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Medicine

Miglioramento di un modello di infarto miocardico porcina cassa chiusa tramite la normalizzazione del tessuto e le procedure di campionamento di sangue

doi: 10.3791/56856 Published: March 12, 2018

Summary

Qui dimostriamo un protocollo per standardizzare le procedure di campionamento di un modello porcino stabilito di infarto miocardico acuto al fine di aumentarne il valore traslazionale nella comprensione della patofisiologia della lesione del miocardio di ischemia/riperfusione e per testare nuovi farmaci candidati.

Abstract

Ischemia del miocardio riperfusione (I / R) lesioni contribuiscono per quasi la metà della zona necrotica dopo infarto miocardico. Fino ad oggi non c'è nessun farmaco approvato per prevenire o ridurre del miocardio mi / lesioni R. Lo studio e la comprensione dei meccanismi fisiopatologici del miocardio I / R la ferita è essenziale sviluppare trattamenti efficaci. Grandi esperimenti sugli animali sono un passo importante in metodi traslazionale. Il modello porcino di infarto miocardico acuto è stato stabilito e descritto da noi stessi e gli altri. Abbiamo mirato a migliorare ulteriormente il valore del modello concentrandosi in particolare sulle tecniche di campionamento per l'utilizzo in futuri esperimenti. Inoltre, diamo risalto a passi piccoli ma importanti che possono influenzare la qualità dei risultati finali. Per simulare la situazione clinica di infarto mi / lesioni R, un catetere di intervento coronarico percutaneo (PCI) è stata inserita l'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (ragazzo) di un maiale anestetizzato. ° ° ° Questo modello imita infarto miocardico acuto e trattamento di PCI in esseri umani con la possibilità di determinare con precisione la zona a rischio come pure il necrotico- e tessuto ischemico vitale. Qui il modello è stato usato per studiare l'effetto di un inibitore di peptide biciclico del FXIIa. Il modello può anche essere modificato per consentire tempi di riperfusione studiare gli effetti successivi di infarto miocardico.

Introduction

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Cardiopatia ischemica, in particolare infarto miocardico (MI), è la principale causa di morte nei paesi sviluppati 1. Oggi, il trattamento standard di MI è intervento coronarico percutaneo (PCI), il trattamento del catetere a palloncino. Uno dei fattori critici che influisce sulla qualità della vita e la prognosi dei pazienti dopo il MI acuto trattati con PCI è la dimensione di infarto. La riduzione delle dimensioni può avere un grande impatto sulla sopravvivenza e prognosi paziente 2. Ischemia/riperfusione miocardica (io / R) lesione ha una notevole influenza sulla dimensione di infarto così uno degli obiettivi principali nella ricerca cardiovascolare è di prevenire o ridurre del miocardio mi / R lesioni 3. I meccanismi esatti di I / lesioni R sono ancora sotto indagine 4. Attivazione della cascata del plasma e cellule endoteliali sono tratti distintivi di I / R lesioni 5. Attivazione del sistema di coagulazione è chiaramente coinvolti 6,7. Recentemente, il ruolo di FXII, come un peptide a Monte presto coinvolto nell'attivazione della fase di contatto della cascata della coagulazione, è stato dimostrato in un FXII k.o. modello del ratto di cerebrale I / R infortunio 8. Convalida di questi risultati in un modello porcino è un passo importante nella traduzione clinica. Di conseguenza, stiamo testando un nuovo inibitore di FXIIa biciclico (80 kDa proteasi) nel contesto del miocardio mi / lesioni R in uno studio pilota.

Modelli animali, che mimano la situazione clinica di trattamenti acuti MI e PCI, sono essenziali per migliorare la nostra comprensione della patofisiologia di miocardio mi / lesioni R e per testare le opzioni di trattamento novello. Suini rappresentano un buon modello animale per clinica del miocardio mi / lesioni R. Questo non è solo perché i loro cuori sono molto simili ai cuori umani per quanto riguarda l'anatomia e la circolazione coronarica, ma mostrano anche risposte fisiopatologiche simili al 9,di ischemia e riperfusione miocardica10. Altri modelli quali ratti e topi non soddisfano questi criteri e mostrano notevoli differenze rispetto ai cuori umani 11,12, mentre ad esempio, i cani hanno molti più vasi coronarici collaterali rispetto agli esseri umani 13.

Il modello di infarto miocardico acuto suina è stato ampiamente usato nella ricerca cardiovascolare per studiare la malattia di cuore ischemica compresa del miocardio mi / R ferita 14,15,16,17. Quest'ultima è una condizione infiammatoria, a causa della quale riducendo al minimo la reazione infiammatoria correlata a sternotomy o toracotomia utilizzato in chirurgia open-petto è essenziale. Il modello di cassa chiusa tramite una regolazione di angiografia clinica C-braccio supera questo problema. Inoltre, uno dei punti più importanti è che il nostro protocollo fornisce un'accurata distinzione tra ischemico (area a rischio, AAR) e aree non-ischemica del ventricolo sinistro (area non a rischio, ANR) in modo che la dimensione di infarto (tessuto ischemico necrotico, NIT) può essere accuratamente determinato. Il nostro obiettivo per questa carta è chiaramente definire una metodologia riproducibile di un porcino del miocardio mi / lesioni R modello, in particolare per quanto riguarda il campionamento del tessuto miocardico, che consentirà una più precisa analisi dei meccanismi molecolari di I / lesioni R e un quadro più chiaro degli effetti di trattamenti farmacologici romanzo.

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Protocol

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1. gli animali:

Tutti gli animali sono stati trattati secondo le linee guida delle leggi nazionali svizzere. Lo studio è stato approvato dal comitato locale di sperimentazione animale del Cantone di Berna (autorizzazione no. ESSERE 25/16).

Utilizzare grandi maiali bianchi di entrambi i sessi (~ 30 ± 5 kg). Dividere gli animali ciecamente in due gruppi, un gruppo che riceve un inibitore (80 kDa proteasi) biciclico del FXIIa o il trattamento di scelta e l'altro un controllo inattivo.

2. intervento chirurgico (Figura 1)

  1. Anestesia e preparazione dell'animale:
    1. Veloce gli animali per 12 h prima di iniziare l'esperimento.
    2. Pre-Medicare l'animale con 20 mg/kg ketamina e 2 mg/kg xylazina tramite un'iniezione intramuscolare nel collo, utilizzando una siringa da 10 mL. Registrare il peso dell'animale e sesso.
    3. Inducono anestesia iniettando 0,5 mg/kg di Midazolam e 0,05 mg/kg Atropin nella vena auricular. Intubare l'animale con un tubo endotracheale.
    4. Mantenere l'anestesia tramite ventilazione meccanica utilizzando un respiratore (O2/air 1:3, Sevorane 1,5%), un tubo endotracheale di 7-8 mm e di un filtro. Regolare la frazione di ossigeno inspirato (FiO2) al 35% e il volume corrente di 6-10 mL/kg.
    5. Profondità dell'anestesia è valutato come adeguato in assenza di risposte o motore o autonomiche a naso pizzicamento. Tono di mascella e riflessi palpebrali sono stati controllati continuamente anche targeting tono mascella rilassata e assenza di riflessi palpebrali. Temperatura al cuore è stato continuamente monitorata e manutenzione del normothermia (38-38,5 ° C) è stata assicurata con il riscaldamento passivo (isolare le coperte e bottiglie di calde).
    6. Sezionare libero, come precedentemente descritto da Koudstaal e suoi passi colleghi 3-1-3-318, arterie carotiche su entrambi i lati e incannulare li con una guaina 7F. Incannulare la vena giugulare di sinistra con una guaina 7F per prelievi del sangue venoso.
    7. Somministrare una dose bolo di 250 µ g analgesico di fentanil attraverso la linea venosa centrale, seguita da 250 µ g/h come infusione endovenosa continua utilizzando una pompa di infusione. Monitorare la temperatura corporea, frequenza cardiaca e ritmo con un 3-piombo elettrocardiogramma (ECG), pressione venosa centrale e arterioso durante l'intero esperimento.
    8. Utilizzando tubi di raccolta sangue standard, prelevare i campioni di sangue della linea di base seguenti dalla linea venosa: 5 mL di plasma citratato e 2,9 mL di plasma EDTA nelle rispettive provette. Centrifugare immediatamente a 2.000 x g per 15 min a 4 ° C. Prendere 2,9 mL di sangue in una provetta da siero e lasciar per coagulare per 30 min a temperatura ambiente prima di centrifugazione come descritto sopra.
    9. Aliquotare 200 µ l di plasma o siero in 500 µ l tubi e memorizzare tutti i campioni a-80 ° C per un'ulteriore analisi.
    10. Prelevare 0,5 mL di sangue dalla linea arteriosa utilizzando che l'analisi di gas del sangue speciale (BGA) siringhe per misurare BGA utilizzando la macchina BGA secondo le istruzioni del produttore.
    11. Prelevare 0,5 mL di sangue dalla linea venosa usando una siringa da 2 mL standard e trasferire immediatamente nella cartuccia ACT utilizzando un ago 30g. Inserire la cartuccia riempita la macchina di ACT per misurare il tempo di coagulazione secondo le istruzioni del produttore. Vedere la Figura 2 per intervalli di tempo.
    12. Somministrare l'eparina 5000 IU sono stati usati insieme nella linea venosa utilizzando una siringa da 2 mL e permettere all'animale di stabilizzare per 20 min prima di iniziare l'esperimento MI.
    13. Monitor agire ogni 30-45 min, come accennato in 2.1.11. Iniettare per via endovenosa dell'eparina 2500 UI sono stati usati insieme, se l'atto è < 180 s.
  2. Esperimento di infarto miocardico
    1. Utilizzare un equipaggiamento di radioscopia del braccio C standard (programma di angiografia coronaria, angolo 0°, 12 fotogrammi al secondo, ~ 70 kV) - o in alternativa un sistema dedicato di angiografia - per eseguire l'intervento coronario.
    2. Utilizzare guida fluoroscopica per inserire un catetere pressione (5F, 120 cm) tramite la guaina precedentemente posizionata nell'arteria carotide sinistra. Farlo avanzare nel ventricolo di sinistra. Collegare il catetere pressione a un sistema di acquisizione per registrare la pressione ventricolare sinistra. Il sistema di acquisizione deve calcolare e registrare la frequenza cardiaca, sviluppato continuamente pressione, dP/dt massimo (contrattilità del ventricolo sinistro) e dP/dt minimo (rilassamento del ventricolo sinistro) durante l'intero esperimento. Registrare i valori basali per 10 min.
    3. Inserire un 6F (100 cm, EB3.75) catetere guida tramite la guaina precedentemente posizionata nell'arteria carotica di destra. Anticipo all'arteria coronaria di sinistra per raggiungere la sinistra arteria coronaria discendente anteriore (LAD) sotto la guida dei raggi x. Iniettare mezzo di contrasto utilizzando una siringa da 20 mL tramite catetere guida per eseguire un'angiografia coronarica della linea di base.
      Nota: L'iniezione di mezzo di contrasto è stato fatto da pressione manuale ma un sistema di iniettore di alimentazione dedicata potrebbe essere abituato così.
    4. Valutare la dimensione del ragazzo sul monitor a raggi x per selezionare la dimensione appropriata del catetere intervento coronarico percutaneo (PCI). Utilizzare palloncini PCI con una lunghezza di 15-25 mm e diametri compresi tra 2 e 3,5 mm a seconda delle dimensioni LAD. Assemblare il catetere PCI e guida coronarica (F 014/J, 175 cm). Collegare il catetere PCI con il dispositivo di gonfiaggio pre-riempito con mezzo di contrasto.
      Nota: Il diametro della lama può essere misurato direttamente su un monitor calibrato utilizzando un righello e la dimensione del palloncino PCI viene quindi selezionata di conseguenza.
    5. Inserire il sistema assemblato da 2.2.4 nel lume del catetere guida. Far avanzare il filo guida nel ragazzo fino a raggiungere oltre il secondo ramo diagonale del ragazzo.
    6. Utilizzare la guida fluoroscopica per far avanzare il catetere PCI fino a raggiungere circa la metà del ragazzo. Scegliere il sito di blocco LAD secondo l'anatomia delle coronarie, di solito dopo il secondo, a volte dopo il primo ramo diagonale (Figura 3) al fine di avere simili percentuali della relazione annuale del ventricolo sinistro (LV).
      Nota: La scelta del sito blocco dipende la lunghezza dei rami diagonali e così la zona di tessuto che viene fornito dal sangue tramite il rispettivo ramo. In caso di un lungo, biforcato primo ramo diagonale il sito blocco sarà solo dopo questo. In caso di un primo ramo diagonale più breve, il blocco è fatto dopo la seconda diagonale.
    7. Rimuovere il filo guida e quindi aumentare la pressione nel dispositivo di gonfiaggio per 7-10 bar per gonfiare il palloncino del catetere PCI e indurre l'ischemia del miocardio per 1 h. aumentare gradualmente il FiO2 al 50-60% tra i 15 e i 40 min di ischemia. Tenere tidal volume a 6-10 mL/kg.
      Nota: Questa procedura verrà ridurre l'insorgenza di extrasistoli e diminuire la frequenza delle fibrillazioni ventricolari.
    8. Record di una sequenza video di s di 5-10 durante l'iniezione di mezzo di contrasto attraverso il catetere guida di avere un angiogramma del palloncino del catetere PCI in vigore solo dopo l'avvio di ischemia; ripetere dopo 10 min di ischemia per verificare l'occlusione completa del ragazzo distale al palloncino del catetere PCI.
    9. Monitorare l'animale molto attentamente per rilevare e trattare (2.2.10) immediatamente le aritmia cardiache. Extrasystoles generalmente si verificano e aumentare in frequenza (> 3 / min) tra 20 e 40 min dopo induzione di ischemia del miocardio. In questo caso, massaggiare delicatamente il collo su entrambi i lati appena sotto la guancia. Nella maggior parte dei casi questo sarà sufficiente a ristabilire un battito cardiaco regolare, probabilmente dalla stimolazione dei barocettori vagale del nervo situato sull'arteria carotica comune.
    10. Se aritmie cardiache progredire nella fibrillazione ventricolare, è possibile utilizzare un defibrillatore bifasico esterno, per ristabilire un ritmo sinusale. Applicare 5-10 compressioni toraciche con le pastiglie di defibrillatore immediatamente prima di applicare l'ammortizzatore al fine di riempire i coronaries con sangue ossigenato e quindi shock con 150 J (per gli animali di 30 kg).
    11. Ripetere se necessario e aumentare l'energia a 175 J dopo lo shock 3rd . Utilizzare impostazioni di energia superiori per gli animali più pesanti.
    12. Cinque minuti prima della fine del tempo di ischemia ripetere il campionamento di sangue accennato in 2.1.8-2.1.13. Iniettare la sostanza in esame (inibitore FXIIa biciclico o controllare 4 mg/kg, questo farlo ciecamente) per via endovenosa attraverso la linea venosa centrale e flush la linea con 20 mL di soluzione salina.
    13. Prelevare un campione di plasma citrato (come accennato in 2.1.8 e 2.1.9) 4 min dopo aver iniettato la sostanza in 2.2.12.
    14. Eseguire un angiogramma (2.2.3) per confermare l'occlusione LAD, poi sgonfiare il palloncino del catetere PCI e rimuovere il catetere dal catetere guida. Confermare l'aspersione del ragazzo distale al luogo di occlusione dall'angiogramma immediatamente dopo la deflazione e la rimozione del palloncino del catetere PCI, 10 min da allora in poi, ogni volta che segni di ischemia del miocardio erano visibili mediante ECG per più di 5 min e immediatamente prima riocclusione del ragazzo.
    15. Consentire la riperfusione del miocardio ischemico per 2 h. Prelevare campioni di siero e plasma alle 10, 30, 60 e 115 min di riperfusione (2.1.8 e 2.1.9). Monitor BGA a 60 e 115 min (2.1.10).
    16. Reinserire il catetere PCI insieme con il filo guida esattamente nella stessa posizione come quello usato per l'ischemia. Gonfiare il palloncino del catetere PCI come prima e confermare l'occlusione LAD dall'angiogramma (2.2.3). Rimuovere il catetere pressione dal ventricolo sinistro e interrompere la registrazione.
    17. Iniettare 100 mL 2% blu di Evans in fosfato tampone salino (PBS, pH 7.4) nella linea venosa centrale. Circa 30 s dopo, quando l'animale intero diventa blu, iniettare 40 mL 20% KCl per eutanasia animale. Morte è stata confermata dall'assenza di segnali ECG e onde di impulso.

3. tecniche di campionamento

  1. Estrazione, dissezione e campionamento del cuore (Figura 4)
    1. Eseguire uno sternotomy per esporre il cuore. Seguire il protocollo precedentemente descritto da Koudstaal e colleghi, i passaggi da 8-2 e 8-318. Aprite il pericardio durante la verifica per le anomalie, che potrebbero derivare da precedente pericardite ed escludere l'animale da un'ulteriore valutazione.
    2. Sgonfiare e rimuovere il PCI così come il catetere guida. Asportare il cuore per ulteriori analisi. Tagliare la vena cava e rimuovere il sangue utilizzando una pompa di aspirazione, quindi tagliare tutti i grandi vasi che collega il cuore con il corpo.
    3. Sciacquare il cuore dentro e fuori con temperatura ambiente salino. Pesare tutto il cuore.
    4. Entro 30-40 min, tagliare il cuore a fette di circa 3-5 mm dall'apice per l' intersectiones Chordae della valvola mitrale, perpendicolare all'asse lungo con un coltello affilato.
    5. Fare attenzione a posizionare sempre il cuore nello stesso orientamento con il lato ventrale rivolto verso l'alto al fine di mantenere l'orientamento dei campioni tagliati (Figura 5).
    6. Fotografare le fette del cuore utilizzando una fotocamera reflex digitale.
    7. Tagliare via il ventricolo di destra (scartare come non necessario). Fotografare le fette del ventricolo sinistro e pesare tutte le sezioni per il peso totale del ventricolo sinistro.
    8. Distinguere tra il positivo blu di Evans e tessuto blu di Evans negativo in tutte le sezioni. Sezionare le fette per separare l'ischemico (blu di Evans negativo) dal tessuto non-ischemica (blu di Evans positivo) usando un bisturi.
    9. Prima di analizzare le sezioni negative blu di Evans (l'area ischemica a rischio, AAR). Pesare tutti loro e metterli tutti in un contenitore di plastica.
    10. Coprire le fette interamente con soluzione di 100-150 mL (secondo le dimensioni del cuore) Trifenil tetrazolio cloruro (2G TTC, 16G destrano, peso molecolare 48000-90000, in 200 mL di PBS, preparati al momento) così che i pezzi di cuore possono muoversi liberamente all'interno della soluzione. Coprire il contenitore e incubare per 20 min a 37 ° C agitando delicatamente.
    11. Durante questo il blu di Evans pesare di tempo incubazione a 20 min pezzi positivi (area non a rischio, ANR), prelevare campioni per l'incorporamento del tessuto-Tek (scegliere la parte più distale dall'infortunio) e conservare a-80 ° C per ulteriori analisi. Trasferire il resto in soluzione al 4% di formaldeide e conservare a temperatura ambiente per sezioni di istologia.
    12. Togliere i pezzi della relazione annuale dalla soluzione TTC. Il tessuto macchiato rosso è praticabile tessuto ischemico (VIT) e il tessuto tinto non è tessuto ischemico necrotico (NIT). Tagliare 2 piccoli pezzi (blocchi di 2-3 mm) da entrambi il NIT e VIT, incorporarli in tessuto - Tek e conservare a-80 ° C per ulteriori analisi. Questi esempi dovrebbero avere lo stesso peso.
    13. Difficoltà il resto dei pezzi (tutte le sezioni derivate dalla RAA) bloccandoli in un contenitore di polistirolo e coprendo completamente con soluzione di formaldeide 4% per 24 h a temperatura ambiente in una cappa aspirante. I pezzi dovrebbero rimanere piatti per la documentazione fotografica nel passaggio successivo.
    14. Il giorno successivo fotografare entrambi i lati dei pezzi con una fotocamera ad alta risoluzione con la stessa impostazione di zoom e la distanza dal tessuto (stesso ingrandimento). Aggiungere barre di scala automatica a tutte le immagini. Tutte le barre devono avere la stessa lunghezza.
      Nota: La fotocamera ad alta risoluzione dovrebbe essere collegata al software che aggiunge automaticamente la barra della scala per ogni foto.
  2. Calcolo della relazione annuale di attività e la dimensione di infarto
    1. % AAR del ventricolo sinistro = (peso di AAR in g / peso del ventricolo sinistro in g) * 100.
    2. Utilizzare software ImageJ per calcolare la superficie totale dell'AAR e NIT (entrambi i lati di ogni pezzo) basato sulle fotografie.
    3. Regolare la barra della scala selezionando la lunghezza della barra scala utilizzando la linea retta dallo strumento di angolo. Scegliere dal menu Analyze > Imposta scala e inserire la distanza nota e l'unità della barra della scala. Scegliere "globale" in modo che la stessa scala verrà applicata a tutte le immagini.
    4. Delimitare la zona di tutta la superficie del tessuto utilizzando lo strumento di selezione a mano libera per calcolare AAR. Fare attenzione a non includere il lato (altezza) del tessuto e/o il tessuto adiposo (Figura 6-C).
    5. Impostare la misura scegliendo "zona" e "visualizzare l'etichetta" da Analyze > menu impostare misure. Misurare l'area della superficie da analizzare > misura.
    6. Ripetere il passaggio 3.2.5 misura NIT (contrassegno solo il tessuto non colorate). Nota: Non include il tessuto adiposo (Figura 6D) nel calcolo NIT. Ripetere il passaggio sul lato opposto del tessuto.
    7. Calcolare la media AAR e NIT per ogni pezzo di tessuto.
    8. Utilizzare i valori ottenuti da 3.2.7 per calcolare il NIT come una percentuale dell'AAR:% NIT di AAR = (Σ superficie media di NIT, cm2/ Σ media superficie di AAR cm2) * 100.
    9. Due diversi investigatori dovrebbero ripetere il metodo sopra descritto. Il margine di differenza accettabile è < 10%.
  3. Marcatori di ischemia
    1. Utilizzare i campioni di plasma EDTA, che sono stati precedentemente memorizzati a-80 ° C (2.1.9) per misurare il livello di troponina i cardiaca-usando un'analisi di Luminex-tipo singolo-plex come precedentemente descritto in 19.

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Representative Results

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Un animale morto prematuramente prima della somministrazione di FXIIa peptide inibitore o di un controllo a causa di un errore tecnico (improvviso calo della pressione sanguigna durante il tempo di ischemia, prima dell'aggiunta della sostanza in esame). Un animale è stato escluso dal gruppo di inibitore di FXIIa perché non di ischemia/riperfusione è stato osservato dovuto l'anatomia anormale dell'arteria discendente anteriore sinistra (ragazzo). Una grande parte del ventricolo sinistro, tra cui all'apice, è stata irrorata dall'arteria circonflessa in questo animale. Gli animali inclusi nell'analisi finale sono stati n = 2 nel gruppo del peptide inibitore del biciclico FXIIa (peso di 27,5 ± 2,5 kg) e n = 3 ricezione un peptide inattivo biciclico controllo (peso di 29 ± 0,8 kg).

X-ray imaging video / angiografia coronaria del cuore del maiale viene utilizzato per visualizzare la posizione del catetere pressione e decidere dove bloccare il lama (Figura 3A). Figura 3B Mostra la posizione del catetere, bloccando il flusso di sangue distale per il secondo ramo diagonale. Confronto della Figura 3A e 3B permette anche una stima di cui parte del miocardio LAD-fornito sarà ischemico. Alla fine del periodo di riperfusione 2h il catetere PCI è reintrodotto e gonfiato nella stessa posizione, come è stato durante l'ischemia. Blu di Evans viene iniettato per via endovenosa per determinare con precisione l'AAR (Figura 5A). Dopo l'asportazione del cuore, il ventricolo sinistro viene tagliato in sezioni di spessore di 3-5 mm dall'apice fino alla valvola mitrale, perpendicolare all'asse longitudinale. AAR e ANR sono chiaramente delimitate da Evans Blue colorazione sulle fette. Zone di campionamento AAR e ANR sono mostrate in figura 5B.

L'AAR, espresso come percentuale del LV, non mostra nessuna differenza statisticamente significativa tra il gruppo di FXIIa trattata e il gruppo di controllo (Figura 6A). La dimensione di infarto (NIT/AAR) non Mostra differenze fra i gruppi sia (prova utilizzando non parametrico di Mann-Whitney, p > 0.05, Figura 6B). Questi dati suggeriscono che FXIIa inibitore da solo, presso la concentrazione usata e la durata dell'applicazione, potrebbe non proteggere il cuore dal miocardio mi / lesioni R. Figura 6 e 6 D viene illustrato come contrassegnare i bordi AAR e NIT per accurato e riproducibile misurare le rispettive aree della superficie.

La strategia di campionamento del sangue permette il rilascio della troponina i cardiaca marcatore danni del muscolo cardiaco-I per essere monitorati nel tempo. Non vi è quasi alcuna differenza dopo un'ora di ischemia con la linea di base mentre dopo riperfusione c'è un continuo aumento nel corso del tempo, come mostrato nella Figura 7. Per la troponina i-I, le differenze tra gruppi anche non erano significative in questi esperimenti.

Figure 1
Figura 1 . Panoramica della timeline sperimentale. Timeline schematici per i passi importanti nel modello di lesione del miocardio di ischemia/riperfusione. Linea di base coronarica visualizzazione, ora di partenza dell'ischemia, monitoraggio aritmie cardiache e iniettare la sostanza in esame sono passi importanti nell'esperimento. L'uso di tempistica esatta in tutti gli esperimenti assicura la riproducibilità. Eutanasia animale e l'asportazione del cuore dovrebbe essere fatto entro 15-20 minuti dopo il completamento della fase di riperfusione di 2h. KCl: cloruro di potassio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 . Timeline del prelievo di sangue e analisi. Punti di tempo per il prelievo di sangue sono indicati insieme al tipo di anticoagulante utilizzato. Secondo l'esperimento e analiti possono essere prelevati altri campioni da misurare. ACT: attivato tempo, BGA di coagulazione: analisi dei gas, RT di sangue: temperatura ambiente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 . L'angiografia coronaria. Visualizzazione fluoroscopica di (A) i coronaries sinistra al basale, le frecce gialle scegliere la prima e il seconda diagonali rami, la freccia bianca indica all'apice del cuore (B) il ragazzo occluso non mostrando la nessuna area di flusso del ventricolo sinistro (LV), la freccia rossa indica al PC Ho catetere (C) richiusura del ragazzo alla fine della riperfusione con il palloncino del catetere PCI reinserito allo stesso sito nel ragazzo come durante l'ischemia. CX: arteria coronaria circonflessa, LAD: sinistra arteria coronaria discendente anteriore, MC: catetere Millar, inserito nel ventricolo sinistro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 . Schematica dei campioni tissutali. Momento esatto della dissezione di cuore e campionamento delle diverse aree per ulteriori analisi. La sequenza temporale inizia alle 205 min dopo l'inizio di ischemia, 20 min dopo il termine della sperimentazione animale. È importante Incubare le sezioni di tessuto in TTC entro un massimo di 40 min dopo eutanasia animale. Campionamento di ANR, VIT e NIT è indicato come quadrati bianchi. Incubando l'AAR in formaldeide 4% permette la chiara distinzione tra NIT e VIT per determinare con precisione la dimensione di infarto. AAR: zona a rischio, ANR: area non a rischio, LV: ventricolo sinistro, NIT: tessuto ischemico necrotico, OTC: tessuto-Tek, RV: ventricolo destro, TTC: Trifenil tetrazolio cloruro, VIT: tessuto ischemico vitale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 . In situ differenziazione tra zona a rischio (AAR) e non a rischio ANR. (A) rappresentativo di tutto il cuore solo dopo sternotomy alla fine dell'esperimento. (B) rappresentante immagine che mostra il 3-5 mm fette spesse ventricolo sinistro dopo la dissezione. AAR e ANR sono chiaramente definiti, indicato da frecce gialle, e la freccia bianca indica l'area di campionamento ANR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 . Dimensione di ischemia e infarto. (A) la percentuale in peso della relazione annuale del ventricolo sinistro (LV). (B) la superficie di percentuale di NIT dell'AAR. (C) una foto rappresentativa del calcolo AAR. (D) un quadro rappresentativo del calcolo NIT. La freccia bianca indica l'area di campionamento VIT e la freccia nera indica l'area di campionamento NIT. I dati sono stati calcolati utilizzando il software ImageJ. I valori vengono visualizzati come punti per ogni singolo esperimento con indicazione della media ±± gruppo di SD. controllo, n = 3 e FXIIa inibitore trattati gruppo, n = 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7 . Indicatore di danno del muscolo cardiaco. Troponina cardiaca-ho gruppo trattato con concentrazione nel corso del tempo in pg/ml di FXIIa inibitore sia il controllo. Sangue è stato raccolto dalla vena giugulare in provette plasma EDTA al basale, fine di ischemia e parecchi punti di tempo durante la riperfusione e cardiaco troponina-è stato misurato dalla schiera di sospensione singola-plex (Bio-Plex). I dati vengono visualizzati come punti per ogni singolo esperimento con indicazione della media ±± gruppo di SD. controllo, n = 3 e gruppo FXIIa trattato, n = 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Del miocardio mi / R la ferita ha un effetto significativo sulla dimensione finale di infarto che si traduce direttamente in prognosi dei pazienti dopo infarto miocardico acuto3. Comprensione della patofisiologia del miocardio mi / R ferita è il primo passo per ridurre o prevenire che. Del miocardio mi / R ferita è una condizione acuta che si verifica subito dopo riperfusione dei vasi occlusi. Io / lesioni R conduce all'attivazione della risposta immunitaria innata e danno cellulare si verifica nel sito di riperfusione ed i tessuti circostanti20. Uno studio recente ha mostrato un miglioramento nel risultato neurologico in un modello del ratto del cervello mi / lesioni R quando trattati con FXIIa inibitore8. Tuttavia, in questo studio pilota abbiamo non trovato alcun effetto dell'inibitore FXIIa biciclico su miocardio mi / lesioni R. L'inibitore di FXIIa usato è romanzo e sua farmacocinetica nei suini non sono ancora noti. Di conseguenza, la mancanza di effetto osservata potrebbe essere causata da dosaggio inadeguato o applicazione. Questo deve essere affrontato in studi di follow-up.

Standardizzazione di un modello animale è essenziale per indagare in profondità la patofisiologia del miocardio mi / lesioni R e portare soluzioni adatte di cliniche. Indagando la patofisiologia del miocardio mi / R lesioni richiede buona e rappresentanza di campionamento al fine di studiare i meccanismi cellulari alla base di esso. La cassa chiusa porcina del miocardio mi / modello ferita R fornisce un metodo riproducibile, che è vicino alla situazione clinica e utile per aiutare a comprendere i meccanismi cellulari e approcci terapeutici nuovi test. Per i suddetti scopi14,17,18, varianti del presente modello sono state descritte prima.

Il nostro protocollo di infarto miocardico acuto nei suini non necessita di pre-trattamento con amiodarone come descritto in precedenza18,21. Abbiamo usato il massaggio del seno carotideo per ridurre le aritmia cardiache e un defibrillatore bifasico per cardioconversion in caso di fibrillazione ventricolare. L'uso del massaggio del seno carotideo clinicamente è conosciuto per influenzare la fibrillazione atriale22, ma finora non ha dimostrato di prevenire o ritardare l'insorgenza di fibrillazione ventricolare in MI, in esseri umani o nei modelli di maiale. Inoltre, l'uso del sevoflurano aiuta a ridurre le aritmia ventricolari, nonché il tasso di mortalità nel modello porcino di infarto miocardico acuto23.

Per garantire la riproducibilità e ridurre il rischio di trombosi durante l'esperimento, dosi multiple dell'eparina sono state iniettate basato sulla misurazione ripetuta della legge, piuttosto che utilizzando fisso dosi di eparina come descritto ad esempio da Koudstaal et al.18. Una quantità controllata di somministrazione di eparina aiuta ad per indagare la cascata di coagulazione nel contesto di I / lesioni R. Blu di Evans consente la determinazione accurata di AAR/LV. L'iniezione endovenosa del blu di Evans dopo riocclusione del ragazzo presso il sito esatto durante l'induzione di ischemia sotto guida fluoroscopica conduce alla macchiatura blu del maiale intero compresa la parte non-ischemica del cuore con minimo effetto sulla ANR miocardio e sistema vascolare. Blu di Evans è una sostanza citotossica Nota24. Negli esperimenti attuali era cruciale per mantenere la vitalità dello strato delle cellule endoteliali in ANR nel vasculature cuore per poter utilizzare come un individuo intra controllo così 100 mL blu di Evans è stato iniettato sistemica e diluito con il sangue intero riducendo la tossicità. In precedenza, in un ambiente simile, 50 ml 2% blu di Evans è stato iniettato direttamente nel coronaries aumentando il rischio di sua citotossicità di cardiaco cellule25. Il prossimo passo importante è stato di sezionare il cuore direttamente a fette di 3-5 mm dall'apice fino alla valvola mitrale (la posizione esatta in ogni animale) e utilizzando questo metodo per effettuare un calcolo preciso della relazione annuale come percentuale del ventricolo sinistro.

La descrizione del metodo corrente fornisce dettagli più fini che non sono state precedentemente descritte. Incubando TTC macchiato sezione in formaldeide 4% per 24 ore fornisce una chiara distinzione tra vitale (rosso) e del tessuto necrotico (bianco), che infine aumenta la riproducibilità del campionamento per ulteriore colorazione molecolare. La strategia di campionamento di sangue oltre 2 h di riperfusione consente la rivelazione di molecole recentemente espresse nelle primissime fasi di riperfusione (10 e 30 min), come pure le successive (60 e 120 min). Corretta sangue e campioni tissutali e deposito anche sono fondamentali per l'analisi di indicatori di cascata del plasma come espressione delle proteine del complemento e della coagulazione.

L'attuale protocollo può essere modificato per avere un più lungo tempo di riperfusione, da poche ore a giorni. Questo consente al ricercatore di indagare le conseguenze successive di I / lesioni R sul cuore e consente inoltre la sperimentazione di nuovi farmaci e valutazione dei loro effetti. La limitazione del protocollo attuale è l'uso di un catetere di punta di pressione per la misura della funzione del cuore. Dati più attendibili sulla funzione cardiaca possono essere ottenuti mediante l'uso di un sistema di misurazione del ciclo di pressione-volume. In sintesi il metodo corrente fornisce dettagliate importanti passaggi necessari per incrementare la riproducibilità della cassa chiusa porcina del miocardio mi / R modello di ferita quando la modalità di utilizzo del modello è per studiare i cambiamenti cellulari e molecolari nel contesto della lo studio del miocardio mi / patofisiologia ferita R o studiare nuove opzioni terapeutiche.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

Gli autori desiderano riconoscere Professor Christian Heinis per fornire l'inibitore di FXIIa e del rispettivo controllo. Riconosciamo anche con gratitudine Olgica Beslac, Dr. Daniel Mettler e Kay Nettelbeck dall'unità di chirurgia sperimentale, Dipartimento per la ricerca biomedica, Università di Berna per il supporto tecnico. Celine Guillod e Matthias Rausch dal reparto per diagnostica, interventistica e radiologia pediatrica, ospedale universitario di Berna, Inselspital fornito supporto con le apparecchiature a raggi x e le tecniche. Questo progetto è stato finanziato dalla Swiss National Science Foundation, progetto n. 320030_156193. Vorremmo anche ringraziare il signor Reto Haenni da comunicazione e marketing, ospedale universitario di Berna, Inselspital per il nostro esperimento di registrazione video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABL 90 Flex, blood gas analyser Radiometer - Blood gas analysis (BGA)
ACT Plus Medtronic - Activated clotting time
Atropin Sintetica - Atropinum Sulfas, 0,5mg/ml
Balance (20-500 Kg) NAGATA Scale, Tiwan HTB/HTR Alternative products can be used
Balance (21-4200 g) Mettler toledo, Switzerland MS4002SDR Alternative products can be used
Blood collection tubes: EDTA, citrate and serum S-Monovette, Nuembrecht, Germany 05.1167.001,
05.1071.001
and
05.1557.001 respectively
Alternative products can be used
BV Pulsera mobile C-arm Philips - Alternative products can be used
Centrifuge Labcare, UK ALC PK120R Alternative products can be used
Defibrillator Lifepak 12 Medtronic - Alternative products can be used
Dextran from Leuconostoc mesenteroides Sigma-Aldrich, Germany D3759 Average M.wt 48000-90000
Digital single lens reflex camera Sony, Thailand DSLR-A500/A550 Alternative products can be used
Dissecting forceps Alternative products can be used
EMPIRA RX PCI dilatation catheter Cordis, Johnson&Johnson, USA 85R15300S Diameter 3 mm, length 15 mm, Alternative products can be used
EMPIRA RX PCI dilatation catheter Cordis, Johnson&Johnson, USA 85R15350S Diameter 3.5 mm, length 15 mm, Alternative products can be used
Evans Blue Sigma-Aldrich, Germany E2129 Toxic
Fabius GS premium respirator Dräger, Lübeck, Germany - Anesthesia work station, Alternative products can be used
Fentanyl Inselspital ISPI - Fentanyl 2500mcg/50ml
Formaldehyde Pathology Institute, Bern University SI148701 Alternative products can be used
FXIIa inhibitor Provided by Prof. Christian Heinis' laboratory in EPFL Novel bicyclic peptide
Galeo, coronary guidewire Biotronik, Germany 125497 Alternative products can be used
Guidance catheter Boston Scientific, Florida, USA 34356-06 6F (100 cm, EB3.75). Alternative products can be used
Heparin Sodium Drossapharm, Basel, Switzerland - Liquemin, 25000 U.I./5 ml
High end electrosurgery BOWA, Germany ARC 400 Electrical source for blood suction. Alternative products can be used
Hydro-Guardmini breathing filter Intersurgical, Lithuania 1745000 Filters
Image J National Institute of Health, USA 1.47v Alternative products can be used
Inflation device, Atrion QL2530 Atrion medical product, Alabama, USA 96402 Alternative products can be used
IntelliVue MP 70 Philips, Boeblingen, Germany - Monitor (ECG, heart rate, blood presure and body temperature). Alternative products can be used
KCl Sintetica SA - Potassium chloride 15%
Ketamine Vetoquinol - Narketan, 1ml/100mg
LR-ACT Medtronic 402-01 ACT special syringes
Midazolam Roche - Dormicum, 5mg/ml
Monopolar scalpel Alternative products can be used
Needle holder Alternative products can be used
High resolution camera, PathStand Macro Imaging Stand for Grossing Spotimaging, USA 1080 p HD resolution. Alternative products can be used
PBS In-house preparation - Alternative products can be used
Peripheral venous cannula, 18 G Alternative products can be used
PowerLab 4/35 data acquisition system Adinstruments, Spechbach, Germany -
Rotamax120T Heidolph, Germany 544-41200-00 Shaker. Alternative can be used
Rüschelit-Super Safety Clear Tube Teleflex, Dublin, Irland 112480 Air way tubing, Alternative products can be used
Safe Pico Aspirator Syringes Radiometer 956-622 BGA special syringes
Saline Sintetica Bioren - NaCl 0,9%. Alternative products can be used
Sevorane 1.5% AbbVie AG - Sevorane 250ml 100%
Sheath Cordis, Johnson&Johnson, USA 504-607 A AVANTI + / 7 F, Alternative products can be used
Space infusion pump B.Braun Medical AG, Germany - For infusion of fentanyl. Alternative products can be used
SPR-350 (Millar catheter) Adinstruments, Texas, USA 840-8166 MIKRO-TIP, 5F, 120 cm
Sternotomy saw Alternative products can be used
Sutures ETHICON, Johnson&Johnson, USA Y3110H Monocryl 3-0 SH-1 Plus. Alternative products can be used
Syringes (20, 10 and 5 mL) CODAN,Baar, Switzerland 62.7602,
62.6616,
62.5607
respectively
Used to inject anesthetic materials intramuscularly or directly into the central venous line. Also to inject heparin or FXIIa or the respective control. Alternative products can be used
Thorax spreader Alternative products can be used
Tissue-tek SAKURA, Netherlands 4583 O.C.T. compound
Vascular forceps Alternative products can be used
Xenetix 300 contrast media Guerbet, Zürich, Switzerland - Lobitridol, 300 mg iodide/ml
Xylazine Vetoquinol - Xylapan, 20mg/1 mL
2,3,5-Triphenyltetrazolium choride Sigma-Aldrich, Austria T8877
500 μL tubes (eppendorf) Trefflab, Switzerland 96.08185.9.03 Alternative products can be used

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References

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Miglioramento di un modello di infarto miocardico porcina cassa chiusa tramite la normalizzazione del tessuto e le procedure di campionamento di sangue
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Abdelhafez, M. M., Shaw, J., Wilbs, J., Despont, A., Rieben, R. Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures. J. Vis. Exp. (133), e56856, doi:10.3791/56856 (2018).More

Abdelhafez, M. M., Shaw, J., Wilbs, J., Despont, A., Rieben, R. Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures. J. Vis. Exp. (133), e56856, doi:10.3791/56856 (2018).

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