Summary
여기 심근 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 상해의 병 태 생리학의 이해에 변환 값을 증가 하기 위하여 급성 심근 경색의 설립된 돼지 모델의 샘플링 절차를 표준화 프로토콜 설명 그리고 새로운 약 후보자를 테스트 합니다.
Abstract
심근 국 소 빈 혈 reperfusion (I / R) 심근 경색 후 괴 면적의 거의 절반에 기여 하는 부상. 날짜 심근을 방지 하거나 감소 승인 된 약은 I / R 상해. 연구와 심근의 병 태 생리 메커니즘의 이해 I / R 상해 성공적인 치료를 개발 하는 필수적 이다. 큰 동물 실험 변환 방법에서 중요 한 단계는. 급성 심근 경색의 돼지 모델 설립 되었고 자신과 다른 사람에 의해 설명. 우리는 더 세부 사항에 미래 실험에 사용 하기 위해 샘플링 기법에 집중 하 여 모델의 가치를 향상 목적. 또한, 우리는 최종 결과의 품질에 영향을 미칠 수 있는 작지만 중요 한 단계를 강조. 심근의 임상 상황을 모방 하기 위해 I / R 상해, 경 피 적인 관상 동맥 내정간섭 (PCI) 카 테 터는 왼쪽된 앞쪽 내림차순 관상 동맥 (젊은이)의 마 취 돼지에 삽입 되었습니다. ° ° °는 괴 사 성 뿐만 아니라이 모델 모방 급성 심근 경색 및 PCI 치료에서 영역을 정확 하 게 결정의 가능성을 가진 인간 위험-가능한 허 혈 성 조직. 여기 모델은 FXIIa의 bicyclic 펩타이드 억제제의 효과 조사 하기 위해 사용 되었다. 모델은 또한 심근 경색의 나중 효과 공부 하 긴 reperfusion 시간 수 있도록 수정할 수 있습니다.
Introduction
허 혈 성 심장 질환, 특히 급성 심근 경색 (MI), 선진국 1에서 죽음의 주요 원인입니다. 오늘, 미의 표준 치료 경 피 적인 관상 동맥 내정간섭 (PCI), 풍선 카 테 터 치료 이다. 급성 미 PCI 치료 후 환자의 예 후 및 삶의 질에 영향을 미치는 중요 한 요소 중 하나는 경색 크기입니다. 크기의 감소는 환자 생존 및 예 지 2에 큰 영향을 가질 수 있습니다. 심근 국 소 빈 혈 또는 reperfusion (I / R) 부상 그래서 심장 혈관 연구의 주요 목표 중 하나를 방지 하거나 감소 심근 경색 크기에 큰 영향 있다 내가 / R 상해 3. 나의 정확한 메커니즘 / R 상해 조사 4의 밑에 아직도 있다. 플라즈마 폭포와 내 피 세포의 활성화는 나의 / R 상해 5. 응고 체계의 활성화는 명확 하 게 관련 된 6,7입니다. 최근, 응고 캐스케이드의 접촉 단계 활성화에 관여 한 초기 업스트림 펩타이드로 FXII의 역할은 FXII에 표시 되었습니다 나 대뇌의 쥐 모델 노크 / R 부상 8. 돼지 모델에서 이러한 결과의 유효성 검사 임상 번역으로 중요 한 단계는 이다. 따라서, 우리는 테스트 소설 bicyclic (80 kDa protease) FXIIa 억제제 심근의 맥락에서 I / R 상해 파일럿 연구에서.
심각한 MI와 PCI 치료의 임상 상황을 모방, 동물 모델은 우리의 이해의 심근의 이상 난 개선 필수 / R 상해 및 새로운 치료 옵션을 테스트 하기. 돼지에 대 한 좋은 동물 모델 대표 임상 심근 I / R 상해. 이건만 있기 때문에 그들의 마음 매우 해부학 및 관상 동맥 순환, 인간의 마음에 유사 하지만 그들은 또한 유사한 병 태 생리 응답 심근 국 소 빈 혈과 reperfusion 9,10을 보여줍니다. 쥐와 쥐 같은 다른 모델 하지 이러한 기준을 충족 하 고 반면 개 인간 에 비해 많은 더 많은 부수적인 관상 동맥 혈관 등 인간의 마음 11,12를 비교할 때 상당한 차이 보여 13.
돼지 급성 심근 경색 모델 널리 이용 되는 심장 혈관 연구에서 심근 허 혈 성 심장 질환 등 조사 I / R 상해 14,15,,1617. 후자는 sternotomy를 최소화 하는 것 때문에 염증 반응 관련 염증 성 상태 또는 thoracotomy 오픈-가슴 수술에 사용 되는 필수적 이다. 닫힌된 가슴 모델 임상 C 팔 혈관 설정을 사용 하 여이 문제를 극복 한다. 또한, 가장 중요 한 포인트 중 하나는 우리의 프로토콜은 위험, AAR에 허 혈 성 (지역)와 비-허 혈 성 좌 심 실 (위험, ANR에 영역) 영역 간의 정확한 구별 경색 크기 (괴 사 성 허 혈 성 조직, 니트) 수은 정확 하 게 결정 될. 이 문서에 대 한 우리의 목표는 심근는 돼지의 재현 방법론을 명확 하 게 정의 하는 나 / R 부상 모델, 특히 심근 조직 샘플링, I의 분자 메커니즘의 더 정확한 분석에 대 한 수에 관하여 / R 상해와 새로운 약물 치료의 효과의 명확 하 게 그림.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1입니다. 동물:
모든 동물 스위스 국가 법률의 지침에 따라 치료 했다. 연구는 구획 베른의 로컬 동물 실험 위원회에 의해 승인 되었다 (권한이 없습니다. 25/16 수).
남녀의 큰 흰 돼지를 사용 하 여 (~ 30 ± 5 k g). 두 그룹으로 동물을 맹목적으로 나누어 한 그룹 FXIIa의 bicyclic (80 kDa 효소) 억제제 또는 선택과 다른 비활성 컨트롤의 치료.
2. 수술 (그림 1)
- 마 취와 동물의 준비:
- 12 h에 대 한 동물 실험을 시작 하기 전에 빠른.
- 전 의료를 베 풀 20 mg/kg 케 타 민 및 2 mg/kg Xylazine 10 mL 주사기를 사용 하 여 목에 근육 주사를 통해 동물. 동물의 무게와 섹스를 기록 합니다.
- 0.5 mg/kg Midazolam와 0.05 mg/kg Atropin 귀의 정 맥으로 주입 하 여 마 취를 유도. Endotracheal 튜브 동물 넣어야
- 기계 환기는 인공 호흡기를 사용 하 여 마 취를 유지 (O2/air 1:3, Sevorane 1.5%), 7-8 m m 기도 튜브와 필터. 6-10 mL/kg를 해 볼륨을 35% 영감된 산소 (FiO2)의 일부를 조정 합니다.
- 마 취의 깊이 모터 또는 자율 응답 코 곤란의 부재로 적절 한 평가. 종을 반사 및 턱 톤은 또한 지속적으로 편안한 턱 색조와 종을 반사의 부재를 대상으로 하는 것을 감시 되었다. 코어 온도 지속적으로 모니터링 하 고 수동 온난화 (격리 담요와 따뜻한 병)와 normothermia (38-38.5 ° C)의 유지 보수 보장 했다.
- 무료, 이전 설명한 Koudstaal와 그의 동료 1 단계 단계 3-3-318, 양쪽에 경 동맥 해 부 고 7 층 칼 집과 cannulate. 왼쪽된 경 정 맥 정 맥 혈액 샘플링에 대 한 7 층 칼 집과 cannulate
- 250 µ g/h는 주입 펌프를 사용 하 여 지속적인 정 맥 주입으로 뒤 중앙 정 맥 라인을 통해 250 µ g 펜타닐 진통제의 큰 알 약 복용량을 관리 합니다. 체온, 심장 박동과 리듬 3 리드 심전도 (ECG), 전체 실험 동안 동맥 및 중앙 정 맥 압력을 모니터링 합니다.
- 정 맥 라인에서 다음 기준선 혈액 샘플을 철회 표준 혈액 컬렉션 튜브를 사용 하 여: 5 mL citrated 플라즈마와 각각 튜브에 2.9 mL EDTA 플라스마. 4 ° c.에 15 분 동안 2000 x g에서 즉시 원심 2.9 mL 혈액 혈 청 관으로 고 위에서 설명한 대로 centrifuging 전에 실 온에서 30 분 동안 응고를 허용.
- 플라스마 또는 혈 청 500 µ L로 aliquot 200 µ L 튜브 고 추가 분석에 대 한-80 ° C에서 모든 샘플을 저장 합니다.
- 특별 한 혈액 가스 분석 (BGA) 주사기 BGA 제조 업체의 지침에 따라 BGA 기계를 사용 하 여 측정을 사용 하 여 간선에서 혈액의 0.5 mL를 철수.
- 표준 2 mL 주사기를 사용 하 여 정 맥에서 혈액의 0.5 mL를 철회 하 고 즉시 30g 바늘을 사용 하 여 ACT 카트리지로 전송. 제조업체의 지침에 따라 응고 시간을 측정 행위 기계로 채워진된 카트리지를 삽입 합니다. 시간 포인트 그림 2 를 참조 하십시오.
- 2 mL 주사기를 사용 하 여 정 맥 라인으로 5000 IU unfractionated 헤 파 린을 관리 하 고 미 실험을 시작 하기 전에 20 분 동안 안정화 동물 허용.
- 2.1.11 듯이 모니터 모든 30-45 분 행동. 법 < 180 s 경우 2500 IU unfractionated 헤 파 린을 정 맥 주사.
- 심근 경색 실험
- 표준 C 팔 fluoroscopy 장비를 사용 하 여 (관상 동맥 혈관 프로그램, 각도 0 °, 두 번째, ~ 70 초당 12 프레임 kV) 또는 전용된 제품은 시스템 또는 관상 동맥 내정간섭을 수행 하려면.
- (5 층, 120 c m) 압력 카 테 터를 삽입 하려면 왼쪽된 경 동맥에 이전 배치 칼 집 통해 fluoroscopic 가이드를 사용 합니다. 좌 심 실에 사전. 왼쪽된 심 실 압력 기록 수집 시스템에 압력 카 테 터를 연결 합니다. 수집 시스템은 지속적으로 계산 하 고 개발 하는 심장 박동을 기록 필요 압력, dP/dt 최대 (좌 심 실 수축)와 dP/dt 최소 (좌 심 실 이완) 전체 실험 기간 동안. 10 분에 대 한 초기 계획 값을 기록 합니다.
- 6F (100 cm, EB3.75) 삽입 오른쪽 경 동맥으로 이전 배치 칼 집 통해 인도 카 테 테 르. X 선 지도 왼쪽된 앞쪽 내림차순 관상 동맥 (젊은이) 도달 왼쪽된 관상 동맥에 진출. 유도 카 테 터를 통해 20 mL 주사기를 사용 하 여 초기 관상동맥 혈관을 수행 하는 대조 매체 주입.
참고: 대조 매체 주입 수동 압력에 의해 수행 됐다 하지만 전용된 파워 인젝터 시스템 뿐만 아니라 사용 될 수 있습니다. - 경 피 적인 관상 동맥 내정간섭 (PCI) 카 테 테 르의 적절 한 크기 선택 x 선 모니터에 젊은이의 크기를 평가 합니다. 15-25 m m 2와 3.5 m m 젊은이 크기에 따라 직경의 길이와 PCI 풍선을 사용 합니다. 조립 PCI 카 테 터와 관상 동맥 guidewire (F 014/J, 175 cm). 대조 매체와 pre-filled 인플레이션 장치와 PCI 카 테 터를 연결 합니다.
참고: 젊은이 직경은 통치자를 사용 하 여 보정된 모니터에 직접 측정 될 수 있다 고 PCI 풍선의 크기에 따라 선택 다음. - 인도 카 테 테 르의 루멘에 2.2.4에서 조립된 시스템을 삽입 합니다. 젊은이의 두 번째 대각선 지점 넘어 도달할 때까지 젊은이에 있는 guidewire를 사전.
- 그것에 대 한 젊은이의 중간에 도달할 때까지 PCI 카 테 터를 fluoroscopic 가이드를 사용 합니다. 일반적으로 좌 심 실 (LV)의 AAR의 유사한 비율이 있기 위하여 첫 번째 대각선 지점 (그림 3) 때로는 후 두 번째 후 coronaries, 해부학에 따라 젊은이 차단 사이트를 선택 합니다.
참고: 차단 사이트의 대각선의 길이에 따라서 각 분기를 통해 혈액에 의해 제공 되는 조직의 지역 따라 달라 집니다. 오래, 경우 분기 첫 번째 대각선 지점 차단 사이트 직후이 될 것입니다. 짧은 첫 번째 대각선 지점 경우 차단 두 번째 대각선 후 수행 됩니다. - guidewire를 제거 하 고 PCI 카 테 터의 풍선을 부 풀 려 1 h. 점차적으로 증가 FiO2 허 혈의 15 그리고 40 분 사이 50-60%에 대 한 심근 허 혈을 유발 하는 7-10 바 인플레이션 장치에 압력을 증가. 6-10 mL/kg에서 해 볼륨을 유지.
참고:이 절차 extrasystoles의 발생 하는 심 fibrillations의 주파수를 감소 하십시오. - 기록 장소에 허 혈; 시작 직후 PCI 테의 풍선의 혈관 촬영을 인도 카 테 테 르 통해 대조 매체 주입 하는 동안 5-10 s 비디오 시퀀스 PCI 테의 풍선에 원심 젊은이의 완전 한 폐색을 확인 허 혈의 10 분 후 반복 합니다.
- 밀접 하 게 즉시 감지 하 고 치료 (2.2.10) 동물 모니터링 심장 부정맥. Extrasystoles는 일반적으로 발생 하 고 주파수에서 증가 (> 분 당 3) 심근 허 혈의 유도 후 20, 40 분 사이. 이 경우, 부드럽게 바로 뺨 아래 양쪽에 목 마사지. 대부분의 경우에서이 다시 일반적인 경 동맥에 있는 vagal 신경 baroreceptors의 자극에 의해 아마 일반 하트 비트 설정에 충분할 것 이다.
- 심장 부정맥 심 동으로 진행을 하는 경우는 외부, 복 형 제 세 동기를 사용 하 여 다시 부 비 동 리듬을 설정 하려면. 5-10 가슴 압축 산소를 혈액은 coronaries 채워 고 다음 150 J (30 kg 동물)에 대 한 충격 충격을 적용 하기 전에 즉시 제 세 동기 패드를 사용 하 여 적용 됩니다.
- 필요한 경우 반복 하 고 175 J 3rd 충격 후에 에너지의 증가. 더 무거운 동물에 대 한 높은 에너지 설정을 사용 합니다.
- 허 혈 시간 끝나기 전에 5 분 2.1.8-2.1.13에서 언급 한 혈액 샘플링을 반복 합니다. 시험 물질을 주입 (중 bicyclic FXIIa 억제제 또는 제어 4 mg/kg, 이렇게이 맹목적으로) 중앙 정 맥 라인 플러시 라인 20 mL 염 분을 통해 정 맥.
- (설명 했 듯이 2.1.8에 2.1.9) 한 플라즈마 시트르산 샘플을 철회 2.2.12에 물질을 주입 후 4 분.
- 젊은이 폐색을 확인 다음 PCI 테의 풍선 폐 인도 카 테 테 르에서이 카 테이 터를 제거 하는 혈관 촬영 (2.2.3)을 수행 합니다. 심근 허 혈의 흔적 직전 5 분 이상 한 ECG에 의해 표시 되었다 때마다 디플레이션과 PCI 카 테 터, 10 분 후, 풍선의 제거 후 즉시 폐색 사이트에 원심 젊은이의 관류 혈관 촬영으로 확인 젊은이의 오 하 클 다시 루
- 2 시간에 대 한 허 혈 성 심근의 reperfusion 허용. Reperfusion (2.1.8 및 2.1.9)의 10, 30, 60, 115 분 플라스마와 혈 청 샘플을 가져가 라. 60, 115 분 (2.1.10) 모니터 BGA.
- 허 혈에 대 한 사용으로 정확 하 게 동일한 위치로 guidewire 함께 PCI 카 테 터를 다시 넣습니다. 앞으로 PCI 카 테 터의 풍선을 부 풀 려 고 젊은이 폐색 혈관 (2.2.3) 촬영 합니다. 좌 심 실에서 압력 카 테 터를 제거 하 고 녹음을 중지.
- 주사 100 mL 2% 에반스 블루 인산에 중심 정 맥 라인에 식 염 수 (PBS, pH 7.4) 버퍼링. 약 30 s 후, 전체 동물 블루 때 주사 40 mL 20 %KCl 동물 안락사를. 죽음은 ECG 신호 및 펄스 파의 부재에 의해 확인 되었다.
3. 샘플링 기법
-
추출, 해 부 및 심장 (그림 4)
- 마음을 노출 sternotomy를 수행 합니다. 앞에서 설명한 Koudstaal 및 동료, 단계 8-2 8-318프로토콜을 따릅니다. 잘라 오픈 심 낭 종양, 이전 pericarditis에서 줄기 수 있습니다 추가 평가에서 동물을 제외 하 고는 검사 하는 동안.
- 폐 고 PCI 인도 카 테 테 르 제거. 추가 분석을 위해 심장 삭제하시오 베 나 정 맥을 잘라 고 혈액 흡입 펌프를 사용 하 여 다음 신체와 마음을 연결 하는 모든 큰 배를 잘라 제거 합니다.
- 실 온 식 염 수와 심장을 내부와 밖으로 헹 구 십시오. 온 마음을 무게.
- 30-40 분 이내 심장의 승 모 판, 날카로운 칼을 사용 하 여 긴 축에 수직인 Chordae tendinae 를 꼭대기에서 약 3-5 mm의 조각으로 잘라.
- 항상 복 부 면이 컷된 샘플 (그림 5)의 방향을 유지 하기 위해 동일한 방향에서 마음을 배치에 주의 해야 합니다.
- 디지털 싱글 렌즈 리 플렉스 카메라를 사용 하 여 심장의 조각 사진.
- 컷 멀리 오른쪽 심 실 (필요 하지 않습니다으로 삭제). 왼쪽된 심 실 조각 사진와 좌 심 실의 총 무게에 대 한 모든 조각 무게.
- 에반스 블루 긍정적인 하 고 모든 섹션에 에반스 블루 부정적인 조직 구분. 메스를 사용 하 여 비-허 혈 성 조직 (에반스 블루 긍정적인)에서 허 혈 성 (에반스 블루 부정적인)을 조각 해 부.
- 먼저 에반스 블루 부정적인 섹션 (위험, AAR에 허 혈 성 지역) 분석. 그들 모두의 무게와 모든 플라스틱 용기에 넣어.
- (심장 크기)에 따라 100-150 mL triphenyl tetrazolium 염화 솔루션 (TTC, 16 g Dextran, 분자량 48000-90000, 200 mL PBS, 갓 준비 2 세대)와 완전히 조각 커버 심장 조각 솔루션 안에 자유롭게 이동할 수 있다 그래야. 컨테이너를 커버 하 고 부드럽게 흔들어 동안 37 ° C에서 20 분 동안 품 어.
- 이 분 보육 시간 무게 에반스 블루 동안 긍정적인 조각 (위험, ANR에 지역), 포함 하는 조직-테크에 대 한 샘플을 채취 (부상에서 가장 말 초 부분 선택) 추가 분석을 위해-80 ° C에서 저장. 나머지 4% 포름알데히드 솔루션에 전송 하 고 조직학 단면도 위한 실내 온도에 저장 합니다.
- TTC 솔루션에서는 AAR의 조각을 제거 합니다. 빨간 얼룩진된 조직 가능한 허 혈 성 조직 (VIT) 이며 비 얼룩진 조직 괴 사 성 허 혈 성 조직 (니트)는. 2 작은 조각 (2-3 m m의 블록)에서 잘라 두 니트와 VIT, 조직-테크에 그들을 포함 하 고 추가 분석을 위해-80 ° C에서 저장. 이러한 샘플에는 동일한 무게가 있어야 합니다.
- 스티로폼 용기에 그들을 고정 하 고 증기 두건에서 실 온에서 24 h에 대 한 4% 포름알데히드 솔루션과 완전히 덮고 하 여 조각 (AAR는에서 파생 된 모든 분할 영역)의 나머지를 해결. 조각 플랫 다음 단계에서 사진 설명서에 대 한 있어야 합니다.
- 다음 날 사진 고해상도 카메라는 동일한 확대/축소 설정 및 조직 (동일한 확대)에서 거리와 함께 조각의 양쪽. 모든 사진에 자동 눈금 막대를 추가 합니다. 모든 바 같은 길이 필요 합니다.
참고: 고해상도 카메라는 자동으로 각 사진에 눈금 막대를 추가 하는 소프트웨어에 연결 되어야 합니다.
-
AAR 및 경색 크기의 계산
- 좌 심 실의 AAR % = (g에서 AAR의 무게 / 무게 g에서 좌 심 실의) * 100.
- ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 AAR 니트 (각 조각의 양쪽 모두)는 사진에 따라의 총 면적을 계산.
- 각 도구에서 직선을 사용 하 여 눈금 막대 길이 선택 하 여 눈금 막대를 조정 합니다. 분석 메뉴에서 선택 > 설정 규모 알려진된 거리 눈금 막대의 단위를 삽입 하 고. 그래서 같은 규모는 모든 사진에 적용 됩니다 "글로벌"을 선택 하십시오.
- AAR 계산 무료 손을 선택 도구를 사용 하 여 조직의 전체 면적을 표시 합니다. 수는 조직 및 지방 조직 (그림 6-C) 측면 (높이)를 포함 하지 않도록 주의 하십시오.
- "지역" 및 분석에서 "레이블 표시"를 선택 하 여 측정을 설정 > 설정 측정 메뉴. 분석에서 표면적 측정 > 측정.
- 3.2.5 측정 니트 (마크 비 얼룩진 조직) 단계를 반복 합니다. 참고: 알 계산에서 지방 조직 (그림 6-D)를 포함 하지 마십시오. 조직의 다른 쪽에 있는 단계를 반복 합니다.
- 평균 AAR 및 니트 직물의 각 조각을 위해 계산 합니다.
- 3.2.7에서 가져온 값을 사용 하 여 니트 AAR:% 니트 AAR의 계산 = (Σ 평균 면적 니트의 cm2/ Σ는 cm2AAR의 표면적 평균) * 100.
- 두 개의 다른 조사 위의 방법을 반복 해야 합니다. 차이의 허용 한계 < 10%입니다.
-
허 혈 마커
- EDTA 플라스마 견본, 이전 심장 분의 수준을 측정 하-80 ° C (2.1.9)에 저장 된를 사용 하 여-단일-플렉스 Luminex 형 분석 결과 사용 하 여 이전 설명한 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1 동물 FXIIa 억제제 또는 제어 펩 티 드의 기술적 오류 (시험 물질의 추가 하기 전에 허 혈 시간 동안 혈압의 급강하) 관리 전에 성급 하 게 사망 했다. 한 동물 때문에 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 상해 없음 왼쪽된 앞쪽 하강 동맥 (젊은이)의 비정상적인 해부학 때문에 관찰 되었다 FXIIa 억제제 그룹에서 제외 했다. 정점를 포함 하 여 좌 심 실의 큰 부분 이었다이 동물에 곡절 동맥에 의해 끼얹는다. 최종 분석에 포함 하는 동물 들이 n = bicyclic FXIIa 펩 티 드 억제 물 그룹에서 2 (27.5 ±의 무게를 의미 2.5 k g)와 n = 3는 비활성 bicyclic 제어 펩 티 드를 받고 (29 ±의 무게를 의미 0.8 k g).
X 선 영상 이미징/돼지 심장의 관상 동맥 혈관 압력 카 테 터의 위치를 시각화 하 고 젊은이 (그림 3A)을 차단 하도록 결정 하는 데 사용 됩니다. 그림 3B 는 두 번째 대각선 지점에 말 초 혈액의 흐름 차단 테 위치를 보여준다. 그림 3A 와 3B 의 비교는 또한의 부분은 젊은이 제공 심근의 허 혈 성 될 것입니다 추정 수 있습니다. 2 h reperfusion 기간의 끝에 PCI 테 재 이며 같은 위치에서 비정상적으로 국 소 빈 혈. 에반스 블루는 다음 주입 정 맥 AAR (그림 5A)를 정확 하 게 결정. 심장의 절단, 후 좌 심 실 승 모 판, 긴 축에 수직인 최대 정점에서 3-5 m m 두꺼운 부분으로 슬라이스입니다. AAR 및 ANR는 에반스 블루 조각에 얼룩에 의해 명확 하 게 구분 됩니다. AAR 및 ANR 샘플링 분야는 그림 5B에서 표시 됩니다.
AAR, 라스베가스의 비율로 표시 FXIIa 대우 그룹 및 제어 그룹 (그림 6A) 사이 통계적으로 유의 한 차이가 표시 됩니다. 경색 크기 (니트/AAR) 중 그룹 간의 차이가 보여줍니다 (비패라메트릭 맨-휘트니를 사용 하 여 테스트, p > 0.05, 그림 6B). 이러한 데이터는 FXIIa 억제제 사용된 농도 및 응용 프로그램의 기간에 혼자 심근에서 마음을 보호 하지 수 것이 좋습니다 I / R 상해. 그림 6 c 와 6 D 정확 하 게 그리고 reproducibly 각각 표면 영역을 측정 하기 위하여 AAR 및 니트 테두리를 표시 하는 방법을 보여 줍니다.
혈액 샘플링 전략 심장 근육 손상 마커 심장 분의 릴리스 수 있습니다-시간이 지남에 따라 모니터링할 난. Reperfusion 거기는 그림 7에서 같이 시간이 지남에 지속적인 증가 후에 국 소 빈 혈 동안 기준선의 1 시간 후 거의 차이가 있다. 분에 대 한-난, 남북 그룹의 차이 했다 또한이 실험에서 중요 한.
그림 1 . 실험 시간 표시 막대의 개요. 도식 시간에 표시 한 막대 심근 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 상해 모델에서 중요 한 단계에 대 한 기준선 관상 시각화, 시작은 허 혈의 시간, 심장 부정맥 모니터링 및 테스트 물질을 주입 실험에서 중요 한 단계가 있습니다. 모든 실험에 정확한 타이밍의 사용 재현성을 보장합니다. 동물 및 심장의 절단을 euthanizing 2 h reperfusion 단계의 완료 후 15-20 분 내에서 수행 되어야 합니다. KCl: 칼륨 염화입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 혈액 샘플링 및 분석의 타임 라인. 혈액 샘플링 시간 포인트 응고 제 사용의 종류와 함께 표시 됩니다. 추가 샘플 측정 실험 및 analytes에 따라 취할 수 있습니다. 법: 응고 시간, BGA 활성화: 혈액 가스 분석, RT: 실 온. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 관상 동맥 혈관. 기준선에서 (A) 왼쪽된 coronaries fluoroscopic 볼, 노란색 화살표는 첫 번째 및 두 번째 대각선 가지 포인트 흰색 화살표를 가리키는 심장 꼭대기 왼쪽된 심 실 (LV)의 아무 흐름 영역을 보여주는 (B) 폐색된 젊은이 PC에 빨간색 화살표가 가리키는 나 카 테 터 (C) 다시는 reperfusion의 끝에 다시 국 소 빈 혈 동안 젊은이 있는 동일한 사이트에 삽입 된 PCI 테의 풍선에 젊은이의 폐쇄. CX: 곡절 관상 동맥, 젊은이: 왼쪽 앞쪽 내림차순 관상 동맥, MC: 밀러 카 테 터, 좌 심 실에 삽입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 조직 샘플링의 도식 차트. 심장 해 부의 정확한 타이밍 그리고 추가 분석을 위해 여러 분야의 샘플링. 타임 라인 205 분 초의 허 혈, 동물 실험의 종료 후 20 분 후 시작 됩니다. 그것은 동물을 euthanizing 후 최대 40 분 내에서 TTC에 조직 단면도 품 어 해야 합니다. ANR, VIT 알의 샘플링 흰색 사각형으로 표시 됩니다. 4% 포름알데히드에 AAR 잠복기 경색 크기의 정확한 결정에 대 한 니트와 VIT 사이 명확한 구별을 허용 한다. AAR: 위험, ANR에 영역: 위험, LV에 지역: 좌 심 실, 니트: 괴 사 성 허 혈 성 조직, OTC: 조직-테크, RV: 우 심 실, TTC: triphenyl tetrazolium 염화, VIT: 가능한 허 혈 성 조직. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 위험 (AAR)에 지역 및 위험 ANR에 지역 사이 제자리 차별화. (실험의 끝에 sternotomy 직후 온 마음 A) 대표 그림. (절 개 후 3-5 m m 두꺼운 왼쪽된 심 실 분할 영역을 보여주는 B) 대표 사진입니다. AAR ANR은 명확 하 게 정의 노란색 화살표로 표시 하 고 흰색 화살표 ANR 샘플링 영역 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 . 허 혈 및 경색 크기입니다. (A) 왼쪽된 심 실 (LV)의 AAR의 백분율 무게. (는 AAR의 니트 B)는 백분율 표면 영역. AAR 계산 (C) A 대표 그림. (D) 니트 계산의 대표 사진. 흰색 화살표는 VIT 샘플링 영역을 표시 하 고 검은색 화살표 니트 샘플링 영역 표시. 데이터는 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 계산 했다. 값은 점 각각에 대 한 실험 평균 ±±의 표시와 함께 sd. 컨트롤 그룹, n으로 표시 됩니다 3와 FXIIa 억제제 치료 그룹, n = = 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 . 심장 근육 손상 표식입니다. 심장 분-내가 제어 및 FXIIa 억제제의 pg/ml에서 시간이 지남에 따라 농도 처리 그룹. 혈액 reperfusion 및 심장 분 중 기준, 국 소 빈 혈의 끝과 여러 시간 지점에서 EDTA 플라즈마 튜브로 경 정 맥에서 수집 된-단일-플렉스 서 스 펜 션 배열 (바이오 플렉스)에 의해 측정 되었다. 데이터 점 들 각각에 대 한 실험 평균 ±±의 표시와 함께 sd. 컨트롤 그룹, n으로 표시 됩니다 3와 FXIIa 처리 그룹, n = = 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
심근 I / R 상해는 급성 심근 경색3후 환자의 예 후에 직접 번역 최종 경색 크기에 큰 영향. 심근의 이상 이해 I / R 상해 감소 하거나 그것을 방지 하는 첫 단계입니다. 심근 I / R 상해 폐색된 혈관의 reperfusion 후 직접 발생 하는 심각한 상태입니다. I / R 상해 타고 난 면역 반응의 활성화 고 세포 손상을 reperfusion와 주변 조직20의 사이트에서 발생 합니다. 최근 연구 결과 뇌의 쥐 모델에서 신경 결과에 개선 보여 I / R 상해 FXIIa 억제제8로 치료 하면. 그러나, 현재 파일럿 연구에서 우리가 발견 bicyclic FXIIa 억제제의 영향을 주지 않습니다에 심근 I / R 상해. 사용된 FXIIa 억제제 소설 이며 돼지에서의 약 동학 아직 알려져 있지 않습니다. 따라서, 효과의 관찰된 부족은 부적절 한 주입 또는 응용 프로그램에 의해 원인일 수 있습니다. 이 후속 연구에서 해결 될 필요가 있다.
심근의 이상 심층에서 조사 필수적 이다 동물 모델을 표준화 I / R 상해 클리닉에 적합 한 솔루션을가지고. 심근의 이상 조사 I / R 상해 좋고 대표 샘플링 그것을 기본 세포 메커니즘 연구 필요. 돼지 닫힌된 가슴 심근 I / R 상해 모델은 임상 상황, 그리고 수 있도록 유용한 세포 메커니즘 및 이해 테스트 소설 새로운 치료제 재현 방법 제공. 위에서 언급 한 목적14,,1718현재 모델의 변종 전에 설명 되어 있다.
돼지에서 급성 심근 경색의 우리의 프로토콜 앞에서 설명한18,21로 amiodarone 사전 치료를 필요 하지 않습니다. 우리는 경 동맥 부 비 동 마사지 심장 부정맥과 심 동과 경우 cardioconversion에 대 한 복 형 제 세 동기를 줄이기 위해 사용. 심 방 세 동22, 영향을 경 동맥 부 비 동 마사지의 사용 알려져 임상 하지만 지금까지 그것은 표시 되지 방지 또는 심 동 미, 인간 또는 돼지 모델에서에서의 발병을 지연. 또한, sevoflurane 사용 하 여 심 실 부정맥으로 급성 심근 경색23의 돼지 모델에서 사망률을 줄일 수 있습니다.
재현성을 보장 하 고 실험 기간 동안 혈전 증의 위험을 감소, 헤 파 린의 여러 복용 법, 반복된 측정에 따라 주입 했다 보다는 헤 파 린 복용량 Koudstaal 외18여 예를 들어 설명 하는 대로 고정을 사용 하 여. 헤 파 린 관리 제어 양의 응고 캐스케이드의 맥락에서 조사 하는 데 도움이 / R 상해. 에반스 블루 AAR/라스베가스의 정확한 결심을 허용 한다. 에반스 블루 fluoroscopic 지도 허 혈 유도 중 정확한 사이트에서 젊은이의 재 폐색 리드는 ANR에 최소 영향 심장의 허 혈 성 비 부분을 포함 하 여 전체 돼지의 블루 얼룩 후의 정 맥 주입 심근 및 맥 관 구조입니다. 에반스 블루는24알려진된 세포 독성 물질 이다. 사용 하려면 심장 맥 관 구조에 ANR에 내 피 세포 층의 생존 능력을 유지 하기 위해 중요 한 그것이 현재 실험에서 내 개인으로 서 그것은 너무 100ml 에반스 블루 체계적으로 주입 되었고 전체 혈액 감소와 함께 희석 제어의 독성입니다. 이전에 비슷한 설정에서 50 ml 2% 에반스 블루 심장에는 세포 독성의 위험이 증가 coronaries에 직접 주입 했다25세포. 다음 중요 한 단계는 심장 승 모 판 (모든 동물에서 정확한 위치)와 좌 심 실의 백분율은 AAR의 정확한 계산을 만들기 위해이 메서드를 사용 하 여 정점에서 3-5 m m 조각으로 직접 해 부 했다.
메서드의 현재 설명 설명 하지 이전 미세한 세부 정보를 제공 합니다. 24 시간 동안 4% 포름알데히드에 섹션을 스테인드 TTC 잠복기 제공 가능한 (레드) 사이 명확한 구별 및 마지막으로 더 분자 얼룩에 대 한 샘플링의 재현성을 증가 하는 괴 (흰색) 조직. 혈액 샘플링 전략 reperfusion의 이상의 2 시간 나중 (60와 120 분)으로 reperfusion의 아주 초기 (10, 30 분) 단계에서 새로 표현된 분자의 검색 수 있습니다. 정확한 혈액 및 조직 샘플링 및 저장소 플라즈마 캐스케이드 마커 보완 및 응고 단백질의 표현 등의 분석에 대 한 중요 한 있습니다.
현재 프로토콜 일 몇 시간에서 더 이상 reperfusion 시간을 수정할 수 있습니다. 그러면 나의 나중 결과 조사 하는 연구원 / R 부상 마음에도 새로운 약물과 그들의 효과의 평가의 테스트 수 있습니다. 현재 프로토콜의 제한 심장 기능 측정에 대 한 압력-팁 카 테 터의 사용 이다. 심장 기능에 더 신뢰할 수 있는 데이터는 압력-볼륨 루프 측정 시스템의 사용에 의해 얻어질 수 있다. 요약에는 현재 제공 합니다 돼지 닫힌된 가슴 심근의 재현성을 증가 하는 데 필요한 자세한 중요 한 단계 I / R 상해 모델은 모델의 용도의 맥락에서 세포질이 고 분자 변화를 공부 하는 심근 공부 I / R 상해 이상 또는 새로운 치료 옵션을 공부.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 충돌의 관심을 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 FXIIa 억제제 및 해당 제어를 제공 하기 위한 교수 기독교 Heinis를 인정 하 고 싶습니다. 우리는 또한 기꺼이 Olgica Beslac, 박사 다니엘 Mettler 및 실험적인 수술 단위, 생물 의학 연구, 기술 지원에 대 한 베른 대학에 대 한 부서에서에서 케이 Nettelbeck를 인정합니다. 셀 린 느 Guillod와 진단, Interventional 및 소아 방사선과, 베른 대학 병원에 대 한 부서에서 마 티아 스 Rausch Inselspital x 선 장비 및 기술 지원 제공. 이 프로젝트는 스위스 국립 과학 재단, 프로젝트 no. 320030_156193에 의해 투자 되었다. 우리 또한 커뮤니케이션 및 마케팅, 베른 대학 병원, 비디오 녹화 우리의 실험에 대 한 Inselspital에서 씨 Reto Haenni를 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABL 90 Flex, blood gas analyser | Radiometer | - | Blood gas analysis (BGA) |
| ACT Plus | Medtronic | - | Activated clotting time |
| Atropin | Sintetica | - | Atropinum Sulfas, 0,5mg/ml |
| Balance (20-500 Kg) | NAGATA Scale, Tiwan | HTB/HTR | Alternative products can be used |
| Balance (21-4200 g) | Mettler toledo, Switzerland | MS4002SDR | Alternative products can be used |
| Blood collection tubes: EDTA, citrate and serum | S-Monovette, Nuembrecht, Germany | 05.1167.001, 05.1071.001 and 05.1557.001 respectively |
Alternative products can be used |
| BV Pulsera mobile C-arm | Philips | - | Alternative products can be used |
| Centrifuge | Labcare, UK | ALC PK120R | Alternative products can be used |
| Defibrillator Lifepak 12 | Medtronic | - | Alternative products can be used |
| Dextran from Leuconostoc mesenteroides | Sigma-Aldrich, Germany | D3759 | Average M.wt 48000-90000 |
| Digital single lens reflex camera | Sony, Thailand | DSLR-A500/A550 | Alternative products can be used |
| Dissecting forceps | Alternative products can be used | ||
| EMPIRA RX PCI dilatation catheter | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 85R15300S | Diameter 3 mm, length 15 mm, Alternative products can be used |
| EMPIRA RX PCI dilatation catheter | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 85R15350S | Diameter 3.5 mm, length 15 mm, Alternative products can be used |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich, Germany | E2129 | Toxic |
| Fabius GS premium respirator | Dräger, Lübeck, Germany | - | Anesthesia work station, Alternative products can be used |
| Fentanyl | Inselspital ISPI | - | Fentanyl 2500mcg/50ml |
| Formaldehyde | Pathology Institute, Bern University | SI148701 | Alternative products can be used |
| FXIIa inhibitor | Provided by Prof. Christian Heinis' laboratory in EPFL | Novel bicyclic peptide | |
| Galeo, coronary guidewire | Biotronik, Germany | 125497 | Alternative products can be used |
| Guidance catheter | Boston Scientific, Florida, USA | 34356-06 | 6F (100 cm, EB3.75). Alternative products can be used |
| Heparin Sodium | Drossapharm, Basel, Switzerland | - | Liquemin, 25000 U.I./5 ml |
| High end electrosurgery | BOWA, Germany | ARC 400 | Electrical source for blood suction. Alternative products can be used |
| Hydro-Guardmini breathing filter | Intersurgical, Lithuania | 1745000 | Filters |
| Image J | National Institute of Health, USA | 1.47v | Alternative products can be used |
| Inflation device, Atrion QL2530 | Atrion medical product, Alabama, USA | 96402 | Alternative products can be used |
| IntelliVue MP 70 | Philips, Boeblingen, Germany | - | Monitor (ECG, heart rate, blood presure and body temperature). Alternative products can be used |
| KCl | Sintetica SA | - | Potassium chloride 15% |
| Ketamine | Vetoquinol | - | Narketan, 1ml/100mg |
| LR-ACT | Medtronic | 402-01 | ACT special syringes |
| Midazolam | Roche | - | Dormicum, 5mg/ml |
| Monopolar scalpel | Alternative products can be used | ||
| Needle holder | Alternative products can be used | ||
| High resolution camera, PathStand Macro Imaging Stand for Grossing | Spotimaging, USA | 1080 p HD resolution. Alternative products can be used | |
| PBS | In-house preparation | - | Alternative products can be used |
| Peripheral venous cannula, 18 G | Alternative products can be used | ||
| PowerLab 4/35 data acquisition system | Adinstruments, Spechbach, Germany | - | |
| Rotamax120T | Heidolph, Germany | 544-41200-00 | Shaker. Alternative can be used |
| Rüschelit-Super Safety Clear Tube | Teleflex, Dublin, Irland | 112480 | Air way tubing, Alternative products can be used |
| Safe Pico Aspirator Syringes | Radiometer | 956-622 | BGA special syringes |
| Saline | Sintetica Bioren | - | NaCl 0,9%. Alternative products can be used |
| Sevorane 1.5% | AbbVie AG | - | Sevorane 250ml 100% |
| Sheath | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 504-607 A | AVANTI + / 7 F, Alternative products can be used |
| Space infusion pump | B.Braun Medical AG, Germany | - | For infusion of fentanyl. Alternative products can be used |
| SPR-350 (Millar catheter) | Adinstruments, Texas, USA | 840-8166 | MIKRO-TIP, 5F, 120 cm |
| Sternotomy saw | Alternative products can be used | ||
| Sutures | ETHICON, Johnson&Johnson, USA | Y3110H | Monocryl 3-0 SH-1 Plus. Alternative products can be used |
| Syringes (20, 10 and 5 mL) | CODAN,Baar, Switzerland | 62.7602, 62.6616, 62.5607 respectively |
Used to inject anesthetic materials intramuscularly or directly into the central venous line. Also to inject heparin or FXIIa or the respective control. Alternative products can be used |
| Thorax spreader | Alternative products can be used | ||
| Tissue-tek | SAKURA, Netherlands | 4583 | O.C.T. compound |
| Vascular forceps | Alternative products can be used | ||
| Xenetix 300 contrast media | Guerbet, Zürich, Switzerland | - | Lobitridol, 300 mg iodide/ml |
| Xylazine | Vetoquinol | - | Xylapan, 20mg/1 mL |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium choride | Sigma-Aldrich, Austria | T8877 | |
| 500 μL tubes (eppendorf) | Trefflab, Switzerland | 96.08185.9.03 | Alternative products can be used |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update. Circulation. 133, e338-e360 (2016).
- Miller, T. D., et al. Infarct size after acute myocardial infarction measured by quantitative tomographic 99mTc sestamibi imaging predicts subsequent mortality. Circulation. 92, 334-341 (1995).
- Ovize, M., et al. Postconditioning and protection from reperfusion injury: where do we stand? Position Paper from the Working Group of Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovasc Res. 87, 406-423 (2010).
- Neri, M., Riezzo, I., Pascale, N., Pomara, C., Turillazzi, E. Ischemia/Reperfusion Injury following Acute Myocardial Infarction: A Critical Issue for Clinicians and Forensic Pathologists. Mediators Inflamm. 2017, 1-14 (2017).
- Yang, Q., He, G. -W., Underwood, M. J., Yu, C. -M. Cellular and molecular mechanisms of endothelial ischemia/reperfusion injury: perspectives and implications for postischemic myocardial protection. Am J Transl Res. 8, 765-777 (2016).
- Massberg, S., et al. Platelet-Endothelial Cell Interactions During Ischemia/Reperfusion: The Role of P-Selectin. Blood. 92, 507-515 (1998).
- Wang, J., et al. Antithrombin is protective against myocardial ischemia and reperfusion injury. J Thromb and Haemost. 11, 1020-1028 (2013).
- Hopp, S., et al. Targeting coagulation factor XII as a novel therapeutic option in brain trauma. Ann Neurol. 79, 970-982 (2016).
- Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. J Anat. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
- Heusch, G., Skyschally, A., Schulz, R. The in-situ pig heart with regional ischemia/reperfusion - ready for translation. J Mol Cell Cardiol. 50, 951-963 (2011).
- Poirier, P. Exercise, heart rate variability, and longevity: the cocoon mystery? Circulation. , 2085-2087 (2014).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacol Ther. 141, 235-249 (2014).
- Bloor, C. M., White, F. C. Functional development of the coronary collateral circulation during coronary artery occlusion in the conscious dog. Am J Pathol. 67, 483-500 (1972).
- Banz, Y. Locally targeted cytoprotection with dextran sulfate attenuates experimental porcine myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 26, 2334-2343 (2005).
- Krombach, G. A., Kinzel, S., Mahnken, A. H., Günther, R. W., Buecker, A. Minimally Invasive Close-Chest Method for Creating Reperfused or Occlusive Myocardial Infarction in Swine. Invest Radiol. 40, 14 (2005).
- Suzuki, Y., Lyons, J. K., Yeung, A. C., Ikeno, F. In vivo porcine model of reperfused myocardial infarction: in situ double staining to measure precise infarct area/area at risk. Catheter Cardiovasc Interv. 71, 100-107 (2008).
- McCall, F. C., et al. Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine. Nat Protoc. 7, 1479-1496 (2012).
- Koudstaal, S., et al. Myocardial infarction and functional outcome assessment in pigs. J Vis Exp. , e51269 (2014).
- Kamat, P., et al. Dexrazoxane Shows No Protective Effect in the Acute Phase of Reperfusion during Myocardial Infarction in Pigs. PLoS One. 11, e0168541 (2016).
- Carden, D. L., Granger, D. N. Pathophysiology of ischaemia-reperfusion injury. J Pathol. 190, 255-266 (2000).
- Pérez de Prado, A., et al. Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).
- Lown, B., Levine, S. A. The carotid sinus. Clinical value of its stimulation. Circulation. 23, 766-789 (1961).
- Regueiro-Purriños, M., et al. Ventricular Arrhythmias and Mortality Associated with Isoflurane and Sevoflurane in a Porcine Model of Myocardial Infarction. J Am Assoc Lab Anim Sci. , (2011).
- Roberts, L. N. Evans blue toxicity. Can Med Assoc J. 71, 489-491 (1954).
- Ellenbroek, G. H. J. M., et al. Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction. J Vis Exp. , e54021 (2016).
