Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Absolut kvantifiering av mikroRNA plasmanivåer hos Cynomolgus-apor använder kvantitativ realtids omvänd Transkription PCR

Published: February 12, 2018 doi: 10.3791/56850

Summary

Denna rapport beskriver ett protokoll för mätning av de absoluta nivåerna i plasma miRNA, använder kvantitativ realtids omvänd Transkription PCR med eller utan före förstärkning. Detta protokoll ger bättre förståelse av mängden plasma MicroRNA och tillåter kvalitativ bedömning av motsvarande data från olika studier eller laboratorier.

Abstract

RT-qPCR är en av de vanligaste metoderna för att bedöma enskilda mål microRNA. MicroRNA mäts vanligtvis i förhållande till ett referensprov. Detta tillvägagångssätt är lämpligt för att undersöka fysiologiska förändringar i genen uttryck målnivåer. Men är absolut kvantifiering med bättre statistisk analys att föredra för en övergripande bedömning av gen uttryck nivåer. Absolut kvantifiering är fortfarande inte i allmänt bruk. Denna rapport beskriver ett protokoll för mätning av de absoluta nivåerna i plasma miRNA, använder RT-qPCR med eller utan före förstärkning.

En fast volym (200 µL) av EDTA-plasma var beredd från blodet samlas in från femoral ven av medvetna cynomolgusapor (n = 50). Total RNA extraherades med hjälp av kommersiellt tillgängliga system. Plasma MicroRNA kvantifierades genom sonden-baserade RT-qPCR-analyser som innehåller miRNA-specifika framåt/bakåt PCR primer och sond. Standard kurvor för absolut kvantifiering genererades med hjälp av kommersiellt tillgängliga syntetiska RNA oligonukleotider. En syntetisk cel-miR-238 användes som en extern kontroll för normalisering och kvalitet bedömning. De MicroRNA som visade kvantifiering cykel (Cq) värden över 35 var pre förstärkta före steget qPCR.

Bland de 8 MicroRNA undersökt, var miR-122, miR-133a och miR-192 detekterbar utan före förstärkning, medan miR-1, miR-206 och miR-499a krävs före förstärkning på grund av deras låga nivåer. MiR-208a och miR-208b var inte upptäckas även efter före förstärkning. Prov bearbetning effektivitet utvärderades av Cq värdena på de spetsiga cel-miR-238. I denna analys metod, teknisk variation uppskattas vara mindre än 3 gånger och den nedre gränsen för kvantifiering (LLOQ) var 102 kopia/µL, för de flesta av de undersökta microRNA.

Detta protokoll ger en bättre uppskattning av mängden plasma MicroRNA, och kvalitetsbedömning av motsvarande data från olika studier. Med tanke på det låga antalet MicroRNA i kroppsvätskor, före förstärkning är användbart för att förbättra identifiering av dåligt uttryckt microRNA.

Introduction

Ett ökande antal studier har varit att utforska mikroRNA (Mirna) som biomarkörer för diagnos och prognos av cancer, eller övervakning och upptäcka andra sjukdomar i icke-kliniska och kliniska studier1,2,3 . Kvantitativ realtids omvänd Transkription PCR (RT-qPCR) är en av de vanligaste metoderna som används för att bedöma enskilda mål MicroRNA, eftersom denna teknik är mer känslig än microarray4 och RNA-sekvensering baserade plattformar5. I allmänhet mäts miRNA uttryck i förhållande till ett referensprov som använder den ΔCq metod6. Detta tillvägagångssätt är lämpligt för att undersöka fysiologiska förändringar i genen uttryck målnivåer. Relativ kvantifiering av cirkulerande MicroRNA har dock begränsat verktyget på grund av deras små mängder. Dessutom gör teknisk variation det svårt att jämföra resultaten från olika studier, eftersom olika laboratorier anpassa protokollen RTqPCR experimentella annorlunda, vilket leder till inkonsekvent eller även motstridiga resultat från olika studier7.

Med tanke på den oro som nämns ovan, kan absolut kvantifiering vara lämpligare för bedömning av de små kvantiteterna MicroRNA i kroppsvätskor. Den absoluta kvantifiering metoden använder en standardkurva som genereras från kända koncentrationer av syntetiska RNA oligonukleotider som är identiska i sekvens med den motsvarande mål miRNA8. Hälsa och Environmental Sciences Institute (HESI) tekniska utskottet genomik nyligen genomfört omfattande studier för att jämföra resultaten av absoluta mätningar av plasma MicroRNA, över flera provplatser. Resultaten visade att använda ett standardprotokoll för absoluta kvantitering av MicroRNA gett jämförbara resultat över flera test platser9. RT-qPCR-analys metod som beskrivs i den aktuella studien är nästan identisk med den HESI standardprotokoll, som innehåller multiplexade analys av flera miRNA mål, och före förstärkning till stöd detektion av låga uttryck microRNA.

I denna studie en fast volym (200 µL) av EDTA-plasma beredd från blodet samlas in från femoral ven av medvetna cynomolgusapor (n = 50) var används10. Följande protokoll beskriver förfarandet för utarbetande av plasmaprover, utvinning av miRNA och RT-qPCR, inklusive före förstärkning. Viktigare, har ytterligare teknisk information om protokollet inkluderats, så att mängden mål MicroRNA i proverna kan valideras i kombination med en väl kvalificerad process. Standardkurvan för varje miRNA validerades först, för dess enskilda detekteringsområde, före dess kvantifiering i biologiska prover. Kvaliteten på den nuvarande metoden utvärderades andra omfattande genom Cq värden av en yttre kontroll (cel-miR-238). Denna plattform ger därför mer informativ och tillförlitliga uppgifter för att jämföra resultaten från olika studier eller laboratorier.

Profiler av 8 MicroRNA har inkluderats i denna rapport som representativa resultat från metoden analys beskrivs här. Dessa MicroRNA har föreslagits som möjliga säkerhet biomarkörer är associerad med vävnadsskada på levern (miR-122 och miR-192), hjärta (miR-1, miR-208a, miR-208b och miR-499a) och skelettmuskulatur (miR-133a och miR-206) i gnagare och människa3, 11,12,13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittén av Daiichi Sankyo Co., Ltd.

1. provberedning

  1. Samla in blod (minst 0,5 mL) från femoral ven på cynomolgusapor i 2K-innehållande EDTA-rör.
    Obs: Citrat och heparin är inte godtagbara eftersom dessa antikoagulantia hämma efterföljande PCR-14,15.
  2. Placera de insamlade proverna omedelbart på is och processen för plasma isolering inom 2 timmar efter provtagning.
  3. Centrifugera proverna vid 10 000 x g vid 4 ° C i 5 min.
  4. Över supernatanten till en 2 mL mikrorör, följt av centrifugering vid 16 000 x g vid 4 ° C för 5 min att ta bort cellfragment och kvarstående trombocyter.
    Obs: Kvantifiering av MicroRNA kan påverkas betydligt av trombocyter kontaminering16.
  5. Placera 200 µL portioner av supernatanten i färska 2 mL-mikrorör och förvaras vid-80 ° C fram till användning.
    Obs: En fast volym av varje prov används för RNA-extraktion; Därför måste volymen av alikvoten vara exakta.

2. RNA-extraktion

  1. Tina frysta prover på is (från steg 1,5).
    1. Håll urval kalla på isen under RNA-extraktion. Chill lysis reagens och kloroform på is före användning.
  2. Tillsätt 5 volymer (1000 µL) lysis reagens, som innehåller monofasiska lösning av fenol och guanidin isotiocyanat, att provet (200 µL), och blanda kraftigt av vortexa för 1 min.
  3. Tillsätt 5 µL 5 nM syntetiska Caenorhabditis elegans miRNA (Syn-cel-miR-238-3 p).
  4. Tillsätt 1 volym (200 µL) kloroform och blanda kraftigt genom vortexa för 1 min.
  5. Hålla på is för 2 till 3 min och sedan Centrifugera proverna vid 12 000 x g vid 4 ° C i 15 min.
  6. Överför den vattenhaltiga fasen försiktigt till en ny mikrorör.
    Obs: Inte över någon av den organiska fasen (röd) eller interphase (vit). Volymen av vattenfasen samlas in bör vara enhetliga för att undvika hantering av inkonsekvens, vilket resulterar i ökad teknisk variation. Den vanliga mängden av vattenfasen överförs i detta protokoll var 650 µL.
  7. Tillsätt 1,5 volymer (975 µL) etanol, och blanda väl genom pipettering upp och ner.
  8. Över provet till en motsvarande kolumn och adapter, följt av vakuumtorkning för 3 min med hjälp av vakuum grenrör. Om provvolymen är mer än 700 µL, upprepa detta steg för att bearbeta den återstående lösningen.
    Obs: Kolumnbaserade RNA isolering är kompatibel med vakuum och centrifugering metod.
  9. Tillsätt 200 µL etanol till kolumnen, följt av vakuumtorkning för 1 min.
  10. Tillsätt 800 µL RWT buffert i kolumnen, följt av vakuumtorkning i 2 min.
  11. Tillsätt 800 µL av RPE buffert till kolumnen, följt av vakuumtorkning i 2 min.
  12. Upprepa steg 2.11.
  13. Tillsätt 300 µL etanol till kolumnen, följt av vakuumtorkning för 1 min.
  14. Placera kolumnen på en ny mikrorör och centrifugeras vid 12 000 x g i rumstemperatur (15-25 ° C) i 1 min.
  15. Flytta kolumnen till ett nytt mikrorör och tillsätt 50 µL nuclease-gratis vatten.
  16. Stå i rumstemperatur (15-25 ° C) för 3 min, och centrifugera vid 8 000 × g vid rumstemperatur (15-25 ° C) i 1 min.
  17. Återapplicera eluatet till kolumnen.
  18. Upprepa steg 2.16 och lagra eluatet vid-80 ° C fram till användning.

3. cDNA syntes

  1. Tina frysta prover (från steg 2.18).
  2. Förbereda känd koncentration av syntetiska RNA oligonukleotider som motsvarar målet microRNA.
    1. Använda syntetiska RNA oligonukleotiden för att generera en standardkurva i qPCR. Stamlösning 1 x 108 kopia/µL koncentration är förberedd för lagringsändamål.
    2. Späd stamlösningen 10 gånger för att få 1 x 107 kopia/µL (inte pre förstärkta prov) eller 1 x 105 kopia/µL (pre förstärkta prov) fungerande lösning som den högsta koncentrationen för att konstruera standardkurvan. I allmänhet är en föreslagna intervallet för standardkurvan koncentrationerna 1 x 107 till 1 x 102 kopia/µL (inte pre förstärkta prov) eller 1 x 105 till 1 x 100 kopia/µL (pre förstärkta prov).
  3. Förbered multiplex RT primer pool genom att blanda lika stora volymer av 20 x RT primers för målet microRNA.
    Obs: Som visas i figur 2, en pool som innehåller upp till 4 mål MicroRNA kan göras genom att blanda 20 x RT primers av varje av MicroRNA i poolen. Cel-miR-238 (extern kontroll) måste inkluderas som ett av de mål MicroRNA i varje rör. Vid färre än 4 mål MicroRNA, lägga till lika stora volymer av 1/10 TE buffert istället för 20 x RT primer.
  4. Förbereda RT reaktionsblandning: 3 µL av RT primer Biljard (från steg 3.3), 0,15 µL av 100 mM dNTP med dTTP, 1 µL av omvänt transkriptas (50 U/µL), 1,5 µL 10 x RT buffert, 0,19 µL av RNase inhibitor (20 U/µL) och 4.16 µL av nuclease-gratis vatten.
  5. Blanda 10 µL av RT reaktion blanda med 5 µL RNA-prov (från steg 3.1) eller oligonukleotider (från steg 3,2) genom pipettering och inkubera på is för 5 min.
  6. Köra omvänd Transkription på en termocykel apparater: 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 min, följt av en avslutande omvänt transkriptas inaktivering steg vid 85 ° C i 5 min. Store omvänd transkriberas prover vid-80 ° C fram till användning.

4. preamplification (tillval)

Obs: De MicroRNA som visar Cq värden över 35 eller mer i efterföljande qPCR är pre förstärks.

  1. Tina frysta prover (från steg 3.6).
  2. Gör 10-faldig seriespädningar av RT produkten från syntetiska RNA oligonukleotider; 1 x 105 till 1 x 100 kopia/µL för att generera standardkurvan.
  3. Förbereda multiplex assay primer pool genom att blanda lika volymer (5 µL) av 20 x assay primers för målet MicroRNA med varje assay primer späds 200-fold slutliga koncentration av TE buffert i en slutlig volym av 1000 µL.
    Obs: Assay primers vars mål MicroRNA kan upptäckas i efterföljande qPCR utan före amplifiering, och de för cel-miR-238 (extern kontroll) ingår inte i primer pool.
  4. Förbereda inför förstärkning reaktionsblandning: 12,5 µL av 2 x ready-to-use preamplification reagens, 3,75 µL av assay primer pool (från steg 4.3) och 6,25 µL nuclease-gratis vatten.
  5. Mix 22,5 µL före förstärkning reaktion blanda med 2,5 µL omvänd transkriberas prov (från steg 4.1) eller oligonukleotider (från steg 4,2) genom pipettering och inkubera på is för 5 min.
  6. Kör reaktion på en termocykel apparater: 95 ° C i ca 10 min; följt av 12 behandlingscykler om 95 ° C för 15 s och 60 ° C under 4 min. lagra pre förstärkta prover vid-80 ° C fram till användning.

5. kvantitativ realtids-PCR (qPCR)

  1. Tina frysta prover (från steg 3,6 eller 4.6).
  2. Späd ut proverna 5 gånger med sterilt vatten.
  3. Förbereda 10-faldig seriespädningar av RT produkten härrör från syntetiska RNA oligonukleotider; 1 x 107 till 1 x 102 kopia/µL (inte pre förstärkta prov) eller 1 x 105 till 1 x 100 kopia/µL (pre förstärkta prov) för att generera standard kurvor.
  4. Förbereda qPCR reaktionsblandning: 10 µL 2 x ready-to-use förstärkning reagens, 1 µL 20 x assay reagens, som innehåller framåt/bakåt PCR primer och sond som motsvarar målet miRNA, och 7 µL nuclease-gratis vatten.
  5. Överföra 18 µL från qPCR reaktion mixen till snabb optisk 96 brunnar reaktion plattorna och tillsätt 2 µL utspädda proverna (från steg 5.2 eller 5.3) i brunnar.
    Obs: Prover och standarder för qPCR ställs in i dubbletter.
  6. Försegla plattan med självhäftande film och centrifugera kort.
  7. Kör reaktion på en realtid termocykel: 95 ° C under 20 s, följt av 45 cykler av 95 ° C för 1 s och 60 ° C för 20 s.

6. dataanalys

  1. Beräkna antalet rå kopia av varje prov med data analys programvara som fungerar med motsvarande realtid termocykel.
    Obs: Tröskel raden ställs in manuellt till ”1.0” i alla plåtar i studien, att bekräfta reproducerbarhet jämfört med deras Cq vales. Cut-off nivå är inställd på Cq > 40 cykler.
  2. Beräkna medelvärdet för antalet rå kopia av varje prov från dubbletter.
  3. Beräkna korrektionsfaktorn genom en kopia antalet cel-miR-238 i varje prov divideras med genomsnittet av kopia antalet cel-miR-238 från alla prover i en motsvarande tub.
    Obs: I figur 2visas varje tub innehåller upp till 4 mål MicroRNA inklusive cel-miR-238 (extern kontroll). Därför beräknas korrektionsfaktorn för varje tub med motsvarande cel-miR-238-värde.
  4. Beräkna antalet justerade kopia genom att dividera antalet i genomsnitt rå kopia av varje prov (från steg 6,2) Korrektionsfaktorn (från steg 6.3) för varje prov.
  5. Beräkna absoluta kopienumret genom att multiplicera antalet justerade rå kopia av varje prov (från steg 6,4) av den utspädningsfaktorn för varje prov.
    Obs: Utspädningsfaktorn är ”5” i detta protokoll, som härleds från steg 5.2.
  6. Beräkna effektivitetsvinsterna av PCR-amplifiering från sluttningen av handlingen i Cq värdena för varje seriell utspädning mot log cDNA koncentration.
    Anmärkning: Formeln för beräkning av effektivitet; E = (10(-1/lutning) -1) x 100%.
  7. Beräkna den tekniska variation med Cq värden av cel-miR-238 från alla prover med hjälp av formeln E = (2 x förstärkning effekt)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)).
    Obs: Steg 6.5 och 6.7 används för kvalitetsbedömning av förfarandet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Arbetsflöde miRNA analys av RT-qPCR och kvalitet assessment
Figur 1 visar arbetsflödet för miRNA analys från blodprov med qPCR10. Kvaliteten på experimenten kan verifieras av inklusive cel-miR-238 som en extern kontroll. Detta kommer att avslöja tekniska variationer i RNA-extraktion och efterföljande RT-qPCR-processer. I denna studie var den medelvärde ± SD Cq värden beräknade från 50 prov 21.0 ± 0,4 (tabell 1). Om den cel-miR-238 försvagades på grund av steget före förstärkning, var Cq värdet 24,2 ± 0,4 (tabell 1). I assay-metoden som beskrivs här uppskattades omfattningen av teknisk variation till mindre än 3-faldig baserat på skillnaden i Cq värdena. Graden av variation bott konsekvent även när ytterligare före förstärkning steg hade inkluderas. Dessa värden är förenliga med de för andra prover från olika djurarter, såsom möss, råttor och människor utförs i detta laboratorium (inga data anges).

Detekterbara utbud från standardkurvan för målet miRNA

Ingen före amplifiering av proverna

Omvänd transkriberas (RT) produkten från syntetiska RNA oligonukleotider vid koncentrationer på 1 x 107 kopia/µL var seriellt spädas före efterföljande qPCR. Dessa serier användes för att generera standardkurva som säkerställer konsekvent täckning av alla biologiska prover som var detekterbar utan före förstärkning steg. Cq värdena av standardprovet vid 1 x 102 kopia/µL koncentration var i allmänhet nära avskuren nivåer för varje mål miRNA. Därför uppskattades detektionsgränsen till 1 x 102 kopia/µL (figur 3).

Pre förstärkta prover

För att avgöra den påvisbara rad prover som kräver före förstärkning, jämfördes två olika serier av utspädda prover, som illustreras i figur 4. För att generera standardkurvan A, var seriespädningar av RT produkten innan före förstärkning steg beredda. Sedan användes serien av pre förstärkta standarder för efterföljande qPCR. För att generera standardkurvan B, var första utspädningen gjord av pre förstärkta prover till en koncentration på 1 x 105 kopia/µL. Dessa standard kurvor visade tydligen olika detektionsgränser (figur 5). Även om standardkurvan B visade linjära rad ökar ner till 1 kopia/µL, standardkurvan A inte kunde användas för specifika amplikoner vid koncentrationer mindre än 102 eller 103 kopia/µL (figur 5). Detta resultat föreslog att extremt små mängder MicroRNA inte kan bedömas även med före förstärkning steg. Dessutom före förstärkta proverna ska tolkas försiktigt när Cq värden är > 30, eftersom detektionsgränserna för pre förstärkta proverna var nära detta värde. Därför som regel användes standardkurvan B i den metod som beskrivs här, efter att bestämma intervallet detekterbara, bara för att undvika att använda otillräckligt antal standard tomter.

Följaktligen var den nedre gränsen för kvantifiering (LLOQ) 102 kopia/µL för de flesta av MicroRNA (figur 3 och figur 5). Bara miR-1 visade en högre LLOQ (103 kopia/µL) (figur 5). Den genomsnittliga förstärkning effektiviteten var cirka 90%, med korrelationskoefficienten (R2) av standard kurvorna alltifrån 0.998 till 1.000. Kännetecken för en korrekt RT-qPCR-analys anses vara en linjär R2 lika med eller större än 0,98 och en PCR-amplifiering verkningsgrad på 90 till 110%17. Därför verifierades kvaliteten på standard kurvorna i analysen.

Effekterna av före förstärkning för små mängder MicroRNA

De MicroRNA som visade Cq värden ovan 35 eller högre i efterföljande qPCR var pre förstärks. Detta förfarande förbättrad detektion av små mängder microRNA. Till exempel Cq värdena (medelvärde ± SD) av icke-pre-förstärkta miR-206 var 37,9 ± 1,9, medan de i förväg förstärkta miR-206 minskade till 27,0 ± 2,2. Signifikanta skillnader mellan dubbla mätning par observerades i icke-pre-förstärkta prover vid höga Cq-värden (figur 6). Däremot före förstärkta prover visade nästan lika värden i dubbletter (figur 6). Dessa resultat visade att före förstärkning skulle vara effektivt för att ge mer precisa och tillförlitliga uppgifter i fall av små mängder av prover.

Profilering av plasma MicroRNA hos cynomolgusapor

Plasmanivåerna av 8 MicroRNA (miR-1, miR-122, miR-133a, miR-192, miR-206, miR-208a, miR-208b och miR-499a) från 50 cynomolgus apor var med hjälp av etablerade assay-plattformen, och analyseras (figur 7)10. I denna analys var miR-122, miR-133a och miR-192 detekterbar utan före förstärkning, medan miR-1, miR-206 och miR-499a krävs före förstärkning på grund av deras låga nivåer. MiR-208a varken miR-208b var dock upptäckas även med före förstärkning. Data var inte normalfördelade; Därför utfördes en logaritmisk omvandling för att beräkna deras medelvärden och standardavvikelser. Bland MicroRNA undersökta, miR-122 visade högsta genomsnittlig plasma (5,71 x 104 kopia/µL), med ett litet dynamiskt omfång (20 gånger). Däremot stora dynamiska spänner observerades för miR-1 (581-fold), miR-133a (971-fold), och miR-206 (426-fold).

Figure 1
Figur 1 : Schematisk arbetsflöde miRNA analys av RT-qPCR. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Schematisk arbetsflödet för omvänd Transkription av miRNA assay. En pool som innehåller upp till 4 mål MicroRNA kan göras genom att blanda 20 x RT primers av varje av MicroRNA i poolen. Cel-miR-238 (extern kontroll) måste inkluderas som ett av de mål MicroRNA i varje rör. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

miR-238 dataanalys
Utan
Före förstärkning
Med
Före förstärkning
N 50 50
Menar 21,0 24,2
SD 0,4 0,4
Max Cq 21,8 25,3
Min Cq 20,3 23,5
Median 21,0 24,2
Max-Min 1.3 1.8
Förstärkning effekt 89 89
Variation 2.4 2.8

Tabell 1: kvalitetsbedömning med kvantifiering cykel (Cq) värden av cel-miR-238. Tekniska variationer utvärderades från Cq värdena av miR-238 i varje analys. Femtio prover var indelade i två grupper motsvarar med (höger) eller utan (vänster) steg före förstärkning. Variationen var beräknas med följande formel E = (2 x förstärkning effekt)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)). Förstärkning effekt beräknades från sluttningen av standardkurvan. De prover som kräver före förstärkning steg späddes under steget före amplifiering (miR-238 själv var inte pre förstärkta). Denna siffra har ändrats från vår rapport10.

Figure 3
Figur 3 : Tomt på standard kurvor för icke-pre-förstärkta prover. Standard kurvor (N = 3, dubbla) genererades av plottning log koncentration kontra Cq. linjär regressionsanalys beräknades för att bestämma lutningen, vilket motsvarar förstärkning effektivitet. Standard kurvor för miR-122 (övre), miR-192 (mitten), och miR-133a (lägre) visade linjärt samband mellan Cq och koncentration vid testade range. I standard kurvorna representera felstaplar en standardavvikelse från tre oberoende analyser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Förfarandet att generera standard kurvor för pre förstärkta prover. (Standardkurvan A) En representativ koncentration av syntetiska oligo (1 x 105 kopia/µL) var omvänd transkriberas, följt av förbereder 10-faldig seriell utspädning rad standardprov. Dessa pre förstärkta standarder användes för efterföljande qPCR. (Standardkurvan B) En representativ koncentration av syntetiska oligo (1 x 105 kopia/µL) var omvänd transkriberas och pre förstärks. Sedan, en 10-faldig seriell spädningsserien av standardproven var beredda före efterföljande qPCR. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Tomt på standard kurvor A och B för pre förstärkta prover. Standardkurvan A (n = 1, dubbla) och standardkurvan B (n = 3, dubbla) genererades av plottning log koncentration kontra Cq. linjär regressionsanalys beräknades för att bestämma lutningen, vilket motsvarar förstärkning effektivitet. ()Övre) Standardkurvan en (prickad linje) visade tydligen icke-specifik amplikon på 1 x 102 kopia/µL, medan standardkurvan B (heldragen linje) visade linjärt samband mellan Cq och koncentration på testade utbud av miR-1. (Mellersta och lägre) Standardkurvan en (prickad linje) visade ingen amplikon vid koncentrationer på 1 x 102 kopia/µL eller lägre, medan standard kurvan B (heldragen linje) visade linjärt samband mellan Cq och koncentration på testade utbud av miR-499a och miR-206. I standardkurvan B representera felstaplar en standardavvikelse från tre oberoende analyser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Förstärkning tomt för icke-pre-förstärkta och pre förstärkta prover. (Övre) Amplification plot av miR-206 i representativa prover (A, B, C) utan (övre), eller med före förstärkning (nedre). Mätningar sattes upp i två exemplar. Det fanns skillnader mellan de två prover som dubbletter i icke-pre-förstärkta prover, särskilt i högre Cq prover (A och B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Absolutvärdet av plasma mikroRNA (Mirna) hos cynomolgusapor. Uttrycksnivåerna för MicroRNA representeras av dot tomter. Medelvärdet, och värdet för två standardavvikelser nedan och ovan medelvärdet (visas i grå ruta), bestämdes efter en logaritmisk förvandling. Denna siffra har ändrats från vår rapport10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vår omfattande bedömning föreskrivs en mer rigorös statistisk analys av omfattningen av det dynamiska omfånget, vilket anges tydligt att omfattningen av variationen mellan enskilda prover var extremt olika bland de MicroRNA testade. Även om dessa variationer kan hänföras till deras små mängder i kroppsvätskor, bör det noteras att dessa data som speglar inte bara biologiska variationer, men också tekniska varianter. De flesta av tekniska variationen kan bedömas med hjälp av Cq värdena i externa kontrollen (cel-miR-238), som används i andra assay plattformar18. Eftersom det har inga standardiserade interna kontroller i miRNA analyser, bör information om teknisk variation ingå i analysen, för kvalitetsbestämning av assay19. Teknisk variation uppskattas vara mindre än 3 gånger i den metod som beskrivs i denna rapport. Även om det inte är möjligt att fastställa kvalitetsnivån för detta förfarande på grund av bristen på jämförbara tekniska information i annan forskning, inklusive sådan information bidrar till att förbättra tillförlitligheten och säkerställer kompatibilitet mellan olika studier.

Ett antal senaste tidningar har rapporterat att olika pre analytiska variabler såsom provhantering, förvaring och lagring varaktighet före bearbetning kan påverka den pålitlighet och reproducerbarhet av cirkulerande miRNA mätningar20 , 21. även om denna studie inte tog hänsyn till effekterna av pre analytiska variabler, följande steg följdes noga under provberedning att minimera variationer. Först, plasma bearbetades så snabbt som möjligt (inom 2 timmar efter insamling) för att minimera effekten av stabiliteten i MicroRNA i plasma8,22. Även MicroRNA anses vara stabil vid rumstemperatur (15-25 ° C), är det fortfarande oklart om intervallet mellan blodinsamling och bearbetning av plasma eller serum påverkar miRNA nivåer. Det andra var varje plasmaprov inspekteras visuellt för att eliminera analytiska bias som härrör från kontaminering med hemolyserade erytrocyter, som representerar en av de störande faktorerna som kan påverka nivåerna av cirkulerande MicroRNA23.

Före förstärkningen är användbart för att förbättra upptäckten av extremt små mängder MicroRNA i kroppsvätskor utan att införa en upptäckt bias24. I den aktuella studien visade Cq värdena av standard kurvorna konstruerade med pre förstärkta syntetiska oligonukleotider hög reproducerbarhet över analyserna. Detta tillät absolut kvantifiering använder pre förstärkta prover, som gjorde det möjligt att upptäcka små mängder microRNA. Däremot, visar låg kopia antalet standarder (1 x 102 eller 103 kopia/µL) inte specifika amplikoner, i kombination med före förstärkning. Mestdagh et al. 24 rapporterade att mätning av låga kopia nummer MicroRNA visade högre variation efter före förstärkning förfarande, jämfört med måttlig eller hög kopia nummer MicroRNA, på grund av den låga verkningsgraden av omvänd Transkription, som kan vara resultatet av miRNA sekvens egenskaper. Därför måste detektionsområdet standard kurvor för varje miRNA valideras innan kvantifiering av biologiska prover, särskilt för pre förstärkta MicroRNA, att eliminera falskt positiva resultat. Viktigare, måste det noteras att de absoluta nivåerna av olika bearbetade MicroRNA såsom pre förstärkta och icke-pre-förstärkta prover inte kan jämföras direkt eftersom mängden pre förstärkta prov inte anges i varje miRNA.

Denna rapport beskriver förfarandet för bestämning av absoluta miRNA nivåer i plasmaprover med RT-qPCR. Vissa MicroRNA upptäcktes inte även efter före förstärkning. För att upptäcka sådana låga uttryck MicroRNA, kanske en annan metod användas. Trots att använda en större prov kvantitet kan kringgå detta problem som en enkel lösning, är stora mängder av provet inte alltid tillgängliga. Hittills har har tekniska framsteg möjliggjort utvecklingen av olika plattformar för miRNA profilering25,26. Droplet digital PCR (ddPCR) har utvecklats nyligen och erbjuder en alternativ metod till konventionella RT-qPCR för absolut kvantifiering. Denna innovativa teknik har rapporterats vara en exakt, reproducerbar och känslig metod som kan upptäcka en target miRNA på nivåer av 1 kopia/µL27,28. Om ddPCR kan identifiera en låg koncentration av MicroRNA utan en pre förstärkning steg, vore det en stor fördel eftersom nivåerna av flera MicroRNA kan jämföras med varandra. Förändringar i extraktionsmetoder och efterföljande RT-qPCR, molekylär plattform och reagenser som används kommer oundvikligen ge varierande resultat. Dessa variationer kan dock lösas om transparent resultat av externa kontroller och absoluta nivåer för enskilda MicroRNA tillhandahålls. Lämplig kvalitetsbedömning av metoden är nyckeln till att förbättra urskillning av biologiska förändringar i miRNA profilering studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författaren har ingen intressekonflikt att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning tog inte emot några specifika stipendier från finansiärer inom den offentliga, kommersiella eller icke-vinstdrivande sektorn.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Microtainer tube (K2EDTA) Becton, Dickinson and Company 365974 For blood collection
Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL Eppendorf 0030124359
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  1.5 mL Eppendorf 0030120086
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  2.0 mL Eppendorf 0030120094
Synthetic oligonucleotide Hokkaido System Science - Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade)
Tris-EDTA Buffer  (pH 8.0) Nippon Gene 314-90021 TE buffer
Buffer RPE QIAGEN - Contents in miRNeasy mini kit 
Buffer RWT QIAGEN - Contents in miRNeasy mini kit 
miRNeasy Mini Kit QIAGEN 217004
Nuclease-Free Water  QIAGEN 129114
QIAzol Lysis Reagent QIAGEN - Contents in miRNeasy mini kit 
Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic  QIAGEN 219600 ID:MSY0000293, 5 nmol
SC Adapters TAIGEN Bioscience Corporation S0120 For RNA extraction
VacEZor 36 Complete System TAIGEN Bioscience Corporation M3610 For RNA extraction
7900HT Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific Inc. 4351405 Fast 96-Well Block
GeneAmp PCR System 9700 Thermo Fisher Scientific Inc. 9700
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific Inc. 4346907
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific Inc. 4311971
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific Inc. 4444557
TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000248
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002245
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002246
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002222
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000491
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000510
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000511
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002290
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 001352
TaqMan MicroRNA Reverse
Transcription Kit
Thermo Fisher Scientific Inc. 4366597
TaqMan PreAmp Master Mix (2×) Thermo Fisher Scientific Inc. 4391128
Chloroform  Wako Pure Chemicals 035-02616
Ethanol (99.5) Wako Pure Chemicals 057-00456

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
  2. Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury. Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).
  3. D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).
  4. Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
  5. Nassirpour, R., et al. Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms. BMC Genomics. 15, 485 (2014).
  6. Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 50 (4), 227-230 (2010).
  7. Bustin, S. A. Why the need for qPCR publication guidelines?--The case for MIQE. Methods. 50 (4), 217-226 (2010).
  8. Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
  9. Thompson, K. L., et al. Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites. Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).
  10. Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys. Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).
  11. Matsuzaka, Y., et al. Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy. Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).
  12. Starkey Lewis, P. J., et al. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury. Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).
  13. Wang, K., et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).
  14. Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR. Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).
  15. Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification. Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).
  16. Cheng, H. H., et al. Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels. PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).
  17. Serafin, A., et al. Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson's disease blood samples. BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).
  18. Akiyama, H., et al. A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms. Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).
  19. Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting. Front Genet. 4, 56 (2013).
  20. Malentacchi, F., et al. SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses. PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).
  21. Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability. J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).
  22. Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis. PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).
  23. Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4, 94 (2013).
  24. Mestdagh, P., et al. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).
  25. Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).
  26. Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).
  27. Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomark. Res. 3, 12 (2015).
  28. Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).

Tags

Molekylärbiologi fråga 132 mikroRNA biomarkör plasma kvantitativa polymeras-kedjereaktion (qPCR) absolut kvantifiering före förstärkning
Absolut kvantifiering av mikroRNA plasmanivåer hos Cynomolgus-apor använder kvantitativ realtids omvänd Transkription PCR
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S.,More

Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR. J. Vis. Exp. (132), e56850, doi:10.3791/56850 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter