए वैक्यूम सुखाने के बाद.
  14. एक नए microtube पर कॉलम प्लेस, और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान (15 से 25 डिग्री सेल्सियस) पर १२,००० x g पर केंद्रापसारक ।
  15. स्तंभ को एक नए microtube में स्थानांतरित करें, और nuclease-मुक्त पानी के ५० µ l को जोड़ें ।
  16. कमरे के तापमान पर खड़े हो जाओ (15 से 25 डिग्री सेल्सियस) 3 मिनट के लिए, और ८,००० × g पर कमरे के तापमान पर (15 से 25 डिग्री सेल्सियस) 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
  17. eluate को स्तंभ पर पुन: लागू करें ।
  18. दोहराएँ चरण २.१६, और eluate पर-८० ° c का उपयोग तक संग्रहीत करें ।

3. सीडीएनए संश्लेषण

  1. गल जमे हुए नमूनों (२.१८ कदम से) ।
  2. लक्ष्य miRNAs के अनुरूप है कि सिंथेटिक आरएनए oligonucleotides के ज्ञात एकाग्रता तैयार करें ।
    1. qPCR में एक मानक वक्र पैदा करने के लिए सिंथेटिक आरएनए oligonucleotide का उपयोग करें । 1 x 108 प्रतिलिपि/µ l एकाग्रता का स्टॉक समाधान संग्रहण प्रयोजनों के लिए तैयार किया गया है ।
    2. शेयर समाधान पतला 10-गुना प्राप्त करने के लिए 1 x 107 प्रतिलिपि/µ l (पूर्व परिलक्षित नमूनोंनहीं ) या 1 x 105 प्रतिलिपि/µ एल (पूर्व परिवर्धित नमूनों) मानक वक्र के निर्माण के लिए उच्चतम एकाग्रता के रूप में काम कर समाधान । सामांय में, मानक वक्र सांद्रता के लिए एक सुझाया सीमा 1 x 107 के लिए 1 x 102 कॉपी/µ l (नहीं पूर्व परिवर्धित नमूनों) या 1 x 105 से 1 x 100 कॉपी/µ l (पूर्व परिवर्धित नमूनों).
  3. लक्ष्य miRNAs के लिए 20x आरटी प्राइमरों के बराबर मात्रा को मिलाकर मल्टीप्लेक्स आरटी प्राइमरी पूल तैयार करें ।
    नोट: के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, एक पूल अप करने के लिए 4 लक्ष्य miRNAs पूल में miRNAs में से प्रत्येक के 20x आरटी प्राइमरों को मिलाकर बनाया जा सकता है । Cel-मीर-२३८ (बाह्य नियंत्रण) प्रत्येक ट्यूब में लक्ष्य miRNAs में से एक के रूप में शामिल किया जाना चाहिए । 4 से कम लक्ष्य miRNAs के मामले में, 20x आरटी प्राइमर के बजाय 1/10 ते बफर के बराबर वॉल्यूम जोड़ें ।
  4. आर टी प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार: आरटी प्राइमर पूल के 3 µ एल (३.३ कदम से), ०.१५ µ एल के १०० मिमी dNTPs के साथ dTTP, 1 µ एल के रिवर्स transcriptase (५० यू/µ एल), १.५ µ एल 10x आरटी बफर, ०.१९ µ एल के RNase (20 यू/µ एल), और µ के ४.१६ nuclease एल-मुक्त पानी ।
  5. (कदम ३.१ से) आरएनए नमूना के 5 µ एल के साथ आर टी रिएक्शन मिश्रण के 10 µ एल मिश्रण (३.२ कदम से) pipetting द्वारा, और 5 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
  6. एक थर्मल साइकिल चालक उपकरण पर रिवर्स प्रतिलेखन चलाने के लिए: 16 ° c 30 मिनट के लिए, ४२ ° c 30 मिनट के लिए, 5 मिनट के लिए ८५ ° c पर एक अंतिम रिवर्स transcriptase निष्क्रियता कदम के बाद, का उपयोग करने तक-८० डिग्री सेल्सियस पर लिखित नमूनों की दुकान रिवर्स ।

4. प्रवर्धन (ऐच्छिक)

नोट: ३५ या उससे अधिक अनुवर्ती qPCR में सीक्यू मान दिखाने miRNAs पूर्व-परिवर्धित हैं ।

  1. गल जमे हुए नमूनों (३.६ कदम से) ।
  2. सिंथेटिक आरएनए oligonucleotides से आरटी उत्पाद के 10 गुना सीरियल कमजोर पड़ने बनाओ; 1 x 105 करने के लिए 1 x 100 कॉपी/µ एल मानक वक्र पैदा करने के लिए ।
  3. एक परख प्राइमर के अंतिम एकाग्रता के साथ बराबर संस्करणों (5 µ एल) लक्ष्य miRNAs के लिए 20x परख प्राइमरों के मिश्रण से मल्टीप्लेक्स परख प्राइमर पूल तैयार १,००० µ एल के एक अंतिम खंड में ते बफर द्वारा गुना ।
    नोट: परख प्राइमर जिसका लक्ष्य miRNAs बाद qPCR में पूर्व प्रवर्धन के बिना detectable जा सकता है, और cel के लिए उन-मीर-२३८ (बाह्य नियंत्रण) प्राइमर पूल में शामिल नहीं हैं ।
  4. तैयार पूर्व प्रवर्धन प्रतिक्रिया मिश्रण: १२.५ µ एल 2x तैयार करने के लिए उपयोग के लिए-प्रवर्धन रिएजेंट, ३.७५ µ परख प्राइमर पूल के एल (चरण ४.३ से), और ६.२५ µ एल के nuclease मुक्त पानी ।
  5. मिक्स २२.५ µ पूर्व प्रवर्धन प्रतिक्रिया मिश्रण के २.५ µ एल के साथ रिवर्स लिखित नमूना (चरण ४.१ से) या oligonucleotides से (४.२ कदम) pipetting द्वारा, और 5 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
  6. एक थर्मल साइकिल चालक उपकरण पर प्रतिक्रिया भागो: ९५ ° c 10 मिनट के लिए; के लिए ९५ ° c के 12 चक्र के बाद 15 एस और ६० डिग्री सेल्सियस के लिए 4 min. Store पूर्व-परिवर्धित नमूनों पर-८० ° c उपयोग तक ।

5. मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qPCR)

  1. गल जमे हुए नमूनों (से कदम ३.६ या ४.६ कदम) ।
  2. 5-बाँझ पानी के साथ गुना नमूने पतला ।
  3. oligonucleotides से व्युत्पन्न उत्पाद के 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार; 1 x 107 to 1 x 102 प्रतिलिपि/µ l (पूर्व परिवर्धित नमूनों कोनहीं ) या 1 x 105 से 1 x 100 कॉपी/µ एल (पूर्व परिवर्धित नमूने) मानक curves पैदा करने के लिए ।
  4. तैयार qPCR प्रतिक्रिया मिश्रण: 10 µ एल के 2x तैयार करने के लिए उपयोग प्रवर्धन रिएजेंट, 20x परख रिएजेंट के 1 µ एल, आगे युक्त/रिवर्स पीसीआर प्राइमर और लक्ष्य miRNA के लिए इसी जांच, और µ के 7 nuclease एल मुक्त पानी ।
  5. qPCR प्रतिक्रिया मिश्रण से तेजी से ऑप्टिकल ९६-well reaction प्लेटों के लिए 18 µ l स्थानांतरण, और कुओं में (५.२ कदम या ५.३ कदम से) पतला नमूनों की 2 µ एल जोड़ें ।
    नोट: qPCR के लिए नमूने और मानक डुप्लिकेट में सेट किए गए हैं ।
  6. चिपकने वाली फिल्म के साथ प्लेट सील, और संक्षेप में केंद्रापसारक ।
  7. एक वास्तविक समय थर्मल साइकिल चालक पर प्रतिक्रिया भागो: ९५ ° c 20 एस के लिए, ९५ ° c के ४५ चक्र के बाद 1 एस के लिए और ६० ° c 20 एस के लिए

6. डेटा विश्लेषण

  1. प्रत्येक नमूने के कच्चे प्रतिलिपि संख्या डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर है कि इसी वास्तविक समय थर्मल साइकिल चालक के साथ काम करता है का उपयोग कर गणना ।
    नोट: थ्रेसहोल्ड लाइन मैंयुअल रूप से "१.०" के लिए अध्ययन में सभी प्लेटों में सेट है, उनके सीक्यू घाटी के साथ तुलना द्वारा reproducibility की पुष्टि करने के लिए । कट-ऑफ स्तर सीक्यू पर सेट है > 40 चक्र ।
  2. डुप्लिकेट से प्रत्येक नमूने की अपुष्ट प्रतिलिपि संख्या का औसत परिकलित करें ।
  3. एक इसी ट्यूब में सभी नमूनों से cel-मीर-२३८ की प्रतिलिपि संख्या के औसत से प्रत्येक नमूने में cel-मीर-२३८ की एक प्रतिलिपि संख्या विभाजित करके सुधार कारक की गणना.
    नोट: के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, प्रत्येक ट्यूब cel-मीर-२३८ (बाहरी नियंत्रण) सहित 4 लक्ष्य miRNAs करने के लिए शामिल हैं. इसलिए, सुधार कारक एक इसी cel-मीर-२३८ मूल्य का उपयोग कर ट्यूब के लिए गणना की है ।
  4. प्रत्येक नमूने (से चरण ६.२) की औसत अपुष्ट प्रतिलिपि संख्या प्रत्येक नमूने के लिए (से चरण ६.३) द्वारा विभाजित करके समायोजित प्रतिलिपि संख्या का परिकलन करें ।
  5. प्रत्येक नमूने के लिए कमजोर पड़ने वाले कारक द्वारा (चरण ६.४ से) प्रत्येक नमूने की समायोजित raw प्रतिलिपि संख्या गुणा करके निरपेक्ष प्रतिलिपि संख्या परिकलित करें ।
    नोट: कमजोर पड़ने का कारक है "5" इस प्रोटोकॉल, जो कदम ५.२ से व्युत्पंन में है ।
  6. लॉग सीडीएनए एकाग्रता के खिलाफ प्रत्येक धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए सीक्यू मूल्यों की साजिश की ढलान से पीसीआर प्रवर्धन की क्षमता की गणना ।
    नोट: क्षमता की गणना के लिए फार्मूला; E = (10(-1/ढलान) -1) x १००% ।
  7. सूत्र का उपयोग कर सभी नमूनों से cel-मीर-२३८ के सीक्यू मूल्यों का उपयोग तकनीकी भिन्नता की गणना = (2 एक्स प्रवर्धन प्रभावकारिता)ΔCt (मैक्स (सीक्यू)-Min (सीक्यू)).
    नोट: चरण ६.५ और ६.७ प्रक्रिया की गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए उपयोग किए जाते हैं ।

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Representative Results

miRNA परख के आरटी द्वारा कार्यप्रवाह-qPCR और गुणवत्ता assessmenटी
चित्रा 1 qPCR10का उपयोग कर रक्त के नमूनों से miRNA परख के कार्यप्रवाह से पता चलता है । प्रयोगों की गुणवत्ता एक बाहरी नियंत्रण के रूप में cel-मीर-२३८ सहित द्वारा सत्यापित किया जा सकता है । यह आरएनए निष्कर्षण और बाद में आरटी-qPCR प्रक्रियाओं में तकनीकी विविधताओं को प्रकट करेगा । इस अध्ययन में, ५० नमूनों से गणना की सीक्यू मूल्यों का मतलब ± एसडी २१.० ± ०.४ (तालिका 1) था । यदि cel-मीर-२३८ पूर्व प्रवर्धन कदम की वजह से पतला था, सीक्यू मूल्य २४.२ ± ०.४ (तालिका 1) था । यहाँ वर्णित परख विधि में तकनीकी भिन्नता की सीमा सीक्यू मूल्यों में अन्तर के आधार पर ३ गुना कम होने का अनुमान लगाया गया था. भिन्नता की डिग्री भी जब अतिरिक्त पूर्व प्रवर्धन कदम शामिल किया जाना था सुसंगत रहे । ये मान ऐसे चूहों, चूहों के रूप में विभिन्न पशु प्रजातियों, से अन्य नमूनों के लिए उन लोगों के साथ संगत कर रहे हैं, और इस प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया मानव (दिखाया नहीं डेटा).

लक्ष्य miRNA के लिए मानक वक्र से detectable श्रेणी

नमूनों का कोई पूर्व-प्रवर्धन नहीं

रिवर्स (आरटी) उत्पाद सिंथेटिक आरएनए oligonucleotides से 1 x 107 कॉपी/µ एल की सांद्रता पर क्रमिक qPCR बाद से पहले पतला था । ये श्रृंखला मानक वक्र जो सभी जैविक नमूनों कि पूर्व के बिना पता लगाने का प्रवर्धन कदम के अनुरूप कवरेज सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया गया । 1 x 102 कॉपी/µ एल एकाग्रता पर मानक नमूना के सीक्यू मूल्यों को आम तौर पर प्रत्येक लक्ष्य miRNA के लिए कट ऑफ स्तरों के करीब थे । इसलिए, पता लगाने की सीमा 1 x 102 प्रतिलिपि/µ l (चित्रा 3) होने का अनुमान लगाया गया था ।

पूर्व परिवर्धित नमूने

पूर्व-प्रवर्धन की आवश्यकता वाले नमूनों की जासूसी रेंज का निर्धारण करने के लिए, पतला नमूनों की दो अलग श्रृंखला की तुलना की गई, जैसा कि चित्र 4में सचित्र है । मानक वक्र एक उत्पादन के लिए, आर टी उत्पाद के धारावाहिक कमजोर पड़ने से पहले पूर्व प्रवर्धन कदम के लिए तैयार थे । फिर पूर्व परिवर्धित मानकों की श्रृंखला के बाद qPCR के लिए इस्तेमाल किया गया. मानक वक्र बी पैदा करने के लिए, पहले कमजोर पड़ने की एक एकाग्रता के लिए पूर्व परिवर्धित नमूनों से बना था 1 x 105 कॉपी/µ एल इन मानक curves जाहिरा तौर पर अलग पता लगाने की सीमा दिखाया (चित्रा 5) । हालांकि मानक वक्र बी नीचे बढ़ाने के रेखीय रेंज दिखाया 1 प्रति/µ एल, मानक वक्र एक विशिष्ट amplicons के लिए 10 से कम सांद्रता पर नहीं किया जा सकता है2 या 103 कॉपी/µ l (चित्रा 5) । इस परिणाम का सुझाव दिया है कि miRNAs की अत्यंत छोटी मात्रा पूर्व प्रवर्धन कदम के साथ भी मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है । इसके अलावा, पूर्व परिवर्धित नमूनों ध्यान से व्याख्या की जानी चाहिए जब सीक्यू मान रहे हैं > 30, क्योंकि पूर्व परिवर्धित नमूनों का पता लगाने सीमा इस मान के करीब थे. इसलिए, एक नियम के रूप में, मानक वक्र B का उपयोग यहां वर्णित विधि में किया गया था, जिसका पता लगाने की सीमा निर्धारित करने के बाद, केवल मानक भूखंडों की अपर्याप्त संख्या का उपयोग करने से बचने के लिए ।

नतीजतन, ठहराव (LLOQ) की निचली सीमा miRNAs (चित्रा 3 और चित्रा 5) के अधिकांश के लिए 102 कॉपी/µ l केवल मीर-1 ने उच्चतर LLOQ (103 कॉपी/µ l) (figure 5) दिखाया । औसत प्रवर्धन क्षमता लगभग ९०% थी, जो मानक curves के सहसंबंध गुणांक (R2) के साथ ०.९९८ से १.००० से लेकर । एक सटीक RT-qPCR परख की पहचान के लिए एक रैखिक आर2 के बराबर या ०.९८ से अधिक और ९० के एक पीसीआर प्रवर्धन क्षमता ११०%17के लिए माना जाता है । इसलिए, परख में मानक घटता की गुणवत्ता सत्यापित किया गया था ।

miRNAs की छोटी मात्रा के लिए पूर्व प्रवर्धन के प्रभाव

miRNAs कि ३५ ऊपर या बाद में qPCR में उच्च सीक्यू मूल्यों दिखाया पूर्व परिवर्धित थे । इस कार्यविधि miRNAs की छोटी मात्रा का पता लगाने बढ़ाया । उदाहरण के लिए, सीक्यू मूल्यों (± एसडी) के गैर-पूर्व-परिवर्धित मीर-२०६ ३७.९ ± १.९ था, जबकि पूर्व में परिवर्धित मीर के उन-२०६ २७.० ± २.२ में कमी आई । उच्च सीक्यू मान (चित्र 6) पर गैर-पूर्व-परिवर्धित नमूनों में डुप्लिकेट माप जोड़ों के बीच महत्वपूर्ण अंतर देखा गया । इसके विपरीत, पूर्व-परिवर्धित नमूनों में डुप्लिकेट (चित्र 6) में लगभग समान मान दिखाई दिए । इन परिणामों से संकेत दिया कि पूर्व प्रवर्धन नमूनों की छोटी मात्रा के मामलों में अधिक सटीक और विश्वसनीय डेटा प्रदान करने के लिए प्रभावी होगा ।

cynomolgus बंदरों में प्लाज्मा miRNAs की रूपरेखा

की स्थापना की परख मंच का उपयोग, 8 miRNAs के प्लाज्मा स्तर (मीर-1, मीर-१२२, मीर-133a, मीर-१९२, मीर-२०६, मीर-208a, मीर-208 बी, और मीर-499a) से ५० cynomolgus बंदरों का विश्लेषण किया गया (चित्रा7) 10 । इस परख में, मीर-१२२, मीर-133a, और मीर-१९२ पूर्व के बिना detectable थे, प्रवर्धन, जबकि मीर-1, मीर-२०६, और मीर-499a की आवश्यकता पूर्व उनके कम अभिव्यक्ति के स्तर के प्रवर्धन । हालांकि, न तो मीर-208a और न ही मीर-208 बी पूर्व प्रवर्धन के साथ भी detectable था । डेटा सामांय रूप से वितरित नहीं किए गए; इसलिए, एक लघुगणक परिवर्तन उनके माध्य और मानक विचलन की गणना करने के लिए किया गया था । miRNAs की जांच के अलावा, मीर-१२२ उच्चतम मतलब प्लाज्मा स्तर (५.७१ x 104 कॉपी/µ एल), एक छोटे से गतिशील रेंज (20 गुना) के साथ दिखाया । इसके विपरीत, बड़ी गतिशील पर्वतमाला मीर-1 (५८१-गुना), मीर-133a (९७१ गुना), और मीर-२०६ (४२६-गुना) के लिए मनाया गया ।

Figure 1
चित्र 1 : आर टी-qPCR द्वारा miRNA परख के योजनाबद्ध कार्यप्रवाह । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : miRNA परख के रिवर्स प्रतिलेखन की योजनाबद्ध कार्यप्रवाह । एक पूल 4 लक्ष्य miRNAs को शामिल पूल में miRNAs में से प्रत्येक के 20x आरटी प्राइमरों को मिलाकर बनाया जा सकता है । Cel-मीर-२३८ (बाह्य नियंत्रण) प्रत्येक ट्यूब में लक्ष्य miRNAs में से एक के रूप में शामिल किया जाना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

मीर-२३८ डेटा विश्लेषण
बिना
पूर्व प्रवर्धन		 साथ
पूर्व प्रवर्धन
एन ५० ५०
मतलब २१.० २४.२
एसडी ०.४ ०.४
मैक्स सीक्यू २१.८ २५.३
मिन सीक्यू २०.३ २३.५
माध्य २१.० २४.२
मैक्स-मिन १.३ १.८
प्रवर्धन प्रभावकारिता ८९ ८९
रूपांतर २.४ २.८

तालिका 1: cel-मीर-२३८ के ठहराव चक्र (सीक्यू) मानों का उपयोग करके गुणवत्ता मूल्यांकन. तकनीकी विविधताओं मीर के सीक्यू मूल्यों से मूल्यांकन किया गया-२३८ प्रत्येक परख में । ५० नमूने दो समूहों के साथ संगत (दाएं) या बिना (बाएं) पूर्व प्रवर्धन कदम में विभाजित किया गया । भिंनता सूत्र E = (2 x प्रवर्धन प्रभावकारिता)ΔCt (Max (सीक्यू)-Min (सीक्यू))का उपयोग करके परिकलित की गई थी । प्रवर्धन प्रभावकारिता मानक वक्र की ढलान से गणना की गई थी । पूर्व प्रवर्धन कदम की आवश्यकता के नमूने पूर्व प्रवर्धन कदम (मीर-२३८ खुद को पूर्व प्रवर्धित नहीं था) के दौरान पतला थे । यह आंकड़ा हमारी रिपोर्ट10से संशोधित किया गया है ।

Figure 3
चित्र 3 : गैर-पूर्व परिवर्धित नमूनों के लिए मानक curves की साजिश । मानक curves (N = 3, डुप्लिकेट) सीक्यू बनाम लॉग एकाग्रता प्लॉटिंग द्वारा जनरेट किया गया था । रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण प्रवणता, जो प्रवर्धन क्षमता से मेल खाती है, यह निर्धारित करने के लिए गणना की गई थी । मीर के लिए मानक घटता-१२२ (ऊपरी), मीर-१९२ (मध्य), और मीर-133a (कम) परीक्षण सीमा पर सीक्यू और एकाग्रता के बीच रैखिक संबंध दिखाया । मानक घटता में, त्रुटि पट्टियां तीन स्वतंत्र परख से एक मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : प्रक्रिया पूर्व-परिवर्धित नमूनों के लिए मानक curves उत्पन्न करने के लिए. (मानक वक्र A) सिंथेटिक oligo का एक प्रतिनिधि एकाग्रता (1 x 105 कॉपी/µ एल) रिवर्स था, तैयार करने के बाद 10-मानक नमूना की धारावाहिक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला गुना । इन पूर्व परिवर्धित मानकों के बाद qPCR के लिए इस्तेमाल किया गया । (मानक वक्र B) सिंथेटिक oligo के एक प्रतिनिधि एकाग्रता (1 x 105 कॉपी/µ एल) रिवर्स और पूर्व परिवर्धित किया गया था । फिर, मानक नमूनों की एक 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने श्रृंखला के बाद qPCR से पहले तैयार किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : पूर्व परिवर्धित नमूनों के लिए मानक घटता A और B का प्लाट । मानक वक्र A (n = 1, डुप्लिकेट) और मानक वक्र B (n = 3, डुप्लिकेट) सीक्यू बनाम लॉग एकाग्रता प्लॉटिंग द्वारा जनरेट किया गया था । रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण प्रवणता, जो प्रवर्धन क्षमता के लिए संगत निर्धारित करने के लिए परिकलित किया गया था । (ऊपरी) मानक वक्र एक (बिंदीदार रेखा) से पता चला जाहिरा तौर पर गैर विशिष्ट amplicon 1 x 102 कॉपी/µ एल, जबकि मानक वक्र बी (ठोस रेखा) मीर के परीक्षण रेंज में सीक्यू और एकाग्रता के बीच रैखिक संबंध दिखाया-1 । (मध्य और निचली) मानक वक्र एक (बिंदीदार रेखा) 1 x 102 कॉपी/µ एल या कम की सांद्रता में कोई amplicon दिखाया, जबकि मानक वक्र बी (ठोस रेखा) सीक्यू और एकाग्रता के बीच का परीक्षण रेंज में रैखिक संबंध दिखाया मीर-499a और मीर-२०६. मानक वक्र B में, त्रुटि पट्टियां तीन स्वतंत्र परख से एक मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : गैर-पूर्व परिवर्धित और पूर्व परिवर्धित नमूनों के लिए प्रवर्धन भूखंड । (ऊपरी) मीर के प्रवर्धन भूखंड-प्रतिनिधि नमूनों में २०६ (A, B, C) बिना (ऊपरी), या पूर्व प्रवर्धन (कम) के साथ. माप डुप्लिकेट में सेट किए गए थे । गैर-पूर्व परिवर्धित नमूनों में डुप्लिकेट के रूप में सेट किए गए दो नमूनों के बीच अंतर था, विशेष रूप से उच्च सीक्यू नमूनों में (A और B). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : प्लाज्मा microRNAs (miRNAs) के cynomolgus बंदरों में निरपेक्ष मूल्य । miRNAs के अभिव्यक्ति स्तर डॉट भूखंडों द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । मतलब, और दो मानक विचलन के लिए मान नीचे और माध्य से ऊपर (धूसर बॉक्स में दिखाया गया), एक लघुगणकीय परिवर्तन के बाद निर्धारित किया गया था । यह आंकड़ा हमारी रिपोर्ट10से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हमारे व्यापक मूल्यांकन गतिशील रेंज है, जो स्पष्ट रूप से संकेत दिया है कि व्यक्तिगत नमूनों के बीच भिन्नता की भयावहता miRNAs परीक्षण के बीच बेहद अलग था की हद के एक और अधिक कठोर सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदान की है । हालांकि इन परिवर्तनों को शरीर के तरल पदार्थ में उनकी छोटी मात्रा के कारण हो सकता है, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इन आंकड़ों न केवल जैविक विविधताओं, लेकिन यह भी तकनीकी विविधताओं को प्रतिबिंबित । तकनीकी भिंनता के अधिकांश बाहरी नियंत्रण (cel-मीर-२३८), जो अंय परख प्लेटफार्मों18में प्रयोग किया जाता है के सीक्यू मूल्यों के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है । के बाद से वहां miRNA विश्लेषण में कोई मानकीकृत आंतरिक नियंत्रण किया गया है, तकनीकी भिंनता पर जानकारी विश्लेषण में शामिल किया जाना चाहिए, परख की गुणवत्ता के निर्धारण के लिए19। तकनीकी भिंनता इस रिपोर्ट में वर्णित पद्धति में 3-गुना से कम होने का अनुमान लगाया गया था । हालांकि यह संभव नहीं है क्योंकि इस प्रक्रिया के लिए गुणवत्ता के स्तर का निर्धारण अंय अनुसंधान में तुलनीय तकनीकी जानकारी की कमी के कारण, ऐसी जानकारी सहित विश्वसनीयता में सुधार करने के लिए योगदान देता है और के बीच अनुकूलता सुनिश्चित करता है अलग पढ़ाई ।

हाल के एक नंबर के कागजात की रिपोर्ट है कि विभिंन पूर्व विश्लेषणात्मक चर जैसे नमूना हैंडलिंग, भंडारण की स्थिति, और भंडारण अवधि प्रसंस्करण से पहले विश्वसनीयता और परिचालित miRNA माप के reproducibility प्रभाव कर सकते हैं20 , 21. हालांकि इस अध्ययन में पूर्व विश्लेषणात्मक चर के प्रभाव को ध्यान में नहीं लिया, निम्न चरणों का पालन किया गया सावधानीपूर्वक नमूना तैयारी के दौरान भिन्नता को कम करने के लिए. सबसे पहले, प्लाज्मा के रूप में जल्दी संभव के रूप में संसाधित किया गया था (2 घंटे के बाद संग्रह) प्लाज्मा में miRNAs की स्थिरता के प्रभाव को कम करने के लिए8,22. हालांकि miRNAs कमरे के तापमान पर स्थिर माना जाता है (15 से 25 डिग्री सेल्सियस), यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि रक्त संग्रह और प्लाज्मा या सीरम के प्रसंस्करण के बीच अंतराल miRNA स्तर को प्रभावित करता है । दूसरा, एक प्लाज्मा नमूना नेत्रहीन hemolyzed लाल रक्त कोशिकाओं के साथ संदूषण से उपजी विश्लेषणात्मक पूर्वाग्रह को खत्म करने के लिए निरीक्षण किया गया था, जो एक कारक है कि23miRNAs परिसंचारी के स्तर को प्रभावित हो सकता है का प्रतिनिधित्व करता है ।

पूर्व प्रवर्धन एक का पता लगाने पूर्वाग्रह24शुरू करने के बिना miRNAs के बहुत कम मात्रा में उपद्रवों में का पता लगाने में सुधार उपयोगी है । वर्तमान अध्ययन में, मानक curves के सीक्यू मूल्यों पूर्व प्रवर्धित सिंथेटिक oligonucleotides का उपयोग कर निर्माण की परख भर में उच्च reproducibility दिखाया । यह पूर्ण quantitation पूर्व परिवर्धित नमूनों का उपयोग कर, जो miRNAs की छोटी मात्रा का पता लगाने के सक्षम अनुमति दी । दूसरी ओर, कम प्रति संख्या मानकों (1 x 102 या 103 कॉपी/µ एल) विशिष्ट amplicons नहीं दिखा, पूर्व प्रवर्धन के साथ संयोजन में । Mestdagh एट अल. 24 सूचना दी कि कम कॉपी संख्या miRNAs की माप पूर्व प्रवर्धन प्रक्रिया के बाद उच्च भिन्नता दिखाई, मध्यम या उच्च प्रतिलिपि संख्या miRNAs की तुलना में, रिवर्स प्रतिलेखन की कम दक्षता के कारण, जो miRNA का परिणाम हो सकता है अनुक्रम विशेषताओं । इसलिए, प्रत्येक miRNA के लिए मानक curves का पता लगाने रेंज जैविक नमूनों की ठहराव से पहले मान्य किया जाना चाहिए, विशेष रूप से पूर्व प्रवर्धित miRNAs के लिए, गलत-सकारात्मक परिणाम को खत्म करने के लिए. इससे भी महत्वपूर्ण बात, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि भिन्न संसाधित miRNAs जैसे पूर्व-परिवर्धित और गैर-प्रवर्धित नमूनों की निरपेक्ष स्तरों की तुलना सीधे नहीं की जा सकती क्योंकि प्रत्येक miRNA में पूर्व-परिवर्धित नमूने की मात्रा निर्दिष्ट नहीं की गई है.

यह रिपोर्ट RT-qPCR का उपयोग करके प्लाज्मा नमूनों में निरपेक्ष miRNA स्तरों के निर्धारण के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करती है. पूर्व के प्रवर्धन के बाद भी कुछ miRNAs का पता नहीं चला । इस तरह के कम अभिव्यक्ति miRNAs का पता लगाने के लिए, एक अलग दृष्टिकोण का उपयोग करना पड़ सकता है । एक बड़ा नमूना मात्रा का उपयोग कर एक सरल समाधान के रूप में इस समस्या को दरकिनार कर सकते हैं, हालांकि नमूना की बड़ी मात्रा हमेशा उपलब्ध नहीं हैं । तिथि करने के लिए, प्रौद्योगिकीय अग्रिमों25,26profiling miRNA के लिए विभिंन प्लेटफार्मों के विकास को सक्षम किया है । छोटी बूंद डिजिटल पीसीआर (ddPCR) हाल ही में विकसित किया गया है और पूर्ण ठहराव के लिए पारंपरिक आरटी-qPCR के लिए एक वैकल्पिक विधि प्रदान करता है । इस नवीन तकनीक में एक सटीक, reproducible और संवेदनशील विधि होने की सूचना दी गई है जो 1 कॉपी/µ l27,28के स्तरों पर miRNA लक्ष्य का पता लगा सकती है । यदि ddPCR एक पूर्व प्रवर्धन कदम के बिना miRNAs की कम एकाग्रता का पता लगा सकते हैं, यह एक महान लाभ होगा क्योंकि एकाधिक miRNAs के स्तर एक दूसरे से तुलना की जा सकती है । निष्कर्षण प्रक्रियाओं में परिवर्तन और बाद में आरटी-qPCR, आणविक मंच, और इस्तेमाल किया एजेंट अनिवार्य रूप से चर परिणाम निकलेगा । बाहरी नियंत्रण और व्यक्तिगत miRNAs के लिए निरपेक्ष स्तर के पारदर्शी परिणाम प्रदान किए जाते हैं, तो हालांकि, इन परिवर्तनों को हल किया जा सकता है । विधि का उचित गुणवत्ता मूल्यांकन miRNA की रूपरेखा अध्ययन में जैविक परिवर्तनों के प्रभेद में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

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Disclosures

लेखक हित का खुलासा करने के लिए कोई संघर्ष नहीं है ।

Acknowledgments

यह अनुसंधान सार्वजनिक, वाणिज्यिक, या नहीं के लिए लाभ क्षेत्रों में अनुदान एजेंसियों से कोई विशेष अनुदान प्राप्त नहीं किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Microtainer tube (K2EDTA) Becton, Dickinson and Company 365974 For blood collection
Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL Eppendorf 0030124359
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  1.5 mL Eppendorf 0030120086
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  2.0 mL Eppendorf 0030120094
Synthetic oligonucleotide Hokkaido System Science - Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade)
Tris-EDTA Buffer  (pH 8.0) Nippon Gene 314-90021 TE buffer
Buffer RPE QIAGEN - Contents in miRNeasy mini kit 
Buffer RWT QIAGEN - Contents in miRNeasy mini kit 
miRNeasy Mini Kit QIAGEN 217004
Nuclease-Free Water  QIAGEN 129114
QIAzol Lysis Reagent QIAGEN - Contents in miRNeasy mini kit 
Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic  QIAGEN 219600 ID:MSY0000293, 5 nmol
SC Adapters TAIGEN Bioscience Corporation S0120 For RNA extraction
VacEZor 36 Complete System TAIGEN Bioscience Corporation M3610 For RNA extraction
7900HT Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific Inc. 4351405 Fast 96-Well Block
GeneAmp PCR System 9700 Thermo Fisher Scientific Inc. 9700
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific Inc. 4346907
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific Inc. 4311971
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific Inc. 4444557
TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000248
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002245
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002246
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002222
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000491
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000510
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000511
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002290
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 001352
TaqMan MicroRNA Reverse
Transcription Kit		 Thermo Fisher Scientific Inc. 4366597
TaqMan PreAmp Master Mix (2×) Thermo Fisher Scientific Inc. 4391128
Chloroform  Wako Pure Chemicals 035-02616
Ethanol (99.5) Wako Pure Chemicals 057-00456

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References

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Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR. J. Vis. Exp. (132), e56850, doi:10.3791/56850 (2018).

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