Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Verbetering van een gesloten borst varkens myocardiaal infarct Model door standaardisatie van weefsel en bloed bemonsteringsprocedures

doi: 10.3791/56856 Published: March 12, 2018

Summary

Hier tonen we een protocol om te standaardiseren bemonsteringsprocedures van een gevestigde varkens model van acuut myocardinfarct teneinde haar translationeel waarde in de kennis van de pathofysiologie van myocardiale ischemie/reperfusie letsel en het testen van nieuwe drugkandidaten.

Abstract

Myocardiale ischemie-reperfusie (Ik / R) schade draagt bij tot bijna de helft van het necrotische gebied na een myocardinfarct. Tot op heden er geen goedgekeurde drug is te voorkomen of beperken myocardiale ik / R letsel. De studie en begrip van de pathofysiologische mechanismen van myocardiale ik / R letsel is essentieel voor het ontwikkelen van succesvolle behandelingen. Grote dierproeven zijn een belangrijke stap in translationeel methoden. De varkens model van acuut myocardinfarct is vastgesteld en beschreven door onszelf en anderen. We gericht aan verdere verbetering van de waarde van het model door de nadruk in detail op de sampling technieken voor gebruik in toekomstige experimenten. Bovendien benadrukken wij kleine maar belangrijke stappen die kunnen invloed hebben op de kwaliteit van het eindresultaat. Om na te bootsen de klinische situatie van myocardiale ik / R letsel, een katheter percutane coronaire interventie (PCI) werd ingevoegd in de linker anterior aflopende coronaire (LAD) van een narcose varken. ° ° ° Dit model nabootsers acuut myocardinfarct en PCI behandeling bij mensen met de mogelijkheid voor het nauwkeurig bepalen van het gebied op risico en het necrotische- en levensvatbare ischemische weefsel. Hier werd het model gebruikt voor het onderzoeken van het effect van een bicyclische peptide inhibitor van FXIIa. Het model kan ook worden gewijzigd zodat de langere reperfusie tijden later effecten van myocardinfarct te bestuderen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ischemische hartziekte, in het bijzonder acuut myocardinfarct (MI), is de belangrijkste doodsoorzaak in de ontwikkelde landen 1. Vandaag is de standaardbehandeling voor MI percutane coronaire interventie (PCI), de ballon katheter behandeling. Een van de cruciale factoren die invloed op de kwaliteit van het leven en de prognose van patiënten na een acute MI PCI-behandeld is de grootte van het infarct. De vermindering van de grootte kan een grote impact hebben op de patiënt overleving en prognose 2. Myocardiale ischemie/reperfusie (Ik / R) letsel heeft een belangrijke invloed op de grootte van het infarct dus een van de hoofddoelstellingen in cardiovasculair onderzoek is te voorkomen of beperken myocardiale ik / R schade 3. De precieze mechanismen van I / R schade zijn nog steeds onder onderzoek 4. Activering van de plasma cascades en endotheliale cellen zijn kenmerken van I / R letsel 5. Activering van de stolling systeem is duidelijk betrokken 6,7. Onlangs, de rol van FXII, als een vroege upstream peptide die betrokken zijn bij contact fase activering van de stolling cascade, is aangetoond in een FXII knock-out rat model van cerebrale ik / R letsel 8. Validatie van deze resultaten in een varkens model is een belangrijke stap in klinische vertaling. Daarom testen we een nieuwe bicyclische (80 kDa) FXIIa proteaseinhibitor in het kader van myocardiale ik / R letsel in een pilot-studie.

Dierlijke modellen, die de klinische situatie van acute MI en PCI behandelingen na te bootsen, zijn essentieel voor het verbeteren van onze kennis van de pathofysiologie van myocardiale ik / R letsel en het testen van nieuwe behandelmogelijkheden. Varkens vertegenwoordigen een goede diermodel voor klinische myocardiale ik / R letsel. Dit is niet alleen omdat hun harten zeer vergelijkbaar met menselijke harten met betrekking tot de anatomie en de coronaire circulatie zijn, maar ze ook soortgelijke pathofysiologische reacties op myocardiale ischemie en reperfusie 9,10 tonen. Andere modellen zoals ratten en muizen niet voldoen aan deze criteria en tonen aanzienlijke verschillen in vergelijking met menselijke harten 11,12, overwegende dat honden bijvoorbeeld veel meer collateral coronaire bloedvaten ten opzichte van de mens hebben 13.

Het model van de varkens acuut myocardinfarct is wijd verbeid gebruikt bij cardiovasculair onderzoek te onderzoeken ischemische hartziekte met inbegrip van myocardiale ik / R letsel 14,15,16,17. Dit laatste is een inflammatoire aandoening, vanwege die minimaliseren de ontstekingsreactie met sternotomy of Thoracotomie gebruikt in open-borst chirurgie is van essentieel belang. Het model van de gesloten borst met behulp van een klinische setting van de C-arm angiografie ondervangt dit probleem. Bovendien is een van de belangrijkste punten dat onze protocol een nauwkeurig onderscheid tussen ischemische (gebied in gevaar, AAR) en niet-ischemische gebieden van het linkerventrikel (gebied niet in gevaar, ANR), voorziet zodat de grootte van het infarct (necrotisch ischemische weefsel, NIT) worden nauwkeurig bepaald. Ons doel voor dit document is om duidelijk te definiëren een reproduceerbare methodologie van een varkens myocardiale ik / R letsel model, in het bijzonder met betrekking tot bemonstering myocardiale weefsel, die zal voorzien in een nauwkeuriger analyse van de moleculaire mechanismen van I / R letsel en een duidelijker beeld van de gevolgen van nieuwe drug behandelingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. dieren:

Alle dieren waren behandeld volgens de richtlijnen van de Zwitserse nationale wetgevingen. De studie werd goedgekeurd door het Comité van de lokale dierlijke proefneming van het kanton Bern (toestemming geen. WORDEN VAN 25/16).

Gebruik van de grote witte varkens van beide geslachten (~ 30 ± 5 kg). De dieren blindelings te verdelen in twee groepen, één groep ontvangen een bicyclische (80 kDa) proteaseinhibitor van FXIIa of behandeling van keuze en de andere een inactief besturingselement.

2. de chirurgische ingreep (Figuur 1)

  1. Narcose en voorbereiding van het dier:
    1. Snel de dieren gedurende 12 uur vóór het begin van het experiment.
    2. Vooraf genezen het dier met 20 mg/kg Ketamine en 2 mg/kg Xylazine via een intramusculaire injectie in de nek, met behulp van een 10 mL spuit. Het opnemen van het dier gewicht en geslacht.
    3. Induceren verdoving door het injecteren van 0,5 mg/kg Midazolam en 0,05 mg/kg Atropin in de auricular ader. Intubate van het dier met een endotracheale buis.
    4. Handhaven van de narcose door mechanische ventilatie met een gasmasker (O2/air 1:3, Sevorane 1,5%), een 7-8 mm airway buis en een filter. De Fractie van geïnspireerd zuurstof (FiO2) aan te passen aan de 35% en de ademhalingsvolume tot 6-10 mL/kg.
    5. Diepte van de verdoving wordt in afwezigheid van motorische of autonome reacties op de neus knijpen als voldoende beoordeeld. Ooglidreflex reflexen en kaak Toon werden bewaakt continu ook gericht op de ontspannen kaak Toon en gebrek aan ooglidreflex reflexen. Kerntemperatuur werd voortdurend bewaakt en onderhoud van normothermia (38-38.5 ° C) was verzekerd met passieve opwarming van de aarde (isoleren dekens en warme flessen).
    6. Ontleden gratis, zoals eerder beschreven door Koudstaal en zijn collega's stappen 3-1 tot 3-318, de halsslagaderen aan beide zijden en cannulate hen met een 7F schede. Cannulate de linker halsslagader met een 7F etui voor veneuze bloedmonsters.
    7. Een dosis van de bolus van 250 µg Fentanyl pijnstiller via de Centraal veneuze lijn gevolgd door 250 µg/h als een continue intraveneuze infusie met behulp van een infusiepomp beheren. Monitor lichaamstemperatuur, hartslag en ritme met een 3-aderige elektrocardiogram (ECG), arteriële en Centraal veneuze druk tijdens het hele experiment.
    8. Met behulp van standaard bloed collectie buizen, trekken de volgende bloedmonsters van de basislijn van de veneuze lijn: 5 mL citrated plasma en 2.9 mL EDTA-plasma in de respectieve buizen. Centrifugeer onmiddellijk bij 2.000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C. 2.9 mL bloed rekening een serum buis en laat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te stollen voordat het centrifugeren zoals hierboven beschreven.
    9. Aliquot 200 µL van plasma of serum in 500 µL buizen en opslaan van alle monsters bij-80 ° C voor verdere analyse.
    10. 0,5 mL bloed trekken uit het arteriële lijn met behulp van dat de speciale bloed gas-analyse (BGA) spuiten voor het meten van BGA met behulp van het BGA-machine volgens de instructies van de fabrikant.
    11. 0,5 mL bloed trekken uit de veneuze lijn met behulp van een standaard 2 mL spuit en onmiddellijk in de ACT-cartridge met behulp van een naald 30 G overbrengen. Plaats de gevulde cartridge in de ACT-machine om bloedstolling tijd volgens de instructies van de fabrikant te meten. Zie Figuur 2 voor de tijdstippen.
    12. Beheren van 5000 IU unfractionated heparine in de veneuze lijn met behulp van een injectiespuit 2 mL en laat het dier te stabiliseren voor 20 min voordat de MI-experiment.
    13. Monitor handelen elk 30-45 min, zoals vermeld in 2.1.11. Injecteren 2500 unfractionated IU heparine intraveneus als ACT < 180 s is.
  2. Myocardinfarct experiment
    1. Gebruik een standaard C arm fluoroscopie apparatuur (Coronaire Angiografie programma, hoek 0°, 12 frames per seconde, ~ 70 kV) - of als alternatief een toegewijde angiografie systeem - voor het uitvoeren van de coronaire interventie.
    2. Fluoroscopic begeleiding invoegen via een katheter druk (5F, 120 cm) via de eerder geplaatste schede in de linker halsslagader. Verder het in het linkerventrikel. De katheter druk verbinden met een acquisitie-systeem om vast te leggen links ventriculaire druk. De acquisitie-systeem moet continu berekenen en registreren van de hartslag, ontwikkelde druk, dP/dt maximale (contractility van de linkerventrikel) en dP/dt minimale (versoepeling van de linkerventrikel) tijdens het hele experiment. Record basislijnwaarden gedurende 10 minuten.
    3. Invoegen van een 6F (100 cm, EB3.75) leidend katheter via de eerder geplaatste schede in de rechts halsslagader. Ging het naar de linker kransslagader te bereiken van de linker anterior aflopende coronaire (LAD) onder leiding van X-ray. Injecteren contrast medium gebruik een 20 mL spuit via de leidende katheter uit te voeren een basislijn Coronaire Angiografie.
      Opmerking: Injectie van contrast medium werd gedaan door manuele druk maar een toegewijde power injector systeem kan ook worden gebruikt.
    4. Beoordelen van de grootte van de LAD op de X-ray-monitor te selecteren van de juiste grootte van de katheter percutane coronaire interventie (PCI). PCI ballonnen gebruiken met een lengte van 15-25 mm en diameter tussen 2 en 3.5 mm, afhankelijk van de grootte van de LAD. Monteer PCI katheter en coronaire guidewire (F 014/J, 175 cm). Sluit de PCI-katheter met het apparaat van de inflatie vooraf gevuld met contrast medium.
      Opmerking: De diameter van de LAD kan direct op een geijkte monitor met behulp van een liniaal worden gemeten en de grootte van de PCI-ballon vervolgens dienovereenkomstig is geselecteerd.
    5. De geassembleerde systeem van 2.2.4 invoegen in het lumen van de leidende katheter. Verder de guidewire in de LAD totdat het reikt verder dan de tweede diagonale tak van de LAD.
    6. Gebruikt u fluoroscopic begeleiding om de katheter PCI totdat het over het midden van de LAD heeft bereikt. Kies de LAD-blokkeren site afhankelijk van de anatomie van de kransslagaders, meestal na de tweede, soms na de eerste diagonale tak (Figuur 3) om soortgelijke percentages van de AAR van de linker ventrikel (LV).
      Opmerking: De keuze van de blokkerende site is afhankelijk van de lengte van de diagonale takken en daarmee het gebied van weefsel die wordt geleverd door bloed via de respectieve tak. In het geval van een lange zullen gespleten eerste diagonale tak de blokkerende site net na dit. In het geval van een kortere eerste diagonale tak, de blokkering gebeurt na de tweede diagonaal.
    7. Verwijder de guidewire en vervolgens verhogen de druk in het apparaat van de inflatie naar 7-10 bar opblazen van de ballon van de katheter PCI te induceren myocardiale ischemie voor 1 h. Verhoog geleidelijk de FiO-2 tot 50-60% tussen 15 en 40 min van ischemie. Houd ademhalingsvolume op 6-10 mL/kg.
      Opmerking: Deze procedure zullen verminderen het optreden van extrasystoles en verminderen van de frequentie van ventricular fibrillations.
    8. Record een 5-10 s videofragment terwijl het injecteren van contrast medium via de leidende katheter te hebben een angiogram van de ballon van de katheter PCI in plaats net na het starten van ischemie; Herhaal na 10 min van ischemie om te controleren of de volledige occlusie van de aan de ballon van de katheter PCI distale LAD.
    9. Controleren van het dier nauw te onmiddellijk sporen en te behandelen (2.2.10) hartritmestoornissen. Extrasystoles meestal optreden en toenemen in frequentie (> 3 per min) tussen 20 en 40 min na inductie van myocardiale ischemie. Als dit gebeurt, zachtjes masseren de nek aan beide zijden net onder de Wang. In de meeste gevallen zal dit volstaan om te herstellen een regelmatige hartslag, waarschijnlijk door stimulatie van de vagale zenuwen caroticus gelegen aan de gemeenschappelijke halsslagader.
    10. Als hartritmestoornissen vooruitgang in ventrikelfibrilleren, gebruikt u een externe, tweefase defibrillator te herstellen een sinus ritme. 5-10 hartmassages met behulp van de defibrillator pads onmiddellijk alvorens de schok om te vullen de kransslagaders met zuurstofrijk bloed en vervolgens schok met 150 J (voor 30 kg dieren) van toepassing.
    11. Herhaal indien nodig en verhoging van de energie tot 175 J na de schok 3rd . Hogere energie-instellingen gebruiken voor zwaardere dieren.
    12. Vijf minuten voor het einde van de ischemie tijd Herhaal de bloedmonsters vermeld in 2.1.8-2.1.13. Injecteren van de teststof (de bicyclische FXIIa-remmer of controle van 4 mg/kg, doen dit dit blindelings) intraveneus via het centraal veneuze lijn en flush de regel met 20 mL zoutoplossing.
    13. Trekken van een plasma citraat monster (zoals vermeld in 2.1.8 en 2.1.9) 4 min na het injecteren van de stof in 2.2.12.
    14. Het uitvoeren van een angiogram (2.2.3) om te bevestigen LAD occlusie, dan het leeglopen van de ballon van de katheter PCI en het verwijderen van deze katheter uit de leidende katheter. Perfusie van het distale naar de site van de occlusie LAD bevestigen door angiogram onmiddellijk na deflatie en verwijdering van de ballon van de katheter PCI, 10 min daarna, wanneer tekenen van myocardiale ischemie zichtbaar door ECG voor meer dan 5 min, en onmiddellijk vóór waren opnieuw occlusie van de LAD.
    15. Toestaan reperfusie van het ischemische myocardium gedurende 2 uur. Plasma en serum monsters nemen op 10, 30, 60 en 115 min van reperfusie (2.1.8 en 2.1.9). Monitor BGA op 60 en 115 min (2.1.10).
    16. Plaats de PCI-katheter samen met de guidewire naar precies dezelfde positie als gebruikt voor de ischemie. Opblazen van de ballon van de katheter PCI als vóór en bevestig LAD occlusie met angiogram (2.2.3). Verwijderen van de katheter druk uit het linkerventrikel en stop de opname.
    17. Injecteren van 100 mL 2% blauw Evans in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7.4) in het centraal veneuze lijn. Ongeveer 30 s later, wanneer het hele dier blauw, injecteren 40 mL 20% KCl te euthanaseren van het dier. Dood werd bevestigd door het ontbreken van de ECG-signalen en pulse golven.

3. de bemonsteringstechnieken

  1. Uitpakken, ontleden en bemonstering van het hart (figuur 4)
    1. Het uitvoeren van een sternotomy om het hart bloot te stellen. Volg het eerder beschreven door Koudstaal en collega's, stappen 8-2 en 8-318-protocol. Opengesneden het hartzakje terwijl inspecteren op afwijkingen, die zou kunnen voortvloeien uit eerdere pericarditis, en het dier uitsluiten van verdere evaluatie.
    2. Laten leeglopen en verwijder de PCI evenals de leidende katheter. Accijnzen het hart voor verdere analyse. Snij de vena cava en verwijder van bloed met behulp van een afzuigpomp, dan snijden van alle grote schepen die het hart met het lichaam aansluiten.
    3. Spoel het hart binnen en buiten met kamertemperatuur zoutoplossing. Weeg het hele hart.
    4. Binnen 30-40 min, snijd het hart in plakjes van ongeveer 3-5 mm van de top tot de Chordae tendinae van de mitralisklep, loodrecht op de lengteas met behulp van een scherp mes.
    5. Wees voorzichtig om altijd het hart in dezelfde afdrukstand met de ventrale zijde naar boven om te houden van de stand van de gesneden monsters (Figuur 5).
    6. Foto van de segmenten van het hart met behulp van een digitale single lens reflexcamera.
    7. Knippen weg de rechterventrikel (negeren als niet nodig). Fotograferen van de linkerventrikel segmenten en weeg alle segmenten voor het totale gewicht van het linkerventrikel.
    8. Onderscheid maken tussen de Evans blauwe positieve en Evans blauwe negatieve weefsel in alle secties. Ontleden de segmenten om te scheiden de ischemische (Evans blauw negatief) van het niet-ischemische weefsel (blauwe Evans positief) met behulp van een scalpel.
    9. Eerst analyseren de blauwe Evans negatieve secties (het ischemische gebied in gevaar, AAR). Wegen ze allemaal en zet ze allemaal in een kunststoffles.
    10. Dekking van de segmenten geheel met 100-150 mL (op basis van de grootte van het hart) triphenyl tetrazolium chloride (2 g TTC, 16 g Dextran, molecuulgewicht 48000-90000, in 200 mL PBS, vers bereide) zodat het hart stukken zich vrij binnen de oplossing verplaatsen kunnen. Bedek de container en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C terwijl het zachtjes te schudden.
    11. Tijdens deze 20 min incubatie tijd Weeg de Evans Blue positieve stukken (gebied niet in gevaar, ANR), monsters te nemen voor weefsel-Tek insluiten (Kies de meest distale deel van de schade) en opslaan bij-80 ° C voor verdere analyse. Breng de rest in 4% formaldehyde oplossing en bewaar bij kamertemperatuur voor secties van de histologie.
    12. Verwijder de stukken van de AAR uit de TTC-oplossing. Het rood gekleurd weefsel is levensvatbaar ischemische weefsel (VIT) en het weefsel van niet-gekleurd necrotisch ischemische weefsel (NIT). Snij 2 kleine stukjes (blokken van 2-3 mm) van zowel de NIT VIT, insluit in weefsel - Tek en opslaan bij-80 ° C voor verdere analyse. Deze monsters moeten hetzelfde gewicht.
    13. Oplossen van de rest van de stukken (alle segmenten afgeleid van de AAR) door pinning hen naar beneden in een container piepschuim en die betrekking hebben op volledig met 4% formaldehyde oplossing gedurende 24 uur bij kamertemperatuur in een zuurkast. De stukken moeten blijven plat voor de fotografische documentatie in de volgende stap.
    14. De volgende dag fotograferen beide zijden van de stukken met een hoge resolutie camera met de dezelfde zoominstelling en afstand van het weefsel (dezelfde vergroting). Voeg automatische schaal bars op alle afbeeldingen. Alle balken moeten dezelfde lengte hebben.
      Opmerking: De hoge resolutie camera moet worden aangesloten op de software die automatisch de schaal bar aan elke foto toevoegt.
  2. Berekening van de AAR en de grootte van het infarct
    1. % AAR van linkerventrikel = (gewicht van AAR in g / gewicht van de linkerventrikel in g) * 100.
    2. ImageJ software gebruiken voor het berekenen van de totale oppervlakte van de AAR en de NIT (beide zijden van elk vel) op basis van de foto's.
    3. Pas de schaal bar door het selecteren van de schaal bar lengte met behulp van de rechte lijn van de hoek-tool. Kies in het menu analyseren > Set schaal en bevestig de bekende afstand en de eenheid van de schaal-bar. Kies "global" zodat dezelfde schaal zal worden toegepast op alle afbeeldingen.
    4. Markeer het hele oppervlak van het weefsel met de vrije hand-gereedschap voor het berekenen van de AAR. Wees voorzichtig niet te nemen de kant (hoogte) van het weefsel en/of het vetweefsel (figuur 6-C).
    5. Instellen van de meting door te kiezen voor "ruimte" en "label tonen" uit analyseren > Set metingen menu. Meten van de oppervlakte van analyseren > maatregel.
    6. Herhaal stap 3.2.5 maatregel NIT (mark alleen het niet-gekleurd weefsel). Opmerking: Niet het vetweefsel (figuur 6-D) opnemen in de berekening van de NIT. Herhaal de stap aan de andere kant van het weefsel.
    7. Bereken de gemiddelde AAR en NIT voor elk stukje weefsel.
    8. De waarden, verkregen uit 3.2.7 gebruiken voor het berekenen van de NIT in procenten van de AAR:% NIT van AAR = (het gemiddelde oppervlakte Σ uit van NIT in cm2/ Σ gemiddelde oppervlakte van AAR in cm2) * 100.
    9. Twee verschillende onderzoekers moeten de bovenstaande methode worden herhaald. De aanvaardbare marge van verschil is < 10%.
  3. Ischemie markeringen
    1. Gebruik van de EDTA-plasma monsters, die al eerder hebt opgeslagen bij-80 ° C (2.1.9) voor het meten van het niveau van de cardiale troponine-ik heb met behulp van een single-plex Luminex-type assay zoals eerder beschreven 19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Één dier stierf voortijdig vóór administratie van FXIIa remmer of besturingselement peptide vanwege een technische fout (plotselinge daling van de bloeddruk tijdens ischemie tijd, vóór toevoeging van de teststof). Één dier was toegetreden tot de Fractie van de Inhibitor van de omwenteling FXIIa omdat geen schade van ischemie/reperfusie werd waargenomen als gevolg van abnormale anatomie van de linker anterior aflopende slagader (LAD). Een groot deel van het linkerventrikel, met inbegrip van de apex, was geperfundeerd door de met accent circonflexe slagader in dit dier. De dieren in de uiteindelijke analyse werden n = 2 in de bicyclische FXIIa peptide remmer groep (bedoel gewicht van 27.5 ± 2,5 kg) en n = 3 ontvangen een inactieve bicyclische controle peptide (bedoel gewicht van 29 ± 0.8 kg).

Video imaging X-Ray / Coronaire Angiografie van het varken hart wordt gebruikt om te visualiseren van de positie van de druk-katheter en om te beslissen waar te het blokkeren van de LAD (figuur 3A). Figuur 3B geeft de positie van de katheter, blokkeert de bloedstroom distale naar de tweede diagonale tak. Vergelijking van figuur 3A en 3B maakt het ook mogelijk een schatting die onderdeel van het myocardium LAD geleverde ischemische zal worden. Aan het einde van de periode van 2 h reperfusie is de PCI-katheter binnengebracht en opgeblazen op dezelfde positie als tijdens ischemie. Blauwe Evans is vervolgens geïnjecteerd intraveneus om nauwkeurig bepalen de AAR (figuur 5A). Na de besnijdenis van het hart, is het linkerventrikel gesneden uit de dikke delen van de 3-5 mm van de top tot de mitralisklep, loodrecht op de lengteas. AAR en ANR zijn duidelijk afgebakend door Evans blauwe vlekken op de segmenten. AAR en ANR bemonstering gebieden worden weergegeven in figuur 5B.

De AAR, uitgedrukt als percentage van de LV, toont geen statistisch significante verschillen tussen de FXIIa behandelde groep en de controlegroep (figuur 6A). De grootte van het infarct (NIT/AAR) toont geen verschillen tussen de groepen ofwel (met behulp van niet-parametrische Mann-Whitney toets, p > 0,05, figuur 6B). Deze gegevens duiden erop dat FXIIa remmer alleen, op het gebruikte concentratie en blootstellingsduur van toepassing, het hart niet tegen myocardiale beschermen kan ik / R schade. Figuur 6 c en 6 D tonen hoe ter gelegenheid van de AAR en NIT grenzen om te reproducibly en nauwkeurig meten de respectieve oppervlakten.

De bemonsteringsstrategie bloed maakt de vrijlating van de hartspier schade marker cardiale troponine-ik na verloop van tijd worden gecontroleerd. Er is bijna geen verschil na een uur van ischemie met de basislijn terwijl na reperfusie er een continue stijging na verloop van tijd is, zoals weergegeven in Figuur 7. Voor troponine-ik, Inter groep verschillen werden ook niet significant in deze experimenten.

Figure 1
Figuur 1 . Overzicht van de experimentele tijdlijn. Schematische tijdlijn voor de belangrijke stappen in de myocardiale ischemie/reperfusie letsel model. Basislijn coronaire visualization, begintijd van de ischemie, monitoring van hartritmestoornissen en injecteren van de teststof zijn belangrijke stappen in het experiment. Het gebruik van exacte timing in alle experimenten zorgt voor reproduceerbaarheid. Euthanizing van het dier en de besnijdenis van het hart moet gebeuren binnen de 15-20 min na afronding van de fase 2h reperfusie. KCl: kaliumchloride. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 . Tijdlijn van bloed bemonsterings- en analysemethoden. Tijdstippen voor bloedmonsters worden aangegeven samen met soort antistollingsmiddel gebruikt. Aanvullende monsters kunnen worden genomen overeenkomstig het experiment en de analyten te meten. ACT: geactiveerd stolling van tijd, BGA: blood gasanalyse, RT: kamertemperatuur. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 . Coronaire Angiografie. Fluoroscopic weergave van (A) de linker kransslagaders op de basislijn, de gele pijlen wijzen naar de eerste en de tweede diagonale takken, de witte pijl wijst naar de hart-apex (B) de afsluiting LAD tonen geen stroom inzake de linker ventrikel (LV), de rode pijl wijst naar de PC Ik katheter (C) opnieuw afsluiting van de LAD aan het einde van de reperfusie met de ballon van de katheter van de PCI opnieuw ingevoegd aan dezelfde site in de LAD zoals tijdens ischemie. CX: coronaire met accent circonflexe, LAD: anterior aflopende kransslagader, MC links: Millar katheter, ingevoegd in het linkerventrikel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 . Schematisch diagram van weefsel bemonstering. Exacte timing van hart dissectie en de bemonstering van de verschillende gebieden voor verdere analyse. De tijdlijn begint bij 205 min na begin van ischemie, 20 minuten na beëindiging van de dierlijke experiment. Het is belangrijk om te broeden de weefselsecties in TTC binnen een maximum van 40 min na het euthanizing van het dier. Bemonstering van ANR, VIT en NIT wordt aangegeven als witte vierkantjes. Het broeden van de AAR in 4% formaldehyde maakt duidelijk onderscheid tussen NIT en VIT voor nauwkeurige bepaling van de grootte van het infarct. AAR: gebied in gevaar, ANR: gebied niet in gevaar, LV: linkerventrikel, NIT: necrotisch ischemische weefsel, OTC: weefsel-Tek, RV: rechterventrikel, TTC: triphenyl tetrazolium chloride, VIT: levensvatbare ischemische weefsel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 . In-situ differentiatie tussen risico (AAR) gebied en niet bedreigd ANR. (A) representatieve foto van het hele hart net na sternotomy aan het einde van het experiment. (B) representatief beeld tonen van de 3-5 mm dikke linkerventrikel segmenten na dissectie. AAR en ANR zijn duidelijk aangegeven door gele pijlen, en de witte pijl geeft de ANR bemonstering gebied. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 . Ischemie en infarct grootte. (A) het gewicht van het percentage van de AAR van de linker ventrikel (LV). (B) het percentage oppervlak van de NIT van de AAR. (C) een representatief beeld van de berekening van de AAR. (D) een representatief beeld van de NIT-berekening. De witte pijl geeft het gebied VIT bemonstering en de zwarte pijl toont de NIT bemonstering gebied. Gegevens werden berekend aan de hand van ImageJ software. Waarden worden weergegeven als stippen voor elk individu met vermelding van de gemiddelde ±± SD. controlegroep, n experimenteren = 3 en FXIIa remmer behandeld groep, n = 2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7 . Hartspier schade marker. Cardiale troponine-ik concentratie na verloop van tijd in pg/ml van zowel de controle en de FXIIa-remmer behandelde groep. Bloed werd bijeengezocht uit de halsslagader in EDTA-plasma buizen aan basislijn, eind van ischemie en verschillende tijdstippen tijdens reperfusie en cardiale troponine-ik werd gemeten door single-plex schorsing array (Bio-Plex). Gegevens worden weergegeven als stippen voor elk individu met vermelding van de gemiddelde ±± SD. controlegroep, n experimenteren = 3 en FXIIa behandeld groep, n = 2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Myocardiale ik / R letsel heeft een significant effect op de grootte van de laatste infarct die rechtstreeks worden vertaald naar de patiënt prognose na acuut myocardinfarct3. Inzicht in de pathofysiologie van myocardiale ik / R letsel is de eerste stap om te verminderen of te voorkomen. Myocardiale ik / R letsel is een acute aandoening die direct na reperfusie van de afgesloten vaten optreedt. Ik / R letsel leidt tot activering van het aangeboren immuun reactie en cellulaire schade optreedt bij de site van reperfusie en de omliggende weefsels20. Een recente studie toonde een verbetering in de neurologische uitkomst in een rat model van hersenen ik / R letsel wanneer behandeld met FXIIa-remmer8. Echter in de huidige pilot-studie vonden we geen effect van de bicyclische FXIIa-remmer op myocardiale ik / R letsel. De gebruikte FXIIa-remmer is roman en haar farmacokinetiek bij varkens zijn nog niet bekend. Daarom kan het waargenomen gebrek aan effect worden veroorzaakt door verkeerde dosering of toepassing. Dit moet worden aangepakt in vervolgstudies.

Standaardiseren van een dierlijk model is van essentieel belang om te onderzoeken in de diepte de pathofysiologie van myocardiale ik / R letsel en om geschikte oplossingen in klinieken. Onderzoek naar de pathofysiologie van myocardiale ik / R letsel vereist goede en representatieve bemonstering om de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan het bestuderen. De varkens gesloten borst myocardiale ik / R letsel model biedt een reproduceerbare methode, die dicht bij de klinische situatie, en handig om te helpen van de cellulaire mechanismen en test nieuwe nieuwe therapeutics begrijpen is. Varianten van het huidige model zijn beschreven voor de hierboven vermelde doeleinden14,17,18.

Ons protocol van acuut myocardinfarct bij varkens hoeft niet vooraf te behandelen met amiodaron als eerder beschreven18,21. We carotid sinus massage gebruikt ter vermindering van hartritmestoornissen en een tweefase defibrillator voor cardioconversion in het geval van ventrikelfibrillatie. Het gebruik van carotid sinus massage heet klinisch te beïnvloeden van boezemfibrilleren22, maar tot nu toe niet is gebleken om te voorkomen of vertragen van het intreden van ventrikelfibrillatie in MI, hetzij bij de mens pig modellen. Bovendien helpt het gebruik van Sevofluraan te reduceren van Ventriculaire ritmestoornissen evenals sterftecijfer in het varkens model van acuut myocardinfarct23.

Om te zorgen voor reproduceerbaarheid en verminderen het risico van trombose tijdens het experiment, meerdere doses van heparine werden ingespoten op basis van de herhaalde meting van ACT, in plaats van met behulp van vaste heparine doses zoals bijvoorbeeld beschreven door Koudstaal et al.18. Een gecontroleerde hoeveelheid heparine administratie helpt bij het onderzoeken van de stolling cascade in het kader van I / R letsel. Blauwe Evans maakt nauwkeurige bepaling van AAR/LV. De intraveneuze injectie van Evans Blue na opnieuw occlusie van de LAD op de exacte locatie tijdens ischemie inductie onder fluoroscopic begeleiding leidt tot blauwe verkleuring van het hele varken met inbegrip van de niet-ischemische deel van het hart met minimale gevolgen voor de ANR myocard en therapieën. Evans Blue is een bekende cytotoxische stof24. In de huidige experimenten het was van cruciaal belang om de levensvatbaarheid van het endotheel cellaag in ANR in het hart therapieën om te gebruiken als individu intra Informaticacontrole zo 100 mL blauw Evans was geïnjecteerd systemisch en verdund met de vermindering van de volbloed zijn toxiciteit. Eerder, in een soortgelijke instelling, 50 ml 2% blauwe Evans werd geïnjecteerd rechtstreeks in de kransslagaders waardoor het risico van de cytotoxiciteit voor cardiale cellen25. De volgende belangrijke stap was om te ontleden van het hart rechtstreeks in plakjes van de 3-5 mm van de top tot de mitralisklep (de exacte positie in elk dier) en het gebruik van deze methode om een nauwkeurige berekening van de AAR in procenten van het linkerventrikel.

De huidige beschrijving van de methode biedt fijnere details die niet eerder zijn beschreven. TTC gekleurd sectie in 4% formaldehyde voor 24 uur incubatie biedt een duidelijk onderscheid tussen levensvatbare (rood) en necrotisch (witte) weefsel, waardoor uiteindelijk de reproduceerbaarheid van de bemonstering voor verdere moleculaire kleuring. De bemonstering strategie inzake bloed met meer dan 2 h van reperfusie kan de detectie van nieuwe uitgedrukt moleculen in een zeer vroeg stadium (10 en 30 min) van reperfusie evenals later (60 en 120 min). De juiste bloed- en weefsel bemonsterings- en opslag zijn ook van cruciaal belang voor de analyse van plasma trapsgewijs markeringen zoals de uitdrukking van de aanvulling en stolling eiwitten.

Het huidige protocol kan worden aangepast voor een langere tijd reperfusie, van enkele uren tot dagen. Hierdoor kan de onderzoeker te onderzoeken van de latere gevolgen van I / R letsel op het hart en maakt het ook mogelijk het testen van nieuwe medicijnen en beoordeling van hun gevolgen. De beperking van het huidige protocol is het gebruik van een katheter druk-tip voor het meten van de hartfunctie. Meer betrouwbare gegevens over de hartfunctie kan worden verkregen door het gebruik van een hulpprogramma voor het meten van de druk-volume-lussysteem. In samenvatting de huidige methode biedt gedetailleerde belangrijke stappen die nodig zijn om de reproduceerbaarheid van de varkens gesloten borst myocardiale ik / R letsel model wanneer het beoogde gebruik van het model is het bestuderen van de cellulaire en moleculaire veranderingen in het kader van studeren myocardiale ik / R letsel pathofysiologie of studeren roman therapeutische opties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Acknowledgments

De auteurs willen erkennen van Professor Christian Heinis voor het verstrekken van de FXIIa-remmer en de respectieve controle. Wij erkennen ook dankbaar Olgica Beslac, Dr. Daniel Mettler en Kay Nettelbeck uit de experimentele chirurgie eenheid, afdeling voor biomedisch onderzoek, Universiteit van Bern voor technische ondersteuning. Celine Guillod en Matthias Rausch van de afdeling voor Diagnostische Interventional en pediatrische radiologie, Bern University Hospital, ondersteunden vanaf met de röntgenapparatuur en technieken. Dit project werd gefinancierd door de Zwitserse National Science Foundation, project nr. 320030_156193. Wij ook bedank Mr. Reto Haenni van communicatie en marketing, Bern University Hospital, vanaf voor video-opname van ons experiment.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABL 90 Flex, blood gas analyser Radiometer - Blood gas analysis (BGA)
ACT Plus Medtronic - Activated clotting time
Atropin Sintetica - Atropinum Sulfas, 0,5mg/ml
Balance (20-500 Kg) NAGATA Scale, Tiwan HTB/HTR Alternative products can be used
Balance (21-4200 g) Mettler toledo, Switzerland MS4002SDR Alternative products can be used
Blood collection tubes: EDTA, citrate and serum S-Monovette, Nuembrecht, Germany 05.1167.001,
05.1071.001
and
05.1557.001 respectively
Alternative products can be used
BV Pulsera mobile C-arm Philips - Alternative products can be used
Centrifuge Labcare, UK ALC PK120R Alternative products can be used
Defibrillator Lifepak 12 Medtronic - Alternative products can be used
Dextran from Leuconostoc mesenteroides Sigma-Aldrich, Germany D3759 Average M.wt 48000-90000
Digital single lens reflex camera Sony, Thailand DSLR-A500/A550 Alternative products can be used
Dissecting forceps Alternative products can be used
EMPIRA RX PCI dilatation catheter Cordis, Johnson&Johnson, USA 85R15300S Diameter 3 mm, length 15 mm, Alternative products can be used
EMPIRA RX PCI dilatation catheter Cordis, Johnson&Johnson, USA 85R15350S Diameter 3.5 mm, length 15 mm, Alternative products can be used
Evans Blue Sigma-Aldrich, Germany E2129 Toxic
Fabius GS premium respirator Dräger, Lübeck, Germany - Anesthesia work station, Alternative products can be used
Fentanyl Inselspital ISPI - Fentanyl 2500mcg/50ml
Formaldehyde Pathology Institute, Bern University SI148701 Alternative products can be used
FXIIa inhibitor Provided by Prof. Christian Heinis' laboratory in EPFL Novel bicyclic peptide
Galeo, coronary guidewire Biotronik, Germany 125497 Alternative products can be used
Guidance catheter Boston Scientific, Florida, USA 34356-06 6F (100 cm, EB3.75). Alternative products can be used
Heparin Sodium Drossapharm, Basel, Switzerland - Liquemin, 25000 U.I./5 ml
High end electrosurgery BOWA, Germany ARC 400 Electrical source for blood suction. Alternative products can be used
Hydro-Guardmini breathing filter Intersurgical, Lithuania 1745000 Filters
Image J National Institute of Health, USA 1.47v Alternative products can be used
Inflation device, Atrion QL2530 Atrion medical product, Alabama, USA 96402 Alternative products can be used
IntelliVue MP 70 Philips, Boeblingen, Germany - Monitor (ECG, heart rate, blood presure and body temperature). Alternative products can be used
KCl Sintetica SA - Potassium chloride 15%
Ketamine Vetoquinol - Narketan, 1ml/100mg
LR-ACT Medtronic 402-01 ACT special syringes
Midazolam Roche - Dormicum, 5mg/ml
Monopolar scalpel Alternative products can be used
Needle holder Alternative products can be used
High resolution camera, PathStand Macro Imaging Stand for Grossing Spotimaging, USA 1080 p HD resolution. Alternative products can be used
PBS In-house preparation - Alternative products can be used
Peripheral venous cannula, 18 G Alternative products can be used
PowerLab 4/35 data acquisition system Adinstruments, Spechbach, Germany -
Rotamax120T Heidolph, Germany 544-41200-00 Shaker. Alternative can be used
Rüschelit-Super Safety Clear Tube Teleflex, Dublin, Irland 112480 Air way tubing, Alternative products can be used
Safe Pico Aspirator Syringes Radiometer 956-622 BGA special syringes
Saline Sintetica Bioren - NaCl 0,9%. Alternative products can be used
Sevorane 1.5% AbbVie AG - Sevorane 250ml 100%
Sheath Cordis, Johnson&Johnson, USA 504-607 A AVANTI + / 7 F, Alternative products can be used
Space infusion pump B.Braun Medical AG, Germany - For infusion of fentanyl. Alternative products can be used
SPR-350 (Millar catheter) Adinstruments, Texas, USA 840-8166 MIKRO-TIP, 5F, 120 cm
Sternotomy saw Alternative products can be used
Sutures ETHICON, Johnson&Johnson, USA Y3110H Monocryl 3-0 SH-1 Plus. Alternative products can be used
Syringes (20, 10 and 5 mL) CODAN,Baar, Switzerland 62.7602,
62.6616,
62.5607
respectively
Used to inject anesthetic materials intramuscularly or directly into the central venous line. Also to inject heparin or FXIIa or the respective control. Alternative products can be used
Thorax spreader Alternative products can be used
Tissue-tek SAKURA, Netherlands 4583 O.C.T. compound
Vascular forceps Alternative products can be used
Xenetix 300 contrast media Guerbet, Zürich, Switzerland - Lobitridol, 300 mg iodide/ml
Xylazine Vetoquinol - Xylapan, 20mg/1 mL
2,3,5-Triphenyltetrazolium choride Sigma-Aldrich, Austria T8877
500 μL tubes (eppendorf) Trefflab, Switzerland 96.08185.9.03 Alternative products can be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update. Circulation. 133, e338-e360 (2016).
  2. Miller, T. D., et al. Infarct size after acute myocardial infarction measured by quantitative tomographic 99mTc sestamibi imaging predicts subsequent mortality. Circulation. 92, 334-341 (1995).
  3. Ovize, M., et al. Postconditioning and protection from reperfusion injury: where do we stand? Position Paper from the Working Group of Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovasc Res. 87, 406-423 (2010).
  4. Neri, M., Riezzo, I., Pascale, N., Pomara, C., Turillazzi, E. Ischemia/Reperfusion Injury following Acute Myocardial Infarction: A Critical Issue for Clinicians and Forensic Pathologists. Mediators Inflamm. 2017, 1-14 (2017).
  5. Yang, Q., He, G. -W., Underwood, M. J., Yu, C. -M. Cellular and molecular mechanisms of endothelial ischemia/reperfusion injury: perspectives and implications for postischemic myocardial protection. Am J Transl Res. 8, 765-777 (2016).
  6. Massberg, S., et al. Platelet-Endothelial Cell Interactions During Ischemia/Reperfusion: The Role of P-Selectin. Blood. 92, 507-515 (1998).
  7. Wang, J., et al. Antithrombin is protective against myocardial ischemia and reperfusion injury. J Thromb and Haemost. 11, 1020-1028 (2013).
  8. Hopp, S., et al. Targeting coagulation factor XII as a novel therapeutic option in brain trauma. Ann Neurol. 79, 970-982 (2016).
  9. Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. J Anat. 193, (Pt 1), 105-119 (1998).
  10. Heusch, G., Skyschally, A., Schulz, R. The in-situ pig heart with regional ischemia/reperfusion - ready for translation. J Mol Cell Cardiol. 50, 951-963 (2011).
  11. Poirier, P. Exercise, heart rate variability, and longevity: the cocoon mystery? Circulation. 2085-2087 (2014).
  12. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacol Ther. 141, 235-249 (2014).
  13. Bloor, C. M., White, F. C. Functional development of the coronary collateral circulation during coronary artery occlusion in the conscious dog. Am J Pathol. 67, 483-500 (1972).
  14. Banz, Y. Locally targeted cytoprotection with dextran sulfate attenuates experimental porcine myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 26, 2334-2343 (2005).
  15. Krombach, G. A., Kinzel, S., Mahnken, A. H., Günther, R. W., Buecker, A. Minimally Invasive Close-Chest Method for Creating Reperfused or Occlusive Myocardial Infarction in Swine. Invest Radiol. 40, 14 (2005).
  16. Suzuki, Y., Lyons, J. K., Yeung, A. C., Ikeno, F. In vivo porcine model of reperfused myocardial infarction: in situ double staining to measure precise infarct area/area at risk. Catheter Cardiovasc Interv. 71, 100-107 (2008).
  17. McCall, F. C., et al. Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine. Nat Protoc. 7, 1479-1496 (2012).
  18. Koudstaal, S., et al. Myocardial infarction and functional outcome assessment in pigs. J Vis Exp. e51269 (2014).
  19. Kamat, P., et al. Dexrazoxane Shows No Protective Effect in the Acute Phase of Reperfusion during Myocardial Infarction in Pigs. PLoS One. 11, e0168541 (2016).
  20. Carden, D. L., Granger, D. N. Pathophysiology of ischaemia-reperfusion injury. J Pathol. 190, 255-266 (2000).
  21. Pérez de Prado, A., et al. Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).
  22. Lown, B., Levine, S. A. The carotid sinus. Clinical value of its stimulation. Circulation. 23, 766-789 (1961).
  23. Regueiro-Purriños, M., et al. Ventricular Arrhythmias and Mortality Associated with Isoflurane and Sevoflurane in a Porcine Model of Myocardial Infarction. J Am Assoc Lab Anim Sci. (2011).
  24. Roberts, L. N. Evans blue toxicity. Can Med Assoc J. 71, 489-491 (1954).
  25. Ellenbroek, G. H. J. M., et al. Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction. J Vis Exp. e54021 (2016).
Verbetering van een gesloten borst varkens myocardiaal infarct Model door standaardisatie van weefsel en bloed bemonsteringsprocedures
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Abdelhafez, M. M., Shaw, J., Wilbs, J., Despont, A., Rieben, R. Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures. J. Vis. Exp. (133), e56856, doi:10.3791/56856 (2018).More

Abdelhafez, M. M., Shaw, J., Wilbs, J., Despont, A., Rieben, R. Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures. J. Vis. Exp. (133), e56856, doi:10.3791/56856 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter