Summary
Her viser vi en protokoll for å standardisere utvalgstrekking av en etablert porcine modell av akutt hjerteinfarkt for å øke sin translasjonsforskning verdi i forståelsen av i Patofysiologien ved hjerteinfarkt iskemi/reperfusion skade og for å teste romanen narkotika kandidater.
Abstract
Myokardisk iskemi reperfusion (jeg / R) skade bidrar til nesten halvparten av nekrotisk området etter hjerteinfarkt. Dato det er ingen godkjente stoffet å forhindre eller redusere myocardial jeg / R skade. Studien og forståelse av patofysiologiske mekanismer for hjerteinfarkt jeg / R skade er avgjørende for å utvikle vellykket behandlinger. Store dyreforsøkene er et viktig skritt i translasjonsforskning metoder. Porcine modell av akutt hjerteinfarkt er etablert og beskrevet av oss selv og andre. Vi som mål å forbedre verdien av modellen ved å fokusere i detalj på prøvetaking teknikker for bruk i senere eksperimenter. Videre fremheve vi små men viktige trinn som kan påvirke kvaliteten på de endelige resultatene. Å etterligne klinisk situasjonen for hjerteinfarkt jeg / R skade, et PCI-behandling (PCI) kateter ble satt inn i venstre fremre synkende koronar (gutt) av en bedøvet gris. ° ° ° Denne modellen imiterer akutt hjerteinfarkt og PCI behandling hos mennesker med mulighet for nøyaktig bestemme området risiko og den nekrotisk- og levedyktig iskemiske vevet. Her ble modellen brukt til å undersøke effekten av en bisyklisk peptid inhibitor av FXIIa. Modellen kan også endres for å tillate lengre reperfusion ganger å studere senere virkningene av hjerteinfarkt.
Introduction
Iskemisk hjertesykdom, spesielt akutt hjerteinfarkt (MI), er den viktigste dødsårsaken i utviklede land 1. I dag er standard behandling av MI PCI-behandling (PCI), ballong kateter behandling. En av de kritiske faktorene som påvirker livskvalitet og prognosen for pasienter etter PCI-behandlet akutt MI er hjerteinfarkt. Reduksjon av størrelsen kan ha en stor innvirkning på pasienten overlevelse og prognose 2. Hjerteinfarkt iskemi/reperfusion (jeg / R) skade har en betydelig innflytelse på hjerteinfarkt størrelsen slik at en av de viktigste målene i hjerte forskning er å forhindre eller redusere myocardial jeg / R skade 3. Nøyaktig mekanismer for jeg / R skade er fremdeles under etterforskning 4. Aktivering av plasma cascades og endotelceller er kjennemerkene til jeg / R skade 5. Aktivering av koagulering systemet er helt klart involvert 6,7. Nylig rolle FXII, som en tidlig oppstrøms peptid involvert i kontakt fase aktivering av koagulasjonssystemet cascade, har vært vist i en FXII slå ut rotte modell av cerebral jeg / R skade 8. Validering av disse resultatene i en porcine modell er et viktig skritt i klinisk oversettelse. Derfor vi tester en ny bisyklisk (80 kDa protease) FXIIa hemmer i sammenheng med hjerteinfarkt jeg / R skade i en pilotstudie.
Dyr modeller, som etterligner klinisk situasjonen for akutt MI og PCI behandlinger, er avgjørende for å forbedre vår forståelse av i Patofysiologien ved hjerteinfarkt jeg / R skade og teste romanen behandlingstilbud. Griser representerer en god dyr modell for klinisk hjerteinfarkt jeg / R skade. Dette er ikke bare fordi deres hjerter er svært lik menneskenes hjerter med hensyn til anatomi og koronar sirkulasjon, men de også vise lignende patofysiologiske svar til hjerteinfarkt iskemi og reperfusion 9,10. Andre modeller som rotter og mus ikke oppfyller disse kriteriene og viser betydelige forskjeller sammenlignet med menneskenes hjerter 11,12, mens hundene for eksempel har mange flere sivile koronar fartøy sammenlignet med mennesker 13.
Porcine akutt hjerteinfarkt modellen har vært mye brukt i hjerte forskning for å undersøke iskemisk hjertesykdom inkludert hjerteinfarkt jeg / R, skade, 14,,15,,16,,17. Sistnevnte er en betennelsestilstand, på grunn av hvilke minimere den inflammatoriske reaksjonen knyttet til sternotomy eller thoracotomy i åpne-bryst kirurgi er viktig. Lukket kiste modellen med en klinisk C-arm angiography setting overvinner dette problemet. Videre, en av de viktigste punktene er at våre protokollen gir et nøyaktig skille mellom iskemiske (området utsatt, AAR) og ikke-iskemiske områder av venstre ventrikkel (område ikke utsatt, ANR) slik at betennelsessykdommer størrelsen (nekrotisk iskemiske vevet, NIT) kan være nøyaktig bestemt. Vårt mål for denne utredningen er å klart definere en reproduserbar metode av et svin hjerteinfarkt jeg / R skade modell, spesielt med hensyn til hjerteinfarkt vev sampling, noe som vil gi en mer nøyaktig analyse av molekylære mekanismer for I / R skade og klarere bilde av effektene av romanen medikamentelle behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dyr:
Alle dyrene ble behandlet i henhold til retningslinjene sveitsiske nasjonale lover. Studien ble godkjent av lokale dyr eksperimentering komiteen i kantonen Bern (tillatelse ingen. VÆRE 25/16).
Bruke stor hvit griser av begge kjønn (~ 30 ± 5 kg). Dele dyrene blindt inn i to grupper, en gruppe motta en bisyklisk (80 kDa protease) hemmer av FXIIa eller behandling av valg og den andre en inaktiv kontroll.
2. kirurgisk prosedyre (figur 1)
- Anestesi og utarbeidelse av dyret:
- Rask dyr 12t før du starter eksperimentet.
- Pre medisinere dyret med 20 mg/kg ketamin og 2 mg/kg Xylazine via en intramuskulær injeksjon i halsen, på en 10 mL sprøyte. Registrere dyr vekt og kjønn.
- Indusere anestesi ved å injisere 0,5 mg/kg Midazolam og 0,05 mg/kg Atropin i auricular venen. Intubate dyr med en endotracheal tube.
- Opprettholde anestesi ved mekanisk ventilasjon med en respirator (O2/air 1:3, Sevorane 1,5%), en 7-8 mm airway tube og et filter. Justere brøkdel av inspirert oksygen (FiO2) til 35% og Tidalvolum til 6-10 mL/kg.
- Dybden av anestesi vurderes som tilstrekkelig i fravær av motor eller autonome svar på nesen knipe. Palpebral reflekser og kjeven tone var overvåkes kontinuerlig samt målretting avslappet kjeven tone og fravær av palpebral reflekser. Kjernetemperatur var kontinuerlig overvåket og vedlikehold av normothermia (38-38,5 ° C) ble sikret med passiv oppvarming (isolere tepper og varme flasker).
- Dissekere gratis, som tidligere beskrevet av Koudstaal og hans kolleger trinn 3-1 til 3-318, carotis arteriene på begge sider, og cannulate dem med en 7F skjede. Cannulate venstre vena jugularis med en 7F skjede for venøst blod prøvetaking.
- Administrere en bolusdose av 250 µg Fentanyl smertestillende gjennom sentrale venøs linjen etterfulgt av 250 µg/t som en kontinuerlig intravenøs infusjon med en infusjon pumpe. Overvåke kroppstemperatur og hjertefrekvens rytme med en 3-avledningers elektrokardiogram (ECG), arterielle og sentralt venetrykk under hele eksperimentet.
- Bruker standard blod samling rør, trekke følgende planlagte blodprøver fra venøs linje: 5 mL citrerte plasma og 2.9 mL EDTA plasma inn i respektive rørene. Sentrifuge umiddelbart 2000 x g i 15 min på 4 ° C. Ta 2.9 mL blod inn i et serum rør og la koagulere i 30 min ved romtemperatur før sentrifugering som beskrevet ovenfor.
- Aliquot 200 µL av plasma- eller serumprøver i 500 µL rør og lagre alle prøver-80 ° c for videre analyse.
- Trekke 0,5 mL blod fra arteriell linje ved hjelp spesielle blod gass analyse (BGA) sprøyter for å måle BGA bruker BGA maskinen i henhold til produsentens instruksjoner.
- Trekke 0,5 mL blod fra venøs linjen med en standard 2 mL sprøyte og umiddelbart overføre den til ACT kassetten bruker en 30 G nål. Fylt kassetten inn ACT maskinen å måle clotting tid i henhold til produsentens instruksjoner. Se figur 2 for tiden punkter.
- Administrere 5000 IU unfractionated heparin til venøs linjen med en 2 mL sprøyte og tillate dyr å stabilisere seg 20 min før du starter eksperimentet MI.
- Skjermen fungerer hver 30-45 minutter som nevnt i 2.1.11. Injisere 2500 IU unfractionated heparin intravenøst hvis loven er < 180 s.
- Hjerteinfarkt eksperiment
- Bruke en standard C arm fluoroscopy utstyr (koronar angiography program, vinkel 0°, 12 rammens per andre, ~ 70 kV) - eller alternativt en dedikert angiography system - utføre coronary intervensjon.
- Bruke fluoroscopic veiledning for å sette et press kateter (5F, 120 cm) via tidligere plassert skjede i den venstre arteria carotis. Frem til venstre ventrikkel. Koble press kateter til en anskaffelse systemet for å registrere venstre ventrikkel press. Oppkjøpet systemet må kontinuerlig beregne og registrere hjertefrekvens, utviklet press, dP/dt maksimal (contractility av venstre ventrikkel) og dP/dt minimum (avslapning av venstre ventrikkel) under hele eksperimentet. Registrere opprinnelige verdier for 10 min.
- Sette inn en 6F (100 cm, EB3.75) styrende kateter via tidligere plassert skjede i den høyre arteria carotis. Gå videre til venstre koronar nå venstre fremre synkende koronar (gutt) under X-ray veiledning. Sette inn kontrast medium med en 20 mL sprøyte via den styrende kateter utføre en planlagt koronar angiography.
Merk: Injeksjon av kontrast medium ble gjort av manuell Trykk men en dedikert injektor kraftsystemet kan brukes også. - Vurdere størrelsen på GUTTEN på X-ray skjermen å velge riktig størrelse for PCI-behandling (PCI) kateter. Bruk PCI bobler med en lengde på 15-25 mm og diameter mellom 2 og 3,5 mm avhengig GUTTEN. Montere PCI kateter og koronar guidewire (F 014/J, 175 cm). Koble PCI kateter inflasjon enheten forhåndsutfylt med kontrast medium.
Merk: LAD diameteren kan måles direkte på en kalibrert skjerm bruker en linjal og størrelsen på PCI ballongen velges deretter tilsvarende. - Inn den sammensatte systemet fra 2.2.4 lumen av det styrende kateter. Gå til guidewire til GUTTEN før den når utover den andre diagonale grenen av GUTTEN.
- Bruke fluoroscopic veiledning til å fremme PCI kateter før den når om midten av GUTTEN. Velg GUTTEN blokkerer området avhengig av anatomi av coronaries, vanligvis etter andre, noen ganger etter den første diagonale grenen (Figur 3) for å få lignende prosenter av AAR av venstre ventrikkel (LV).
Merk: Valg av webområdet blokkerer avhenger av lengden på diagonal grenene og dermed området av vev som leveres av blod via den aktuelle grenen. Ved en lang blir bifurcated første diagonale grenen sperring sted like etter dette. Ved en kortere første diagonale gren, er blokkering gjort etter den andre diagonalen. - Fjerne guidewire, og deretter øker trykket i inflasjonen enheten til 7-10 bar økning av ballongen av PCI-kateter og indusere myokardisk iskemi for 1 h. gradvis øke FiO2 til 50-60% mellom 15 og 40 min ischemia. Hold Tidalvolum på 6-10 mL/kg.
Merk: Denne fremgangsmåten vil redusere forekomsten av extrasystoles og redusere hyppigheten av ventricular fibrillations. - Post en 5-10 s videosekvens mens injisering kontrast medium gjennom den styrende kateter har en angiografi på ballongen av PCI-kateter sted like etter starter iskemi; Gjenta etter 10 min av iskemi kontrollere komplett okklusjon av GUTTEN distale boble av PCI-kateter.
- Overvåke dyret nøye for å oppdage og behandle (2.2.10) hjertearytmi. Extrasystoles vanligvis oppstår og øke i hyppighet (> 3 per min) mellom 20 og 40 min etter induksjon av myokardisk iskemi. Hvis dette skjer, forsiktig massasje halsen på begge sider like nedenfor kinnet. I de fleste tilfeller vil dette være tilstrekkelig å reetablere vanlige hjerterytme, sannsynligvis ved stimulering av vagal nerve baroreceptors på carotis.
- Hvis hjertearytmi fremgang i ventrikkelflimmer, kan du bruke en ekstern, bifasisk defibrillator for å reetablere en sinus rytme. Bruke 5-10 brystkompresjon bruker defibrillator pads umiddelbart før sjokket for å fylle coronaries med oksygenrikt blod og deretter støt med 150 J (for 30 kg dyr).
- Gjenta om nødvendig og øke energien til 175 J sjokket 3rd . Bruk høyere strømsparingsinnstillingene for tyngre dyr.
- Fem minutter før slutten av iskemi tiden gjenta blod prøvetaking nevnt i 2.1.8-2.1.13. Injisere test stoffet (enten den bisyklisk FXIIa inhibitor eller kontrollere 4 mg/kg, gjør dette dette blindt) intravenøst gjennom sentrale venøs linje og flush linjen med 20 mL saltvann.
- Trekke en plasmaprøve citrate (som nevnt i 2.1.8 og 2.1.9) 4 min etter sprøytebruk stoffet i 2.2.12.
- Utføre en angiografi (2.2.3) for å bekrefte GUTTEN okklusjon, så deflate boblen av PCI-kateter denne kateter fra den styrende kateter. Bekreft perfusjon av GUTTEN distale til området okklusjon angiografi umiddelbart etter deflasjon og fjerning av boblen av PCI kateter, 10 min etter når tegn på myokardisk iskemi var synlig ved ECG for mer enn 5 min, og umiddelbart før Re okklusjon av GUTTEN.
- Tillate reperfusion av iskemiske myokard 2 h. Ta plasma og serum prøver 10, 30, 60 og 115 minutter av reperfusion (2.1.8 og 2.1.9). Overvåke BGA 60 og 115 minutter (2.1.10).
- Sett inn PCI-kateter sammen med guidewire til nøyaktig samme posisjon som brukes for ischemia. Økning av ballongen av PCI kateter som før og Bekreft GUTTEN okklusjon angiografi (2.2.3). Fjerne press kateter fra venstre ventrikkel og stoppe innspillingen.
- Injisere 100 mL 2% blå Evans i fosfat bufret saltvann (PBS, pH 7.4) i sentrale venøs linje. Ca 30 s senere, når hele dyret blir blå, injisere 40 mL 20% KCl å avlive dyrene. Død ble bekreftet av fravær av EKG-signaler og puls bølger.
3. prøvetaking teknikker
-
Utpakking, dissekere og prøvetaking hjertet (figur 4)
- Utføre en sternotomy å avsløre hjertet. Følg protokollen tidligere beskrevet av Koudstaal og kolleger, trinn 8-2 og 8-318. Klipp opp pericardium mens inspiseres for unormalt, som kan stamme fra tidligere Perikarditt og utelukke dyret fra videre evaluering.
- Tømming og fjerne PCI samt den styrende kateter. Avgiftsdirektoratet hjertet for videre analyse. Skjær vena cava og fjern blod ved hjelp av et inntaks-pumpe, og deretter klippe alle store fartøyene koble hjertet med kroppen.
- Skyll hjertet innvendig og utvendig med romtemperatur saltvann. Veie hele hjerte.
- Innen 30-40 minutter, skivet hjertet av ca 3-5 mm fra toppen til Chordae tendinae av Mitralklaff, vinkelrett på den lange aksen med en skarp kniv.
- Pass på å alltid plassere hjertet i samme retning med ventral side vendt opp for å holde retningen på kutt prøvene (figur 5).
- Fotografere skiver av hjertet bruker et digitalt speilreflekskamera.
- Klippe bort høyre ventrikkel (kast som ikke nødvendig). Fotografere venstre ventrikkel skiver og veie alle sektorene for den totale vekten av venstre ventrikkel.
- Skille mellom Evans blå positiv og Evans blå negative vev i alle delene. Dissekere skiver for å skille den iskemiske (Evans blå negativ) fra ikke-iskemiske vevet (Evans blå positiv) ved hjelp av en skalpell.
- Først analysere Evans blå negative delene (iskemiske området utsatt, AAR). Veie dem og sette dem alle i en plastbeholder.
- Dekke skiver helt med 100-150 mL (i hjertet størrelsen) triphenyl tetrazolium chloride løsning (2 g TTC, 16 g dekstran, molekylvekt 48000-90000, i 200 mL PBS, nylagde) slik at hjertet brikkene kan bevege seg fritt i løsningen. Dekket beholderen og ruge etter 20 min på 37 ° C mens forsiktig risting.
- Under denne 20 min incubation tid veie Evans blå positiv deler (området ikke utsatt, ANR), ta prøver for vev-Tek innebygging (Velg den mest distale del fra skaden) og lagre-80 ° c for videre analyse. Overføre resten til 4% formaldehyd løsning og lagre ved romtemperatur for histology deler.
- Fjerne deler av AAR fra TTC løsning. Rød farget vevet er levedyktig iskemiske vevet (VIT) og ikke-farget vevet er nekrotisk iskemiske vevet (NIT). Klipp 2 små biter (blokker av 2-3 mm) fra både NIT og VIT, bygge dem inn i vev - Tek og lagre-80 ° c for videre analyse. Disse prøvene skal ha samme vekt.
- Fikse resten av brikkene (alle skiver avledet fra AAR) ved å feste dem i en Styrofoam beholder og dekker helt med 4% formaldehyd løsning 24 timer ved romtemperatur i avtrekksvifte. Bitene bør holde flatt for fotografisk dokumentasjon i neste trinn.
- Neste dag fotografi begge brikkene med en høy oppløsning kamera med samme zoominnstilling og avstand fra vev (samme forstørrelse). Legge til automatiske skala barer til alle bilder. Alle må ha samme lengde.
Merk: Høyoppløselig kameraet skal kobles til programvare som automatisk legger baren skala til hvert bilde.
-
Beregningen av AAR og betennelsessykdommer størrelse
- % AAR av venstre ventrikkel = (vekten av AAR g / vekt av venstre ventrikkel g) * 100.
- Bruk ImageJ programvare for å beregne det samlede arealet av både AAR og NIT (begge sider av hvert) basert på fotografiene.
- Juster skalaen bar ved å velge skala bar lengde med den rette linjen fra verktøyet vinkel. Velg menyen analyser > Angi skala og sette inn kjent distanse og enhet av baren skala. Velg "global" så samme skala vil bli brukt på alle bilder.
- Merk hele arealet av vev med markeringsverktøyet frie hender til å beregne AAR. Pass på at du ikke inkluderer siden (høyde) av vev og/eller fettvev (figur 6-C).
- Angi målingen ved å velge "området" og "Vis etiketten" fra analyser > angi mål-menyen. Måle areal fra analyser > mål.
- Gjenta trinn 3.2.5 å måle NIT (merke bare ikke-farget vev). Merk: Ikke ta fettvev (figur 6-D) i NIT beregningen. Gjenta trinnet på den andre siden av vev.
- Beregn gjennomsnittet AAR og NIT for hver del av vev.
- Bruke verdier fra 3.2.7 til å beregne NIT som en prosent av AAR:% NIT av AAR = (Σ gjennomsnittlig areal på NIT i cm2/ Σ gjennomsnittlig areal på AAR i cm2) * 100.
- To forskjellige etterforskere bør gjenta metoden ovenfor. Akseptabel er forskjell < 10%.
-
Ischemia markører
- Bruke EDTA plasmaprøver, som tidligere har blitt lagret på-80 ° C (2.1.9 Tool) for å måle nivået av cardiac troponin-jeg bruker en enkelt-plex Luminex-type analysen som tidligere beskrevet 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En dyr døde tidlig før administrasjonen av FXIIa hemmer eller kontroll peptid på grunn av en teknisk feil (plutselig fall i blodtrykket under iskemi tid, før tillegg av test). En dyr ble ekskludert fra gruppen FXIIa hemmer fordi ingen iskemi/reperfusion skade ble observert på grunn av anatomi av venstre fremre synkende subclavia (gutt). En stor del av venstre ventrikkel, inkludert apex, var parfyme av den sirkumfleks arterien i dette dyret. Dyrene i den endelige analysen var n = 2 i bisyklisk FXIIa peptid hemmer gruppen (mener vekt 27.5 + 2,5 kg) og n = 3 mottar en inaktiv bisyklisk kontroll peptid (mener vekten av 29 ± 0,8 kg).
X-ray video tenkelig / koronar angiography hjertets gris brukes å visualisere plasseringen av press kateter og bestemme hvor å blokkere GUTTEN (figur 3A). Figur 3B viser catheter stillingen, blokkerer blodstrømmen distale til andre diagonale grenen. Sammenligning av figur 3A og 3B kan også en vurdering som en del av GUTTEN levert myokard blir iskemiske. På slutten av 2t reperfusion perioden er PCI kateter gjeninnføres og oppblåst i samme posisjon som det var i ischemia. Evans blå da injiseres intravenøst å nøyaktig bestemme AAR (figur 5A). Etter excision av hjertet, er venstre ventrikkel skiver i 3-5 mm tykk inndelinger fra toppen til mitral ventil, vinkelrett på den lange aksen. AAR og ANR tydelig grenser til Evans blå flekker på sektorene. AAR og ANR prøvetaking områder vises i figur 5B.
AAR, uttrykt som prosent av LV, viser ingen statistisk signifikante forskjeller mellom FXIIa behandlet gruppen og kontrollgruppen (figur 6A). Betennelsessykdommer størrelsen (NIT/AAR) viser ingen forskjeller mellom gruppene enten (bruker ikke-parametriske Mann-Whitney test, p > 0,05, figur 6B). Disse data tyder på at FXIIa hemmer alene, brukte konsentrasjon og varigheten av programmet, ikke kan beskytte hjertet fra hjerteinfarkt jeg / R skade. Figur 6C og 6 D viser hvordan du merker AAR og NIT grenser for å nøyaktig og reproduserbar måle respektive flater.
Blod prøvetaking strategien tillater utgivelsen av Hjertemuskel skade markør cardiac troponin-jeg over tid. Det er nesten ingen forskjell etter en Times iskemi i den opprinnelige planen mens etter reperfusion det er en kontinuerlig økning over tid som vist i figur 7. For troponin-jeg, Inter gruppe forskjellene var heller ikke betydelig i disse eksperimentene.
Figur 1 . Oversikt over eksperimentell tidslinjen. Skjematisk tidslinje for de viktige trinnene i hjerteinfarkt iskemi/reperfusion skade modellen. Planlagte koronar visualisering, starttid for ischemia, overvåking hjertearytmi og injisere test stoffet er viktige skritt i eksperimentet. Bruk av eksakt tidspunkt i alle eksperimentene sikrer reproduserbarhet. Euthanizing animal og excision hjertets bør gjøres innen 15-20 min etter ferdigstillelse av 2t reperfusion fasen. KCl: kalium klorid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Tidslinje over blod prøvetaking og analyse. Tidspunkt for blodprøve angis sammen med typen antikoagulerende brukes. Tapp kan tas eksperiment og analytter som skal måles. ACT: aktivert clotting tid, BGA: blod gass analyse, RT: romtemperatur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Koronar angiography. Fluoroscopic visning av (A) de venstre coronaries ved baseline, de gule pilene peker til først og andre diagonale grener, hvite pilen viser hjertet apex (B) okkludert GUTTEN viser ingen flyt området av venstre ventrikkel (LV), den røde pilen peker til PC Jeg kateter (C) å nedleggelse av GUTTEN på slutten av reperfusion med boblen av PCI kateter settes inn på nytt til det samme området i GUTTEN som under ischemia. CX: sirkumfleks koronar, LAD: venstre fremre synkende koronar, MC: Millar kateter, inn i venstre ventrikkel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Skjematisk diagram av vev prøvetaking. Eksakt tidspunkt for hjertet disseksjon og utvalg av de forskjellige områdene for videre analyse. Tidslinjen starter på 205 min etter begynnelsen av iskemi, 20 min etter opphør av dyr eksperimentet. Det er viktig å ruge avsnittene vev i TTC maksimalt 40 min etter euthanizing dyrene. Utvalg av ANR, VIT og NIT vises som hvite firkanter. Rugende AAR i 4% formaldehyd kan klart skille mellom NIT og VIT for nøyaktig bestemmelse av betennelsessykdommer. AAR: området i faresonen, ANR: ikke med risiko, LV: venstre ventrikkel, NIT: nekrotisk iskemiske vevet, OTC: vev-Tek, RV: høyre ventrikkel, TTC: triphenyl tetrazolium chloride, VIT: levedyktig iskemiske vevet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . På plass differensiering mellom risiko (AAR) og ikke i faresonen ANR. (A) representativt bilde av hele hjertet like etter sternotomy på slutten av eksperimentet. (B) representativt bilde viser 3-5 mm tykk venstre ventrikkel skiver etter disseksjon. AAR og ANR er klart definert, angitt av gule piler, og den hvite pil viser ANR Prøvetakingsområdet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 . Iskemi og betennelsessykdommer størrelse. (A) den prosentvise vekten av AAR av venstre ventrikkel (LV). (B) prosent areal på NIT av AAR. (C) et representativt bilde av AAR beregningen. (D) et representativt bilde av NIT beregningen. Den hvite pil viser Prøvetakingsområdet VIT og den svarte pilen viser NIT Prøvetakingsområdet. Dataene ble beregnet ved hjelp av ImageJ programvare. Vises som prikker for hver enkelt eksperimentere med angivelse av mener ±± SD. kontrollgruppen, n = 3 og FXIIa inhibitor behandlet gruppe, n = 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 . Hjertemuskel skade markør. Cardiac troponin-jeg konsentrasjon over tid i pg/ml av både kontrollen og FXIIa inhibitor behandlet gruppe. Blodet ble samlet inn fra vena jugularis i EDTA plasma rør på grunnlinjen, slutten av iskemi og flere tidspunkt under reperfusion og kardial troponin-jeg ble målt ved single-plex suspensjon matrise (Bio-Plex). Dataene vises som prikker for hver enkelt eksperimentere med angivelse av mener ±± SD. kontrollgruppen, n = 3 og FXIIa behandlet gruppen n = 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hjerteinfarkt jeg / R skade har en betydelig effekt på siste betennelsessykdommer størrelse som oversettes direkte til pasientens prognose etter akutt hjerteinfarkt3. Forstå i Patofysiologien ved hjerteinfarkt jeg / R skade er første skritt for å redusere eller hindre den. Hjerteinfarkt jeg / R skade er en akutt tilstand som oppstår direkte etter reperfusion av okkludert fartøyene. Jeg / R skade fører til aktivering av medfødte immunforsvaret og cellular skade oppstår på stedet av reperfusion og de omkringliggende vev20. En fersk studie viste en forbedring i nevrologiske utfallet i en rotte modell av hjernen jeg / R skade når behandlet med FXIIa hemmer8. Men i gjeldende pilotstudien vi fant ingen effekt av den bisyklisk FXIIa hemmer på hjerteinfarkt jeg / R skade. Den brukte FXIIa inhibitor er romanen sin farmakokinetikken i griser er ennå ikke kjent. Derfor kan observert mangelen på effekten forårsakes av upassende dosering eller program. Dette må rettes i oppfølgingsstudier.
Standardisere en dyremodell er viktig å undersøke i dybden i Patofysiologien ved hjerteinfarkt jeg / R skade og bringe egnet løsninger til klinikker. Undersøker i Patofysiologien ved hjerteinfarkt jeg / R skade krever god og representative utvalg for å studere mobilnettet mekanismene bak den. Den svin lukket kiste hjerteinfarkt jeg / R skade modellen gir en reproduserbar metode, som er nær klinisk situasjonen, og nyttig å forstå cellulære mekanismer og test romanen nye therapeutics. Varianter av den nåværende modellen har blitt beskrevet før for nevnte formål14,17,18.
Våre protokollen for hjerteinfarkt i griser trenger ikke forbehandling med amiodarone som beskrevet tidligere18,21. Vi brukte carotis sinus massasje for å redusere hjertearytmi og bifasisk defibrillator for cardioconversion ved ventrikkelflimmer. Bruk av carotis sinus massasje er klinisk kjent for å påvirke atrieflimmer22, men så langt har det ikke vært vist å forebygge eller forsinke utbruddet av ventrikkelflimmer i MI, i mennesker eller gris modeller. Videre bidrar bruk av desflurane til å redusere ventrikulær arytmi samt dødelighet i porcine modell av akutt hjerteinfarkt23.
For å sikre reproduserbarhet og redusere risikoen for trombose under eksperimentet, flere doser heparin ble injisert basert på gjentatte måling av ACT, snarere enn benytter fast heparin doser som beskrevet for eksempel av Koudstaal et al18. En kontrollert mengde heparin administrasjon hjelper for å undersøke koagulasjonssystemet cascade i sammenheng med jeg / R skade. Evans blå lar nøyaktig bestemmelse av AAR/LV. Intravenøs injeksjon av Evans blå etter re okklusjon av GUTTEN på nøyaktige stedet under iskemi induksjon under fluoroscopic veiledning fører til blå flekker av hele grisen inkludert ikke-iskemiske delen av hjertet med minimal effekt på ANR myokard og blodkar. Evans Blue er en kjent cytotoksiske stoff24. Gjeldende eksperimentene var avgjørende for å opprettholde levedyktigheten til endothelial celle laget i ANR i hjertet blodkar for å bruke det som privatperson intra kontrollerer så 100 mL Evans blå ble injisert systemisk og fortynnet med fullblod redusere sin toksisitet. Tidligere i en lignende innstilling cellene 50 ml 2% Evans blå ble injisert direkte inn coronaries øker risikoen for sin cytotoksisitet til hjerte25. Det neste viktige skrittet var å dissekere hjertet direkte i 3-5 mm skiver fra toppen mitral ventil (den nøyaktige plasseringen i hvert dyr) og benytter denne metoden for å gjøre en nøyaktig beregning av AAR som en prosentandel av venstre ventrikkel.
Gjeldende beskrivelsen av metoden gir finere detaljer som tidligere ikke vært beskrevet. Rugende TTC farget delen i 4% formaldehyd i 24 timer gir et klart skille mellom levedyktig (rød) og nekrose (hvit) vev, som til slutt øker reproduserbarhet av prøvetaking for ytterligere molekylær flekker. Blod prøvetaking strategien over 2 timer med reperfusion gjør påvisning av nylig uttrykt molekyler i de tidlige (10 og 30 min) stadiene av reperfusion samt senere (60 og 120 min). Riktig blod og vev prøvetaking og oppbevaring er også avgjørende for analyse av plasma gjennomgripende markører som uttrykk for supplement og koagulering proteiner.
Gjeldende protokollen kan endres for å ha lengre reperfusion tid, fra noen timer til dager. Dette gjør forskeren undersøke senere konsekvensene av jeg / R skader på hjertet og gjør også testing av romanen narkotika og vurdering av deres effekter. Begrensning av gjeldende protokollen er bruken av et press-tip kateter for måling av hjertefunksjon. Mer pålitelige data om hjertefunksjon kan oppnås ved bruk av et trykk volum loop målesystem. Oppsummert det aktuelle metoden gir detaljert viktige trinn kreves for å øke reproduserbarhet av svin lukket brystet hjerteinfarkt jeg / R skade modellen når tiltenkt bruk av modellen er å studere cellulære og molekylære endringer i sammenheng med studere hjerteinfarkt jeg / R skade patofysiologi eller studere romanen behandlingsalternativer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklære noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne Professor Christian Heinis for å gi den FXIIa inhibitor og respektive kontrollen. Vi erkjenner også takknemlig Olgica Beslac, Dr. Daniel Mettler og Kay Nettelbeck fra Experimental kirurgi enhet, avdeling for biomedisinsk forskning, Universitetet i Bern kundestøtte. Celine Guillod og Matthias Rausch fra departementet for diagnose og Interventional Pediatric radiologi, Bern universitetssykehus, Inselspital gitt støtte med X-ray og teknikker. Dette prosjektet ble finansiert av Swiss National Science Foundation, prosjektet nr. 320030_156193. Vi ønsker også å takke Mr. Reto Haenni fra kommunikasjon og markedsføring, Bern universitetssykehus, Inselspital for videoopptak eksperimentet vårt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABL 90 Flex, blood gas analyser | Radiometer | - | Blood gas analysis (BGA) |
| ACT Plus | Medtronic | - | Activated clotting time |
| Atropin | Sintetica | - | Atropinum Sulfas, 0,5mg/ml |
| Balance (20-500 Kg) | NAGATA Scale, Tiwan | HTB/HTR | Alternative products can be used |
| Balance (21-4200 g) | Mettler toledo, Switzerland | MS4002SDR | Alternative products can be used |
| Blood collection tubes: EDTA, citrate and serum | S-Monovette, Nuembrecht, Germany | 05.1167.001, 05.1071.001 and 05.1557.001 respectively |
Alternative products can be used |
| BV Pulsera mobile C-arm | Philips | - | Alternative products can be used |
| Centrifuge | Labcare, UK | ALC PK120R | Alternative products can be used |
| Defibrillator Lifepak 12 | Medtronic | - | Alternative products can be used |
| Dextran from Leuconostoc mesenteroides | Sigma-Aldrich, Germany | D3759 | Average M.wt 48000-90000 |
| Digital single lens reflex camera | Sony, Thailand | DSLR-A500/A550 | Alternative products can be used |
| Dissecting forceps | Alternative products can be used | ||
| EMPIRA RX PCI dilatation catheter | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 85R15300S | Diameter 3 mm, length 15 mm, Alternative products can be used |
| EMPIRA RX PCI dilatation catheter | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 85R15350S | Diameter 3.5 mm, length 15 mm, Alternative products can be used |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich, Germany | E2129 | Toxic |
| Fabius GS premium respirator | Dräger, Lübeck, Germany | - | Anesthesia work station, Alternative products can be used |
| Fentanyl | Inselspital ISPI | - | Fentanyl 2500mcg/50ml |
| Formaldehyde | Pathology Institute, Bern University | SI148701 | Alternative products can be used |
| FXIIa inhibitor | Provided by Prof. Christian Heinis' laboratory in EPFL | Novel bicyclic peptide | |
| Galeo, coronary guidewire | Biotronik, Germany | 125497 | Alternative products can be used |
| Guidance catheter | Boston Scientific, Florida, USA | 34356-06 | 6F (100 cm, EB3.75). Alternative products can be used |
| Heparin Sodium | Drossapharm, Basel, Switzerland | - | Liquemin, 25000 U.I./5 ml |
| High end electrosurgery | BOWA, Germany | ARC 400 | Electrical source for blood suction. Alternative products can be used |
| Hydro-Guardmini breathing filter | Intersurgical, Lithuania | 1745000 | Filters |
| Image J | National Institute of Health, USA | 1.47v | Alternative products can be used |
| Inflation device, Atrion QL2530 | Atrion medical product, Alabama, USA | 96402 | Alternative products can be used |
| IntelliVue MP 70 | Philips, Boeblingen, Germany | - | Monitor (ECG, heart rate, blood presure and body temperature). Alternative products can be used |
| KCl | Sintetica SA | - | Potassium chloride 15% |
| Ketamine | Vetoquinol | - | Narketan, 1ml/100mg |
| LR-ACT | Medtronic | 402-01 | ACT special syringes |
| Midazolam | Roche | - | Dormicum, 5mg/ml |
| Monopolar scalpel | Alternative products can be used | ||
| Needle holder | Alternative products can be used | ||
| High resolution camera, PathStand Macro Imaging Stand for Grossing | Spotimaging, USA | 1080 p HD resolution. Alternative products can be used | |
| PBS | In-house preparation | - | Alternative products can be used |
| Peripheral venous cannula, 18 G | Alternative products can be used | ||
| PowerLab 4/35 data acquisition system | Adinstruments, Spechbach, Germany | - | |
| Rotamax120T | Heidolph, Germany | 544-41200-00 | Shaker. Alternative can be used |
| Rüschelit-Super Safety Clear Tube | Teleflex, Dublin, Irland | 112480 | Air way tubing, Alternative products can be used |
| Safe Pico Aspirator Syringes | Radiometer | 956-622 | BGA special syringes |
| Saline | Sintetica Bioren | - | NaCl 0,9%. Alternative products can be used |
| Sevorane 1.5% | AbbVie AG | - | Sevorane 250ml 100% |
| Sheath | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 504-607 A | AVANTI + / 7 F, Alternative products can be used |
| Space infusion pump | B.Braun Medical AG, Germany | - | For infusion of fentanyl. Alternative products can be used |
| SPR-350 (Millar catheter) | Adinstruments, Texas, USA | 840-8166 | MIKRO-TIP, 5F, 120 cm |
| Sternotomy saw | Alternative products can be used | ||
| Sutures | ETHICON, Johnson&Johnson, USA | Y3110H | Monocryl 3-0 SH-1 Plus. Alternative products can be used |
| Syringes (20, 10 and 5 mL) | CODAN,Baar, Switzerland | 62.7602, 62.6616, 62.5607 respectively |
Used to inject anesthetic materials intramuscularly or directly into the central venous line. Also to inject heparin or FXIIa or the respective control. Alternative products can be used |
| Thorax spreader | Alternative products can be used | ||
| Tissue-tek | SAKURA, Netherlands | 4583 | O.C.T. compound |
| Vascular forceps | Alternative products can be used | ||
| Xenetix 300 contrast media | Guerbet, Zürich, Switzerland | - | Lobitridol, 300 mg iodide/ml |
| Xylazine | Vetoquinol | - | Xylapan, 20mg/1 mL |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium choride | Sigma-Aldrich, Austria | T8877 | |
| 500 μL tubes (eppendorf) | Trefflab, Switzerland | 96.08185.9.03 | Alternative products can be used |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update. Circulation. 133, e338-e360 (2016).
- Miller, T. D., et al. Infarct size after acute myocardial infarction measured by quantitative tomographic 99mTc sestamibi imaging predicts subsequent mortality. Circulation. 92, 334-341 (1995).
- Ovize, M., et al. Postconditioning and protection from reperfusion injury: where do we stand? Position Paper from the Working Group of Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovasc Res. 87, 406-423 (2010).
- Neri, M., Riezzo, I., Pascale, N., Pomara, C., Turillazzi, E. Ischemia/Reperfusion Injury following Acute Myocardial Infarction: A Critical Issue for Clinicians and Forensic Pathologists. Mediators Inflamm. 2017, 1-14 (2017).
- Yang, Q., He, G. -W., Underwood, M. J., Yu, C. -M. Cellular and molecular mechanisms of endothelial ischemia/reperfusion injury: perspectives and implications for postischemic myocardial protection. Am J Transl Res. 8, 765-777 (2016).
- Massberg, S., et al. Platelet-Endothelial Cell Interactions During Ischemia/Reperfusion: The Role of P-Selectin. Blood. 92, 507-515 (1998).
- Wang, J., et al. Antithrombin is protective against myocardial ischemia and reperfusion injury. J Thromb and Haemost. 11, 1020-1028 (2013).
- Hopp, S., et al. Targeting coagulation factor XII as a novel therapeutic option in brain trauma. Ann Neurol. 79, 970-982 (2016).
- Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. J Anat. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
- Heusch, G., Skyschally, A., Schulz, R. The in-situ pig heart with regional ischemia/reperfusion - ready for translation. J Mol Cell Cardiol. 50, 951-963 (2011).
- Poirier, P. Exercise, heart rate variability, and longevity: the cocoon mystery? Circulation. , 2085-2087 (2014).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacol Ther. 141, 235-249 (2014).
- Bloor, C. M., White, F. C. Functional development of the coronary collateral circulation during coronary artery occlusion in the conscious dog. Am J Pathol. 67, 483-500 (1972).
- Banz, Y. Locally targeted cytoprotection with dextran sulfate attenuates experimental porcine myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 26, 2334-2343 (2005).
- Krombach, G. A., Kinzel, S., Mahnken, A. H., Günther, R. W., Buecker, A. Minimally Invasive Close-Chest Method for Creating Reperfused or Occlusive Myocardial Infarction in Swine. Invest Radiol. 40, 14 (2005).
- Suzuki, Y., Lyons, J. K., Yeung, A. C., Ikeno, F. In vivo porcine model of reperfused myocardial infarction: in situ double staining to measure precise infarct area/area at risk. Catheter Cardiovasc Interv. 71, 100-107 (2008).
- McCall, F. C., et al. Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine. Nat Protoc. 7, 1479-1496 (2012).
- Koudstaal, S., et al. Myocardial infarction and functional outcome assessment in pigs. J Vis Exp. , e51269 (2014).
- Kamat, P., et al. Dexrazoxane Shows No Protective Effect in the Acute Phase of Reperfusion during Myocardial Infarction in Pigs. PLoS One. 11, e0168541 (2016).
- Carden, D. L., Granger, D. N. Pathophysiology of ischaemia-reperfusion injury. J Pathol. 190, 255-266 (2000).
- Pérez de Prado, A., et al. Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).
- Lown, B., Levine, S. A. The carotid sinus. Clinical value of its stimulation. Circulation. 23, 766-789 (1961).
- Regueiro-Purriños, M., et al. Ventricular Arrhythmias and Mortality Associated with Isoflurane and Sevoflurane in a Porcine Model of Myocardial Infarction. J Am Assoc Lab Anim Sci. , (2011).
- Roberts, L. N. Evans blue toxicity. Can Med Assoc J. 71, 489-491 (1954).
- Ellenbroek, G. H. J. M., et al. Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction. J Vis Exp. , e54021 (2016).
