Summary
이 보고서 또는 사전 증폭 없이 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 miRNA의 절대 레벨을 측정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 플라즈마 miRNAs의 수량의 더 나은 이해를 제공 하 고 다른 연구 나 실험실에서 해당 데이터의 질적 평가 허용 한다.
Abstract
실시간 정량 Pcr 개별 대상 miRNAs 평가 하는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. MiRNAs 수준 일반적으로 참조 샘플을 기준으로 측정 됩니다. 이 방법은 조사 대상 유전자 식 수준에 생리 적 변화에 대 한 적절 한입니다. 그러나, 더 나은 통계 분석을 사용 하 여 절대 정량화 유전자 식 레벨의 포괄적인 평가 위해 바람직합니다. 절대 부 량은 여전히 공통 사용 하지. 이 보고서 또는 사전 증폭 없이 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 플라즈마 miRNA의 절대 레벨을 측정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다.
EDTA 플라스마의 고정된 볼륨 (200 µ L) 의식 cynomolgus 원숭이의 대 퇴 정 맥에서 수집 된 혈액에서 준비 되었다 (n = 50). 총 RNA는 상업적으로 사용 가능한 시스템을 사용 하 여 추출 되었다. 플라즈마 miRNAs는 프로브 기반 실시간 정량 Pcr 분석 실험 미르 관련 앞으로 또는 반전 PCR 뇌관 및 프로브를 포함 하 여 정량 했다. 절대 정량화에 대 한 표준 곡선 상용 합성 RNA oligonucleotides를 사용 하 여 생성 되었다. 합성 cel-미르-238 표준화 및 품질 평가 대 한 외부 제어로 사용 되었다. MiRNAs는 정량화 35 위 주기 (Cq) 값 정량 단계 전에 미리 증폭 했다.
가운데 8 miRNAs 검사, 미르-122, 미르-133a, 및 미르-192 했다 사전 증폭 없이 감지 미르-1, 미르-206, 그리고 미르-499a 그들의 낮은 식 수준 때문에 사전 확대를 요구 하는 반면. 미르-208a와 미르 208b 했다 감지 전 확대 후에. 샘플 처리 효율 아군된 cel-미르-238의 Cq 값에 의해 평가 되었다. 이 분석 방법에서 기술 변화 3 미만 이기 위하여 견적 되었다 하 고 정량화 (LLOQ)의 하한값은 102 복사 / µ L, 시험된 miRNAs의 대부분을 위해.
이 프로토콜 플라즈마 miRNAs의 수량의 더 나은 견적을 제공 하 고 다른 연구에서 해당 하는 데이터의 품질 평가 허용 한다. 체액, 사전 증폭 miRNAs의 낮은 수는 저조한의 탐지를 향상 시키기 위해 유용 고려 miRNAs 표현.
Introduction
연구의 증가 진단 및 암의 예 후에 대 한 생체로 microRNAs (miRNAs)를 탐험 또는 모니터링 및 nonclinical 및 임상 연구1,2,3에에서 다른 질병을 감지 . 양이 많은 실시간 반전 녹음 방송 PCR (RT-정량)이이 기술은 microarray4 와 RNA 시퀀싱 플랫폼5기반 보다 더 중요 한 있기 때문에 개별 대상 miRNAs, 평가 하는 데 사용 하는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 일반적으로, 미르 식6의 ΔCq 메서드 사용 하 여 참조 샘플을 기준으로 측정 됩니다. 이 방법은 조사 대상 유전자 식 수준에 생리 적 변화에 대 한 적절 한입니다. 그러나, 순환 miRNAs의 상대 부 량 그들의 소량 때문에 유틸리티를 제한 했다. 또한, 기술 변형 하기가 다른 실험실 사용자 정의 실시간 정량 Pcr 실험 프로토콜 다르게, 일관성에 이르게 하거나 심지어 모순에서 결과 때문에 다른 연구에서 결과 비교 하기 어려운 다른 연구7.
위에서 언급 한 문제에 비추어 절대 정량화는 더 작은 양의 체액에서 miRNAs의 평가 적합 수 있습니다. 절대 정량화 방법은 해당 대상 미르8의 시퀀스와 동일한 합성 RNA oligonucleotides의 알려진된 농도에서 생성 된 표준 곡선을 사용 합니다. 건강과 환경 과학 연구소 (HESI) 유전체학 회 최근 여러 테스트 사이트에서 플라즈마 miRNAs의 절대 측정의 결과 비교 하는 포괄적인 연구를 실시 했다. 결과 여러 테스트 사이트9에서 유사한 결과 굴복 miRNAs의 절대 정량에 대 한 표준 프로토콜을 사용 하 여 보였다. 현재 연구에서 설명 하는 실시간 정량 분석 방법을 거의 여러 miRNA 표적, 및 낮은 식 miRNAs의 검색을 돕기 위해 사전 증폭의 다중화 분석 포함 HESI의 표준 프로토콜.
이 연구에서 EDTA-혈장 혈액에서 준비의 고정된 볼륨 (200 µ L) 의식 cynomolgus 원숭이의 대 퇴 정 맥에서 수집 (n = 50) 사용10. 다음과 같은 프로토콜의 추출, miRNA 및 RT-정량, 사전 증폭을 포함 하 여 플라즈마 샘플의 준비를 위한 절차를 설명 합니다. 샘플에서 대상 miRNAs의 수량 충분 한 자격이 프로세스와 함께에서 유효성을 검사할 수 있도록 더 중요 하 게는 프로토콜에 대 한 추가 기술 정보 포함 되었습니다. 첫째, 각 미르의 표준 곡선 생물학 견본에서 그것의 부 량 이전의 개별 검색 범위에 대 한 유효성을 검사 했다. 둘째, 현재 방법론의 품질 외부 컨트롤 (cel-미르-238)의 Cq 값에 의해 종합적으로 평가 되었습니다. 따라서,이 플랫폼은 다른 연구 나 실험실에서 결과 비교 하기 위한 더 유익 하 고 신뢰할 수 있는 데이터를 생성 합니다.
8 miRNAs의 프로필 대표 결과로이 보고서에 포함 된 시험 방법을 여기에 설명 된에서. 이러한 miRNAs (미르-1, 미르 208a, 미르-208b, 그리고 미르-499a), 심장 및 골격 근육 (133a 미르와 미르-206) 설치류와 인간3, 잠재적인 안전 생체 (122 미르와 미르-192), 간 조직 상해와 관련 된으로 제안 되어 11,,1213.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 다이 이치 산 쿄 주식회사에 의해 승인 되었다
1. 샘플 준비
- EDTA 2 K 포함 된 튜브에 cynomolgus 원숭이의 대 퇴 정 맥에서 혈액 (적어도 0.5 mL)를 수집 합니다.
참고: 시트르산과 헤 파 린 허용 되지 않습니다 때문에 이러한 응고 억제 이후 PCR14,15. - 즉시 얼음과 컬렉션의 2 시간 이내 플라즈마 격리 프로세스에 수집 된 샘플을 놓습니다.
- 5 분 동안 4 ° C에서 10000 x g에서 샘플 원심
- 2 mL microtube, 세포 파편 및 잔여 혈소판을 제거 하 5 분 동안 4 ° C에서 16000 x g에서 원심 분리 뒤에 상쾌한을 전송 합니다.
참고: 정량화 miRNAs의 혈소판 오염16에 의해 크게 달라질 수 있습니다. - 신선한 2 mL-microtubes에 상쾌한의 200 µ L aliquots를 놓고 사용까지-80 ° C에 저장 합니다.
참고: 각 샘플의 고정된 볼륨은 사용할 RNA 추출; 따라서,는 약 수의 볼륨 정확 해야 합니다.
2. RNA 추출
- 냉동된 샘플 (1.5 단계)에서 얼음에 녹여
- 계속 샘플 차가운 얼음에 RNA 추출 하는 동안. 세포 시 약을 진정 하 고 사용 하기 전에 얼음에 클로 프롬.
- 세포 시 약, 포함 하는 샘플 (200 µ L), 페 놀 및 guanidine isothiocyanate monophasic 솔루션의 5 볼륨 (1000 µ L)를 추가 하 고 1 분 동안 vortexing에 의해 적극적으로 혼합.
- 5 nM 합성의 5 µ L 추가 꼬마 선 충 미르 (Syn-cel-미르-238-3 p).
- 클로 프롬의 1 볼륨 (200 µ L)를 추가 하 고 1 분 동안 vortexing에 의해 적극적으로 혼합.
- 2 ~ 3 분 동안 얼음에 유지 하 고 15 분 동안 4 ° C에서 12000 x g에서 샘플을 원심.
- 신중 하 게 새로운 microtube 수성 단계 전송.
참고: 유기 단계 (빨간색) 또는 interphase (흰색)를 전송 하지 않습니다. 수집 된 수성 단계의 볼륨 증가 기술 변화에서 결과 불일치를 처리 하지 않도록 균일 해야 한다. 이 프로토콜에 수성 단계의 일반적인 금액 650 µ L 이었다. - 에탄올, 1.5 볼륨 (975 µ L)를 추가 하 고 아래로 pipetting으로 잘 혼합.
- 해당 열과 어댑터, 진공 건조 진공 매니폴드를 사용 하 여 3 분 뒤에 샘플을 전송 합니다. 샘플 볼륨 이상 700 µ L 이면 나머지 솔루션을 처리 하려면이 단계를 반복 합니다.
참고: 열 기반 RNA 격리 진공 및 원심 분리 방법와 호환 됩니다. - 뒤에 1 분 동안 진공 건조 열에 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다.
- 뒤에 2 분 동안 진공 건조 열 RWT 버퍼의 800 µ L를 추가 합니다.
- RPE 버퍼의 800 µ L 뒤에 2 분 동안 진공 건조 하 여 열을 추가 합니다.
- 2.11 단계를 반복 합니다.
- 뒤에 1 분 동안 진공 건조 열에 에탄올의 300 µ L를 추가 합니다.
- 새로운 microtube에 열을 배치 하 고 1 분 동안 실 온 (15 ~ 25 ° C)에서 12000 x g에서 원심.
- 새로운 microtube에 열을 전송 하 고 nuclease 무료 물 50 µ L를 추가 합니다.
- 실 온 (15 ~ 25 ° C)에서 3 분, 그리고 1 분 동안 실 온 (15 ~ 25 ° C)에서 8000 × g에서 원심 분리기에 대 한 서.
- 다시는 eluate 열에 적용 됩니다.
- 2.16, 단계를 반복 하 고 사용까지 eluate-80 ° C에서 저장.
3입니다. cDNA 합성
- (단계 2.18)에서 냉동된 샘플 녹여
-
대상 miRNAs에 해당 하는 합성 RNA oligonucleotides의 알려진된 농도 준비 합니다.
- 합성 RNA oligonucleotide를 사용 하 여 정량에서 표준 곡선을 생성 하기 위한. 1 x 108 복사 / µ L 농도의 재고 솔루션 스토리지 목적을 위해 준비가 되어 있습니다.
- 재고 솔루션을 1 x 107 복사 / µ L (하지 미리 증폭된 샘플) 또는 1 x 105 복사 / µ L (미리 증폭된 샘플) 작업 솔루션 표준 곡선을 만들기 위한 가장 높은 농도 10 배 희석. 일반적으로, 표준 곡선 농도 대 한 제안된 범위는 1 x 102 복사 / µ L (하지 미리 증폭된 샘플)을 1 x 107 또는 1 x 100 복사 / µ L (미리 증폭된 샘플)을 1 x 105 .
- 멀티플렉스 RT 뇌관 수영장 대상 miRNAs에 대 한 20 x RT 뇌관의 동일한 볼륨을 혼합 하 여 준비 합니다.
참고: 지금까지 그림 2에서 같이에 포함 된 최대 4 대상 miRNAs 수영장 수영장에서 miRNAs의 각각의 20 배 RT 뇌관을 혼합 하 여 만들 수 있습니다. Cel-미르-238 (외부 제어) 각 관에서 대상 miRNAs의 하나로 포함 되어야 합니다. 미만 4 대상 miRNAs의 경우 20 x RT 뇌관 대신 1/10 테 버퍼의 동일한 볼륨을 추가 합니다. - RT 반응 혼합 준비: 3 µ L RT 뇌관의 dTTP와 100mm dNTPs의 0.15 µ L, 역전사 (50 U / µ L), RT 버퍼 x 1.5 µ L 10, RNase 억제제 (20 U / µ L)의 0.19 µ L의 1 µ L (3.3 단계)에서 수영장 및 4.16 µ L nuclease 무료의 물.
- RT 반응의 믹스 10 µ L pipetting, 여 (3.1 단계)에서 RNA 샘플 또는 (3.2 단계)에서 oligonucleotides의 5 µ L를 혼합 하 고 5 분 동안 얼음에 품 어.
- 열 cycler 기구에 반전 녹음 방송 실행: 16 ° C 30 분, 30 분 동안 42 ° C에 대 한 다음 5 분에 85 ° C에서 최종 역전사 비활성화 단계 저장소 역방향 베낀된 샘플-80 ° C에서 사용까지.
4입니다. preamplification (선택 사항)
참고: Cq 값 35 또는 후속 정량에 더 이상 보여 주는 miRNAs는 미리 증폭.
- 냉동된 샘플 (3.6 단계)에서 녹여
- 10 직렬 희석 합성 RNA oligonucleotides;에서 실시간 제품의 확인 1 x 10을 1 x 100 복사 / µ L 표준 곡선을 생성 하기 위한5 .
- 대상 miRNAs 200-fold 묽 게 되 고 각 분석 결과 뇌관의 최종 농도 대 한 분석 결과 뇌관 x 20의 다중 분석 결과 뇌관 풀 같은 볼륨 (5 µ L)를 혼합 하 여 준비 테 버퍼 1000 µ L의 최종 볼륨에 의해.
참고: 해당 대상 miRNAs 사전 증폭 없이 cel-미르-238 (외부 제어)에 대 한 후속 정량에서 감지 수 분석 결과 뇌관 뇌관 수영장에는 포함 되지 않습니다. - 사전 증폭 반응 혼합물 준비: 2 x 준비-사용 preamplification 시 약, 분석 결과 뇌관 풀 (4.3 단계)에서 3.75 µ L nuclease 무료 물 6.25 µ L의 12.5 µ L.
- 사전 증폭 반응의 µ L 믹스 22.5 pipetting, 여 역 베낀된 샘플 (4.1 단계) 또는 (4.2 단계)에서 oligonucleotides의 2.5 µ L를 혼합 하 고 5 분 동안 얼음에 품 어.
- 반응 열 cycler 기구에 실행: 95 ° C 10 분; 15 s 및 4 분 동안 60 ° C까지 사용-80 ° C에 미리 증폭된 샘플을 저장 하는 동안 95 ° C의 12 주기 다음.
5. 정량 실시간 PCR (정량)
- 냉동된 샘플 (3.6 단계 또는 단계 4.6)에서 녹여
- 5-fold 샘플을 희석 소독 물.
- 합성 RNA oligonucleotides;에서 파생 된 RT 제품의 10 연속 희석을 준비 1 x 102 복사 / µ L (하지 미리 증폭된 샘플)을 1 x 107 또는 1 x 105 1 x 100 복사 / µ L (미리 증폭된 샘플) 표준 곡선을 생성 합니다.
- 정량 Pcr 반응 혼합 준비: 준비-사용 증폭 시 약, 분석 시 약, 앞으로 또는 반전 PCR 뇌관 및 조사 대상 미르에 포함 된 x 20의 1 µ L과 nuclease 무료 물 7 µ L x 2의 10 µ L.
- 정량 Pcr 반응 혼합에서 빠른 광학 96-잘 반응 판 18 µ L를 전송 하 고 우물에 (단계 5.2 또는 5.3 단계)에서 희석 샘플 2 µ L를 추가 합니다.
참고: 샘플 및 정량에 대 한 표준을 설정 됩니다 중복에. - 접착 필름, 접시를 봉인 하 고 짧게 원심.
- 반응 실시간 열 cycler에서 실행: 20 95 ° C 95 ° C의 45 주기 다음 s 1 s 및 20 60 ° C에 대 한 s.
6. 데이터 분석
- 해당 실시간 열 cycler와 함께 작동 하는 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 각 샘플의 원시 복사본 수를 계산 합니다.
참고: 임계값 줄 설정 됩니다 수동으로 "1.0"은 연구에 모든 접시에 그들의 Cq vales 비교해보면 재현성 확인 하. Cq에서 차단 수준 설정 > 40 주기. - 중복에서 각 샘플의 원시 복사본 수의 평균을 계산 합니다.
- 해당 관의 모든 샘플에서 cel-미르-238의 복사본 수의 평균에 의해 cel-미르-238 각 샘플에서의 복사본 수를 분할 하 여 수정 계수를 계산 합니다.
참고: 그림 2에서처럼 각 튜브 4 대상 miRNAs cel-미르-238 (외부 제어) 등까지 포함 합니다. 따라서, cel-미르-238의 해당 값을 사용 하 여 각 튜브에 대 한 수정 계수를 계산 합니다. - (단계 6.2)에서 각 샘플의 평균된 원시 복사본 수를 분할 하 여 각 샘플 (단계 6.3)에서 수정 계수에 의해 조정된 복사본 수를 계산 합니다.
- 여 (단계 6.4)에서 각 샘플의 조정된 원시 복사본 수를 곱하여 절대 복사본 수를 계산는 각 샘플에 대 한 희석 비율.
참고: 희석 요인은 단계 5.2에서 파생 되는이 프로토콜에 "5"입니다. - 로그 cDNA 농도 대 한 각 직렬 희석 Cq 값의 작의의 사면에서 PCR 증폭의 효율을 계산 합니다.
참고: 수식을 계산 하는 효율성; E = (10(-1/경사) -1) x 100%. - 계산 수식 E를 사용 하 여 모든 샘플에서 cel-미르-238의 Cq 값을 사용 하 여 기술 변화 = (2 x 확대 효능)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)).
참고: 6.5, 6.7 단계 절차의 품질 평가에 사용 됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
실시간 정량 Pcr에 의해 분석 결과 miRNA의 워크플로 및 품질 assessment
그림 1 에서 정량10를 사용 하 여 혈액 샘플 분석 결과 miRNA의 워크플로 보여 줍니다. Cel-미르-238는 외부 컨트롤을 포함 하 여 실험의 품질을 확인할 수 있습니다. 이 RNA 추출 기술 변화를 보여줄 것입니다 및 후속 실시간 정량 Pcr 처리 합니다. 이 연구에서는 50 샘플에서 계산 하는 Cq 값의 평균 ± SD 21.0 ± 0.4 (표 1) 이었다. Cel-미르-238 사전 증폭 단계 때문에 희석 했다, Cq 값 24.2 ± 0.4 (표 1)을 했다. 여기 설명 하는 시험 방법을에서 기술 변화의 정도 Cq 값에 차이에 따라 미만 3 것으로 추정 했다. 변화의 정도 추가 사전 증폭 단계 포함 해야만 하는 경우에 일관 된 체재. 이러한 값은 같은 쥐, 쥐, 및 인간 (데이터 표시 되지 않음) 본이 연구실에서 수행 다른 동물 종에서 다른 샘플에 대 한 호환.
대상 miRNA에 대 한 표준 곡선에서 감지 범위
샘플의 아무 사전 증폭
1 x 107 복사 / µ L의 농도에서 합성 RNA oligonucleotides에서 역방향 베낀된 (RT) 제품 직렬 후속 정량 사전 희석 되었다. 이 시리즈는 사전 증폭 단계 없이 감지 했다 모든 생물 학적 샘플의 일관 된 적용을 보장 하는 표준 곡선을 생성 하는 데 사용 되었다. 1 x 102 복사 / µ L 농도에서 표준 샘플의 Cq 값 일반적으로 각 대상 miRNA에 대 한 수준 잘라 가까이 했다. 따라서, 검출 한계 1 x 102 복사 / µ L (그림 3) 추정 했다.
미리 증폭된 샘플
사전 증폭을 필요로 하는 샘플의 감지 범위를 확인 하려면 그림 4에서 볼 수 있듯이 두 개의 서로 다른 일련의 희석된 샘플 비교 되었다. 표준 곡선 A를 생성 하기 위한 사전 증폭 단계 전에 RT 제품의 직렬 희석 준비 되었다. 다음 일련의 미리 증폭된 표준 후속 정량 사용 되었다. 표준 곡선 B를 생성 하기 위한 첫 번째 희석 미리 증폭 샘플 1 x 105 복사 / µ L의 농도에 되었다. 이러한 표준 곡선 보여주었다 분명히 다른 검출 한계 (그림 5). 표준 곡선 A 10 미만의 농도에서 특정 amplicons에 사용할 수 없습니다 비록 표준 곡선 B 1 복사 / µ L까지 증가의 선형 범위를 보여,2 또는 103 복사 / µ L (그림 5). 이 결과 제안 miRNAs의 매우 소량 사전 증폭 단계와도 평가 될 수 없습니다. 또한, 미리 증폭된 샘플 판정 신중 하 게 Cq 값이 > 30, 미리 증폭된 샘플의 탐지 한계 때문에이 값을 닫습니다. 따라서, 일반적으로 표준 곡선 B 표준 작의 부족 한 수를 사용 하지 않도록 하기 위해만 감지 범위를 결정 한 후 여기에, 설명 하는 방법을에 사용 되었다.
따라서, 정량화 (LLOQ)의 하한값 102 복사 / µ L (그림 3 과 그림 5)는 miRNAs의 대부분 이었다. 미르-1 보여준 높은 LLOQ만 (103 복사 / µ L) (그림 5). 평균 증폭 효율 0.998에서 1.000까지 표준 곡선의 약 90%, 상관 계수 (R2)와 함께 했다. 정확한 실시간 정량 분석 결과 수는 선형 R2 0.98와 90 ~ 11017의 PCR 증폭 효율 보다 크거나 간주 됩니다. 따라서, 분석 결과에서 표준 곡선의 품질 확인 했습니다.
MiRNAs의 소량에 대 한 사전 확대의 효과
MiRNAs는 Cq 값 35 이상 위의 후속 정량에 미리 증폭 했다. 이 절차는 miRNAs의 소량 검출 향상. 예를 들어 사전 증폭-미르-206의 Cq 값 (평균 ± SD) 27.0 ± 2.2 감소 미리 증폭된 미르-206의 그 37.9 ± 1.9 이었다. 중복 측정 쌍 사이의 중요 한 차이 높은 Cq 값 (그림 6)에서 사전 증폭-샘플에서 관찰 되었다. 반면, 미리 증폭된 샘플 중복 (그림 6)에서 거의 같은 값을 보여주었다. 이러한 결과 사전 증폭 소량 샘플의 경우에 더 정확 하 고 신뢰할 수 있는 데이터를 제공 하기 위한 효과적일 것 이라고 지적 했다.
Cynomolgus 원숭이에서 플라즈마 miRNAs의 프로 파일링
설립된 시험 플랫폼을 사용 하 여, 원숭이 했다 50 cynomolgus에서 8 miRNAs (미르-1, 미르-122, 미르 133a, 미르-192, 미르-206, 미르 208a, 미르-208b, 및 미르-499a)의 플라스마 수준 분석 (그림 7)10. 미르-1, 미르-206, 그리고 미르-499a 그들의 낮은 식 수준 때문에 사전 확대를 요구 하는 반면이 분석 결과, 미르-122, 미르-133a, 및 미르-192를 사전 증폭 없이 감지 했다. 그러나, 미르 208a도 미르 208b 사전 증폭으로 감지 했다. 데이터는 일반적으로 분산 되지 했다; 따라서, 로그 변환 그들의 평균 및 표준 편차를 계산 하기 위해 수행 되었다. 시험, 미르-122 miRNAs 중 보여주었다 가장 높은 비 열 플라즈마 수준 (104 복사 / µ L x 5.71), 작은 동적 범위 (20-fold). 대조적으로, 큰 동적 범위 관찰 되었다 미르-1 (581-fold), 미르 133a (971-fold), 그리고 미르-206 (426-fold).
그림 1 : 실시간 정량 Pcr에 의해 분석 결과 miRNA의 도식 워크플로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 미르 분석 결과의 반전 녹음 방송의 도식 워크플로. 포함 된 최대 4 대상 miRNAs 수영장 수영장에서 miRNAs의 각각의 20 배 RT 뇌관을 혼합 하 여 만들 수 있습니다. Cel-미르-238 (외부 제어) 각 관에서 대상 miRNAs의 하나로 포함 되어야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 미르-238 데이터 분석 | ||
| 없이 사전 증폭 |
와 함께 사전 증폭 |
|
| N | 50 | 50 |
| 평균 | 21.0 | 24.2 |
| SD | 0.4 | 0.4 |
| Max Cq | 21.8 | 25.3 |
| 분 Cq | 20.3 | 23.5 |
| 중간 | 21.0 | 24.2 |
| 최대-최소 | 1.3 | 1.8 |
| 증폭 효능 | 89 | 89 |
| 변형 | 2.4 | 2.8 |
표 1: cel-미르-238의 정량화 주기 (Cq) 값을 사용 하 여 품질 평가. 기술 변화는 각 분석 결과에서 미르-238의 Cq 값에서 평가 했다. 50 샘플 (오른쪽)에 해당 하는 두 그룹으로 분할 되었다 아니면 사전 증폭 단계 (왼쪽) 없이. 변형 E 수식을 사용 하 여 계산 = (2 x 확대 효능)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)). 증폭 효능 표준 곡선의 기울기 로부터 계산 됩니다. 사전 증폭 단계를 요구 하는 샘플은 사전 증폭 단계 희석 (미르-238 자체 사전 증폭 되지 않았습니다). 이 그림 우리의 보고서10에서 수정 되었습니다.
그림 3 : 사전 증폭-샘플에 대 한 표준 곡선의 줄거리. 표준 곡선 (N = 3, 중복) 플로팅 Cq. 선형 회귀 분석 증폭 효율에 해당 기울기를 결정 하기 위해 계산 된 대 로그 농도 의해 생성 된. 표준 곡선 미르-122 (위)에 대 한 미르-192 (중간), 그리고 미르-133a (아래) 시험된 범위에서 Cq와 농도 사이의 선형 관계를 보여주었다. 표준 곡선에서 오차 막대는 3 개의 독립적인 분석 실험에서 1 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 미리 증폭된 샘플에 대 한 표준 곡선을 생성 하는 절차. (표준 곡선 A) 합성 올리고 (1 x 105 복사 / µ L)의 농도 대표 했다 역 문자, 표준 샘플의 10 연속 희석 시리즈를 준비 하 여 다음. 이러한 사전 증폭된 표준 후속 정량 사용 되었다. (표준 곡선 B) 합성 올리고 (1 x 105 복사 / µ L)의 대표적인 집중 되었고 역 복사할 미리 증폭. 다음, 표준 샘플의 10 연속 희석 시리즈 후속 정량 사전 준비 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 미리 증폭된 샘플에 대 한 표준 곡선 A와 B의 줄거리. 표준 곡선 A (n = 1, 중복) 및 표준 곡선 B (n = 3, 중복) 플로팅 Cq. 선형 회귀 분석 증폭 효율에 해당 기울기를 결정 하기 위해 계산 된 대 로그 농도 의해 생성 된. (위) 표준 곡선 (점선) 표준 곡선 B (실선) 미르-1의 시험된 범위에서 Cq와 농도 사이의 선형 관계를 보여준 반면 1 x 102 복사 / µ L에서 분명히 일반적인 amplicon을 보였다. (중간 와 더 낮은) 표준 곡선 (점선) 1 x 102 복사 / µ L 이하로의 농도에서 아무 amplicon 보여준 반면 표준 곡선 B (실선) Cq와 농도 사이의 선형 관계에서 보였다 미르-499a의 시험된 범위 및 미르-206입니다. B 표준 곡선에서 오차 막대는 3 개의 독립적인 분석 실험에서 1 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 증폭 비 사전 증폭과 미리 증폭 샘플에 대 한 줄거리. (상단) 미르-206 (위)에 하지 않고 대표 샘플 (A, B, C)에서 증폭 줄거리 또는 사전 증폭 (아래). 측정은 중복에서 설정 했다. 비 사전 증폭 샘플, 특히 더 높은 Cq 샘플 (A와 B)에 중복으로 설정 하는 두 샘플 간의 차이점을 확인 하 고 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : Cynomolgus 원숭이에 플라즈마 microRNAs (miRNAs)의 절대값. miRNAs의 식 수준 점 플롯으로 표현 됩니다. 평균, 및 평균 (회색 상자에 표시), 위 아래 두 개의 표준 편차에 대 한 값은 로그 변환 후 결정 했다. 이 그림 우리의 보고서10에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
우리의 포괄적인 평가 개별 샘플 사이 변이의 크기는 매우 다른 miRNAs 테스트 중 명확 하 게 표시 동적 범위의 넓이의 더 엄격한 통계 분석을 제공 합니다. 비록 이러한 유사 체액에 그들의 작은 수량에 기인 수 있습니다, 생물학 변화 뿐만 아니라 기술 변화 반영 하는 이러한 데이터 주목 해야한다. 기술 변화의 대부분은 다른 분석 결과 플랫폼18에서 사용 되는 외부 제어 (cel-미르-238)의 Cq 값에 의하여 평가 수 있습니다. 이후 미르 분석에 아무 표준된 내부 통제 되었습니다, 기술 변화에 대 한 정보 분석 결과19의 품질을 결정 하기 위한 분석에 포함 되어야 합니다. 기술 변화 3 미만 이기 위하여 견적 되었다이 보고서에 설명 된 방법에. 다른 연구에 비해 기술 정보 부족으로 인해이 절차에 대 한 품질 수준을 확인할 수는 없습니다, 비록 같은 정보를 포함 하 여 신뢰성 향상에 기여 하 고 간의 호환성 보장 다른 연구입니다.
최근 논문의 수는 샘플 처리, 저장 조건, 처리 하기 전에 저장 기간 등 다양 한 사전 분석 변수 영향을 미칠 수 안정성과 재현성 미르 측정20 순환의 보고 , 21. 다음 단계 변화를 최소화 하기 위해 샘플 준비 하는 동안 신중 하 게 다음이 연구 취하지 않았다 고려 사항으로 사전 분석 변수 효과, 비록. 첫째, 플라즈마 플라즈마8,22miRNAs의 안정성의 영향을 최소화 하기 위해 (2 시간 후 컬렉션)에서 최대한 빨리 처리 했다. MiRNAs는 실 온 (15 ~ 25 ° C)에서 안정적인 것으로 간주 됩니다, 하지만 그것은 하지 아직 분명 혈액 수집 및 플라스마 또는 혈 청의 처리 간격 미르 수준에 영향을 미치는 여부. 둘째, 각 플라즈마 샘플 miRNAs23순환의 수준에 영향을 미칠 수 있는 혼란 요인 중 하나를 나타내는 hemolyzed 붉은 혈액 세포, 오염에서 형태소 분석 바이어스를 제거 하기 위해 시각적으로 검사 했다.
사전 증폭 검출 바이어스24를 도입 하지 않고 매우 작은 양의 biofluids에 miRNAs의 탐지를 개선 하기 위해 유용 합니다. 현재 연구에서 미리 증폭된 합성 oligonucleotides를 사용 하 여 건설 표준 곡선의 Cq 값은 분석 실험에서 높은 재현성을 보여주었다. 이 절대 정량 미리 증폭된 샘플, miRNAs의 소량 검출을 활성화를 사용 하 여 허용. 다른 한편으로, 낮은 복사 번호 기준 (1 x 102 또는 103 복사 / µ L)는 사전 확대와 함께에서 특정 amplicons를 표시 되지 않습니다. Mestdagh 외. 24 보고 낮은 복사 번호 miRNAs의 측정 번호 miRNAs, miRNA의 결과 수 있는 반전 녹음 방송의 낮은 효율으로 인해 중간 또는 높은 복사에 비해 사전 확대 절차 후 높은 변화 보여 시퀀스 특성입니다. 따라서, 각 miRNA에 대 한 표준 곡선의 감지 범위 생물 학적 샘플, 특히 거짓 양성 결과 제거 하기 위해 미리 증폭된 miRNAs의 정량화 하기 전에 확인 해야 합니다. 더 중요 한 것은, 그것은 미리 증폭된 샘플의 수량 각 미르에 지정 되지 않은 때문에 미리 증폭과 비 전 증폭 샘플 등 다르게 처리 miRNAs의 절대 수준 직접 비교 될 수 없다 언급 해야 합니다.
이 보고서는 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 플라즈마 샘플에서 절대 미르 수준의 결심을 위한 절차를 설명 합니다. 몇몇 miRNAs 했다 전 확대 후에 검색 되지 않습니다. 같은 낮은 식 miRNAs, 감지 하는 다른 접근 방식을 사용할 수 할 수 있습니다. 큰 샘플 수량을 사용 하 여 간단한 솔루션으로이 문제를 우회 수 있습니다, 하지만 많은 양의 샘플 제공 되지 않습니다 항상. 날짜 하려면, 기술 진보는 미르25,26프로 파일링에 대 한 다양 한 플랫폼의 개발을 활성화 했습니다. 드롭릿 디지털 PCR (ddPCR) 최근 개발 된 절대 정량화에 대 한 기존의 RT 정량 다른 방법을 제공 하. 이 혁신적인 기술은 1 복사 / µ L27,28의 수준에서 대상 miRNA를 감지할 수 있는, 재현성, 정확 하 고 민감한 방법으로 보고 되었습니다. DdPCR 사전 증폭 단계 없이 miRNAs의 낮은 농도 감지할 수 있습니다, 그것은 것 큰 장점은 여러 miRNAs의 수준이 서로 비교 될 수 있다 때문에. 추출 절차와 후속 실시간 정량, 분자 플랫폼 및 시 약 사용에 변화는 필연적으로 결과가 되지 변수. 그러나,이 변이 외부 컨트롤 및 개별 miRNAs에 대 한 절대 레벨의 투명 한 결과 제공 하는 경우 해결할 수 있습니다. 적절 한 품질 평가 방법의 개선 연구를 프로 파일링 하는 miRNA에 생물 학적 변화의 분별 열쇠입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 충돌의 관심이 있다.
Acknowledgments
이 연구는 공공, 상업, 또는 하지-위한-비영리 부문에 자금 지원 기관에서 어떤 특정 그랜트를 받지 않았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Microtainer tube (K2EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 365974 | For blood collection |
| Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Synthetic oligonucleotide | Hokkaido System Science | - | Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade) |
| Tris-EDTA Buffer (pH 8.0) | Nippon Gene | 314-90021 | TE buffer |
| Buffer RPE | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| Buffer RWT | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
| Nuclease-Free Water | QIAGEN | 129114 | |
| QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic | QIAGEN | 219600 | ID:MSY0000293, 5 nmol |
| SC Adapters | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | For RNA extraction |
| VacEZor 36 Complete System | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | For RNA extraction |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4351405 | Fast 96-Well Block |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 9700 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4311971 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4444557 | |
| TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000248 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002245 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002246 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002222 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000491 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000510 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000511 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002290 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 001352 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit |
Thermo Fisher Scientific Inc. | 4366597 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4391128 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 035-02616 | |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemicals | 057-00456 |
References
- Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
- Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury. Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).
- D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).
- Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
- Nassirpour, R., et al. Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms. BMC Genomics. 15, 485 (2014).
- Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 50 (4), 227-230 (2010).
- Bustin, S. A. Why the need for qPCR publication guidelines?--The case for MIQE. Methods. 50 (4), 217-226 (2010).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
- Thompson, K. L., et al. Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites. Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).
- Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys. Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).
- Matsuzaka, Y., et al. Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy. Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).
- Starkey Lewis, P. J., et al. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury. Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).
- Wang, K., et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).
- Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR. Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).
- Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification. Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).
- Cheng, H. H., et al. Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels. PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).
- Serafin, A., et al. Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson's disease blood samples. BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).
- Akiyama, H., et al. A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms. Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).
- Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting. Front Genet. 4, 56 (2013).
- Malentacchi, F., et al. SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses. PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).
- Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability. J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).
- Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis. PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).
- Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4, 94 (2013).
- Mestdagh, P., et al. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).
- Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).
- Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomark. Res. 3, 12 (2015).
- Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).
