Summary
Här visar vi ett protokoll för att standardisera förfaranden för provtagning av en etablerad svin modell av akut hjärtinfarkt för att öka dess translationell värde i förståelsen av patofysiologin av myokardischemi/reperfusion skada och att testa nya läkemedelskandidater.
Abstract
Myokardischemi reperfusion (jag / R) skada bidrar till nästan hälften av det nekrotiska området efter hjärtinfarkt. Hittills finns inga godkända läkemedel för att förebygga eller minska hjärtinfarkt jag / R skada. Studien och förståelse av de patofysiologiska mekanismerna av hjärtinfarkt I / R skada är nödvändigt att utveckla framgångsrika behandlingar. Stora djurförsök är ett viktigt steg i translationell metoder. Svin modell av akut hjärtinfarkt har etablerat och beskrivs av oss själva och andra. Vi syftar till att ytterligare förbättra värdet av modellen genom att fokusera närmare på provtagning teknik för användning i framtida experiment. Dessutom betonar vi små men viktiga steg som kan påverka kvaliteten på de slutliga resultaten. Att efterlikna den kliniska situationen av hjärtinfarkt jag / R skada, en perkutan koronar intervention (PCI) kateter infogades i vänster främre fallande kranskärl (LAD) av en sövda gris. ° ° ° Denna modell härmar akut hjärtinfarkt och PCI behandling hos människor med möjligheten att exakt bestämma området på risk samt den nekrotiska- och livskraftig ischemisk vävnad. Här användes modellen för att undersöka effekten av en bicykliska peptid hämmare av FXIIa. Modellen kan också ändras för att tillåta längre reperfusion gånger att studera senare effekter av hjärtinfarkt.
Introduction
Ischemisk hjärtsjukdom, särskilt akut hjärtinfarkt (MI), är den främsta dödsorsaken i utvecklade länder 1. Idag är standardbehandling av MI perkutan koronar intervention (PCI), ballong kateter behandling. En av de kritiska faktorerna som påverkar livskvalitet och prognos för patienter efter PCI-behandlade akut hjärtinfarkt är infarkt storlek. Minskning av storleken kan ha en stor inverkan på patientens överlevnad och prognos 2. Myokardischemi/reperfusion (jag / R) skada har ett betydande inflytande på infarkt storlek så en av de viktigaste målen i kardiovaskulär forskning är att förebygga eller minska hjärtinfarkt jag / R skada 3. De exakta mekanismerna av I / R skador är fortfarande under utredning 4. Aktivering av plasma kaskader och endotelceller är kännetecken av I / R skada 5. Aktivering av koagulering systemet är tydligt inblandade 6,7. Nyligen, FXII, roll som en tidig uppströms peptid som är inblandade i kontakt fas aktivering av koagulationskaskaden, har visat i en FXII knocka råtta modell av cerebral jag / R skada 8. Validering av dessa resultat i en svin modell är ett viktigt steg i kliniska översättning. Därför testar vi en ny bicykliska (80 kDa) FXIIa proteashämmare i samband med hjärtinfarkt jag / R skada i en pilotstudie.
Djurmodeller, som efterliknar den kliniska situationen akut MI och PCI behandlingar, är nödvändigt att förbättra vår förståelse av patofysiologin bakom hjärtinfarkt jag / R skada och att testa nya behandlingsalternativ. Svin representerar en bra djurmodell för klinisk hjärtinfarkt jag / R skada. Detta är inte bara eftersom deras hjärtan är mycket liknande till människors hjärtan med avseende på anatomi och koronar omsättning, men de visar också liknande patofysiologiska Svaren till myokardiell ischemi och reperfusion 9,10. Andra modeller som råttor och möss inte uppfyller dessa kriterier och visar stora skillnader jämfört med människors hjärtan 11,12, medan hundar exempelvis har många fler säkerheter koronar fartyg jämfört med människor 13.
Svin akut hjärtinfarkt modellen har använts i kardiovaskulär forskning för att undersöka ischemisk hjärtsjukdom inklusive hjärtinfarkt jag / R skada 14,15,16,17. Det senare är ett inflammatoriskt tillstånd, följd av som minimerar den inflammatoriska reaktionen relaterade till sternotomi eller torakotomi används i öppet-Kista kirurgi är viktigt. Den slutna bröst modell med en klinisk C-arm angiografi inställning övervinner detta problem. Dessutom är en av de viktigaste punkterna att våra protokoll ger en korrekt åtskillnad mellan ischemisk (område i riskzonen, AAR) och icke-ischemiska områden av den vänstra ventrikeln (område inte i riskzonen, ANR) så att storleken infarct (nekrotisk ischemisk vävnad, NIT) kan noggrant bestämmas. Vårt mål för denna uppsats är att tydligt definiera en reproducerbar metod för ett svin hjärtinfarkt jag / R skador modell, i synnerhet med avseende på hjärtinfarkt vävnad provtagning, vilket kommer att möjliggöra en mer exakt analys av molekylära mekanismer av I / R skada och en tydligare bild av effekterna av nya läkemedelsbehandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. djur:
Alla djur behandlades enligt riktlinjerna i de schweiziska nationella lagarna. Studien var godkänd av utskottet lokala djurförsök på cantonen av Bern (tillstånd ingen. VARA 25/16).
Använda stora vita grisar av båda könen (~ 30 ± 5 kg). Dela djuren blint i två grupper, en grupp som får en bicykliska (80 kDa) proteashämmare av FXIIa eller behandling av val och den andra en inaktiv kontroll.
2. kirurgiska ingrepp (figur 1)
- Anestesi och beredning av djur:
- Snabbt djuren för 12 h innan experimentet.
- Pre medicinera djuret med 20 mg ketamin och 2 mg/kg xylazin via intramuskulär injektion i halsen, med en 10 mL-spruta. Registrera djurens vikt och kön.
- Inducera anestesi genom att injicera 0,5 mg Midazolam och 0,05 mg/kg Atropin i auricular ven. Intubation djuret med en endotrakealtub.
- Underhåll av anestesi av mekanisk ventilation med hjälp av en respirator (O2/air 1:3, Sevorane 1,5%), en 7-8 mm luftvägarna slang eller ett filter. Justera del av inspirerade syre (FiO2) 35% och tidalvolymen 6-10 mL/kg.
- Djup av anestesi bedöms som tillräckliga i avsaknad av antingen motoriska eller autonoma Svaren till näsan klämmande. Palpebrala reflexer och käken tonen övervakades kontinuerligt samt inriktning avslappnad käke tonen och avsaknad av palpebrala reflexer. Kärntemperatur övervakades kontinuerligt och underhåll av normothermia (38-38,5 ° C) säkerställdes med passiv uppvärmning (isolerande filtar och varma flaskor).
- Dissekera gratis, som tidigare beskrivits av Koudstaal och hans kollegor steg 3-1 till 3-318, halspulsåder på båda sidor och cannulate dem med en 7F slida. Cannulate den vänstra halsvenen med en 7F slida för venös blodprovstagning.
- Administrera en bolusdos av 250 µg Fentanyl smärtstillande genom den central venkateter följt av 250 µg/h som kontinuerlig intravenös infusion med infusionspump. Övervaka kroppstemperatur, puls och rytm med en 3-avlednings EKG (EKG), arteriella och centrala venösa trycket under hela experimentet.
- Använder standard blod insamling rör, frånträda venkateter följande baslinjen blodproverna: 5 mL citrerade plasma och 2,9 mL EDTA-plasma in i respektive rören. Centrifugera omedelbart vid 2000 x g i 15 minuter vid 4 ° C. Beakta en serum tube 2,9 mL blod och låt koagulera i 30 min i rumstemperatur före centrifugering som beskrivs ovan.
- Alikvotens 200 µL plasma eller serum till 500 µL rör och lagra alla prover vid-80 ° C för ytterligare analys.
- Dra upp 0,5 mL blod från arteriell linje med den särskilda blod gasar analysen (BGA) sprutor för att mäta BGA använder BGA maskinen enligt tillverkarens anvisningar.
- Frånträda de venkateter med en standard 2 mL spruta med 0,5 mL blod och omedelbart överföra det in i ACT kassetten med hjälp av en 30 G nål. Fylld tonerkassetten i ACT maskinen att mäta koagulationstid enligt tillverkarens anvisningar. Se figur 2 för tidpunkter.
- Administrera 5000 IU ofraktionerat heparin in en venkateter med en 2 mL spruta och tillåter djuret att stabilisera i 20 min innan du börjar MI experimentet.
- Övervaka agera varje 30-45 min som nämns i 2.1.11. Injicera 2500 IU ofraktionerat heparin intravenöst om ACT är < 180 s.
- Hjärtinfarkt experiment
- Använda en standard C arm fluoroskopi utrustning (koronarangiografi program, vinkel 0°, 12 bildrutor per sekund, ~ 70 kV) - eller alternativt en dedikerad angiografi system - att utföra den koronar interventionen.
- Använd fluoroskopisk vägledning för att infoga en tryck-kateter (5F, 120 cm) via den tidigare placerade slidan i den vänstra halspulsådern. Gå vidare till vänster kammare. Anslut trycket katetern till ett förvärv-system för att registrera vänster ventrikulära trycket. Förvärvsystemet behöver kontinuerligt beräknar och registrerar puls, utvecklat pressar, dP/dt maximal (kontraktilitet av vänster kammare) och dP/dt minsta (avkoppling av vänster kammare) under hela experimentet. Spela in utgångsvärden i 10 min.
- Infoga en 6F (100 cm, EB3.75) vägledande kateter via den tidigare placerade slidan till höger halspulsådern. Gå vidare till vänster kranskärl att nå vänster främre fallande kranskärl (LAD) under X-ray vägledning. Injicera kontrastmedel med en 20 mL spruta via vägledande katetern för att utföra en baslinje koronarangiografi.
Obs: Injektion av kontrastmedel gjordes av manuellt tryck men en dedikerad power injector system skulle kunna användas också. - Bedöma storleken på pojken på röntgen bildskärmen att välja lämplig storlek av perkutan koronar intervention (PCI) katetern. Använd PCI ballonger med en längd på 15-25 mm och diametrar mellan 2 och 3,5 mm beroende på LAD storlek. Montera PCI katetern och koronar ledaren (F 014/J, 175 cm). Anslut PCI katetern med inflationen enheten förfylld med kontrastmedel.
Obs: LAD diameter kan mätas direkt på en kalibrerad bildskärm använder en linjal och storleken på PCI ballongen väljs då med detta. - Infoga det sammansatta systemet från 2.2.4 i lumen av vägledande katetern. Förväg ledaren in pojken tills den når bortom den andra diagonala grenen av pojken.
- Använd fluoroskopisk vägledning för att avancera PCI katetern tills den når ungefär i mitten av pojken. Väljer du LAD blockerande webbplats beroende på anatomin av hjärtinfarkt, vanligtvis efter andra, ibland efter den första diagonal grenen (figur 3) för att få liknande procentsatser av vänster kammare (LV).
Obs: Valet av blockerande platsen beror på längden av diagonalen grenar och därmed området av vävnad som levereras av blodet via den respektiva grenen. Vid en lång blir tvåspetsnitar första diagonal gren blockerande platsen precis efter detta. Vid ett kortare första diagonal gren sker blockering efter den andra diagonalen. - Avlägsna ledaren och sedan öka trycket i inflationen enheten till 7-10 bar att blåsa upp ballongen av PCI katetern och framkalla myokardischemi för 1 h. gradvis öka den FiO2 till 50-60% mellan 15 och 40 min av ischemi. Hålla tidalvolym 6-10 mL/kg.
Obs: Denna procedur kommer att minska förekomsten av extraslag och minska frekvensen av ventricular fibrillations för hjärta. - Post en 5-10 s videosekvensen medan du injicerar kontrastmedel genom vägledande katetern har en angiografi av ballongen av PCI katetern strax efter start ischemia; Upprepa efter 10 min av ischemi att verifiera komplett ocklusion av pojken distalt om PCI kateterns ballong.
- Övervaka djuret noga för att omedelbart upptäcka och behandla (2.2.10) hjärtarytmier. Extraslag brukar förekomma och öka i frekvens (> 3 per min) mellan 20 och 40 min efter induktion av myokardischemi. Om detta inträffar, massera varsamt halsen på båda sidorna strax under kinden. I de flesta fall kommer detta att vara tillräckligt att återupprätta en regelbunden hjärtrytm, förmodligen genom stimulering av de vagusnerven baroreceptors ligger på den gemensamma halspulsådern.
- Om hjärtarytmier utvecklas till ventrikelflimmer, använda en extern, biphasic-defibrillator för att återupprätta en sinusrytm. Gäller 5-10 bröstkompressioner använder defibrillator kuddar omedelbart innan chocken för att fylla hjärtinfarkt med syresatt blod och sedan chocka med 150 J (för 30 kg djur).
- Upprepa vid behov och öka energin till 175 J efter 3rd chocken. Använd högre energi inställningar för tyngre djur.
- Fem minuter före slutet av ischemitid upprepa de blodprov som nämns i 2.1.8-2.1.13. Injicera testsubstansen (antingen de bicykliska FXIIa hämmaren eller styra 4 mg/kg, göra detta detta blint) intravenöst via central venkateter och spolning med 20 mL koksaltlösning.
- Återkalla ett plasmaprov citrat (som nämns i 2.1.8 och 2.1.9) 4 min efter injicering ämnet i 2.2.12.
- Utföra en angiografi (2.2.3) för att bekräfta LAD ocklusion, sedan tömma ballongen av PCI katetern och ta bort denna kateter från vägledande katetern. Bekräfta genomblödning av pojken distala till webbplatsen ocklusion av angiografi omedelbart efter deflation och avlägsnande av ballongen av PCI katetern, 10 min därefter, när tecken på myokardischemi var synliga av ECG för mer än 5 min, och omedelbart före Re ocklusion av pojken.
- Tillåta reperfusion av ischemisk myokardiet för 2 h. Ta plasma-och serumprover vid 10, 30, 60 och 115 min reperfusion (2.1.8 och 2.1.9). Övervaka BGA vid 60 och 115 min (2.1.10).
- Sätt tillbaka PCI katetern tillsammans med ledaren till exakt samma position som används för ischemi. Blåsa upp ballongen av PCI katetern som innan och bekräfta LAD ocklusion av angiografi (2.2.3). Ta bort trycket katetern från vänster kammare och stoppa inspelningen.
- Injicera 100 mL 2% Evans Blue fosfat buffrad saltlösning (PBS, pH 7,4) till den central venkateter. Ca 30 s senare, när hela djuret blir blå, injicera 40 mL 20% KCl att avliva djuret. Död bekräftades av avsaknad av EKG-signaler och puls vågor.
3. urvalsmetoder
-
Utvinna, dissekera och provtagning hjärtat (figur 4)
- Utföra en sternotomi för att exponera hjärtat. Följ de protokoll som tidigare beskrivits av Koudstaal och kollegor, steg 8-2 och 8-318. Uppskuren hjärtsäck medan inspektion för avvikelser, som kan härröra från tidigare perikardit, samt utesluta djuret från ytterligare utvärdering.
- Tömma och ta bort PCI samt vägledande katetern. Punktskatt hjärtat för vidare analys. Skär vena cava och ta bort blodet med en sugpump och sedan klippa alla de stora fartyg som förbinder hjärtat med kroppen.
- Skölj hjärtat inifrån och ut med rumstemperatur saltlösning. Väga hela hjärtat.
- Inom 30-40 min, skär hjärtat i skivor ca 3-5 mm från spetsen till den Chordae tendinae av mitralisklaffstenos, vinkelrätt mot den långa axeln med en vass kniv.
- Var noga med att alltid placera hjärtat i samma riktning med den ventrala sidan uppåt för att hålla orienteringen för de skära proverna (figur 5).
- Fotografera skivor av hjärtat med en digital enkel linsen reflexkamera.
- Skär bort höger kammare (kassera som inte behövs). Fotografera vänster kammare skivor och väger alla skivor för den totala vikten av vänster kammare.
- Skilja mellan Evans Blue positiva och Evans Blue negativa vävnad i alla avsnitten. Dissekera skivor för att separera den ischemiska (Evans blå negativa) från icke-ischemisk vävnad (Evans Blue positiva) med en skalpell.
- Först analysera avsnitten Evans Blue negativa (ischemisk området risk, AAR). Väga dem alla och sätta dem alla i en plastbehållare.
- Täcka skivor helt med 100-150 mL (beroende på hjärtat storleken) trifenyl tetrazolium natriumkloridlösning (2 g TTC, 16 g Dextran, molekylvikt 48000-90000, i 200 mL PBS, nyberedd) så att hjärtat bitar kan röra sig fritt i lösningen. Täcka behållaren och Inkubera under 20 minuter vid 37 ° C medan du försiktigt skaka.
- Under denna 20 min inkubering tid väga den Evans Blue positiva bitar (område inte i riskzonen, ANR), ta prover för inbäddning av vävnad-Tek (Välj den mest distala delen från skadan) och förvaras vid-80 ° C för vidare analys. Överför resten till 4% formaldehydlösning och förvara i rumstemperatur för histologi sektioner.
- Ta bort bitar av den årliga Verksamhetsrapporten från TTC lösningen. Den röda färgade vävnaden är livskraftig ischemisk vävnad (VIT) och den icke-färgade vävnaden är nekrotisk ischemisk vävnad (NIT). Skär 2 små bitar (block 2-3 mm) från både den NIT och VIT, bädda in dem i vävnad - Tek och förvaras vid-80 ° C för vidare analys. Dessa prover bör ha samma vikt.
- Fixa resten av bitarna (alla skivor som härrör från AAR) genom att fästa dem i en Styrofoam behållare och täcka helt med 4% formaldehydlösning för 24 h i rumstemperatur i ett dragskåp. Bitarna bör bo platt för den fotografiska dokumentationen i nästa steg.
- Nästa dag fotografera båda sidor av bitar med en högupplöst kamera med samma zoominställning och avstånd från vävnaden (samma förstoring). Lägg till automatisk skala barer i alla bilder. Alla barer måste ha samma längd.
Obs: Högupplösta kameran ska anslutas till programvara som automatiskt lägger till skalstapeln varje foto.
-
Beräkningen av den årliga Verksamhetsrapporten och infarkt storlek
- % AAR av vänster kammare = (vikt av AAR i g / vikt av vänster kammare i g) * 100.
- Använda ImageJ programvara för att beräkna den totala ytan av både AAR och NIT (båda sidor av varje bit) baserat på fotografier.
- Justera skalstapeln genom att välja skala bar längd med den raka linjen från verktyget vinkel. Välj från menyn Analyze > Ange skala och infoga den kända avstånd och enheten för skalstapeln. Välja ”global” så samma skala kommer att tillämpas på alla bilder.
- Markera hela ytan av vävnad med fri hand markeringsverktyget för att beräkna AAR. Var noga med att inte inkludera sidan (höjd) av vävnaden eller fettvävnaden (Figur 6-C).
- Ställa in mätningen genom att välja ”område” och ”Visa etikett” från Analyze > ange mätningar-menyn. Mät ytan från Analyze > mått.
- Upprepa steg 3.2.5 åtgärd NIT (Markera endast icke-färgade vävnaden). Obs: Inkludera inte fettvävnaden (Figur 6-D) vid beräkningen av NIT. Upprepa på andra sidan av vävnad.
- Beräkna den genomsnittliga AAR och NIT för varje bit vävnad.
- Använd de värden som erhålls från 3.2.7 för att beräkna NIT som en procentandel av den AAR:% NIT av AAR = (Σ genomsnittlig yta på NIT i cm2/ Σ genomsnittlig yta på AAR i cm2) * 100.
- Två olika utredare bör upprepa ovanstående metod. Godtagbara är skillnaden < 10%.
-
Ischemi markörer
- Använda EDTA plasma proven, som tidigare har lagrats vid-80 ° C (2.1.9) att mäta nivån av hjärt troponin-jag använder en enda-plex Luminex-typ analys som tidigare beskrivs 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett djur dog i förtid före administrering av FXIIa hämmare eller kontroll peptid på grund av ett tekniskt fel (plötslig minskning av blodtrycket under ischemitid före tillsats av testsubstansen). Ett djur var utesluten från gruppen FXIIa hämmare eftersom ingen ischemi/reperfusionsskada observerades på grund av onormal anatomi av den vänstra främre fallande artären (LAD). En stor del av vänster kammare, inklusive apexen, var perfusion av cirkumflex artär i detta djur. De djur som ingår i den slutliga analysen var n = 2 i gruppen bicykliska FXIIa för peptid hämmare (menar vikt 27.5 ± 2,5 kg) och n = 3 mottagande en inaktiv bicykliska kontrollpeptid (menar vikt 29 ± 0,8 kg).
Röntga video imaging / koronarangiografi gris hjärta används för att visualisera positionen för trycket katetern och att avgöra var att blockera pojken (figur 3A). Figur 3B visar katetern position, blockerar blodflödet distalt grenen andra diagonal. Jämförelse mellan figur 3A och 3B kan även en uppskattning som del LAD-levererade hjärtmuskeln blir ischemisk. I slutet av perioden 2 h reperfusion är PCI katetern återinfördes och uppblåst på samma position som den var under ischemi. Evans blå sedan injiceras intravenöst för att exakt fastställa AAR (figur 5A). Efter excision av hjärtat, är vänster kammare skuret i 3-5 mm tjocka sektioner från spetsen upp till mitralklaffen, vinkelrätt mot den långa axeln. AAR och ANR avgränsas tydligt med Evans blå färgning på skivor. AAR och ANR provtagning områden visas i figur 5B.
Den årliga Verksamhetsrapporten, uttryckt som procentandel av LV, visar inga statistiskt signifikanta skillnader mellan FXIIa behandlade gruppen och kontrollgruppen (figur 6A). Infarct storlek (NIT/AAR) visar inga skillnader mellan grupperna antingen (använda icke-parametriska Mann-Whitney test, p > 0,05, figur 6B). Dessa data tyder på att FXIIa hämmare ensam, på begagnade koncentration och varaktigheten av ansökan, inte kan skydda hjärtat från hjärtinfarkt jag / R skada. Figur 6 c och 6 D visar hur man Markera de AAR och NIT gränserna för att noggrant och reproducibly mäta de respektive ytor.
Den blod provtagningsstrategi tillåter frisläppandet av den hjärtmuskulatur skada markör hjärt troponin-I till följas över tid. Det finns nästan ingen skillnad efter en timme av ischemi med baslinjen medan efter reperfusion det är en kontinuerlig ökning över tiden som visas i figur 7. För troponin-I, mellan grupperna skillnaderna var också inte betydande i dessa experiment.
Figur 1 . Översikt över experimentella tidslinjen. Schematisk tidsplan för de viktigaste stegen i myokardischemi/reperfusion skada modellen. Baslinjen koronar visualisering, starttiden för ischemi, övervakning hjärtarytmier och injicera testämnet är viktiga steg i experimentet. Användningen av exakta tidpunkten i alla experiment garanterar reproducerbarhet. Euthanizing djuret och excision av hjärtat bör göras inom 15-20 min efter avslutad fasen 2h reperfusion. KCl: kaliumklorid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Tidslinje för blod provtagning och analys. Tidpunkter för blodprovstagning anges tillsammans med typ av antikoagulantia som används. Ytterligare prover kan tas enligt experiment och analyter som skall mätas. ACT: aktiverat koagulering tid, BGA: blod gasar analys, RT: rumstemperatur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Koronarangiografi. Fluoroskopisk syn på (A) vänster hjärtinfarkt vid baslinjen, gula pilarna pekar på först och den andra diagonalt grenar, vita pilen pekar mot hjärtat apexen b ockluderad LAD visar inget flödesområdet i vänster kammare (LV), den röda pilen pekar på PC Jag katetern (C) åter stängning av pojken i slutet av reperfusion med ballongen PCI kateterns återinföras till samma plats i pojken som under ischemi. CX: cirkumflex kranskärl, LAD: vänster främre fallande kranskärl, MC: Millar kateter, in i vänster kammare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Schematiskt diagram av vävnad provtagning. Exakt tidpunkt för hjärtat dissektion och provtagning av olika områden för vidare analys. Tidslinjen börjar vid 205 min efter början av ischemi, 20 min efter avslutandet av djurförsök. Det är viktigt att Inkubera avsnitten vävnad i TTC inom högst 40 min efter euthanizing djuret. Provtagning av ANR, VIT och NIT indikeras som vita fyrkanter. Ruvning och den årliga Verksamhetsrapporten i 4% formaldehyd gör tydlig åtskillnad mellan NIT och VIT för noggrann bestämning av infarkt storlek. AAR: området risk, ANR: område inte i riskzonen, LV: vänster kammare, NIT: nekrotisk ischemisk vävnad, OTC: vävnad-Tek, RV: höger kammare, TTC: trifenyl-tetrazoliumklorid, VIT: livskraftig ischemisk vävnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . In situ-differentiering mellan området risk (AAR) och inte riskerar ANR. (A) representativ bild av hela hjärtat precis efter sternotomi i slutet av experimentet. B representativa bilden visar den 3-5 mm tjock vänster kammare skivor efter dissektion. AAR och ANR är tydligt definierade, anges med gula pilar, och den vita pilen visar området ANR provtagning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 . Ischemi och infarkt storlek. (A) den procentuella vikten av vänster kammare (LV). (B) andel yta NIT av den årliga Verksamhetsrapporten. C en representativ bild av AAR beräkningen. (D) en representativ bild av beräkningen NIT. Den vita pilen visar provtagningsområdet VIT och den svarta pilen visar området NIT provtagning. Data beräknades med hjälp av ImageJ programvara. Värden visas som punkter för varje individ experimentera med uppgift om genomsnittlig ±± SD. kontrollgruppen, n = 3 och FXIIa hämmare behandlade gruppen, n = 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 . Hjärtmuskulatur skada markör. Hjärt troponin-I koncentration över tid i pg/ml både kontroll-och FXIIa-hämmare behandlade gruppen. Blod samlades från halsvenen in EDTA plasma rören vid studiestart, slutet av ischemi och flera tidpunkter under reperfusion och hjärt troponin-jag var mätt med singel-plex suspension array (Bio-Plex). Data visas som punkter för varje individ experimentera med uppgift om genomsnittlig ±± SD. kontrollgruppen, n = 3 och FXIIa behandlade gruppen, n = 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hjärtinfarkt I / R skada har en betydande effekt på den slutliga infarct storlek vilket översätts direkt till patientens prognos efter akut hjärtinfarkt3. Förstå patofysiologin bakom hjärtinfarkt jag / R skada är det första steget att minska eller förhindra den. Hjärtinfarkt I / R skada är ett akut tillstånd som uppstår direkt efter reperfusion ockluderad fartyg. Jag / R skada leder till aktivering av medfödda immunsvaret och cellulära skador uppstår på platsen för reperfusion och omgivande vävnader20. En nyligen genomförd studie visade en förbättring i neurologiska utfallet i en råtta modell av hjärnan jag / R skada när de behandlades med FXIIa hämmare8. I den nuvarande pilotstudien Vi hittade dock ingen effekt av de bicykliska FXIIa-hämmaren på hjärtinfarkt jag / R skada. Den används FXIIa-hämmaren är romanen och dess farmakokinetik hos svin är ännu inte kända. Observerade bristen på effekt kan därför orsakas av olämplig dosering eller ansökan. Detta behöver åtgärdas i uppföljande studier.
Standardisera en djurmodell är nödvändigt att undersöka på djupet patofysiologin bakom hjärtinfarkt jag / R skada och att få lämpliga lösningar i kliniker. Utredning av patofysiologin bakom hjärtinfarkt jag / R skada kräver bra och representativ provtagning för att studera de cellulära mekanismer som ligger bakom den. Svin stängda bröstet hjärtinfarkt jag / R skador modell ger en reproducerbar metod, som är nära den kliniska situationen, och användbar för att förstå cellulära mekanismer och testa nya nya behandlingar. Varianter av den nuvarande modellen har beskrivits innan för ovan nämnda ändamål14,17,18.
Våra protokoll av akut hjärtinfarkt hos svin behöver inte före behandling med amiodaron som tidigare beskrivits18,21. Vi använde carotid sinus massage för att minska hjärtarytmier och en bifasisk hjärtstartare för cardioconversion vid ventrikelflimmer. Användning av carotid sinus massage är kliniskt kända för att påverka förmaksflimmer22, men hittills har det inte visats att förhindra eller fördröja uppkomsten av ventrikelflimmer i MI, antingen människor eller i gris modeller. Dessutom, användning av sevofluran hjälper till att reducera ventrikulära arytmier samt dödligheten i akut hjärtinfarkt23svin modell.
För att säkerställa reproducerbarhet och minska risken för trombos under experimentet, multipla doser av heparin injicerades baserat på upprepad mätning av ACT, snarare än med fasta heparin doser som beskrivs till exempel av Koudstaal et al18. En kontrollerad mängd heparin administration hjälper till att undersöka koagulationskaskaden i samband med jag / R skada. Evans Blue tillåter noggrann bestämning av AAR/LV. Intravenös injektion av den Evans blå efter förnyad ocklusion av pojken på den exakta platsen under ischemi induktion under fluoroskopisk vägledning leder till blå färgning av hela grisen inklusive den icke-ischemiska delen av hjärtat med lägsta effekt på ANR hjärtmuskeln och kärlsystemet. Evans Blue är en känd cytotoxiska substansen24. I nuvarande experiment det var avgörande för att upprätthålla livskraften i endotelceller lagret i ANR i det hjärtat vaskulatur för att använda det som individ inom kontroll så 100 mL Evans Blue var injiceras systemiskt och spädas med den helblod att minska dess toxicitet. Tidigare, i en liknande inställning för 50 ml 2% Evans Blue var injiceras direkt in i hjärtinfarkt ökar risken för dess cytotoxicitet till hjärt celler25. Nästa viktiga steg var att dissekera hjärtat direkt i 3-5 mm skivor från spetsen upp till mitralisklaffstenos (exakta position i varje djur) och använda denna metod för att göra en exakt beräkning av den årliga Verksamhetsrapporten som en procentandel av vänster kammare.
Den nuvarande beskrivningen av metoden ger finare detaljer som tidigare inte beskrivits. Ruvning TTC målat avsnitt i 4% formaldehyd i 24 timmar ger en tydlig åtskillnad mellan livskraftiga (röd) och nekrotisk (vit) vävnad, vilket slutligen ökar reproducerbarheten för provtagningen för ytterligare molekylär färgning. Den blod provtagningsstrategi över 2 h reperfusion möjliggör upptäckt av nyligen uttryckt molekyler i ett mycket tidigt skede (10 och 30 min) reperfusion samt senare (60 och 120 min). Rätt blod och vävnad provtagning och förvaring är också avgörande för analys av plasma cascade markörer såsom uttrycket av komplement och koagulering proteiner.
Det nuvarande protokollet kan ändras för att ha en längre reperfusion tid, från några timmar till dagar. Detta tillåter forskare att undersöka senare konsekvenserna av I / R skador på hjärtat och även möjliggör testning av nya läkemedel och bedömning av deras effekter. Begränsning av det nuvarande protokollet är användningen av en tryck-tip kateter för mätning av hjärtats funktion. Mer tillförlitliga uppgifter om hjärtfunktionen kan erhållas genom användning av ett tryck-volym loop mätsystem. Sammanfattning den nuvarande metoden ger detaljerad viktiga steg som krävs för att öka reproducerbarheten hos svin stängda bröstet hjärtinfarkt jag / R skador modell när avsedd användning av modellen är att studera de cellulära och molekylära förändringarna i samband med studera hjärtinfarkt jag / R skada patofysiologi eller studerar nya behandlingsalternativ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna vill uppmärksamma Professor Christian Heinis för att tillhandahålla den FXIIa-hämmaren och respektive kontroll. Vi erkänner också tacksamt Olgica Beslac, Dr Daniel Mettler och Kay Nettelbeck från den experimentella enheten kirurgi, Institutionen för biomedicinsk forskning, University of Bern för teknisk support. Celine Guillod och Matthias Rausch från avdelningen för diagnostik, Interventional och pediatrisk radiologi, Bern University Hospital, Inselspital gav stöd med röntgenutrustning och tekniker. Detta projekt har finansierats av schweiziska National Science Foundation, projekt nr 320030_156193. Vi vill också tacka Mr Reto Haenni från kommunikation och marknadsföring, Bern University Hospital, Inselspital för videoinspelning vårt experiment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABL 90 Flex, blood gas analyser | Radiometer | - | Blood gas analysis (BGA) |
| ACT Plus | Medtronic | - | Activated clotting time |
| Atropin | Sintetica | - | Atropinum Sulfas, 0,5mg/ml |
| Balance (20-500 Kg) | NAGATA Scale, Tiwan | HTB/HTR | Alternative products can be used |
| Balance (21-4200 g) | Mettler toledo, Switzerland | MS4002SDR | Alternative products can be used |
| Blood collection tubes: EDTA, citrate and serum | S-Monovette, Nuembrecht, Germany | 05.1167.001, 05.1071.001 and 05.1557.001 respectively |
Alternative products can be used |
| BV Pulsera mobile C-arm | Philips | - | Alternative products can be used |
| Centrifuge | Labcare, UK | ALC PK120R | Alternative products can be used |
| Defibrillator Lifepak 12 | Medtronic | - | Alternative products can be used |
| Dextran from Leuconostoc mesenteroides | Sigma-Aldrich, Germany | D3759 | Average M.wt 48000-90000 |
| Digital single lens reflex camera | Sony, Thailand | DSLR-A500/A550 | Alternative products can be used |
| Dissecting forceps | Alternative products can be used | ||
| EMPIRA RX PCI dilatation catheter | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 85R15300S | Diameter 3 mm, length 15 mm, Alternative products can be used |
| EMPIRA RX PCI dilatation catheter | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 85R15350S | Diameter 3.5 mm, length 15 mm, Alternative products can be used |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich, Germany | E2129 | Toxic |
| Fabius GS premium respirator | Dräger, Lübeck, Germany | - | Anesthesia work station, Alternative products can be used |
| Fentanyl | Inselspital ISPI | - | Fentanyl 2500mcg/50ml |
| Formaldehyde | Pathology Institute, Bern University | SI148701 | Alternative products can be used |
| FXIIa inhibitor | Provided by Prof. Christian Heinis' laboratory in EPFL | Novel bicyclic peptide | |
| Galeo, coronary guidewire | Biotronik, Germany | 125497 | Alternative products can be used |
| Guidance catheter | Boston Scientific, Florida, USA | 34356-06 | 6F (100 cm, EB3.75). Alternative products can be used |
| Heparin Sodium | Drossapharm, Basel, Switzerland | - | Liquemin, 25000 U.I./5 ml |
| High end electrosurgery | BOWA, Germany | ARC 400 | Electrical source for blood suction. Alternative products can be used |
| Hydro-Guardmini breathing filter | Intersurgical, Lithuania | 1745000 | Filters |
| Image J | National Institute of Health, USA | 1.47v | Alternative products can be used |
| Inflation device, Atrion QL2530 | Atrion medical product, Alabama, USA | 96402 | Alternative products can be used |
| IntelliVue MP 70 | Philips, Boeblingen, Germany | - | Monitor (ECG, heart rate, blood presure and body temperature). Alternative products can be used |
| KCl | Sintetica SA | - | Potassium chloride 15% |
| Ketamine | Vetoquinol | - | Narketan, 1ml/100mg |
| LR-ACT | Medtronic | 402-01 | ACT special syringes |
| Midazolam | Roche | - | Dormicum, 5mg/ml |
| Monopolar scalpel | Alternative products can be used | ||
| Needle holder | Alternative products can be used | ||
| High resolution camera, PathStand Macro Imaging Stand for Grossing | Spotimaging, USA | 1080 p HD resolution. Alternative products can be used | |
| PBS | In-house preparation | - | Alternative products can be used |
| Peripheral venous cannula, 18 G | Alternative products can be used | ||
| PowerLab 4/35 data acquisition system | Adinstruments, Spechbach, Germany | - | |
| Rotamax120T | Heidolph, Germany | 544-41200-00 | Shaker. Alternative can be used |
| Rüschelit-Super Safety Clear Tube | Teleflex, Dublin, Irland | 112480 | Air way tubing, Alternative products can be used |
| Safe Pico Aspirator Syringes | Radiometer | 956-622 | BGA special syringes |
| Saline | Sintetica Bioren | - | NaCl 0,9%. Alternative products can be used |
| Sevorane 1.5% | AbbVie AG | - | Sevorane 250ml 100% |
| Sheath | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 504-607 A | AVANTI + / 7 F, Alternative products can be used |
| Space infusion pump | B.Braun Medical AG, Germany | - | For infusion of fentanyl. Alternative products can be used |
| SPR-350 (Millar catheter) | Adinstruments, Texas, USA | 840-8166 | MIKRO-TIP, 5F, 120 cm |
| Sternotomy saw | Alternative products can be used | ||
| Sutures | ETHICON, Johnson&Johnson, USA | Y3110H | Monocryl 3-0 SH-1 Plus. Alternative products can be used |
| Syringes (20, 10 and 5 mL) | CODAN,Baar, Switzerland | 62.7602, 62.6616, 62.5607 respectively |
Used to inject anesthetic materials intramuscularly or directly into the central venous line. Also to inject heparin or FXIIa or the respective control. Alternative products can be used |
| Thorax spreader | Alternative products can be used | ||
| Tissue-tek | SAKURA, Netherlands | 4583 | O.C.T. compound |
| Vascular forceps | Alternative products can be used | ||
| Xenetix 300 contrast media | Guerbet, Zürich, Switzerland | - | Lobitridol, 300 mg iodide/ml |
| Xylazine | Vetoquinol | - | Xylapan, 20mg/1 mL |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium choride | Sigma-Aldrich, Austria | T8877 | |
| 500 μL tubes (eppendorf) | Trefflab, Switzerland | 96.08185.9.03 | Alternative products can be used |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update. Circulation. 133, e338-e360 (2016).
- Miller, T. D., et al. Infarct size after acute myocardial infarction measured by quantitative tomographic 99mTc sestamibi imaging predicts subsequent mortality. Circulation. 92, 334-341 (1995).
- Ovize, M., et al. Postconditioning and protection from reperfusion injury: where do we stand? Position Paper from the Working Group of Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovasc Res. 87, 406-423 (2010).
- Neri, M., Riezzo, I., Pascale, N., Pomara, C., Turillazzi, E. Ischemia/Reperfusion Injury following Acute Myocardial Infarction: A Critical Issue for Clinicians and Forensic Pathologists. Mediators Inflamm. 2017, 1-14 (2017).
- Yang, Q., He, G. -W., Underwood, M. J., Yu, C. -M. Cellular and molecular mechanisms of endothelial ischemia/reperfusion injury: perspectives and implications for postischemic myocardial protection. Am J Transl Res. 8, 765-777 (2016).
- Massberg, S., et al. Platelet-Endothelial Cell Interactions During Ischemia/Reperfusion: The Role of P-Selectin. Blood. 92, 507-515 (1998).
- Wang, J., et al. Antithrombin is protective against myocardial ischemia and reperfusion injury. J Thromb and Haemost. 11, 1020-1028 (2013).
- Hopp, S., et al. Targeting coagulation factor XII as a novel therapeutic option in brain trauma. Ann Neurol. 79, 970-982 (2016).
- Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. J Anat. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
- Heusch, G., Skyschally, A., Schulz, R. The in-situ pig heart with regional ischemia/reperfusion - ready for translation. J Mol Cell Cardiol. 50, 951-963 (2011).
- Poirier, P. Exercise, heart rate variability, and longevity: the cocoon mystery? Circulation. , 2085-2087 (2014).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacol Ther. 141, 235-249 (2014).
- Bloor, C. M., White, F. C. Functional development of the coronary collateral circulation during coronary artery occlusion in the conscious dog. Am J Pathol. 67, 483-500 (1972).
- Banz, Y. Locally targeted cytoprotection with dextran sulfate attenuates experimental porcine myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 26, 2334-2343 (2005).
- Krombach, G. A., Kinzel, S., Mahnken, A. H., Günther, R. W., Buecker, A. Minimally Invasive Close-Chest Method for Creating Reperfused or Occlusive Myocardial Infarction in Swine. Invest Radiol. 40, 14 (2005).
- Suzuki, Y., Lyons, J. K., Yeung, A. C., Ikeno, F. In vivo porcine model of reperfused myocardial infarction: in situ double staining to measure precise infarct area/area at risk. Catheter Cardiovasc Interv. 71, 100-107 (2008).
- McCall, F. C., et al. Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine. Nat Protoc. 7, 1479-1496 (2012).
- Koudstaal, S., et al. Myocardial infarction and functional outcome assessment in pigs. J Vis Exp. , e51269 (2014).
- Kamat, P., et al. Dexrazoxane Shows No Protective Effect in the Acute Phase of Reperfusion during Myocardial Infarction in Pigs. PLoS One. 11, e0168541 (2016).
- Carden, D. L., Granger, D. N. Pathophysiology of ischaemia-reperfusion injury. J Pathol. 190, 255-266 (2000).
- Pérez de Prado, A., et al. Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).
- Lown, B., Levine, S. A. The carotid sinus. Clinical value of its stimulation. Circulation. 23, 766-789 (1961).
- Regueiro-Purriños, M., et al. Ventricular Arrhythmias and Mortality Associated with Isoflurane and Sevoflurane in a Porcine Model of Myocardial Infarction. J Am Assoc Lab Anim Sci. , (2011).
- Roberts, L. N. Evans blue toxicity. Can Med Assoc J. 71, 489-491 (1954).
- Ellenbroek, G. H. J. M., et al. Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction. J Vis Exp. , e54021 (2016).
