Summary
Aquí demostramos un protocolo para estandarizar los procedimientos de muestreo de un modelo establecido de porcino de infarto agudo de miocardio con el fin de aumentar su valor traslacional en la comprensión de la fisiopatología de la isquemia/reperfusión miocárdica y para probar a nuevos fármacos candidatos.
Abstract
Reperfusión de la isquemia miocárdica (me / R) lesión contribuye a casi la mitad de la zona necrótica después de infarto de miocardio. Hasta la fecha no existe ningún fármaco aprobado para prevenir o reducir del miocardio I / lesiones R. El estudio y la comprensión de los mecanismos fisiopatológicos de miocardio I / R es esencial para el desarrollo de tratamientos eficaces. Grandes experimentos con animales son un paso importante en los métodos de traslación. El modelo porcino de infarto agudo de miocardio ha sido establecido y descrito por nosotros mismos y otros. El objetivo fue para mejorar aún más el valor del modelo centrándose en detalle en las técnicas de muestreo para su uso en futuros experimentos. Además, hacemos hincapié en medidas pequeñas pero importantes que pueden afectar la calidad de los resultados finales. Para imitar la situación clínica de infarto lesiones R, un catéter de intervención coronaria percutánea (ICP) fue insertado en la arteria descendente anterior izquierda coronaria (CHAVAL) de un cerdo anestesiado. ° ° ° Este modelo mímico infarto agudo de miocardio y el tratamiento de la PCI en seres humanos con la posibilidad de determinar con precisión el área en riesgo así como el necrótico- y tejido isquémico viable. Aquí se utilizó el modelo para investigar el efecto de un inhibidor de péptidos bicíclicos de FXIIa. El modelo puede modificarse para permitir el tiempo de reperfusión estudiar efectos después del infarto de miocardio.
Introduction
Cardiopatía isquémica, en particular infarto de miocardio (MI), es la principal causa de muerte en los países desarrollados 1. Hoy en día, el tratamiento estándar de MI es la intervención coronaria percutánea (PCI), el tratamiento del catéter balón. Uno de los factores críticos que afecta la calidad de vida y pronóstico de los pacientes después de MI aguda tratados con PCI es el tamaño del infarto. La reducción del tamaño puede tener un gran impacto en la supervivencia y pronóstico paciente 2. Isquemia/reperfusión miocárdica (me / R) lesión tiene una influencia significativa en el tamaño del infarto, así que uno de los principales objetivos en la investigación cardiovascular es prevenir o reducir del miocardio I / R lesiones 3. Los mecanismos exactos del daño R están todavía bajo investigación 4. Activación de las cascadas de plasma y las células endoteliales son características distintivas de I / R lesiones 5. Activación del sistema de coagulación está claramente implicado 6,7. Recientemente, el papel de FXII, como un péptido upstream principios implicado en la activación de la fase de contacto de la cascada de la coagulación, se ha demostrado en un FXII noquear a modelo de la rata de cerebral I / R lesión 8. Validación de estos resultados en un modelo porcino es un paso importante en la traducción clínica. Por lo tanto, estamos probando un nuevo inhibidor de FXIIa bicíclicos (proteasa de 80 kDa) en el contexto de miocardio I / lesiones de R en un estudio piloto.
Modelos animales, que imitan la situación clínica de los tratamientos de MI y PCI agudas, son esenciales para mejorar nuestra comprensión de la fisiopatología del miocardio I / lesiones R y para probar nuevos tratamientos. Los cerdos representan un buen modelo animal para clínica del miocardio / lesiones R. Esto no es sólo porque sus corazones son muy similares a los corazones humanos con respecto a la anatomía y la circulación coronaria, pero también muestran respuestas fisiopatológicas similares a miocardio isquemia y reperfusión 9,10. Otros modelos como las ratas y ratones no satisfacen estos criterios y muestran diferencias considerables en comparación con los corazones humanos 11,12, mientras que por ejemplo, los perros tienen muchas más garantías los vasos coronarios en comparación con los seres humanos 13.
El modelo porcino de infarto de miocardio ha sido ampliamente utilizado en investigación cardiovascular investigar cardiopatía isquémica incluyendo miocardio I / R lesiones 14,15,16,17. Este último es una condición inflamatoria, debido a que minimiza la reacción inflamatoria relacionada con esternotomía o toracotomía utilizada en cirugía abierta de tórax es esencial. El modelo de pecho cerrado mediante un ajuste clínico de la angiografía de brazo en C supera este problema. Además, uno de los puntos más importantes es que nuestro protocolo proporciona una distinción precisa entre isquémico (zona de riesgo, AAR) y áreas no isquémica del ventrículo izquierdo (área no peligra, ANR) para que el tamaño del infarto (tejido isquémico necrótico, NIT) puede determinarse con precisión. Nuestro objetivo para este trabajo es definir con claridad una metodología reproducible de un porcino del miocardio I / lesiones R modelo, en particular con respecto a la toma de muestras de tejido miocárdico, que permitirá un análisis más preciso de los mecanismos moleculares de I / lesiones R y un imagen más clara de los efectos de los tratamientos con nuevos fármacos.
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Protocol
1. los animales:
Todos los animales fueron tratados según las pautas de las leyes nacionales suizos. El estudio fue aprobado por el Comité de experimentación animal local del cantón de Berna (permiso no. SER 25/16).
Utilizar grandes cerdos blancos de ambos sexos (30 ± 5 kg). Dividir los animales ciegamente en dos grupos, un grupo un inhibidor (80 kDa proteasa) bicíclica de FXIIa o tratamiento de elección y el otro un control inactivo.
2. quirúrgico (figura 1)
- Anestesia y preparación del animal:
- Rápidamente los animales de 12 h antes de comenzar el experimento.
- Pre medicar al animal con 20 mg/kg ketamina y 2 mg/kg xilacina a través de una inyección intramuscular en el cuello, utilizando una jeringa de 10 mL. Registrar el peso de los animales y el sexo.
- Inducir la anestesia mediante la inyección de 0,5 mg/kg Midazolam y Atropin de 0,05 mg/kg en la vena auricular. Intubar al animal con un tubo endotraqueal.
- Mantener la anestesia, ventilación mecánica, usando un respirador (/air de2O 1:3, Sevorane 1,5%), un tubo de vía aérea 7-8 mm y un filtro. Ajustar la fracción de oxígeno inspirado (FiO2) 35% y el volumen tidal de 6-10 mL/kg.
- Profundidad de la anestesia se valora como adecuada en ausencia de respuestas ya sea motor o autonómicas a pellizcar la nariz. Reflejos palpebrales y el tono de la mandíbula fueron monitoreados continuamente así a tono de mandíbula relajada y ausencia de reflejos palpebrales. Temperatura central fue monitoreada continuamente y mantenimiento de la normotermia (38-38,5 ° C) estaba garantizada con el calentamiento pasivas (aislamiento de botellas calientes y mantas).
- Diseccionar libre, anteriormente descrita por Koudstaal y sus pasos colegas 3-1 a 3-318, las arterias carótidas en ambos lados y canule con una vaina de 7F. Canule la vena yugular izquierda con una vaina de 7F para tomar muestras de sangre venosa.
- Administrar una dosis en bolo de 250 μg analgésico de fentanilo a través de la línea venosa central seguida de 250 μg/h como una infusión intravenosa continua mediante una bomba de infusión. Controlar la temperatura corporal, pulso y ritmo con un plomo de 3 Electrocardiograma (ECG), presión venosa central y arterial durante el experimento entero.
- Utilizando tubos de sangre estándar, retirar las siguientes muestras de sangre de referencia de la línea venosa: plasma citratado 5 mL y 2,9 mL EDTA plasma en los respectivos tubos. Centrifugar inmediatamente a 2.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Tomar 2,9 mL de sangre en un tubo de suero y dejar para coagular durante 30 min a temperatura ambiente antes de la centrifugación como se describió anteriormente.
- Alícuotas de 200 μL de plasma o suero en 500 μl los tubos y almacenar las muestras a-80 ° C para su posterior análisis.
- Retirar 0.5 mL de sangre de la línea arterial utilizando que el análisis del gas de sangre especial (BGA) jeringas para medir BGA BGA utilizarla según las instrucciones del fabricante.
- Retirarse de la línea venosa con una jeringa de 2 mL estándar a 0.5 mL de sangre y ponerlo inmediatamente en el cartucho de ley utilizando una aguja de 30 G. Inserte el cartucho lleno en la máquina de ley para medir tiempo de coagulación según las instrucciones del fabricante. Vea la figura 2 para los puntos de tiempo.
- Administrar heparina unfractionated IU 5000 en la línea venosa con una jeringa de 2 mL y permitir que el animal estabilizar por 20 min antes de comenzar el experimento de MI.
- Monitor de actuar cada 30-45 min como se menciona en 2.1.11. Inyectar por vía intravenosa 2500 IU unfractionated heparin si es < 180 s.
- Experimento de infarto de miocardio
- Utilizar un equipo de fluoroscopia de brazo estándar de C (programa de angiografía coronaria, ángulo de 0°, 12 fotogramas por segundo, ~ 70 kV) - o también un sistema de angiografía dedicado - para realizar la intervención coronaria.
- Usar guía fluoroscópica para insertar un catéter de presión (5F, 120 cm) a través de la vaina previamente colocada en la arteria carótida izquierda. Avanzar hacia el ventrículo izquierdo. Conectar el catéter de presión a un sistema de adquisición para registrar la presión ventricular izquierda. El sistema de adquisición necesita continuamente calcular y registrar la frecuencia cardíaca, se convirtió de presión, dP/dt máxima (contractilidad del ventrículo izquierdo) y dP/dt mínima (relajación del ventrículo izquierdo) durante todo el experimento. Anote los valores de línea de base durante 10 minutos.
- Inserte un 6F (100 cm, EB3.75) catéter guía través de la vaina previamente colocada en la arteria carótida derecha. Avance a la arteria coronaria izquierda para llegar a la arteria coronaria descendente anterior izquierda (CHAVAL) bajo guía por rayos x. Inyectar medio de contraste utilizando una jeringa de 20 mL a través del catéter guía para realizar una angiografía coronaria de base.
Nota: La inyección de medio de contraste se realizó por presión manual pero un sistema inyector de alimentación dedicada podría utilizarse así. - Evaluar el tamaño del muchacho en el monitor de rayos x para seleccionar el tamaño apropiado del catéter la intervención coronaria percutánea (PCI). Utilice globos PCI con una longitud de 15-25 m m y diámetros entre 2 y 3.5 mm dependiendo del tamaño del muchacho. Montar PCI catéter y guía coronaria (F 014/J, 175 cm). Conectar el catéter PCI con el dispositivo de inflado previamente llenado con medio de contraste.
Nota: El diámetro del muchacho puede medirse directamente en un monitor calibrado utilizando una regla y el tamaño del balón PCI entonces se selecciona por consiguiente. - Insertar el sistema montado de 2.2.4 en el lumen del catéter guía. Avanzar la guía en el muchacho hasta que llegue más allá de la segunda rama diagonal del muchacho.
- Usar guía fluoroscópica para avanzar el catéter PCI hasta que llegue a la mitad del muchacho. Elegir el sitio de bloqueo de LAD dependiendo de la anatomía de los coronaries, generalmente después de la segunda, a veces después de la primera rama diagonal (figura 3) para tener porcentajes similares de AAR del ventrículo izquierdo (LV).
Nota: La elección del sitio de bloqueo depende de la longitud de las ramas diagonales y por lo tanto el área de tejido que se provee por la sangre a través de la rama respectiva. En caso de una larga y bifurcada primera rama diagonal el sitio bloqueo será justo después de esto. En el caso de una primera rama diagonal más corta, el bloqueo se realiza después de la segunda diagonal. - Retire la guía y luego aumentar la presión en el dispositivo de inflado a 7-10 bar para inflar el balón del catéter PCI e inducir isquemia miocárdica 1 h. poco a poco aumentar la FiO2 a 50-60% entre 15 y 40 min de isquemia. Mantener volumen corriente a 6-10 mL/kg.
Nota: Este procedimiento reducirá la aparición de extrasístoles y disminuir la frecuencia de las fibrilaciones ventriculares. - Registro de una secuencia de 5-10 s vídeo al inyectar medio de contraste a través del catéter guía con una angiografía del balón del catéter PCI en lugar justo después de comenzar la isquemia; Repita después de 10 min de isquemia para verificar obstrucción completa de la LAD distal al balón del catéter PCI.
- Monitorear los animales estrechamente para detectar inmediatamente y tratar (2.2.10) arritmias cardíacas. Extrasystoles generalmente ocurren y aumento en la frecuencia (> 3 por minuto) entre 20 y 40 min después de la inducción de isquemia miocárdica. Si esto ocurre, Masajee suavemente el cuello a ambos lados justo debajo de la mejilla. En la mayoría de los casos esto será suficiente para restablecer un ritmo cardíaco regular, probablemente por estimulación de los barorreceptores del nervio vago, situado en la arteria carótida común.
- Si arritmias cardiacas progresan en fibrilación ventricular, use un desfibrilador bifásico externo, para volver a establecer un ritmo sinusal. Aplicar 5-10 compresiones usando las teclas de desfibrilador inmediatamente antes de aplicar el golpe para llenar los coronaries con sangre oxigenada y luego del choque con 150 J (para animales de 30 kg).
- Repita si es necesario y aumento de la energía de 175 J después del choque 3rd . Utilice ajustes más altos de energía para los animales más pesados.
- Cinco minutos antes del final del tiempo de isquemia repetir el muestreo de sangre mencionado en 2.1.8-2.1.13. Inyectar la sustancia de ensayo (ya sea el inhibidor FXIIa bicíclica o control de 4 mg/kg, ello esta oculto) por vía intravenosa a través de la línea venosa central y al ras de la línea con solución salina de 20 mL.
- Retirar una muestra de plasma citrato (como se menciona en el 2.1.8 y 2.1.9) 4 min después de la inyección de la sustancia en 2.2.12.
- Realizar una angiografía (2.2.3) para confirmar oclusión chaval, después desinflar el balón del catéter PCI y retire este catéter el catéter guía. Confirmar la perfusión de la LAD distal al sitio de oclusión por angiografía inmediatamente después de la deflación y el retiro del balón del catéter PCI, 10 minutos después, cuando signos de isquemia miocárdica fueron visibles por ECG durante más de 5 minutos e inmediatamente antes la oclusión del muchacho.
- Permite reperfusión del miocardio isquémico por 2 h. Tomar muestras de suero y plasma a los 10, 30, 60 y 115 min de reperfusión (2.1.8 y 2.1.9). Monitor de BGA en el minuto 60 y 115 (2.1.10).
- Vuelva a insertar el catéter PCI junto con el guía a exactamente la misma posición usada para la isquemia. Inflar el balón del catéter PCI como antes y confirmar la oclusión LAD por angiografía (2.2.3). Retire el catéter de presión desde el ventrículo izquierdo y detener la grabación.
- Inyectar 100 mL 2% azul de Evans en fosfato tampón salino (PBS, pH 7,4) en la línea venosa central. Cerca de 30 s más tarde, cuando el animal entero se vuelve azul, inyectar 40 mL 20% KCl a la eutanasia del animal. La muerte fue confirmada por la ausencia de señales de ECG y pulso ondas.
3. técnicas de muestreo
-
Extracción, de disección y toma de muestras el corazón (Figura 4)
- Realizar una esternotomía para exponer el corazón. Seguir el protocolo descrito previamente por Koudstaal y colegas, pasos 8-2 y 8-318. Corte abierto el pericardio y sirviendose de anormalidades, que provienen de anterior pericarditis y excluir al animal de evaluación adicional.
- Desinflar y elimina la PCI, así como el catéter guía. Suprimir el corazón para su posterior análisis. Cortar la vena cava y extraiga la sangre utilizando una bomba de succión, luego corte todos los recipientes grandes que conectan el corazón con el cuerpo.
- Enjuague el corazón dentro y por fuera con temperatura ambiente salino. Pesar el corazón entero.
- Dentro de 30-40 min, corte el corazón en rodajas de unos 3-5 mm desde el ápice a los Chordae tendinae de la válvula mitral, perpendicular al eje largo con un cuchillo afilado.
- Tenga cuidado de colocar siempre el corazón en la misma orientación con la cara ventral hacia arriba con el fin de mantener la orientación de las muestras cortadas (figura 5).
- Fotografiar las rebanadas del corazón usando una réflex digital de lente única.
- Corte del ventrículo derecho (descartar como no necesario). Fotografiar las rebanadas del ventrículo izquierdo y pesan todas las rebanadas para el peso total del ventrículo izquierdo.
- Distinguir entre el azul de Evans positivo y azul de Evans tejido negativo en todas las secciones. Diseccionar los cortes para separar la isquémica (Evans azul negativo) el tejido no isquémica (azul de Evans positivo) con un bisturí.
- En primer lugar analizar las secciones negativo azul de Evans (el área isquémica en riesgo, AAR). Pese a todos ellos y ponerlos todos en un recipiente de plástico.
- Cubrir las láminas con solución de cloruro de 100-150 mL (según el tamaño del corazón) trifenil tetrazolio (TTC, 16 g, dextrano de peso molecular 48000-90000, en 200 mL de PBS, recién preparado de 2 g) para que las piezas de corazón pueden moverse libremente dentro de la solución. Cubra el recipiente e incubar durante 20 min a 37 ° C agitando suavemente.
- Durante este pesaje de tiempo de incubación de 20 minutos el azul de Evans piezas positivas (área no peligra, ANR), tomar muestras para inclusión de tejidos-Tek (elegir la parte más distal de la lesión) y almacenar a-80 ° C para su posterior análisis. Transferir el resto en solución de formaldehído 4% y almacenar a temperatura ambiente para las secciones de la histología.
- Retire las piezas de la AAR de la solución TTC. El tejido manchado rojo es tejido isquémico viable (VIT) y el tejido manchado no es tejido isquémico necrótico (NIT). Corte 2 piezas pequeñas (bloques de 2-3 mm) de tanto el NIT y VIT, incrustarlos en tejido - Tek y almacenar a-80 ° C para su posterior análisis. Estas muestras deben tener el mismo peso.
- Fijar el resto de las piezas (todos los sectores derivados de la AAR) los clavos hacia abajo en un envase de espuma de poliestireno y cubriendo completamente con solución de formaldehído 4% durante 24 h a temperatura ambiente en una campana de humos. Las piezas deben permanecer planas para la documentación fotográfica en el paso siguiente.
- Al día siguiente la fotografía ambos lados de las piezas con una cámara de alta resolución con la misma configuración de zoom y la distancia del tejido (ampliación de la misma). Agregar barras de escala automática a todas las imágenes. Todas las barras deben tener la misma longitud.
Nota: La cámara de alta resolución debe conectarse al software que agrega automáticamente la barra de escala a cada foto.
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Cálculo de la AAR y el tamaño del infarto
- AAR % de ventrículo izquierdo = (peso de AAR en g / peso del ventrículo izquierdo en g) * 100.
- Utilizar software ImageJ para calcular la superficie total del AAR y NIT (ambos lados de cada pieza) basado en las fotografías.
- Ajuste la barra de escala seleccionando la longitud de la barra de escala utilizando la línea recta de la herramienta ángulo. Seleccione en el menú Analyze > Set escala e inserte la unidad de la barra de escala y distancia conocida. Elige "global" para que la misma escala se aplicará a todas las imágenes.
- Marcar zona de toda la superficie del tejido con la herramienta de selección libre para calcular el AAR. Tenga cuidado de no incluir el lado (altura) de los tejidos y el tejido adiposo (Figura 6 C).
- Configurar la medida eligiendo "área" y "Mostrar la etiqueta" de analizar > menú establecer mediciones. Medir el área de análisis > medida.
- Repita el paso 3.2.5 a medida NIT (marca sólo el tejido no manchados). Nota: No incluye el tejido graso (Figura 6-D) en el cálculo de NIT. Repita el paso al otro lado del tejido.
- Calcule la media AAR y NIT de cada tejido.
- Utilizar los valores obtenidos de 3.2.7 para calcular el NIT como porcentaje de la NIT de AAR de AAR:% = (Σ promedio superficie de NIT en cm2/ Σ promedio superficie de AAR en cm2) * 100.
- Dos investigadores diferentes deben repetir el método anterior. El margen aceptable de diferencia es < 10%.
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Marcadores de isquemia
- Utilizar las muestras de plasma EDTA, que han sido previamente almacenadas a-80 ° C (2.1.9) para medir el nivel de la troponina cardiaca-usando un análisis de tipo Luminex de plex solo como se ha descrito 19.
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Representative Results
Un animal murió prematuramente antes de la administración del péptido inhibidor o control FXIIa debido a un error técnico (caída repentina de la presión arterial durante el tiempo de isquemia, antes de la adición de la sustancia de ensayo). Un animal fue excluido del grupo de inhibidor FXIIa porque ninguna lesión de isquemia/reperfusión se observó debido a la anatomía anormal de la arteria descendente anterior izquierda (CHAVAL). Una gran parte del ventrículo izquierdo, incluyendo el ápice, fue inundada por la arteria circunfleja en este animal. Los animales incluidos en el análisis final fueron n = 2 en el grupo de inhibidores de péptido FXIIa bicíclicos (: peso de 27,5 ± 2,5 kg) y n = 3 recibir un péptido inactivo control bicíclicos (: peso de 29 ± 0,8 kg).
Radiografía proyección de imagen de video / angiografía coronaria del corazón del cerdo se utiliza para visualizar la posición de la sonda de presión y decidir bloquear al muchacho (Figura 3A). Figura 3B muestra la posición del catéter, bloqueando el flujo sanguíneo distal a la segunda rama diagonal. Comparación de la Figura 3A y 3B también permite una valoración de que parte del miocardio LAD suministrada será isquémica. Al final del período de reperfusión 2 h catéter PCI es reintroducido e inflado en la misma posición, como lo fue durante la isquemia. Azul de Evans luego se inyecta por vía intravenosa para determinar con precisión el AAR (figura 5A). Después de la supresión del corazón, el ventrículo izquierdo se corta en secciones gruesas de 3-5 mm desde el ápice hasta la válvula mitral, perpendicular al eje largo. AAR y ANR están claramente demarcados por azul de Evans, manchas en las láminas. Áreas de muestreo AAR y ANR se muestran en la figura 5B.
El AAR, expresado como porcentaje del LV, no muestra diferencias estadísticamente significativas entre el grupo de FXIIa tratado y el grupo control (figura 6A). El tamaño del infarto (NIT/AAR) muestra o bien no hay diferencias entre los grupos (utilizando Mann-Whitney no paramétrica de la prueba, p > 0.05, Figura 6B). Estos datos sugieren que inhibidor FXIIa solo, en la concentración utilizada y duración de la aplicación, no podría proteger el corazón de miocardio I / lesiones R. Figura 6 y 6 D se muestra cómo marcar las fronteras de AAR y NIT para medir exactamente y reproducible las superficies respectivas.
La estrategia de muestreo de sangre permite la liberación del músculo cardiaco daño marcador troponina-I que se monitorea con el tiempo. No hay casi ninguna diferencia después de una hora de isquemia con la línea de fondo mientras después de la reperfusión hay es un aumento continuo en el tiempo como se muestra en la figura 7. Para la troponina-I, las diferencias entre los grupos también no fueron significativas en estos experimentos.
Figura 1 . Resumen de la cronología experimental. Cronología esquemática de los pasos importantes en el modelo de la lesión de isquemia/reperfusión miocárdica. Visualización coronaria basal, a partir de tiempo de la isquemia, monitoreo de arritmias cardíacas e inyección de la sustancia son pasos importantes en el experimento. El uso del tiempo exacto en todos los experimentos garantiza la reproducibilidad. Euthanizing el animal y la supresión del corazón debe hacerse dentro de 15-20 min después de la terminación de la fase de reperfusión de 2h. KCl: cloruro de potasio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Línea de tiempo de análisis y muestreo de sangre. Momentos para tomar muestras de sangre se indican tipo de anticoagulante utilizado. Muestras adicionales pueden tomarse según el experimento y los analitos que se medirá. ACT: activa la coagulación de la época, BGA: sangre gasometría, RT: temperatura ambiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . La angiografía coronaria. Vista fluoroscópica de la izquierda coronaries en condiciones basales, las flechas amarillas señalan la primera y las segunda diagonales ramas, la flecha blanca señala el ápice del corazón (B) el muchacho ocluido que muestra el área de ningún flujo del ventrículo izquierdo (LV), la flecha roja señala a la PC Te catéter (C) cierre del muchacho en el extremo de la reperfusión con el globo del catéter PCI insertado nuevamente al mismo sitio en el muchacho como durante la isquemia. CX: arteria coronaria circunfleja, chaval: arteria coronaria descendente anterior, MC a la izquierda: catéter Millar, insertado en el ventrículo izquierdo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Gráfico esquemático de toma de muestras de tejido. Momento exacto de disección de corazón y muestreo de las diferentes áreas para su posterior análisis. La línea de tiempo comienza a 205 min comienzo de isquemia, 20 minutos después de la terminación del experimento animal. Es importante incubar las secciones de tejido de TTC en un plazo máximo de 40 minutos después euthanizing el animal. Muestreo de la ANR, VIT y NIT está indicado como blancos. Incubando el AAR en formol 4% permite una distinción clara entre Liendre y VIT para la determinación exacta del tamaño del infarto. AAR: zona en riesgo, ANR: zona de no riesgo, LV: ventrículo izquierdo, NIT: tejido isquémico necrótico, OTC: tejido-Tek, RV: ventrículo derecho, TTC: cloruro de trifenil tetrazolio, VIT: tejido isquémico viable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . In situ la diferenciación entre área en riesgo (AAR) y no en riesgo ANR. (A) cuadro representante del corazón entero justo después de sternotomy al final del experimento. (B) representación imagen muestra 3-5 mm rebanadas gruesas ventrículo izquierdo después de la disección. AAR y ANR están claramente definidas, indica con flechas amarillas, y la flecha blanca muestra el área de muestreo de la ANR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 . Tamaño de isquemia e infarto. (A) el peso del porcentaje de AAR del ventrículo izquierdo (LV). (B) el porcentaje de superficie de la NIT de la AAR. Cuadro representativo de (C) un AAR del cálculo de la. (D) un cuadro representativo del cálculo del NIT. La flecha blanca muestra el área de muestreo de VIT y la flecha negra muestra el área de muestreo de NIT. Los datos fueron calculados utilizando el software ImageJ. Los valores se muestran como puntos para cada experimentan con indicación de ±± media SD., testigo, n = 3 y el grupo de tratamiento inhibidor FXIIa, n = 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 . Marcador de daño del músculo cardiaco. Troponina cardiaca-I concentración con el tiempo en pg/ml del control y del inhibidor FXIIa tratados grupo. Se extrajo sangre de la vena yugular en tubos de plasma con EDTA al inicio, final de la isquemia y varios puntos del tiempo durante la reperfusión y cardíaca de la troponina-I estaba medido por matriz de suspensión single-plex (Bio-Plex). Datos se muestran como puntos para cada experimentan con indicación de ±± media SD., testigo, n = 3 y grupo FXIIa tratada, n = 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Del miocardio lesiones R tiene un efecto significativo en el tamaño final del infarto que se traduce directamente en el pronóstico del paciente después de infarto agudo de miocardio3. Comprensión de la fisiopatología del miocardio lesiones de R es el primer paso para reducir o evitar. Del miocardio I / R es una condición aguda que se produce directamente después de la reperfusión de los recipientes ocluidos. I R lesión conduce a la activación de la respuesta inmune innata y el daño celular se produce en el sitio de reperfusión y los tejidos circundantes20. Un estudio reciente demostró una mejora en el resultado neurológico en un modelo de cerebro de ratas I / lesiones R tratamiento de inhibidor FXIIa8. Sin embargo, en el presente estudio piloto encontramos ningún efecto del inhibidor FXIIa bicíclica en miocardio I / lesiones R. El inhibidor FXIIa usado es novela y aún no se conocen su farmacocinética en cerdos. Por lo tanto, la observada falta de efecto ocasionada por un inadecuado de dosificación o aplicación. Esto debe ser abordado en estudios de seguimiento.
Estandarización de un modelo animal es esencial para investigar en profundidad la fisiopatología del miocardio I / lesiones R y soluciones adecuadas en clínicas. Investigación de la fisiopatología del miocardio lesiones R requiere buena y representativo muestreo para estudiar los mecanismos celulares subyacentes. El pecho cerrado porcino del miocardio modelo de lesión R proporciona un método reproducible, que es cerca de la situación clínica y útil para ayudar a la comprensión de los mecanismos celulares y prueba terapéutica nueva novela. Variantes del actual modelo se han descrito antes para los mencionan fines14,17,18.
Nuestro protocolo de infarto agudo de miocardio en cerdos no necesita tratamiento previo con amiodarona descrita18,21. Utilizamos el masaje del seno carotídeo para reducir las arritmias cardíacas y un desfibrilador bifásico para cardioconversion en caso de fibrilación ventricular. El uso del masaje del seno carotídeo se conoce clínicamente para influir en la fibrilación auricular22, pero hasta ahora no se ha demostrado para prevenir o retrasar la aparición de fibrilación ventricular en MI, en los seres humanos o en modelos de cerdo. Por otra parte, el uso de sevoflurano ayuda a reducir las arritmias ventriculares así como la tasa de mortalidad en el modelo porcino de infarto agudo de miocardio23.
Para asegurar reproducibilidad y reducir el riesgo de trombosis durante el experimento, se inyectaron dosis múltiples de heparina basado en la medición repetida de la ley, en lugar de usar fija la dosis de heparina según lo descrito por ejemplo por Koudstaal et al18. Una cantidad controlada de administración de heparina ayuda a investigar la cascada de la coagulación en el contexto de I / lesiones R. Azul de Evans permite la determinación exacta de AAR/LV. La inyección intravenosa del azul de Evans después de la oclusión del muchacho en el lugar exacto durante la inducción de isquemia bajo guía fluoroscópica conduce a la coloración azul del cerdo entero incluyendo la parte no isquémica del corazón con efecto mínimo en la ANR miocardio y vasculatura. Evans Blue es una conocida sustancia citotóxica24. En los experimentos actuales fue crucial para mantener la viabilidad de la capa de células endoteliales en la ANR en la vasculatura de corazón para uso como un individuo intra control así 100 mL azul de Evans se inyecta sistémicamente y diluido con la reducción de sangre su toxicidad. Previamente, en un entorno similar, 50 ml 2% azul de Evans se inyecta directamente en los coronaries aumenta el riesgo de su citotoxicidad a cardiaco las células25. El siguiente paso importante fue disecar el corazón directamente en rodajas de 3 a 5 mm desde el ápice hasta la válvula mitral (la posición exacta de cada animal) y el uso de este método para hacer un cálculo exacto de la AAR como un porcentaje del ventrículo izquierdo.
La descripción actual del método proporciona detalles que anteriormente no se han descrito. TTC manchado sección en formaldehído al 4% durante 24 horas de incubación proporciona una clara distinción entre viable (rojo) y tejido necrótico del (blanco), que finalmente aumenta la reproducibilidad de la toma de muestras para tinción más molecular. La estrategia de muestreo de sangre más 2 h de la reperfusión permite la detección de moléculas recién expresadas en las primeras etapas (10 y 30 min) de la reperfusión, así como más tarde (60 y 120 min). La correcta toma de muestras de tejido y de almacenamiento son también cruciales para el análisis de marcadores de la cascada de plasma como la expresión de proteínas de complemento y coagulación.
El protocolo actual puede ser modificado para tener un tiempo de reperfusión, desde unas horas a días. Esto permite que el investigador investigar las consecuencias posteriores de I / lesiones de R en el corazón y también permite la prueba de nuevos medicamentos y evaluación de sus efectos. La limitación del protocolo actual es el uso de un catéter con punta de presión para la medición de la función cardíaca. Pueden obtenerse datos más fiables sobre la función cardiaca mediante el uso de un sistema de medición del bucle de presión volumen. En resumen el método actual proporciona detallados pasos importantes para incrementar la reproducibilidad del pecho cerrado porcino del miocardio es modelo de la lesión de R cuando el uso del modelo estudiar los cambios celulares y moleculares en el contexto de estudio del miocardio I / Fisiopatología de lesiones R o estudiar nuevas opciones terapéuticas.
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Disclosures
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer el Profesor Christian Heinis el inhibidor FXIIa y el control respectivo. También agradecemos Olgica Beslac, Dr. Daniel Mettler y Kay Nettelbeck de la unidad de Cirugía Experimental, Departamento de investigaciones biomédicas, Universidad de Berna para el soporte técnico. Celine Guillod y Matthias Rausch del Departamento de diagnóstico, intervencional y radiología pediátrica, Hospital Universitario de Berna, Inselspital prestó apoyo con el equipo de rayos x y técnicas. Este proyecto fue financiado por la Swiss National Science Foundation, proyecto Nº 320030_156193. También nos gustaría dar las gracias a Sr. Reto Haenni de comunicación y marketing, Hospital Universitario de Berna, Inselspital para nuestro experimento de grabación de video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABL 90 Flex, blood gas analyser | Radiometer | - | Blood gas analysis (BGA) |
| ACT Plus | Medtronic | - | Activated clotting time |
| Atropin | Sintetica | - | Atropinum Sulfas, 0,5mg/ml |
| Balance (20-500 Kg) | NAGATA Scale, Tiwan | HTB/HTR | Alternative products can be used |
| Balance (21-4200 g) | Mettler toledo, Switzerland | MS4002SDR | Alternative products can be used |
| Blood collection tubes: EDTA, citrate and serum | S-Monovette, Nuembrecht, Germany | 05.1167.001, 05.1071.001 and 05.1557.001 respectively |
Alternative products can be used |
| BV Pulsera mobile C-arm | Philips | - | Alternative products can be used |
| Centrifuge | Labcare, UK | ALC PK120R | Alternative products can be used |
| Defibrillator Lifepak 12 | Medtronic | - | Alternative products can be used |
| Dextran from Leuconostoc mesenteroides | Sigma-Aldrich, Germany | D3759 | Average M.wt 48000-90000 |
| Digital single lens reflex camera | Sony, Thailand | DSLR-A500/A550 | Alternative products can be used |
| Dissecting forceps | Alternative products can be used | ||
| EMPIRA RX PCI dilatation catheter | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 85R15300S | Diameter 3 mm, length 15 mm, Alternative products can be used |
| EMPIRA RX PCI dilatation catheter | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 85R15350S | Diameter 3.5 mm, length 15 mm, Alternative products can be used |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich, Germany | E2129 | Toxic |
| Fabius GS premium respirator | Dräger, Lübeck, Germany | - | Anesthesia work station, Alternative products can be used |
| Fentanyl | Inselspital ISPI | - | Fentanyl 2500mcg/50ml |
| Formaldehyde | Pathology Institute, Bern University | SI148701 | Alternative products can be used |
| FXIIa inhibitor | Provided by Prof. Christian Heinis' laboratory in EPFL | Novel bicyclic peptide | |
| Galeo, coronary guidewire | Biotronik, Germany | 125497 | Alternative products can be used |
| Guidance catheter | Boston Scientific, Florida, USA | 34356-06 | 6F (100 cm, EB3.75). Alternative products can be used |
| Heparin Sodium | Drossapharm, Basel, Switzerland | - | Liquemin, 25000 U.I./5 ml |
| High end electrosurgery | BOWA, Germany | ARC 400 | Electrical source for blood suction. Alternative products can be used |
| Hydro-Guardmini breathing filter | Intersurgical, Lithuania | 1745000 | Filters |
| Image J | National Institute of Health, USA | 1.47v | Alternative products can be used |
| Inflation device, Atrion QL2530 | Atrion medical product, Alabama, USA | 96402 | Alternative products can be used |
| IntelliVue MP 70 | Philips, Boeblingen, Germany | - | Monitor (ECG, heart rate, blood presure and body temperature). Alternative products can be used |
| KCl | Sintetica SA | - | Potassium chloride 15% |
| Ketamine | Vetoquinol | - | Narketan, 1ml/100mg |
| LR-ACT | Medtronic | 402-01 | ACT special syringes |
| Midazolam | Roche | - | Dormicum, 5mg/ml |
| Monopolar scalpel | Alternative products can be used | ||
| Needle holder | Alternative products can be used | ||
| High resolution camera, PathStand Macro Imaging Stand for Grossing | Spotimaging, USA | 1080 p HD resolution. Alternative products can be used | |
| PBS | In-house preparation | - | Alternative products can be used |
| Peripheral venous cannula, 18 G | Alternative products can be used | ||
| PowerLab 4/35 data acquisition system | Adinstruments, Spechbach, Germany | - | |
| Rotamax120T | Heidolph, Germany | 544-41200-00 | Shaker. Alternative can be used |
| Rüschelit-Super Safety Clear Tube | Teleflex, Dublin, Irland | 112480 | Air way tubing, Alternative products can be used |
| Safe Pico Aspirator Syringes | Radiometer | 956-622 | BGA special syringes |
| Saline | Sintetica Bioren | - | NaCl 0,9%. Alternative products can be used |
| Sevorane 1.5% | AbbVie AG | - | Sevorane 250ml 100% |
| Sheath | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 504-607 A | AVANTI + / 7 F, Alternative products can be used |
| Space infusion pump | B.Braun Medical AG, Germany | - | For infusion of fentanyl. Alternative products can be used |
| SPR-350 (Millar catheter) | Adinstruments, Texas, USA | 840-8166 | MIKRO-TIP, 5F, 120 cm |
| Sternotomy saw | Alternative products can be used | ||
| Sutures | ETHICON, Johnson&Johnson, USA | Y3110H | Monocryl 3-0 SH-1 Plus. Alternative products can be used |
| Syringes (20, 10 and 5 mL) | CODAN,Baar, Switzerland | 62.7602, 62.6616, 62.5607 respectively |
Used to inject anesthetic materials intramuscularly or directly into the central venous line. Also to inject heparin or FXIIa or the respective control. Alternative products can be used |
| Thorax spreader | Alternative products can be used | ||
| Tissue-tek | SAKURA, Netherlands | 4583 | O.C.T. compound |
| Vascular forceps | Alternative products can be used | ||
| Xenetix 300 contrast media | Guerbet, Zürich, Switzerland | - | Lobitridol, 300 mg iodide/ml |
| Xylazine | Vetoquinol | - | Xylapan, 20mg/1 mL |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium choride | Sigma-Aldrich, Austria | T8877 | |
| 500 μL tubes (eppendorf) | Trefflab, Switzerland | 96.08185.9.03 | Alternative products can be used |
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