Summary
Her viser vi en protokol for at standardisere prøveudtagningsprocedurer af en etableret svin model af akut myokardieinfarkt for at øge dens translationel værdi i forståelsen af Patofysiologi af Myokardie iskæmi/reperfusion skade og til at teste nye lægemiddelkandidater.
Abstract
Myokardie iskæmi reperfusion (jeg / R) skade bidrager til næsten halvdelen af området nekrotisk efter myokardieinfarkt. Til dato er der ikke godkendt lægemiddel til at forebygge eller mindske Myokardie jeg / Rasmussen skade. Undersøgelsen og forståelse af de patofysiologiske mekanismer, der af Myokardie / Rasmussen skade er afgørende for at udvikle vellykkede behandlinger. Store dyreforsøg er et vigtigt skridt i translationel metoder. Den svin model af akut myokardieinfarkt har været etableret og beskrevet af os selv og andre. Vi havde til formål at forbedre værdien af modellen ved at fokusere nærmere på stikprøver til brug i fremtidige eksperimenter. Desuden understreger vi små men vigtige skridt, der kan påvirke kvaliteten af de endelige resultater. At efterligne den kliniske situation af Myokardie jeg / Rasmussen skade, perkutan koronar intervention (PCI) kateter er indsat i venstre forreste faldende koronararterie (LAD) af en bedøvede gris. ° ° ° Denne model efterligner akut myokardieinfarkt og PCI behandling hos mennesker med mulighed for præcist bestemme området på risiko samt den nekrotiske- og levedygtige iskæmisk væv. Her blev modellen brugt til at undersøge effekten af en bicykliske peptid hæmmer af FXIIa. Modellen kan også ændres for at tillade længere reperfusion gange at studere senere virkninger af myokardieinfarkt.
Introduction
Iskæmisk hjertesygdom, især akut myokardieinfarkt (MI), er den vigtigste dødsårsag i udviklede lande 1. I dag, er den standard behandling af MI perkutan koronar intervention (PCI), ballon kateter behandling. En af de kritiske faktorer, der påvirker livskvaliteten og prognosticering af patienter efter PCI-behandles akut MI er infarkt størrelse. Reduktion af størrelsen kan have stor indflydelse på patienternes overlevelse og prognose 2. Myokardie iskæmi/reperfusion (jeg / R) skade har en betydelig indflydelse på infarkt størrelse, så en af de vigtigste mål i hjerte-kar-forskning er at forebygge eller mindske Myokardie jeg / R skade 3. De præcise mekanismer af jeg / Rasmussen skade er stadig under efterforskning 4. Aktivering af plasma kaskader og endotelceller er kendetegnende for jeg / R skade 5. Aktivering af koagulation system er klart involveret 6,7. For nylig, FXII, rolle som en tidlig opstrøms peptid involveret i kontakt fase aktivering af koagulationskaskaden, er blevet vist i en FXII banke ud rotte model af cerebral / R skade 8. Validering af disse resultater i en svin model er et vigtigt skridt i klinisk oversættelse. Derfor, vi tester en roman bicykliske (80 kDa protease) FXIIa hæmmer i forbindelse med Myokardie jeg / Rasmussen skade i en pilotundersøgelse.
Dyremodeller, der efterligner den kliniske situation af akut MI og PCI-behandlinger, er afgørende for at forbedre vores forståelse af Patofysiologi af Myokardie jeg / Rasmussen skade og til at teste nye behandlingsmuligheder. Svin repræsenterer en god dyremodel for kliniske Myokardie jeg / Rasmussen skade. Dette er ikke kun fordi deres hjerter er meget lig menneskers hjerter anatomi og koronar omsætning, men de viser også lignende patofysiologiske svar til Myokardie iskæmi og reperfusion 9,10. Andre modeller som rotter og mus ikke opfylde disse kriterier og viser store forskelle i forhold til menneskers hjerter 11,12, mens hunde for eksempel har mange flere sikkerhedsstillelse koronar fartøjer forhold mennesker 13.
Svin akut myokardieinfarkt model har været meget anvendt i hjerte-kar-forskning for at undersøge iskæmisk hjertesygdom herunder Myokardie jeg / Rasmussen skade 14,15,16,17. Sidstnævnte er en inflammatorisk tilstand, på grund af hvilke minimere den inflammatoriske reaktion relateret til sternotomi eller torakotomi bruges i åben kiste kirurgi er afgørende. Den lukkede kiste model ved hjælp af en klinisk C-arm angiografi indstilling overvinder dette problem. Desuden er et af de vigtigste punkter, at vores protokol giver en nøjagtig skelnen mellem iskæmisk (område i fare, AAR) og ikke-iskæmiske områder af venstre ventrikel (område ikke i fare, ANR) således at infarkt størrelse (nekrotisk iskæmisk væv, NIT) præcist bestemmes. Vores mål for dette papir er at definere en reproducerbar metode af et svin Myokardie jeg / Rasmussen skade model, navnlig med hensyn til Myokardie væv prøveudtagning, som vil muliggøre en mere præcis analyse af de molekylære mekanismer af jeg / Rasmussen skade og en klarere billede af virkningerne af nye medicinske behandlingsmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dyr:
Alle dyrene blev behandlet i overensstemmelse med retningslinjerne i de schweiziske nationale love. Undersøgelsen blev godkendt af den lokale dyreforsøg kanton Bern (tilladelse ikke. VÆRE 25/16).
Bruge store hvide svin af begge køn (~ 30 ± 5 kg). Opdele dyrene blindt i to grupper, den ene gruppe modtager en bicykliske (80 kDa protease) hæmmer af FXIIa eller behandling af valg og den anden en inaktiv kontrol.
2. kirurgisk procedure (figur 1)
- Anæstesi og forberedelse af dyret:
- Hurtigt dyr i 12 timer før du starter eksperimentet.
- Pre-medicinerer dyr med 20 mg/kg ketamin og 2 mg/kg xylazin via en intramuskulær injektion i hals, ved hjælp af en 10 mL sprøjte. Optage dyrenes vægt og køn.
- Fremkalde anæstesi ved at indsprøjte 0,5 mg/kg Midazolam og 0,05 mg/kg Atropin i auricular vene. Intubate dyr med en endotrakealtube.
- Opretholde anæstesi ved mekanisk ventilation ved hjælp af en respirator (O2/air 1:3, Sevorane 1,5%), en 7-8 mm luftvejene rør og et filter. Justere brøkdel af inspireret ilt (FiO2) til 35% og tidalvolumen til 6-10 mL/kg.
- Dybde af anæstesi er vurderet som passende i mangel af enten motoriske eller autonome svar til næse klemme. Øjenlågenes reflekser og kæbe tone blev overvåget løbende samt målretning afslappet kæbe tone og fravær af øjenlågenes reflekser. Kernetemperatur var løbende overvåges og vedligeholdelse af normothermia (38-38,5 ° C) blev sikret med passiv opvarmning (isolere Plaider og varme flasker).
- Dissekere gratis, som tidligere beskrevet af Koudstaal og hans kolleger trin 3-1 til 3-318, carotis arterierne på begge sider og kanyleres dem med en 7F kappe. Kanyleres venstre halsfedt med en 7F kappe for venøse blod prøveudtagning.
- Administrere en bolus dosis af 250 µg Fentanyl smertestillende gennem det centrale venøse linje efterfulgt af 250 µg/h som en kontinuerlig intravenøs infusion ved hjælp af en infusion pumpe. Overvåge kropstemperatur, puls og rytme med en 3-bly elektrokardiogram (EKG), arteriel og centrale venetryk under hele forsøget.
- Bruger standard blod indsamling rør, trække de følgende baseline blodprøver fra den venøse linje: 5 mL værdier plasma og 2,9 mL EDTA plasma i de respektive rør. Centrifugeres straks ved 2.000 x g i 15 min. ved 4 ° C. Tages en serum tube 2,9 mL blod og tillade for at koagulere i 30 min. ved stuetemperatur inden centrifugering som beskrevet ovenfor.
- Alikvot 200 µL plasma eller serum til 500 µL rør og gemme alle prøver på-80 ° C for yderligere analyse.
- Trække 0,5 mL blod fra arteriel linie ved hjælp af særlige blod gas analyse (BGA) sprøjter for at måle BGA bruger BGA maskine ifølge producentens anvisninger.
- Trække 0,5 mL af blodet fra den venøse linje ved hjælp af en standard 2 mL sprøjte og straks overføre det i loven patronen ved hjælp af en 30 G nål. Indsæt den fyldte patron i ACT maskinen til at måle koagulationstid efter fabrikantens anvisninger. Se figur 2 for tiden point.
- Administrere 5000 IU ufraktionerede heparin i venøse linjen bruger en 2 mL sprøjte og give dyret til at stabilisere for 20 min før start MI eksperiment.
- Skærm fungere hver 30-45 min som nævnt i 2.1.11. Injicere 2500 I.E. ufraktionerede heparin intravenøst, hvis loven er < 180 s.
- Myokardieinfarkt eksperiment
- Brug en standard C arm fluoroskopi udstyr (koronar angiografi program, vinkel 0°, 12 billeder pr. sekund, ~ 70 kV) - eller alternativt et dedikeret angiografi system - til at udføre de koronar intervention.
- Bruge fluoroskopisk vejledning til at indsætte et pres kateter (5F, 120 cm) via den tidligere indsatte kappe i den venstre halspulsåren. Rykke det ind i venstre hjertekammer. Tilsluttes en erhvervelse system til at optage venstre ventrikel trykket pres kateter. Erhvervelse systemet skal løbende beregne og registrere pulsen, udviklet pres, dP/dt maksimale (kontraktilitet af venstre ventrikel) og dP/dt minimum (lempelse af venstre ventrikel) under hele forsøget. Optage baseline værdier i 10 min.
- Indsæt en 6F (100 cm, EB3.75) vejledende kateter via den tidligere indsatte kappe i lige halspulsåren. Fremme det til venstre koronararterie at nå venstre forreste faldende koronararterie (LAD) under X-ray vejledning. Indsprøjtes kontrast medium ved hjælp af en 20 mL sprøjte via den vejledende kateter til at udføre en baseline koronar angiografi.
Bemærk: Injektion af kontraststof blev udført af manuel pres men en dedikeret magt injektor systemet kunne bruges som godt. - Vurdere størrelsen af Lund på X-ray skærm til at vælge den passende størrelse af perkutan koronar intervention (PCI) kateter. Bruge PCI balloner med en længde på 15-25 mm og diametre mellem 2 og 3,5 mm afhængigt af Lund størrelse. Samle PCI kateter og koronar guidewire (F 014/J, 175 cm). Tilslut PCI kateter med inflationen enhed fyldt med kontraststof.
Bemærk: Lund diameter kan måles direkte på en kalibreret skærm ved hjælp af en lineal og størrelsen på PCI ballon vælges derefter i overensstemmelse hermed. - Indsæt den forsamlede system fra 2.2.4 i lumen af de vejledende kateter. Rykke guidewire ind i drengen, indtil det når ud over den anden diagonale gren af drengen.
- Bruge fluoroskopisk vejledning til at fremme PCI kateter, indtil omkring midten af drengen. Vælg webstedet Lund blokerende afhængigt af anatomi af kranspulsårer, som regel efter andet, nogle gange efter de første diagonale gren (figur 3) for at få tilsvarende procenter af AAR af venstre ventrikel (LV).
Bemærk: Valget af webstedet blokerer afhænger af længden af de diagonale grene og dermed området af væv, der er leveret af blodet via de respektive gren. I tilfælde af en lang vil todelt første diagonale gren den blokerende site være lige efter dette. I tilfælde af en kortere første diagonale gren, er blokering gjort efter den anden diagonal. - Fjerne guidewire, og derefter øge trykket i inflationen enheden til 7-10 bar at puste ballonen af PCI kateter og fremkalde Myokardie iskæmi for 1 h. gradvist øge FiO2 til 50-60% mellem 15 og 40 min. for iskæmi. Holde tidalvolumen på 6-10 mL/kg.
Bemærk: Denne procedure vil reducere forekomsten af ekstrasystoler og nedsætte hyppigheden af ventrikulær fibrillations. - Post en 5-10 s videosekvens mens indsprøjte kontraststof gennem det ledende kateteret at have en angiogram af ballon af PCI kateter i sted lige efter start iskæmi; Gentag efter 10 min af iskæmi at kontrollere komplet okklusion af drengen distalt for ballon af PCI kateter.
- Overvåge dyr tæt for straks at opdage og behandle (2.2.10) hjertearytmi. Ekstrasystoler normalt forekommer og stigning i hyppighed (> 3 pr. min.) mellem 20 og 40 min. efter induktion af Myokardie iskæmi. Hvis dette sker, forsigtigt massere nakken på begge sider lige under kinden. I de fleste tilfælde vil dette være tilstrækkeligt til at genetablere en regelmæssig hjerterytme, sandsynligvis ved stimulering af vagus nerve baroreceptors beliggende på den fælles halspulsåren.
- Hvis hjertearytmi fremskridt i ventrikelflimmer, skal du bruge en ekstern, bifasisk defibrillator for at genetablere en sinusrytme. Anvende 5-10 brystet kompression ved hjælp af defibrillator puder umiddelbart før du anvender stød for at udfylde kranspulsårer med iltet blod og derefter chok med 150 Jørgensen (for 30 kg dyr).
- Gentag om nødvendigt og stigning energi til 175 Jørgensen efter 3rd chok. Bruge højere energi indstillinger for tungere dyr.
- Fem min. før slutningen af iskæmi gang gentage den udtagning af blodprøve nævnt i 2.1.8-2.1.13. Injicere test-kemikaliet (enten de bicykliske FXIIa hæmmer eller styre 4 mg/kg, gør dette det blindt) intravenøst gennem det centrale venøse linje og flush linje med 20 mL saltvand.
- Trække en plasmaprøve citrat (som nævnt i 2.1.8 og 2.1.9) 4 min efter injektion stof i 2.2.12.
- Udføre en angiogram (2.2.3) for at bekræfte Lund okklusion, derefter deflatere ballon af PCI kateter og fjerne denne kateter fra ledende kateteret. Bekræfte perfusion af drengen distalt for webstedet okklusion af angiogram umiddelbart efter deflation og fjernelse af ballon af PCI kateter, 10 min. derefter, når tegn på myokardieiskæmi blev synlig ved ECG for mere end 5 min, og umiddelbart før re okklusion af drengen.
- Tillad reperfusion af iskæmisk myokardiet i 2 timer. Tage plasma og serum prøver ved 10, 30, 60 og 115 min. af reperfusion (2.1.8 og 2.1.9). Monitor BGA 60 og 115 min. (2.1.10).
- Indsæt PCI kateteret sammen med guidewire til nøjagtig samme situation som anvendes til iskæmi. Puste ballonen af PCI kateteret som før og bekræfte Lund okklusion af angiogram (2.2.3). Fjerne presset kateter fra venstre hjertekammer og stoppe optagelsen.
- Indsprøjtes 100 mL 2% Evans blå i phosphat bufferet saltvand (PBS, pH 7,4) i den centrale venøse linje. Ca. 30 s senere, når hele dyret bliver blå, injicere 40 mL 20% KCl at aflive dyret. Død blev bekræftet ved fravær af EKG-signalerne og puls bølger.
3. stikprøver
-
Udvinding, dissekere og prøvetagning hjerte (figur 4)
- Udføre en sternotomi at eksponere hjertet. Følge protokollen tidligere beskrevet af Koudstaal og kolleger, trin 8-2 og 8-318. Skære åbne at hjertesækken mens inspektion for abnormiteter, som kan stamme fra tidligere pericarditis, og udelukke dyret fra yderligere evaluering.
- Deflatere og fjerne PCI samt den vejledende kateter. Punktafgifter hjerte for yderligere analyse. Skær vena cava og fjern blod bruger en vakuumpumpen, så skære alle de store fartøjer, der forbinder centrum med kroppen.
- Skyl hjerte inde og ude med stuetemperatur saltvand. Veje hele hjertet.
- Inden for 30-40 min, skæres midt i skiver af ca 3-5 mm fra spids til Chordae tendinae af mitralklap, vinkelret på denne akse med en skarp kniv.
- Vær omhyggelig med at altid plads midt i den samme retning med den ventrale side opad for at holde retningen af de afskårne prøver (figur 5).
- Fotografere skiver af hjertet ved hjælp af en digital single lens reflex kameraet.
- Skære væk den højre ventrikel (kassere ikke behov). Fotografere i venstre ventrikel skiver og vejer alle skiver for den samlede vægt af venstre ventrikel.
- Differentiere mellem Evans blå positive og Evans blå negative væv i alle sektioner. Dissekere skiver for at adskille den iskæmisk (Evans blå negative) fra de ikke-iskæmisk væv (Evans blå positive) ved hjælp af en skalpel.
- Først analysere de Evans blå negative sektioner (iskæmisk område i fare, AAR). Afveje dem alle og sætte dem alle i en plastikbeholder.
- Dække skiver helt med 100-150 mL (efter hjerte størrelse) trifenyl tetrazolium chloridopløsning (2 g TTC, 16 g Dextran, molekylvægt 48000-90000, i 200 mL PBS, frisklavet) så at hjertet stykker kan bevæge sig frit inden for løsningen. Dække beholderen, og Ruger i 20 min. ved 37 ° C mens forsigtigt ryste.
- Under denne 20 min inkubation tid vejer Evans blå positive stykker (område ikke i fare, ANR), udtage prøver til væv-Tek embedding (Vælg den mest distale del af skaden) og opbevares ved-80 ° C for yderligere analyse. Overføre resten til 4% formaldehyd løsning og opbevares ved stuetemperatur til histologi sektioner.
- Fjern brikkerne i den årlige aktivitetsrapport fra TTC løsning. Den røde farves væv er levedygtige iskæmisk væv (VIT) og ikke-farvede væv er nekrotiske iskæmisk væv (NIT). Klippet 2 små stykker (blokke af 2-3 mm) fra både NIT og VIT, integrere dem i væv - Tek og opbevares ved-80 ° C for yderligere analyse. Disse prøver skal have samme vægt.
- Løse resten af stykker (alle skiver afledt af den årlige aktivitetsrapport) ved at fastgøre dem i en Styrofoam containere og dækker helt med 4% formaldehyd løsning i 24 timer ved stuetemperatur i et stinkskab. Brikkerne skal blive flad for den fotografisk dokumentation i det næste trin.
- Den næste dag fotografere begge sider af brikkerne med en høj opløsning kamera med samme zoomindstilling og afstand fra væv (samme forstørrelse). Tilføje automatisk skala barer til alle billeder. Alle barer skal have samme længde.
Bemærk: Høj opløsning kameraet bør forbindes til software, der automatisk tilføjer skalalinjen hvert foto.
-
Beregningen af den årlige aktivitetsrapport og infarkt størrelse
- % AAR af venstre ventrikel = (vægt af AAR i g / vægt af venstre ventrikel i g) * 100.
- Bruge ImageJ software til at beregne det samlede overfladeareal af både AAR og NIT (begge sider af hvert stykke) baseret på fotografier.
- Justere skalalinjen ved at vælge den skala bar længde ved hjælp af den lige linje fra vinkel værktøjet. Vælg fra menuen Analyze > angive skala og indsætte kendt afstand og enheden for skalalinjen. Vælge "global", så den samme skala vil blive anvendt til alle billeder.
- Markere hele arealet af vævet markeringsværktøjet frie hænder til at beregne AAR. Pas på ikke at medtage siden (højden) af væv og/eller fedtvæv (figur 6-C).
- Indstille målingen ved at vælge "område" og "Vis etiketten" fra analyser > sæt målinger menu. Måle areal fra analyser > foranstaltning.
- Gentag trin 3.2.5 foranstaltning NIT (mark kun ikke-farvede væv). Bemærk: Medtag ikke fedtvæv (figur 6-D) i beregningen af NIT. Gentag trin på anden siden af væv.
- Beregn den gennemsnitlige AAR og NIT for hvert stykke af væv.
- Bruge de opnåede fra 3.2.7 værdier til at beregne NIT som en procentdel af AAR:% NIT af AAR = (Σ gennemsnitlige areal af NIT i cm2/ Σ gennemsnitlige areal af AAR i cm2) * 100.
- To forskellige efterforskere bør gentage ovenstående metode. Acceptabel er forskellen < 10%.
-
Iskæmi markører
- Bruge EDTA-plasmaprøver, som tidligere har været gemt på-80 ° C (2.1.9) til at måle niveauet af cardiac troponin-jeg bruger en enkelt-plex Luminex-type analyse som tidligere beskrevet 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et dyr døde tidligt før administration af FXIIa hæmmer eller kontrol peptid som følge af en teknisk fejl (pludseligt fald i blodtrykket under iskæmi tid, før tilsætning af test-kemikaliet). Et dyr blev udelukket fra FXIIa hæmmer gruppe fordi ingen skade, iskæmi/reperfusion blev observeret på grund af unormale anatomi af den venstre forreste faldende arterie (Lund). En stor del af venstre ventrikel, herunder apex, var perfunderet af cirkumfleks arterie i dette dyr. De dyr, der er medtaget i den endelige analyse var n = 2 i gruppen med bicykliske FXIIa peptid inhibitor (: vægt på 27,5 ± 2,5 kg) og n = 3 modtager en inaktiv bicykliske kontrol peptid (betyder vægten af 29 ± 0,8 kg).
X-ray video imaging / koronar angiografi af gris hjertet bruges til at visualisere holdning af pres kateter og at beslutte, hvor at blokere Lund (figur 3A). Figur 3B viser positionen kateter blokerer blodgennemstrømning distalt for den anden diagonale gren. Sammenligning af figur 3A og 3B giver også mulighed for en skøn som en del af Lund-leveret myokardiet vil være iskæmisk. I slutningen af perioden 2 h reperfusion er PCI kateteret genindført og oppustet på den samme position som det var under iskæmi. Evans blå er derefter injiceres intravenøst at præcist bestemme AAR (figur 5A). Efter excision af hjertet, er venstre hjertekammer skåret i 3-5 mm tyk dele fra apex op til mitralklap, vinkelret på længdeaksen. AAR og ANR er klart afgrænset af Evans blå farvning på skiver. AAR og ANR prøveudtagning områder er vist i figur 5B.
AAR, udtrykt som procentdel af LV, viser ingen statistisk signifikante forskelle mellem FXIIa behandlede gruppe og kontrolgruppen (figur 6A). Infarkt størrelse (NIT/AAR) viser ingen forskelle mellem grupperne enten (ved hjælp af ikke-parametrisk Mann-Whitney test, p > 0,05, fig. 6B). Disse data tyder på, at FXIIa hæmmer alene, brugte koncentration og varigheden af programmet, ikke kunne beskytte hjertet fra Myokardie jeg / Rasmussen skade. Figur 6 c og 6 D viser hvordan man markerer AAR og NIT grænserne for at præcist og reproducerbar måling af de respektive overfladearealer.
Prøvetagningsmetode blod giver mulighed for frigivelse af hjertemusklen skader markør hjerte troponin-jeg skal overvåges over tid. Der er næsten ingen forskel efter en time af iskæmi med oprindeligt mens efter reperfusion der er en kontinuerlig stigning over tid som vist i figur 7. For troponin-jeg, mellem grupperne forskelle også ikke var væsentlig i disse eksperimenter.
Figur 1 . Oversigt over den eksperimentelle tidslinjen. Skematisk tidslinje for de vigtige skridt i Myokardie iskæmi/reperfusion skade model. Baseline koronar visualisering, starttidspunkt af iskæmi, overvågning hjertearytmi og indsprøjtning af prøvestoffet er et vigtigt skridt i eksperimentet. Brug af eksakt timing i alle eksperimenter sikrer reproducerbarhed. Euthanizing dyr og excision af hjertet bør gøres inden for 15-20 min efter afslutningen af 2h reperfusion fase. KCl: kaliumchlorid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Tidslinjen af blod prøveudtagnings- og analysemetoder. Tidspunkter for udtagning af blodprøve er angivet sammen med typen af antikoagulans anvendes. Ekstra prøver kan tages efter eksperiment og analysander skal måles. Handling: aktiveret koagulation tid, BGA: blod gas analyse, RT: stuetemperatur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Koronar angiografi. Fluoroskopisk udsigt over (A) de venstre kranspulsårer ved baseline, de gule pile peger på først og de anden diagonal grene, den hvide pil peger på hjertet apex b occluded Lund viser ingen flow området af venstre ventrikel (LV), den røde pil peger på PC Jeg kateter (C) re lukning af Lund for enden af reperfusion med ballon af PCI kateteret igen indsat til det samme sted i drengen som under iskæmi. CX: cirkumfleks koronar arterie, Lund: venstre forreste faldende koronararterie, MC: Millar kateter, indsat i venstre hjertekammer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Skematisk diagram af væv prøveudtagning. Nøjagtige timing af hjertet dissektion og stikprøver af de forskellige områder til yderligere analyse. Tidslinjen starter ved 205 min. efter begyndelsen af iskæmi, 20 min efter afslutning af den animalsk eksperiment. Det er vigtigt at udruge afsnittene væv i TTC inden for højst 40 min. efter euthanizing dyret. Prøveudtagning af ANR, VIT og NIT er indiceret som hvide firkanter. Inkubere AAR i 4% formaldehyd giver tydelig sondring mellem NIT og VIT for nøjagtig bestemmelse af infarkt størrelse. AAR: område i fare, ANR: område ikke i fare, LV: venstre hjertekammer, NIT: nekrotiske iskæmisk væv, OTC: væv-Tek, RV: højre hjertekammer, TTC: trifenyl tetrazolium chlorid, VIT: levedygtige iskæmisk væv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . In situ differentiering mellem område i fare (AAR) og området ikke risikerer ANR. (A) repræsentativt billede af hele hjertet lige efter sternotomi i slutningen af forsøget. (B) repræsentative billede viser 3-5 mm tyk venstre ventrikel skiver efter dissektion. AAR og ANR er klart defineret, angivet med gule pile, og den hvide pil viser området ANR prøveudtagning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Iskæmi og infarkt størrelse. (A) vægtprocenten af AAR af venstre ventrikel (LV). (B) den procentdel areal af NIT af den årlige aktivitetsrapport. C en repræsentativt billede af beregningen af AAR. (D) et repræsentativt billede af NIT beregning. Den hvide pil viser området VIT prøveudtagning og den sorte pil viser området NIT prøveudtagning. Data blev beregnet ved hjælp af ImageJ software. Værdier er vist som prikker for hver enkelt eksperimentere med angivelse af gennemsnitlige ±± SD. kontrolgruppe, n = 3 og FXIIa hæmmer behandlede gruppe, n = 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 . Hjertemusklen skader markør. Hjerte troponin-jeg koncentration over tid i pg/ml både kontrol-og FXIIa hæmmer behandlede gruppe. Blodet blev indsamlet fra halsfedt i EDTA plasma rør baseline, slutningen af iskæmi og flere tidspunkter under reperfusion og hjerte troponin-jeg blev målt ved single-plex suspension array (Bio-Plex). Tallene vises som prikker for hver enkelt eksperimentere med angivelse af gennemsnitlige ±± SD. kontrolgruppe, n = 3 og FXIIa behandlede gruppe, n = 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Myokardial jeg / Rasmussen skade har en betydelig indvirkning på den endelige infarkt størrelse, som er direkte oversat til patientens prognose efter akut myokardieinfarkt3. Forståelse Patofysiologi af Myokardie jeg / Rasmussen skade er det første skridt til at mindske eller forhindre det. Myokardial jeg / Rasmussen skade er en akut tilstand, der opstår direkte efter reperfusion occluded fartoejer. Jeg / Rasmussen skade fører til aktivering af det medfødte immunforsvar og cellulære skader opstår i stedet for reperfusion og omkringliggende væv20. En nylig undersøgelse viste en forbedring i den neurologiske udfald i en rotte model af hjernen jeg / Rasmussen skade når de behandles med FXIIa hæmmer8. Men i den nuværende pilotundersøgelse vi fandt ingen effekt af den bicykliske FXIIa hæmmer på Myokardie jeg / Rasmussen skade. Den anvendte FXIIa hæmmer er roman og dens farmakokinetik hos svin er endnu ikke kendt. Derfor, den observerede manglende effekt kan skyldes uhensigtsmæssige dosering eller anvendelse. Dette skal løses i follow-up studier.
Standardisere en dyremodel er vigtigt at undersøge i dybde Patofysiologi af Myokardie jeg / Rasmussen skade og at bringe egnede løsninger på klinikker. Undersøge Patofysiologi af Myokardie jeg / Rasmussen skade kræver god og repræsentative stikprøver for at studere de underliggende det cellulære mekanismer. Svin lukkede brystet Myokardie jeg / Rasmussen skade model giver en reproducerbar metode, som er tæt på den kliniske situation, og nyttige i forbindelse med forståelse af cellulære mekanismer og test roman nye therapeutics. Varianter af den nuværende model er beskrevet inden for den ovenfor nævnte formål14,17,18.
Vores protokol af akut myokardieinfarkt hos svin behøver ikke før behandling med amiodaron som tidligere beskrevet18,21. Vi brugte carotis sinus massage til at reducere hjertearytmi og et bifasisk defibrillator for cardioconversion i tilfælde af ventrikelflimmer. Brugen af carotis sinus massage er klinisk kendt for at påvirke atrieflimren22, men hidtil har det ikke vist at forebygge eller sinke udviklingen af ventrikulær fibrillation i MI, hverken hos mennesker eller i gris modeller. Desuden brug af Sevofluran hjælper med at reducere ventrikulære arytmier samt dødelighed i de svin model af akut myokardieinfarkt23.
For at sikre, at reproducerbarhed og reducere risikoen for trombose under eksperimentet, var flere doser af heparin injiceres baseret på gentagen måling af handling, snarere end ved hjælp af faste heparin doser som beskrevet for eksempel af Koudstaal al.18. En kontrolleret mængde af heparin administration hjælper med at undersøge koagulationskaskaden i forbindelse med jeg / Rasmussen skade. Evans blå giver mulighed for præcis bestemmelse af AAR/LV. Intravenøs injektion af Evans blå efter fornyet okklusion af Lund på det nøjagtige sted under iskæmi induktion under fluoroskopisk vejledning fører til blå farvning af hele grisen, herunder den ikke-iskæmiske del af hjertet med minimal effekt på ANR myokardiet og Vaskulaturen. Evans blå er en kendt cytotoksiske stof24. I de nuværende eksperimenter var det afgørende at bevare levedygtigheden af i endothelial cellelag i ANR i hjertet Vaskulaturen for at bruge det som individ intra kontrol så 100 mL Evans blå blev injiceret systemisk og fortyndes med fuldblod reducere sin toksicitet. Tidligere, i en lignende indstilling, 50 ml 2% Evans blå blev sprøjtet direkte ind i øger risikoen for sin cytotoksicitet til hjertets kranspulsårer celler25. Det næste vigtige skridt var at dissekere hjertet direkte i 3-5 mm skiver fra apex mitralklap (den nøjagtige placering i hvert dyr) og ved hjælp af denne metode til at foretage en nøjagtig beregning af de årlige aktivitetsrapporter som en procentdel af venstre ventrikel.
Den nuværende beskrivelse af metoden giver finere detaljer, der ikke tidligere er blevet beskrevet. Inkubere TTC farves afsnit i 4% formaldehyd i 24 timer giver en klar sondring mellem levedygtige (rød) og nekrotiske (hvid) væv, som endelig øger reproducerbarhed af stikprøven yderligere molekylære farvning. Blod prøvetagningsmetode over 2 h af reperfusion giver mulighed for påvisning af nyligt udtrykt molekyler i de meget tidlige (10-30 min) stadier af reperfusion samt senere (60 og 120 min). Korrekte blod og væv udtagning og opbevaring er også afgørende for analysen af plasma cascade markører som udtryk for supplement og koagulation proteiner.
Den nuværende protokol kan ændres til at have en længere reperfusion tid, fra et par timer til dage. Dette gør det muligt for forskeren at undersøge de senere følger af jeg / Rasmussen skade på hjertet og giver også mulighed for afprøvning af nye lægemidler og vurdering af deres virkninger. Begrænsning af den nuværende protokol er brugen af en pres-tip kateter til måling af hjertefunktionen. Mere pålidelige data om hjertets funktion kan opnås ved brug af et tryk-volumen loop målesystem. I Resumé den nuværende metode giver detaljerede vigtige foranstaltninger til at øge reproducerbarhed af svin lukkede brystet Myokardie jeg / Rasmussen skade model, når påtænkte brug af modellen er at undersøge de cellulære og molekylære ændringer i forbindelse med at studere Myokardie jeg / Rasmussen skade Patofysiologi eller studere nye terapeutiske muligheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Professor Christian Heinis for at give FXIIa-hæmmer og de respektive kontrol. Vi anerkender også taknemmeligt Olgica Beslac, Dr. Daniel Mettler og Kay Nettelbeck fra enhedens eksperimentel kirurgi, Institut for biomedicinsk forskning, Berns universitet for teknisk support. Celine Guillod og Matthias Rausch fra Institut for diagnostiske, Interventional og pædiatrisk radiologi, Bern University Hospital, Inselspital ydet støtte med røntgenudstyr og teknikker. Dette projekt blev finansieret af den schweiziske National Science Foundation, projekt nr. 320030_156193. Vi vil også gerne takke Mr. Reto Haenni fra kommunikation og marketing, Bern University Hospital, Inselspital for video-optagelse vores eksperiment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABL 90 Flex, blood gas analyser | Radiometer | - | Blood gas analysis (BGA) |
| ACT Plus | Medtronic | - | Activated clotting time |
| Atropin | Sintetica | - | Atropinum Sulfas, 0,5mg/ml |
| Balance (20-500 Kg) | NAGATA Scale, Tiwan | HTB/HTR | Alternative products can be used |
| Balance (21-4200 g) | Mettler toledo, Switzerland | MS4002SDR | Alternative products can be used |
| Blood collection tubes: EDTA, citrate and serum | S-Monovette, Nuembrecht, Germany | 05.1167.001, 05.1071.001 and 05.1557.001 respectively |
Alternative products can be used |
| BV Pulsera mobile C-arm | Philips | - | Alternative products can be used |
| Centrifuge | Labcare, UK | ALC PK120R | Alternative products can be used |
| Defibrillator Lifepak 12 | Medtronic | - | Alternative products can be used |
| Dextran from Leuconostoc mesenteroides | Sigma-Aldrich, Germany | D3759 | Average M.wt 48000-90000 |
| Digital single lens reflex camera | Sony, Thailand | DSLR-A500/A550 | Alternative products can be used |
| Dissecting forceps | Alternative products can be used | ||
| EMPIRA RX PCI dilatation catheter | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 85R15300S | Diameter 3 mm, length 15 mm, Alternative products can be used |
| EMPIRA RX PCI dilatation catheter | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 85R15350S | Diameter 3.5 mm, length 15 mm, Alternative products can be used |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich, Germany | E2129 | Toxic |
| Fabius GS premium respirator | Dräger, Lübeck, Germany | - | Anesthesia work station, Alternative products can be used |
| Fentanyl | Inselspital ISPI | - | Fentanyl 2500mcg/50ml |
| Formaldehyde | Pathology Institute, Bern University | SI148701 | Alternative products can be used |
| FXIIa inhibitor | Provided by Prof. Christian Heinis' laboratory in EPFL | Novel bicyclic peptide | |
| Galeo, coronary guidewire | Biotronik, Germany | 125497 | Alternative products can be used |
| Guidance catheter | Boston Scientific, Florida, USA | 34356-06 | 6F (100 cm, EB3.75). Alternative products can be used |
| Heparin Sodium | Drossapharm, Basel, Switzerland | - | Liquemin, 25000 U.I./5 ml |
| High end electrosurgery | BOWA, Germany | ARC 400 | Electrical source for blood suction. Alternative products can be used |
| Hydro-Guardmini breathing filter | Intersurgical, Lithuania | 1745000 | Filters |
| Image J | National Institute of Health, USA | 1.47v | Alternative products can be used |
| Inflation device, Atrion QL2530 | Atrion medical product, Alabama, USA | 96402 | Alternative products can be used |
| IntelliVue MP 70 | Philips, Boeblingen, Germany | - | Monitor (ECG, heart rate, blood presure and body temperature). Alternative products can be used |
| KCl | Sintetica SA | - | Potassium chloride 15% |
| Ketamine | Vetoquinol | - | Narketan, 1ml/100mg |
| LR-ACT | Medtronic | 402-01 | ACT special syringes |
| Midazolam | Roche | - | Dormicum, 5mg/ml |
| Monopolar scalpel | Alternative products can be used | ||
| Needle holder | Alternative products can be used | ||
| High resolution camera, PathStand Macro Imaging Stand for Grossing | Spotimaging, USA | 1080 p HD resolution. Alternative products can be used | |
| PBS | In-house preparation | - | Alternative products can be used |
| Peripheral venous cannula, 18 G | Alternative products can be used | ||
| PowerLab 4/35 data acquisition system | Adinstruments, Spechbach, Germany | - | |
| Rotamax120T | Heidolph, Germany | 544-41200-00 | Shaker. Alternative can be used |
| Rüschelit-Super Safety Clear Tube | Teleflex, Dublin, Irland | 112480 | Air way tubing, Alternative products can be used |
| Safe Pico Aspirator Syringes | Radiometer | 956-622 | BGA special syringes |
| Saline | Sintetica Bioren | - | NaCl 0,9%. Alternative products can be used |
| Sevorane 1.5% | AbbVie AG | - | Sevorane 250ml 100% |
| Sheath | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 504-607 A | AVANTI + / 7 F, Alternative products can be used |
| Space infusion pump | B.Braun Medical AG, Germany | - | For infusion of fentanyl. Alternative products can be used |
| SPR-350 (Millar catheter) | Adinstruments, Texas, USA | 840-8166 | MIKRO-TIP, 5F, 120 cm |
| Sternotomy saw | Alternative products can be used | ||
| Sutures | ETHICON, Johnson&Johnson, USA | Y3110H | Monocryl 3-0 SH-1 Plus. Alternative products can be used |
| Syringes (20, 10 and 5 mL) | CODAN,Baar, Switzerland | 62.7602, 62.6616, 62.5607 respectively |
Used to inject anesthetic materials intramuscularly or directly into the central venous line. Also to inject heparin or FXIIa or the respective control. Alternative products can be used |
| Thorax spreader | Alternative products can be used | ||
| Tissue-tek | SAKURA, Netherlands | 4583 | O.C.T. compound |
| Vascular forceps | Alternative products can be used | ||
| Xenetix 300 contrast media | Guerbet, Zürich, Switzerland | - | Lobitridol, 300 mg iodide/ml |
| Xylazine | Vetoquinol | - | Xylapan, 20mg/1 mL |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium choride | Sigma-Aldrich, Austria | T8877 | |
| 500 μL tubes (eppendorf) | Trefflab, Switzerland | 96.08185.9.03 | Alternative products can be used |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update. Circulation. 133, e338-e360 (2016).
- Miller, T. D., et al. Infarct size after acute myocardial infarction measured by quantitative tomographic 99mTc sestamibi imaging predicts subsequent mortality. Circulation. 92, 334-341 (1995).
- Ovize, M., et al. Postconditioning and protection from reperfusion injury: where do we stand? Position Paper from the Working Group of Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovasc Res. 87, 406-423 (2010).
- Neri, M., Riezzo, I., Pascale, N., Pomara, C., Turillazzi, E. Ischemia/Reperfusion Injury following Acute Myocardial Infarction: A Critical Issue for Clinicians and Forensic Pathologists. Mediators Inflamm. 2017, 1-14 (2017).
- Yang, Q., He, G. -W., Underwood, M. J., Yu, C. -M. Cellular and molecular mechanisms of endothelial ischemia/reperfusion injury: perspectives and implications for postischemic myocardial protection. Am J Transl Res. 8, 765-777 (2016).
- Massberg, S., et al. Platelet-Endothelial Cell Interactions During Ischemia/Reperfusion: The Role of P-Selectin. Blood. 92, 507-515 (1998).
- Wang, J., et al. Antithrombin is protective against myocardial ischemia and reperfusion injury. J Thromb and Haemost. 11, 1020-1028 (2013).
- Hopp, S., et al. Targeting coagulation factor XII as a novel therapeutic option in brain trauma. Ann Neurol. 79, 970-982 (2016).
- Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. J Anat. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
- Heusch, G., Skyschally, A., Schulz, R. The in-situ pig heart with regional ischemia/reperfusion - ready for translation. J Mol Cell Cardiol. 50, 951-963 (2011).
- Poirier, P. Exercise, heart rate variability, and longevity: the cocoon mystery? Circulation. , 2085-2087 (2014).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacol Ther. 141, 235-249 (2014).
- Bloor, C. M., White, F. C. Functional development of the coronary collateral circulation during coronary artery occlusion in the conscious dog. Am J Pathol. 67, 483-500 (1972).
- Banz, Y. Locally targeted cytoprotection with dextran sulfate attenuates experimental porcine myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 26, 2334-2343 (2005).
- Krombach, G. A., Kinzel, S., Mahnken, A. H., Günther, R. W., Buecker, A. Minimally Invasive Close-Chest Method for Creating Reperfused or Occlusive Myocardial Infarction in Swine. Invest Radiol. 40, 14 (2005).
- Suzuki, Y., Lyons, J. K., Yeung, A. C., Ikeno, F. In vivo porcine model of reperfused myocardial infarction: in situ double staining to measure precise infarct area/area at risk. Catheter Cardiovasc Interv. 71, 100-107 (2008).
- McCall, F. C., et al. Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine. Nat Protoc. 7, 1479-1496 (2012).
- Koudstaal, S., et al. Myocardial infarction and functional outcome assessment in pigs. J Vis Exp. , e51269 (2014).
- Kamat, P., et al. Dexrazoxane Shows No Protective Effect in the Acute Phase of Reperfusion during Myocardial Infarction in Pigs. PLoS One. 11, e0168541 (2016).
- Carden, D. L., Granger, D. N. Pathophysiology of ischaemia-reperfusion injury. J Pathol. 190, 255-266 (2000).
- Pérez de Prado, A., et al. Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).
- Lown, B., Levine, S. A. The carotid sinus. Clinical value of its stimulation. Circulation. 23, 766-789 (1961).
- Regueiro-Purriños, M., et al. Ventricular Arrhythmias and Mortality Associated with Isoflurane and Sevoflurane in a Porcine Model of Myocardial Infarction. J Am Assoc Lab Anim Sci. , (2011).
- Roberts, L. N. Evans blue toxicity. Can Med Assoc J. 71, 489-491 (1954).
- Ellenbroek, G. H. J. M., et al. Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction. J Vis Exp. , e54021 (2016).
