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Quantificazione assoluta dei livelli di MicroRNA del Plasma nella scimmia cynomolgus, mediante trascrizione d'inversione quantitativa Real-Time PCR

Published: February 12, 2018 doi: 10.3791/56850
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Medicinal Safety Research Laboratories, Daiichi Sankyo Co., Ltd.

Summary

Questo rapporto descrive un protocollo per misurare i livelli assoluti di miRNA al plasma, usando trascrizione d'inversione quantitativa Real-Time PCR, con o senza pre-amplificazione. Questo protocollo offre una migliore comprensione della quantità di plasma Mirna e permette la valutazione qualitativa dei dati corrispondenti da diversi studi o laboratori.

Abstract

RT-qPCR è uno dei metodi più comuni per valutare i miRNA obiettivo individuale. Livelli di Mirna sono generalmente misurati rispetto a un campione di riferimento. Questo approccio è appropriato per l'esame di cambiamenti fisiologici nei livelli di espressione del gene bersaglio. Tuttavia, la quantificazione assoluta usando meglio l'analisi statistica è preferibile per una valutazione completa dei livelli di espressione genica. Quantificazione assoluta è ancora non di uso comune. Questo rapporto descrive un protocollo per misurare i livelli assoluti di miRNA al plasma, usando RT-qPCR con o senza pre-amplificazione.

Un volume fisso (200 µ l) di plasma EDTA è stato preparato dal sangue raccolto dalla vena femorale di scimmie cynomolgus cosciente (n = 50). il RNA totale è stato estratto utilizzando sistema commercialmente disponibile. Al plasma miRNA sono stati quantificati dall'analisi di RT-qPCR sonda-based che contiene specifici miRNA avanti/indietro PCR primer e sonda. Le curve standard per quantificazione assoluta sono state generate utilizzando oligonucleotidi da RNA sintetici disponibile in commercio. Un sintetico cel-miR-238 è stato usato come un controllo esterno per la valutazione di qualità e di normalizzazione. I miRNA che ha mostrato la quantificazione ciclo (Cq) valori superiori a 35 sono stati pre-amplificati prima il passo di qPCR.

Tra i 8 Mirna esaminati, miR-122, miR-133a e miR-192 erano rilevabili senza pre-amplificazione, considerando che miR-1, miR-206 e miR-499a necessari pre-amplificazione a causa dei loro livelli di espressione bassa. MiR-208a e miR-208b non erano rilevabili anche dopo pre-amplificazione. L'efficienza di elaborazione del campione è stata valutata dai valori Cq di spillo cel-miR-238. In questo metodo di analisi, tecnica variazione è stata stimata in meno di 3 volte e il limite inferiore di quantificazione (LLOQ) era 102 copia / µ l, per la maggior parte dei miRNA esaminati.

Questo protocollo fornisce una migliore stima della quantità di plasma Mirna e permette la valutazione della qualità dei dati corrispondenti da diversi studi. Considerando che il basso numero di miRNA nei liquidi corporei, pre-amplificazione è utile per migliorare la rilevazione di mal espresso Mirna.

Introduction

Un numero crescente di studi è stati esplorare i microRNA (Mirna) come biomarcatori per la diagnosi e la prognosi di tumori, o di monitoraggio e rilevamento di altre malattie in studi non clinici e clinici1,2,3 . Trascrizione d'inversione quantitativa Real-Time PCR (RT-qPCR) è uno dei metodi più comuni utilizzati per valutare i miRNAs obiettivo individuale, perché questa tecnica è più sensibile la sequenza di RNA e microarray4 basato su piattaforme5. In generale, espressione dei miRNA è misurata rispetto a un campione di riferimento utilizzando il metodo di ΔCq6. Questo approccio è adatto per indagare i cambiamenti fisiologici nei livelli di espressione del gene bersaglio. Tuttavia, quantificazione relativa di Mirna in circolazione ha limitato l'utilità a causa delle loro piccole quantità. Inoltre, variazione tecnica rende difficile confrontare i risultati di diversi studi, perché diversi laboratori personalizzare i protocolli sperimentali di RT-qPCR in modo diverso, che porta a incoerente o contraddittoria anche risultati da diversi studi7.

In considerazione delle problematiche di cui sopra, quantificazione assoluta potrebbe essere più adatto per la valutazione delle quantità piccole di miRNA nei liquidi corporei. Il metodo di quantificazione assoluta utilizza una curva standard generata da concentrazioni note di oligonucleotidi sintetici di RNA che sono identici in sequenza per la corrispondente destinazione miRNA8. La salute e l'Istituto di scienze ambientali (HESI) Comitato tecnico sulla genomica ha recentemente condotto studi completi per confrontare i risultati di misure assolute di Mirna al plasma, in più siti di prova. I risultati hanno mostrato che utilizzando un protocollo standard per la quantificazione assoluta di Mirna ha dato risultati comparabili tra i siti di più prova9. Il metodo di analisi di RT-qPCR descritto nel presente studio è quasi identico al protocollo standard di HESI, che include analisi "multiplex" di molteplici obiettivi di miRNA e pre-amplificazione per facilitare il rilevamento di bassa espressione di Mirna.

In questo studio, un volume fisso (200 µ l) di plasma EDTA preparato dal sangue raccolti dalla vena femorale di scimmie cynomolgus cosciente (n = 50) è stato usato10. Il seguente protocollo descrive la procedura per la preparazione di campioni di plasma, estrazione di miRNA e RT-qPCR, tra cui pre-amplificazione. Ancora più importante, ulteriori informazioni tecniche sul protocollo sono stato inclusi, affinché la quantità di destinazione miRNA nei campioni possa essere convalidata in combinazione con un processo ben qualificato. In primo luogo, la curva standard di ciascun miRNA è stata validata per la sua gamma di rilevazione individuale, prima della relativa quantificazione in campioni biologici. In secondo luogo, la qualità della metodologia corrente completamente è stata valutata per mezzo di valori Cq di un controllo esterno (cel-miR-238). Pertanto, questa piattaforma produce dati più informativi e affidabili per confrontare i risultati di diversi studi o laboratori.

I profili dei 8 miRNA sono stati inclusi in questo rapporto come risultati rappresentativi dal metodo di analisi descritto qui. Questi miRNA sono stati proposti come potenziali biomarcatori di sicurezza associate a lesioni dei tessuti al fegato (miR-122 e miR-192), cuore (miR-1, miR-208a, miR-208b e miR-499a) e muscolo scheletrico (miR-133a e miR-206) in roditori ed esseri umani3, 11,12,13.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato di Daiichi Sankyo Co., Ltd.

1. preparazione del campione

  1. Raccogliere il sangue (almeno 0,5 mL) dalla vena femorale di scimmie cynomolgus in provette EDTA 2K-contenenti.
    Nota: Citrato o eparina non sono accettabili perché questi anticoagulanti inibiscono successive PCR14,15.
  2. Posizionare i campioni raccolti immediatamente sul ghiaccio e processo per l'isolamento del plasma entro 2 ore dalla raccolta.
  3. Centrifugare i campioni a 10.000 x g a 4 ° C per 5 min.
  4. Trasferire il surnatante in una microprovetta 2 mL, seguita da centrifugazione a 16.000 x g a 4 ° C per 5 min rimuovere i detriti cellulari e piastrine residue.
    Nota: Quantificazione dei miRNA possa essere influenzate in modo significativo da piastrine contaminazione16.
  5. Inserire 200 aliquote µ l del surnatante in freschi 2 mL-microprovette e conservare a-80 ° C fino all'utilizzo.
    Nota: Un volume fisso di ogni campione viene utilizzato per l'estrazione di RNA; di conseguenza, il volume dell'aliquota deve essere esatto.

2. estrazione del RNA

  1. Scongelare i campioni congelati sul ghiaccio (dal punto 1.5).
    1. Mantenere il campione freddo sul ghiaccio durante l'estrazione di RNA. Reagente di lisi di chill e cloroformio il priore di ghiaccio da utilizzare.
  2. Aggiungere 5 volumi (1000 µ l) di reagente di Lisi, contenente soluzione monofasica di fenolo e guanidina isotiocianato, al campione (200 µ l) e mescolare energicamente nel Vortex per 1 min.
  3. Aggiungere 5 µ l di 5 nM sintetico Caenorhabditis elegans miRNA (Syn-cel-miR-238-3 p).
  4. Aggiungere 1 volume (200 µ l) di cloroformio e mescolare energicamente nel Vortex per 1 min.
  5. Tenere il ghiaccio per 2 o 3 minuti e poi Centrifugare i campioni a 12.000 x g a 4 ° C per 15 min.
  6. Trasferire la fase acquosa con attenzione ad una nuova microprovetta.
    Nota: Non trasferire qualsiasi fase organica (rosso) o interfase (bianco). Il volume della fase acquosa raccolto deve essere uniforme per evitare di gestire incoerenza, che si traduce in una maggiore variazione tecnica. La solita quantità di fase acquosa trasferito in questo protocollo era 650 µ l.
  7. Aggiungere 1,5 volumi (975 µ l) di etanolo e mescolare bene pipettando su e giù.
  8. Trasferire il campione in una colonna corrispondente e adattatore, seguita da essiccazione sotto vuoto per 3 minuti utilizzando collettori sottovuoto. Se il volume del campione è più di 700 µ l, ripetere questo passaggio per elaborare la soluzione rimanente.
    Nota: Isolamento del RNA basata su colonne è compatibile con il metodo vuoto e centrifugazione.
  9. Aggiungere 200 µ l di etanolo per la colonna, seguita da essiccazione sotto vuoto per 1 min.
  10. Aggiungere 800 µ l di tampone di RWT alla colonna, seguita da essiccazione sotto vuoto per 2 min.
  11. Aggiungere 800 µ l di tampone di RPE alla colonna, seguita da essiccazione sotto vuoto per 2 min.
  12. Ripetere il punto 2.11.
  13. Aggiungere 300 µ l di etanolo per la colonna, seguita da essiccazione sotto vuoto per 1 min.
  14. Posizionare la colonna in una nuova provetta e centrifugare a 12.000 x g a temperatura ambiente (15-25 ° C) per 1 min.
  15. La colonna di trasferimento ad una nuova microprovetta e aggiungere 50 µ l di acqua priva di nucleasi.
  16. Riposare a temperatura ambiente (15-25 ° C) per 3 min e centrifugare a 8.000 × g a temperatura ambiente (15-25 ° C) per 1 min.
  17. Riapplicare l'eluato alla colonna.
  18. Ripetere il passaggio 2.16 e memorizzare eluato a-80 ° C fino all'utilizzo.

3. sintesi del cDNA

  1. Scongelare i campioni congelati (dal punto 2.18).
  2. Preparare la concentrazione nota dei oligonucleotides sintetici di RNA che corrispondono a destinazione Mirna.
    1. Utilizzare oligonucleotide sintetico di RNA per generare una curva standard in qPCR. Soluzione madre di concentrazione di 1 x 108 copia / µ l è preparata per scopi di archiviazione.
    2. Diluire la soluzione madre 10 volte per ottenere 1 x 107 copia / µ l (non pre-amplificati campioni) o soluzione di lavoro di 1 x 105 copia / µ l (campioni pre-amplificati) come la più alta concentrazione per costruire la curva standard. In generale, una gamma suggerita per le concentrazioni di curva standard è 1 x 107 a 1 x 102 copia / µ l (non pre-amplificati campioni) o 1 x 105 a 1 x 100 copia / µ l (campioni pre-amplificati).
  3. Preparare piscina di primer multiplex RT mescolando volumi uguali di primers di RT x 20 per destinazione Mirna.
    Nota: Come mostrato nella Figura 2, una piscina contenente fino a 4 destinazione miRNA può essere fatto mescolando i primer RT 20x di ciascuno dei miRNA in piscina. Cel-miR-238 (controllo esterno) deve essere incluso come uno dei miRNA target in ogni provetta. In caso di meno di 4 destinazione Mirna, aggiungere volumi uguali di 1/10 buffer di TE invece di primer di RT x 20.
  4. Preparare la miscela di reazione di RT: 3 µ l di primer RT della piscina (dal punto 3.3), 0.15 µ l di 100 mM dNTPs con dTTP, 1 µ l di trascrittasi inversa (50 U / µ l), 1,5 µ l 10 x tampone RT, 0.19 µ l di inibitore di RNAsi (20 U / µ l) e 4.16 µ l di nucleasi-free acqua.
  5. Miscelare 10 µ l di reazione di RT mescolare con 5 µ l di campione di RNA (dal punto 3.1) o oligonucleotidi (dal punto 3.2) pipettando e incubare in ghiaccio per 5 min.
  6. Eseguire la trascrizione d'inversione su un apparato termociclatore: 16 ° C per 30 min, 42 ° C per 30 minuti, seguita da una fase di inattivazione finale della trascrittasi inversa a 85 ° C per 5 min, esempi di trascritto inverso Store a-80 ° C fino all'utilizzo.

4. preamplificazione (opzionale)

Nota: I miRNA che mostrano valori di Cq sopra 35 o più in qPCR successive sono pre-amplificati.

  1. Scongelare i campioni congelati (dal punto 3.6).
  2. Effettuare diluizioni seriali di 10 volte del prodotto RT da oligonucleotidi sintetici di RNA; 1 x 105 a 1 x 100 copia / µ l per la generazione di curva standard.
  3. Preparare piscina primer multiplex assay mescolando volumi uguali (5 µ l) di 20x primer di dosaggio per miRNA di destinazione con la concentrazione finale di ogni primer saggio essere diluito 200 volte di buffer di TE in un volume finale di 1.000 µ l.
    Nota: Gli iniettori di analisi cui miRNA di destinazione possono essere rilevabili in qPCR successive senza pre-amplificazione e quelli per cel-miR-238 (controllo esterno) non sono inclusi nel pool di primer.
  4. Preparare la miscela di reazione di pre-amplificazione: 12,5 µ l di reagente preamplificazione ready-to-use, 3,75 µ l del pool di primer di analisi (dal punto 4.3) e 6,25 µ l di acqua priva di nucleasi: 2x.
  5. µ L di mix 22.5 del pre-amplificazione mescolare con 2,5 µ l di campione inverso trascritto (dal punto 4.1) o oligonucleotidi (dal punto 4.2) pipettando e incubare in ghiaccio per 5 min.
  6. Eseguire la reazione su un apparato termociclatore: 95 ° C per 10 min; seguita da 12 cicli di 95 ° C per 15 s e 60 ° C per 4 min. conservare i campioni pre-amplificati a-80 ° C fino all'utilizzo.

5. quantitative PCR in tempo reale (qPCR)

  1. Scongelare i campioni congelati (dal passaggio 3.6 o 4.6).
  2. Diluire i campioni 5 volte con acqua sterile.
  3. Preparare diluizioni seriali x10 del prodotto RT derivato da oligonucleotidi sintetici di RNA; 1 x 107 a 1 x 102 copia / µ l (non pre-amplificati campioni) o 1 x 105 a 1 x 100 copia / µ l (pre-amplificati campioni) per la generazione di curve standard.
  4. Preparare la miscela di reazione qPCR: 10 µ l di reagente di amplificazione di ready-to-use, 1 µ l di reagente di analisi, contenente PCR primer sonda corrispondente alla destinazione miRNA e avanti/indietro: 20x e 7 µ l di acqua priva di nucleasi: 2x.
  5. Trasferire le piastre di reazione veloce ottico a 96 pozzetti 18 µ l dal mix di reazione qPCR e aggiungere 2 µ l dei campioni diluiti (dal passaggio 5.2 o 5.3) nei pozzetti.
    Nota: I campioni e gli standard per qPCR vengono impostati in duplicati.
  6. Sigillare la piastra con la pellicola adesiva e centrifugare.
  7. Eseguire la reazione in un termociclatore in tempo reale: 95 ° C per 20 s, seguita da 45 cicli di 95 ° C per 1 s e 60 ° C per 20 s.

6. analisi dei dati

  1. Calcolare il numero di copia crudo di ogni campione usando il software di analisi dati che funziona con corrispondente termociclatore in tempo reale.
    Nota: Linea di soglia è impostata manualmente su "1.0" in tutte le piastre nello studio, per confermare la riproducibilità rispetto ai loro vales Cq. Livello di cut-off è impostato al Cq > 40 cicli.
  2. Calcolare la media del numero di ciascun campione da duplicati copia crudo.
  3. Calcolare il fattore di correzione dividendo un numero di copia di cel-miR-238 in ciascun campione per la media del numero di copia di cel-miR-238 da tutti i campioni in un tubo corrispondente.
    Nota: Come mostrato nella Figura 2, ogni tubo contiene fino a 4 miRNA di destinazione tra cui cel-miR-238 (controllo esterno). Di conseguenza, fattore di correzione viene calcolato per ogni provetta utilizzando il corrispondente valore di cel-miR-238.
  4. Calcolare il numero di copia regolato dividendo il numero di media copia crudo di ogni campione (da passo 6.2) per il fattore di correzione (da passo 6.3) per ogni campione.
  5. Calcolare il numero di copia assoluta moltiplicando il numero di copia crudo rettificato di ciascun campione (da passo 6.4) il fattore di diluizione per ciascun campione.
    Nota: Il fattore di diluizione è "5" nel presente protocollo, che è derivato dal punto 5.2.
  6. Calcolare l'efficienza di amplificazione di PCR dal versante della trama dei valori Cq per ogni diluizione seriale contro concentrazione di cDNA di registro.
    Nota: Formula per calcolare l'efficienza; E = (10(-1/slope) -1) x 100%.
  7. Calcolare la variazione tecnica utilizzando i valori di Cq di cel-miR-238 da tutti i campioni usando la formula E = (efficacia di amplificazione 2 x)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)).
    Nota: I passaggi 6.5 e 6.7 sono utilizzati per la valutazione di qualità della procedura.

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Representative Results

Flusso di lavoro di analisi di miRNA da RT-qPCR e la valutazione di qualità deit
La figura 1 Mostra il flusso di lavoro di analisi di miRNA da campioni di sangue usando qPCR10. La qualità degli esperimenti può essere verificata includendo cel-miR-238 come un controllo esterno. Questo rivelerà varianti tecniche in estrazione del RNA e i processi successivi RT-qPCR. In questo studio, la media ± SD di Cq valori calcolati da 50 campioni era 21.0 ± 0,4 (tabella 1). Se il cel-miR-238 è stato diluito a causa del passaggio di pre-amplificazione, il valore di Cq era 24,2 ± 0,4 (tabella 1). Nel metodo di analisi descritto qui, l'entità della variazione tecnica è stata stimata per essere inferiore a 3 volte sulla base della differenza nei valori Cq. Il grado di variazione siamo stati coerente anche quando il passaggio aggiuntivo di pre-amplificazione doveva essere incluso. Questi valori sono compatibili con quelli per altri campioni da diverse specie animali, come topi, ratti e gli esseri umani effettuata in questo laboratorio (dati non mostrati).

Fascia rilevabile dalla curva standard per destinazione miRNA

Nessun pre-amplificazione dei campioni

Il prodotto di (RT) inverso trascritto da oligonucleotidi sintetici di RNA alle concentrazioni di 1 x 107 copia / µ l in serie era diluito prima della qPCR successive. Queste serie sono state utilizzate per la generazione di curva standard, che ha garantito la copertura coerente di tutti i campioni biologici che erano rilevabili senza passaggio di pre-amplificazione. I valori di Cq del campione di riferimento alla concentrazione di 1 x 102 copia / µ l erano generalmente nei pressi di cut-off livelli per ogni destinazione miRNA. Di conseguenza, il limite di rilevazione è stato stimato a 1 x 102 copia / µ l (Figura 3).

Campioni pre-amplificati

Per determinare l'intervallo rilevabile di campioni che richiedono pre-amplificazione, sono stata confrontata due differenti serie di campioni diluiti, come illustrato nella Figura 4. Per la generazione di curva standard A, sono state preparate diluizioni seriali del prodotto RT prima del passaggio di pre-amplificazione. Poi la serie di norme pre-amplificate sono stata utilizzata per qPCR successive. Per la generazione di curva standard B, la prima diluizione era fatta di campioni pre-amplificati per una concentrazione di 1 x 105 copia / µ l. Queste curve standard ha mostrato limiti di rilevazione apparentemente differenti (Figura 5). Anche se la curva standard B ha mostrato gamma lineare di aumento fino a 1 copia / µ l, curva standard A non poteva essere usato per ampliconi specifici a concentrazioni inferiori a 102 o 103 copia / µ l (Figura 5). Questo risultato ha indicato che la quantità estremamente ridotte di Mirna non può essere valutato anche con passaggio di pre-amplificazione. Inoltre, i campioni pre-amplificati devono essere interpretati con attenzione quando i valori di Cq sono > 30, perché i limiti di rilevazione dei campioni pre-amplificati erano vicino a questo valore. Pertanto, come regola, curva standard B è stato utilizzato nel metodo descritto qui, dopo aver determinato l'intervallo rilevabile, solo al fine di evitare l'uso di numero insufficiente di appezzamenti standard.

Di conseguenza, il limite inferiore di quantificazione (LLOQ) era 102 copia / µ l per la maggior parte dei miRNA (Figura 3 e Figura 5). Solo miR-1 hanno mostrato un LLOQ più alto (103 copia / µ l) (Figura 5). L'efficienza di amplificazione medio era circa il 90%, con il coefficiente di correlazione (R2) delle curve standard che vanno da 0,998 a 1.000. I tratti distintivi di un'accurata analisi di RT-qPCR sono considerati un lineare R2 pari o superiore a 0,98 e un'efficienza di amplificazione di PCR di 90-110%17. Di conseguenza, la qualità delle curve standard nell'analisi è stata verificata.

Effetti di pre-amplificazione per piccole quantità di Mirna

I miRNA che hanno mostrato i valori Cq sopra 35 o superiore in qPCR successive erano pre-amplificati. Questa procedura migliorata la rilevazione di piccoli quantitativi di Mirna. Per esempio, i valori di Cq (media ± SD) di non pre-amplificata miR-206 era 37,9 ± 1,9, mentre quelle di pre-amplificate miR-206 è diminuito a 27,0 ± 2.2. Differenze significative tra le coppie di misurazione duplicati sono state osservate in campioni non pre-amplificata a valori elevati di Cq (Figura 6). Al contrario, pre-amplificati campioni hanno mostrato valori quasi uguali in duplicati (Figura 6). Questi risultati hanno indicato che pre-amplificazione sarebbe efficace per fornire dati più precisi e affidabili in caso di piccole quantità di campioni.

Profilatura di Mirna al plasma nella scimmia cynomolgus

Utilizzando la piattaforma di analisi stabiliti, i livelli del plasma di 8 Mirna (miR-1, miR-122, miR-133a, miR-192, miR-206, miR-208a, miR-208b e miR-499a) da 50 cynomolgus scimmie sono stati analizzati (Figura 7)10. In questo saggio, miR-122, miR-133a e miR-192 erano rilevabili senza pre-amplificazione, considerando che miR-1, miR-206 e miR-499a necessari pre-amplificazione a causa dei loro livelli di espressione bassa. Tuttavia, miR-208a né miR-208b era rilevabile anche con pre-amplificazione. I dati non sono stati distribuiti normalmente; di conseguenza, una trasformazione logaritmica è stata effettuata per calcolare la media e le deviazioni standard. Tra i miRNA esaminati, miR-122 ha mostrato il più alto livello del plasma (5,71 x 104 copia / µ l), con una piccola gamma dinamica (20 volte). In contrasto, ampi intervalli dinamici sono stati osservati per miR-1 (581-fold), miR-133a (971-fold) e miR-206 (426-fold).

Figure 1
Figura 1 : Flusso di lavoro schematico di miRNA analisi di RT-qPCR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Flusso di lavoro schematico di trascrizione d'inversione del dosaggio di miRNA. Una piscina che contiene fino a 4 destinazione miRNA può essere fatto mescolando i primer RT 20x di ciascuno dei miRNA in piscina. Cel-miR-238 (controllo esterno) deve essere incluso come uno dei miRNA target in ogni provetta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

analisi dei dati miR-238
Senza
Pre-amplificazione		 Con
Pre-amplificazione
N 50 50
Significa 21,0 24,2
SD 0.4 0.4
Max Cq 21,8 25,3
Cq min 20,3 23,5
Median 21,0 24,2
Max-Min 1.3 1.8
Efficacia di amplificazione 89 89
Variazione 2.4 2.8

Tabella 1: valutazione della qualità utilizzando i valori di ciclo (Cq) quantificazione del cel-miR-238. Varianti tecniche sono stati valutati dai valori Cq di miR-238 in ogni analisi. Cinquanta campioni sono stati divisi in due gruppi corrispondenti con (destra) o senza (sinistra) passaggio pre-amplificazione. Variazione è stata calcolata usando la formula E = (efficacia di amplificazione 2 x)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)). L'efficacia di amplificazione è stata calcolata dalla pendenza della curva standard. I campioni che richiedono il passaggio di pre-amplificazione sono stati diluiti durante la fase di pre-amplificazione (miR-238 stessa non era pre-amplificati). Questa figura è stata modificata dalla nostra relazione10.

Figure 3
Figura 3 : Trama di curve standard per campioni non pre-amplificata. Le curve standard (N = 3, duplicati) sono stati generati riportando la concentrazione di registro contro Cq. lineare analisi di regressione è stato calcolato per determinare la pendenza, che corrisponde all'efficienza di amplificazione. Standard curve per miR-122 (tomaia), miR-192 (al centro) e miR-133a (inferiore) ha mostrato la relazione lineare tra Cq e concentrazione presso il campo testato. Nelle curve standard, barre di errore rappresentano una deviazione standard da tre saggi indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Procedura per generare le curve standard per campioni pre-amplificate. (Curva standard A) Una concentrazione rappresentanza di oligo sintetico (1 x 105 copia / µ l) era inversa trascritto, seguita da preparare 10 volte serie di diluizioni seriali del campione di riferimento. Questi standard pre-amplificati sono stati utilizzati per qPCR successive. (Curva standard B) Una concentrazione rappresentanza di oligo sintetico (1 x 105 copia / µ l) era inversa trascritto e pre-amplificate. Quindi, una serie di diluizione seriale 10 volte di campioni standard sono state preparate prima del successivo qPCR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Trama di curve standard A e B per campioni pre-amplificate. Curva standard A (n = 1, duplicati) e la curva Standard B (n = 3, duplicati) sono stati generati riportando la concentrazione di registro contro Cq. lineare analisi di regressione è stato calcolato per determinare la pendenza, che corrisponde all'efficienza di amplificazione. (Superiore) Curva standard A (linea tratteggiata) ha mostrato apparentemente aspecifiche amplicon a 1 x 102 copia / µ l, mentre la curva standard B (linea continua) ha mostrato una relazione lineare tra Cq e concentrazione alla collaudata gamma di miR-1. (Middle e inferiore) Curva standard A (linea tratteggiata) ha mostrato nessun amplicone alle concentrazioni di 1 x 102 copia / µ l o inferiore, considerando standard curva B (linea continua) ha mostrato una relazione lineare tra Cq e concentrazione alla collaudata gamma di miR-499a e miR-206. Nella curva standard B, barre di errore rappresentano una deviazione standard da tre saggi indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 : Trama amplificazione per campioni non pre-amplificati e preamplificati. (Superiore) trama di amplificazione del miR-206 a campioni rappresentativi (A, B, C) senza (superiore), o con pre-amplificazione (inferiore). Misurazioni sono stati istituiti in duplice copia. C'erano differenze tra i due campioni impostare come duplicati nei campioni non pre-amplificati, soprattutto nei più alti campioni di Cq (A e B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7 : Valore assoluto di plasma i microRNA (Mirna) in scimmie cynomolgus. I livelli di espressione dei miRNA sono rappresentati da appezzamenti di dot. La media e il valore per due deviazioni standard sotto e sopra la media (mostrato nella casella grigia), sono stati determinati dopo una trasformazione logaritmica. Questa figura è stata modificata dalla nostra relazione10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La nostra valutazione globale fornito un'analisi statistica più rigorosa dell'estensione della gamma dinamica, che ha chiaramente indicato che la grandezza della variazione tra singoli campioni era estremamente diversa tra i miRNA testati. Anche se queste variazioni possono essere attribuibili ai loro piccoli quantitativi nei liquidi corporei, si deve osservare che questi dati riflettono non solo variazioni biologiche, ma anche varianti tecniche. La maggior parte della variazione tecnica può essere valutata mediante valori di Cq del controllo esterno (cel-miR-238), che viene utilizzato in altre piattaforme di analisi18. Dato che non ci sono stati standardizzati controlli interni nell'analisi di miRNA, le informazioni sulla variazione tecniche dovrebbero essere inclusi nell'analisi, per determinare la qualità del dosaggio19. Variazione tecnica è stata stimata in meno di 3 volte nel metodo descritto in questo rapporto. Sebbene non sia possibile determinare il livello di qualità per questa procedura a causa della mancanza di informazioni tecniche comparabili in altre ricerche, compreso tali informazioni contribuisce a migliorare l'affidabilità e garantisce la compatibilità tra diversi studi.

Una serie di carte recenti hanno riferito che diverse variabili pre-analitiche come la manipolazione del campione, condizioni di conservazione e durata di stoccaggio prima della trasformazione possono urtare l'affidabilità e la riproducibilità del circolante miRNA misure20 , 21. anche se questo studio non ha preso in considerazione gli effetti delle variabili pre-analitiche, i seguenti passaggi sono stati seguiti con attenzione durante la preparazione del campione per minimizzare le variazioni. In primo luogo, al plasma è stato elaborato nel minor tempo possibile (all'interno di post-raccolta 2 ore) per minimizzare l'effetto della stabilità dei miRNA nel plasma8,22. Anche se i miRNA sono considerati essere stabile a temperatura ambiente (15-25 ° C), non è ancora chiaro se l'intervallo tra la raccolta del sangue e la lavorazione del plasma o siero colpisce i livelli di miRNA. In secondo luogo, ogni campione di plasma è stato ispezionato visivamente per eliminare la discriminazione analitiche derivanti dalla contaminazione con eritrociti emolizzati, che rappresenta uno dei fattori di confusione che potrebbero influenzare i livelli di circolazione Mirna23.

Pre-amplificazione è utile per migliorare la rilevazione di quantità estremamente ridotte di Mirna in biofluidi senza introdurre una polarizzazione di rilevazione24. Nello studio presente, i valori di Cq delle curve standard costruiti usando i oligonucleotides sintetici preamplificati ha mostrato elevata riproducibilità attraverso le analisi. Questo ha permesso la quantificazione assoluta utilizzando campioni pre-amplificati, che ha permesso la rilevazione di piccoli quantitativi di Mirna. D'altra parte, gli standard numeri di copia basso (1 x 102 o 103 copia / µ l) non mostrano ampliconi specifici, in combinazione con pre-amplificazione. Mestdagh et al. 24 riferito che misura di copia basso numeri miRNA ha mostrato maggiore variazione dopo procedura di pre-amplificazione, rispetto alla copia moderata o alta numeri Mirna, a causa della scarsa efficienza di trascrizione inversa, che potrebbe essere il risultato di miRNA caratteristiche di sequenza. Di conseguenza, la gamma di rilevazione di curve standard per ciascun miRNA dovrà essere convalidata prima della quantificazione dei campioni biologici, soprattutto per i miRNAs pre-amplificate, per eliminare i risultati falsi-positivi. Ancora più importante, si deve constatare che i livelli assoluti di Mirna diversamente trattati come campioni pre-amplificati e non pre-amplificata non possono essere confrontati direttamente perché la quantità di campione pre-amplificata non è specificata in ciascun miRNA.

Questo rapporto descrive una procedura per la determinazione dei livelli assoluti di miRNA in campioni di plasma utilizzando RT-qPCR. Alcuni miRNA non sono stati rilevati anche dopo pre-amplificazione. Per rilevare tali bassa espressione Mirna, può avere un approccio diverso essere utilizzato. Anche se utilizza una maggiore quantità di campione può eludere questo problema come una soluzione semplice, grandi quantità di campione non sono sempre disponibili. Ad oggi, i progressi tecnologici hanno consentito lo sviluppo di varie piattaforme per miRNA profilatura25,26. Gocciolina digitale PCR (ddPCR) è stata sviluppata di recente e offre un metodo alternativo per RT-qPCR convenzionale per quantificazione assoluta. Questa tecnologia innovativa è stata segnalata per essere un metodo preciso, riproducibile e sensibile che può rilevare un miRNA di destinazione a livelli di 1 copia / µ l27,28. Se ddPCR in grado di rilevare una concentrazione bassa di Mirna senza una fase di pre-amplificazione, sarebbe un grande vantaggio perché i livelli di Mirna multipli possono essere paragonati a vicenda. Cambiamenti nelle procedure di estrazione e successiva RT-qPCR, piattaforma molecolare e dei reagenti utilizzati produrrà inevitabilmente risultati variabili. Tuttavia, queste variazioni possono essere risolte se trasparente risultati di controlli esterni e livelli assoluti per singoli miRNA sono forniti. Valutazione di qualità adeguata del metodo è la chiave per migliorare il discernimento dei cambiamenti biologici in miRNA studi di profilatura.

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Disclosures

L'autore non ha alcun conflitto d'interessi di divulgare.

Acknowledgments

Questa ricerca non ha ricevuto alcuna sovvenzione specifiche da agenzie di finanziamento nel settore pubblico, commerciale, o non-profit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Microtainer tube (K2EDTA) Becton, Dickinson and Company 365974 For blood collection
Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL Eppendorf 0030124359
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  1.5 mL Eppendorf 0030120086
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  2.0 mL Eppendorf 0030120094
Synthetic oligonucleotide Hokkaido System Science - Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade)
Tris-EDTA Buffer  (pH 8.0) Nippon Gene 314-90021 TE buffer
Buffer RPE QIAGEN - Contents in miRNeasy mini kit 
Buffer RWT QIAGEN - Contents in miRNeasy mini kit 
miRNeasy Mini Kit QIAGEN 217004
Nuclease-Free Water  QIAGEN 129114
QIAzol Lysis Reagent QIAGEN - Contents in miRNeasy mini kit 
Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic  QIAGEN 219600 ID:MSY0000293, 5 nmol
SC Adapters TAIGEN Bioscience Corporation S0120 For RNA extraction
VacEZor 36 Complete System TAIGEN Bioscience Corporation M3610 For RNA extraction
7900HT Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific Inc. 4351405 Fast 96-Well Block
GeneAmp PCR System 9700 Thermo Fisher Scientific Inc. 9700
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific Inc. 4346907
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific Inc. 4311971
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific Inc. 4444557
TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000248
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002245
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002246
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002222
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000491
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000510
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000511
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002290
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 001352
TaqMan MicroRNA Reverse
Transcription Kit		 Thermo Fisher Scientific Inc. 4366597
TaqMan PreAmp Master Mix (2×) Thermo Fisher Scientific Inc. 4391128
Chloroform  Wako Pure Chemicals 035-02616
Ethanol (99.5) Wako Pure Chemicals 057-00456

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References

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Biologia molecolare problema 132 microRNA biomarcatore al plasma reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) quantificazione assoluta pre-amplificazione
Quantificazione assoluta dei livelli di MicroRNA del Plasma nella scimmia cynomolgus, mediante trascrizione d'inversione quantitativa Real-Time PCR
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Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR. J. Vis. Exp. (132), e56850, doi:10.3791/56850 (2018).

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