Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Een gemanipuleerde Split-TET2 enzym voor chemische-afleidbare DNA Hydroxymethylation en epigenetische Remodeling

Published: December 18, 2017 doi: 10.3791/56858
Automatic Translation
1, 2, 1
1Centre for Epigenetics and Disease Prevention, Department of Molecular and Cellular Medicine, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University, 2Centre for Translational Cancer Research, Department of Medical Physiology, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University

Summary

Gedetailleerde protocollen voor de invoering van een gemanipuleerde split-TET2 enzym (appelwijn) in zoogdiercellen voor chemische afleidbare DNA-hydroxymethylation en epigenetische remodeling worden gepresenteerd.

Abstract

Methylation van DNA is een stabiele en erfelijke epigenetische wijziging in het genoom van zoogdieren en is betrokken bij de regulering van de genexpressie om cellulaire functies. De omkering van methylation van DNA en DNA demethylatie, is bemiddeld door de tien-elf translocatie (TET) eiwit familie van dioxygenases. Hoewel het is wijd gemeld dat aberrant methylation van DNA en demethylatie geassocieerd met ontwikkelingsstoornissen gebreken en kanker zijn, hoe deze epigenetische veranderingen dragen rechtstreeks bij aan de latere wijziging in gen expressie of ziekte progressie blijft onduidelijk, grotendeels als gevolg van het gebrek aan betrouwbare instrumenten nauwkeurig toevoegen of verwijderen van DNA wijzigingen in het genoom bij gedefinieerde temporele en ruimtelijke resolutie. Om te overwinnen deze hindernis, ontwierpen we een split-TET2 enzym om de temporele controle van oxidatie van de 5-methylcytosine (5mC) en de daaropvolgende remodeling van epigenetische Staten in zoogdiercellen door simpelweg toevoegen van chemicaliën. Hier beschrijven we methoden voor de invoering van een chemische stof-afleidbare epigenome remodelleert tool (appelwijn), gebaseerd op een gemanipuleerde split-TET2 enzym, in zoogdiercellen en kwantificeren van de chemische afleidbare productie van 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) met immunokleuring, stroom cytometry of een dot-blot test. Deze chemische-afleidbare epigenome remodelleert tool vindt brede gebruik in het ondervragen van cellulaire systemen zonder te veranderen van de genetische code, evenals in het sonderen van de epigenotype−phenotype betrekkingen in verschillende biologische systemen.

Introduction

Methylation van DNA, meestal verwijst naar de toevoeging van een methylgroep naar de koolstof 5 positie van cytosine te vormen 5-methylcytosine (5mC), wordt gekatalyseerd door DNA methyl-transferasen (DNMTs). 5mC fungeert als een grote epigenetische mark in de zoogdieren genoom die vaak signalen voor transcriptionele onderdrukking, x-chromosoom inactivering en transposon silencing1. De omkering van methylation van DNA wordt gemedieerd door de tien-elven translocatie (TET) eiwit-familie. TET enzymen behoren tot de ijzer (II) en de afhankelijke dioxygenases 2-oxoglutarate, die de opeenvolgende oxidatie van 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) en 5-carboxycytosine (5caC) katalyseren. 5mC TET-gemedieerde oxidatie legt een extra beveiligingslaag epigenetische controle over het genoom van zoogdieren. De ontdekking van TET heeft gevonkt intense belangstelling in de epigenetische veld te onthullen van de biologische functies van TET eiwitten en hun grote katalytische product 5hmC. 5hmC is niet alleen een intermediair tijdens TET-gemedieerde actieve DNA demethylatie2,3,4, maar ook fungeert als een stabiele epigenetische mark5,6,7,8 . Hoewel de DNA-hydroxymethylation is sterk gecorreleerd met genexpressie en afwijkende veranderingen in DNA hydroxymethylation worden geassocieerd met sommige menselijke aandoeningen9,10,11, de causale relaties tussen de epigenetische veranderingen op DNA en de fenotypes blijven vaak uitdagend om te worden vastgesteld, die deels kan worden toegeschreven aan het ontbreken van betrouwbare hulpmiddel om nauwkeurig wijzigingen toevoegen of verwijderen DNA in het genoom bij gedefinieerd temporele en ruimtelijke resolutie.

Wij rapporteren hier het gebruik van een chemische stof-afleidbare epigenome remodelleren gereedschap (appelwijn) te overwinnen de hindernis tegenover studies van causale relaties tussen DNA-hydroxymethylation en gene transcriptie. Het ontwerp is gebaseerd op de veronderstelling dat het katalytische domein van TET2 (TET2CD) kan worden gesplitst in twee inactief fragmenten als uitgedrukt in zoogdiercellen en de enzymatische functie kan worden hersteld door een chemisch afleidbare dimerisatie benadering ( Figuur 1A). Systeem in te stellen een split-TET2CD, wij zes locaties geselecteerd in TET2CD, samengesteld uit een Cys-rijke regio en een double-stranded β-helix (DSBH) vouwen, op basis van een gerapporteerde kristalstructuur van TET2-DNA-complex dat een lage complexiteit regio12ontbreekt. Een synthetische gen codering rapamycin-afleidbare dimerisatie module FK506 bindend-proteïne 12 (FKBP12) en FKBP rapamycin bindend domein (FRB) van de zoogdieren streefcijfer van rapamycin14,15, samen met een zelf verbrijzelen peptide T2A polypeptide reeks16,17, werd individueel ingevoegd in de geselecteerde split sites binnen TET2CD. De selectie van TET2 als onze engineering doel is gebaseerd op de volgende overwegingen. Eerste, somatische mutaties in TET2 met gelijktijdige afname DNA hydroxymethylation worden vaak waargenomen bij menselijke aandoeningen waaronder myeloïde aandoeningen en kanker10, die nuttige informatie op gevoelige plaatsen te vermijden voor inbrengen. Ten tweede, een groot gedeelte van het katalytische domein van TET2, met name de lage complexiteit regio, is overbodig voor de enzymatische functie12, waardoor ons om een geminimaliseerde split-TET2 voor afleidbare epigenetische aanpassingen ambacht. Na het screenen van meer dan 15 constructies, was een constructie die hoogste rapamycin-afleidbare herstel van de enzymatische activiteit tentoongesteld in de zoogdieren systeem gekozen en CiDER18uitgeroepen. We beschrijven hierin het gebruik van mCherry-gelabeld CiDER tot afleidbare DNA hydroxymethylation en epigenetische remodelleren met rapamycin, en presenteren van drie methoden voor het valideren van CiDER-gemedieerde 5hmC productie in een model cellulaire systeem HEK293T.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cel cultuur, plasmide transfectie en chemische inductie

  1. Cultuur een aanhangend cellijn (bijvoorbeeld de menselijke embryonale nier HEK293T cel) in Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM), aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum, 100 U/mL penicilline en streptomycine bij 37 ° C met 5% CO2.
  2. Transfect cellen met de plasmide CiDER.
    1. Ten minste 18 h voor transfectie, zaad 0.3 x 106 cellen in 2.5 mL van de passende DMEM per goed in een 6-well-plate en Incubeer bij 37 ° C's nachts te bereiken van 60-80% confluentie cellen.
    2. Vooraf warm het transfectiereagens aan kamertemperatuur vóór gebruik.
    3. Plaats 250 µL van serumvrij medium in een steriele buis.
      Opmerking: Dit bedrag is op maat gemaakt voor een 6-well plaat met 80% confluentie. Proportioneel Wijzig indien nodig de middellange bedragen volgens de grootte van de platen of cel nummers.
    4. Toevoegen van 2,5 µg van de plasmide codering CiDER18 of het katalytische domein van TET2 (TET2CD als positieve controle)12,13 in het medium serumvrij en zachtjes Meng door pipetteren.
    5. Voeg 7,5 µL van het transfectiereagens aan het verdunde mengsel van DNA en zachtjes Meng door pipetteren.
    6. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur voor 20-30 min.
    7. Wijzig voorverwarmde media en breng het mengsel drop-wise in de putjes en zachtjes schudden de cel cultuur plaat om de transfectiereagens en DNA mengsel gelijkmatig te verdelen.
    8. Cellen en mengsel na een nacht bebroeden, en vervang het transfectiereagens met media met 2ml vers volledig DMEM.
  3. Chemische inductie
    1. Verdunde 2 mM rapamycin voorraad (ontbonden in DMSO) tot een concentratie van 20 µM in passende compleet medium.
    2. Voeg 20 µL van verdunde rapamycin naar transfected cellen gehandhaafd in 2 mL medium om te bereiken een eindconcentratie van 200 nM.
      Opmerking: Na incubatie gedurende 48 h, cellen zijn klaar voor de kwantificering van 5hmC generatie of andere downstream toepassingen. Indien nodig, kan de efficiëntie van de inductie worden gecontroleerd door middel van cellen elke 3 h voor verdere 5hmC kwantificering zoals hieronder beschreven en afgebeeld in Figuur 1.
    3. Voor betere kwantificering van 5hmC inductie efficiëntie scheiden zaad wells als u wilt controleren cellen elke 3 uur.

2. kwantificering van Rapamycin-geïnduceerde 5hmC productie door immunokleuring

  1. 5hmC immunofluorescentie kleuring
    Opmerking: Voeg voldoende hoeveelheden van de oplossingen van fixatie, die bestaan uit 4% paraformaldehyde, 0,2% oppervlakteactieve stof (zoals Triton X-100) in PBS met 3 N HCl, ter dekking van alle cellen in de plaat. Bijvoorbeeld zou 500 µL van oplossing genoeg zijn voor een goed in een 6-well-plate. Voer alle stappen uit bij kamertemperatuur.
    1. Om dit te corrigeren cellen toevoegen 4% paraformaldehyde PBS aan rapamycin behandelde cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik cellen uiten mCherry-CiDER zonder rapamycin behandeling voor de controlegroep. Niet doorroeren.
      Let op: Paraformaldehyde is giftig. Draag passende bescherming.
    2. Gooi kleefpoeders oplossing. Incubeer vaste cellen met 0,2% oppervlakteactieve stof in PBS voor 30 min aan het permeabilize van de celmembraan.
    3. Gooi de permeabilization oplossing. Voeg 3 N HCl toe aan de permeabilized cellen en incubeer gedurende 15 min te denatureren van het DNA.
    4. Gooi HCl. Add 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) naar de cellen voor 10 min voor neutralisatie van pH.
    5. Gooi alle de oplossing. Wassen van cellen grondig met PBS voor 3 - 5 keer. PBS grondig verwijderen.
      Opmerking: Voeg voldoende hoeveelheden van PBS voor elke stap van het wassen. Bijvoorbeeld, is 1 mL PBS genoeg voor een 6-well-plate.
    6. Het blokkeren van cellen door de bestaande uit 1% BSA en 0,05 procent van de oppervlakteactieve stof (zoals tween-20) in PBS voor 1 h met zacht schudden blokkeerbuffer toe te voegen.
    7. Gooi de blokkerende oplossing. Het antilichaam van de verdunde 5hmC (1:200) toevoegen aan de cellen en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 ° C.
    8. De cellen met PBS drie keer voor 15 min te wassen.
    9. Toevoegen van een verdunde fluorophore (FITC)-geconjugeerd secundair antilichaam (1:200) aan de cellen en incubeer gedurende 1 uur.
    10. Spoel de cellen met PBS driemaal uitgebreid Schakel residuele antilichamen.
    11. Voeg 250 ng/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) om de kern voor 5 min. vlek verwijderen de kleurstofoplossing.
    12. Monteer de dia of glazen-bodem cultuur schotel met immunostained cellen voor confocal imaging. Een representatief resultaat werd getoond in figuur 1B.
  2. Stroom cytometry
    Opmerking: Gebruik een 96-Wells-ronde bodemplaat voor kleuring volgt. 150 µL van reagentia is meestal voldoende voor elk putje.
    1. Resuspendeer transfected en rapamycin-geïnduceerde cellen in FACS buffer (PBS met 1% BSA, 2 mM EDTA). Voor de controlegroep, CiDER-uiten cellen zonder rapamycin behandeling worden gebruikt.
    2. Lossen en permeabilize van de cellen, zoals beschreven in stap 2.1.
    3. 2 N HCl toevoegen aan de cellen te denatureren van het DNA voor 10 min.
    4. HCl. neutraliseren negeren en blokkeren van de cellen, zoals beschreven in stap 2.1.
    5. Een antilichaam verdunde anti-5hmC (1:200) toevoegen aan de cellen en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 ° C.
    6. Spoel de cellen met FACS buffer driemaal. FACS buffer grondig verwijderen.
    7. Toevoegen van een verdunde fluorophore (FITC)-geconjugeerd secundair antilichaam (1:400) voor fluorescentie-activated cell sorting (FACS) analyse, en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    8. Spoel de cellen met FACS buffer driemaal.
    9. Er zijn monsters klaar voor FACS analyse. Een representatief resultaat werd getoond in Figuur 1 c-D.

3. dot-blot Assay te kwantificeren 5hmC en 5-methylcytosine (5mC) bedraagt

  1. Isoleer genomic DNA van transfected en rapamycin-geïnduceerde cellen met behulp van een commerciële DNA-extractie kit. Voor de controlegroep, CiDER-transfected cellen zonder rapamycin behandeling worden gebruikt.
  2. Verwarm de vacuüm oven tot 80 ° C en inweekmiddel nitrocellulose membraan in tweemaal gedestilleerd H2O en daarna in 6 x saline-Natriumcitraat (SSC) buffer gedurende 10 minuten.
  3. Laden 60 µL van gelijke hoeveelheden DNA (totale 2 µg in TE buffer) aan een 96-Wells PCR plaat. Voeg 30 µL van TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) de rest putjes.
  4. Maak twee-voudige seriële verdunningen verticaal op de 96-wells-plaat door de overdracht van 30 µL van oplossing op rij 1 aan de dezelfde kolompositie op rij 2. Meng opnieuw en breng 30 µL van oplossing aan de putjes in de volgende rij tot het bereiken van de grens.
Verwijder de laatste 30 µL.
  • 20 µL van 1 M NaOH en 10 mM EDTA toevoegen aan elk putje, afdichting van de plaat en verwarm het mengsel gedurende 10 minuten bij 95 ° C tot de DNA-duplex volledig te denatureren.
  • Onmiddellijk de monsters op ijs afkoelen en voeg 50 µL ijskoude ammoniumacetaat op 2 M (pH 7.0) en incubeer op ijs gedurende 10 minuten.
    Opmerking: Stappen 3.7-3.10 impliceert het gebruik van vacuüm.
  • Bouw de opstelling van de vlek dot met vooraf doorweekt membraan en verwijder residuele buffer met behulp van de volledige vacuüm.
  • Wassen het membraan door 200 µL van TE buffer toe te voegen aan elk putje van het toestel van de vlek dot. Vacuüm te verwijderen TE buffer inschakelen.
  • Het gedenatureerde DNA (bereid in de vorige stappen 3.1-3,6) aan elk putje van het toestel van de vlek dot laden. Vacuüm oplossing verwijderen inschakelen.
  • Wassen het membraan door 200 µL van 2 x SSC en verwijder residuele oplossingen volledig met behulp van vacuüm toe te voegen.
  • Demonteren van het toestel van de vlek dot, neem het membraan en spoel het hele membraan met 20 mL 2 x SSC.
  • Het membraan gedurende 20 minuten drogen.
  • Bak het membraan bij 80 ° C onder vacuüm voor 2 h.
  • De blokkerende oplossing (5% magere melk in TBST) toevoegen aan het membraan en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  • Gooi de blokkerende oplossing. Voeg een verdunde 5hmC (1:5, 000) of 5mC (1:1, 000) antilichamen tegen het membraan en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
  • Het wassen van het membraan met TBST driemaal voor 10 min te verwijderen van residuele antilichamen. TBST grondig verwijderen.
  • Toevoegen van een HRP-geconjugeerde secundair antilichaam (1:10, 000 voor anti-konijn HRP(5hmC) of 1:3,000 voor anti-muis HRP(5mC)) aan het membraan en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  • Het wassen van het membraan met TBST drie keer, gedurende 10 min.
  • Toevoegen van ECL westelijke bevlekken substraat naar de membraan voor visualisatie van 5hmC signalen met behulp van een chemiluminescentie-detector. Een representatief resultaat werd getoond in figuur 1E.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Chemische afleidbare conversie van de 5mC-aan-5hmC kan worden gevalideerd door immunokleuring op het niveau van de eencellige, stroom cytometry analyse op transfected (mCherry-positief)-cel populaties, of een meer kwantitatieve bepaling van de dot-blot zoals geïllustreerd in Figuur 1. Het katalytische domein van TET2, of TET2CD, werden gebruikt in de studie als positieve controle. Zie referenties 18-20 voor nadere details betreffende de toewijzing van genoom-brede van rapamycin-geïnduceerde veranderingen in 5hmC en chromatine toegankelijkheid.

    Figure 1
    Figuur 1: CiDER-gemedieerde afleidbare DNA hydroxymethylation in cellen HEK293T. (A) het ontwerp van een chemische stof-afleidbare epigenome remodelleren (appelwijn) tool gebaseerd op een splitsing TET2 enzym. (B) vertegenwoordiger immunokleuring resulteert in HEK293T cellen uiten van CiDER-mCherry voor (bovenste deelvenster) en na (lagere paneel) rapamycin behandeling (200 nM). Green, 5hmC, rode, CiDER-mCherry, blauwe, DAPI kleuring van kernen. Schaal bar = 10 µm. (C) de productie van de kwantificering van CiDER-gemedieerde 5hmC door stroom cytometry analyse. HEK293T cellen transfected met CiDER-mCherry van TET2CD-mCherry (als positieve controle) werden gekleurd met een anti-5hmc primair antilichaam en een FITC-gelabeld secundair antilichaam. Alleen TET2 (mCherry) en 5hmC (FITC) dubbel-positieve cellen waren omheinde en aangegeven. (D) tijdsverloop van chemische afleidbare productie van 5hmC in HEK293T cellen uiten van CiDER na toediening of intrekking van rapamycin (200 nM). n = 5, gegevens weergegeven als gemiddelde ± S.D. (E) Dot-blot assay te kwantificeren rapamycin-afleidbare veranderingen in de 5hmC in de HEK293T cellen. HEK293T cellen werden transfected met CiDER of een TET2CD-constructie. Een synthetische oligonucleotide met een bekende hoeveelheid 5hmC werd gebruikt als positieve controle (bovenste rij). De controle van de laden gevisualiseerd door ethyleen blauwe verkleuring van de totale hoeveelheid input DNA werd getoond in het onderste paneel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Hier hebben we laten zien dat het gebruik van een gemanipuleerde split-TET2 enzym om de temporele controle van DNA-hydroxymethylation. Na de ontdekking van TET familie van 5-methycytosine-dioxygenase, te ontcijferen van de biologische functies van TET eiwitten en hun grote katalytische product 5hmC1,2,3, tal van studies hebben verricht 4,5,6,7,8,9,10,11. Temporele en nauwkeurige controle over wijzigingen van het DNA in het genoom blijft echter een veeleisende uitdaging voor het veld. Onze CiDER-system is een van de paar systemen met behulp van een gemodificeerde DNA enzym wijzigen om deze technische gat te vullen. Het protocol hierin beschreven is meestal op maat gemaakt voor model cellulaire systemen, zoals de menselijke embryonale nier (HEK) 293T en de HeLa cellijnen. Rapamycin concentraties en behandeltijd wellicht worden aangepast om het bereiken van optimale prestaties in verschillende soorten cellen. Om te weten het beste tijdstip van de 5hmC-inductie, wordt een tijd cursus experiment, zoals we in punt 1.3.3 beschreven, sterk aanbevolen. Immunofluorescentie kleuring van 5hmC in transfected cellen kan worden gebruikt als de meest geschikte uitlezing. Voor een meer kwantitatieve analyse, een dot-blot test wordt aangeraden maar meer omslachtige procedures kan duren. Voor dot-blot testen, moeten de hoeveelheid invoer DNA worden geoptimaliseerd voor verschillende soorten cellen. Een zorgvuldige titratie experiment met behulp van 2-fold seriële verdunning met variërende DNA laden bedragen wordt sterk aanbevolen.

    Het systeem van de CiDER kan in grote lijnen worden gebruikt om te ontleden de correlatie tussen DNA-hydroxymethylation en fenotypische wijzigingen in verschillende biologische systemen. Hieronder vermeld zijn voorbeeldige downstream toepassingen of vragen die kunnen worden aangepakt met het systeem van CiDER.

    Hoe zal het DNA methylering landschap veranderen door 5mC TET-gemedieerde oxidatie in verschillende model cellulaire systeem? Dit kan nu gemakkelijk worden aangepakt door vergelijking van de DNA-methylome en hydroxymethylome voor en na rapamycin behandeling. Hoe zal DNA hydroxymethylation chromatine toegankelijkheid en histone modificaties veranderen? Een vergelijking van ATAC-seq en ChIP-Seq resulteert in dezelfde cel voor en na toediening van rapamycin zal het antwoord vertellen. Aangezien TET eiwitten een onderdrukkende rol in bepaalde vormen van kanker spelen, het zal interessant zijn om te testen hoe chemische afleidbare restauratie van TET eiwitten en 5hmC productie tumorgroei zal aantasten. Gezien de rol van TET/5hmC in de differentiatie van de cel van de stam, het valt nog te worden bepaald hoe stoffelijk gecontroleerde 5hmC productie een omschreven overgangsperiode stadium zal gevolgen hebben voor de specificatie van de bloedlijn van stamcellen tijdens de ontwikkeling.

    In haar huidige configuratie, kan de CiDER systeem alleen worden gebruikt ertoe wereldwijd 5mc-aan-5hmC conversie. Idealiter kan de CiDER met een catalytically-inactieve Cas9 of de orthologues, waardoor loci-specifieke targeting en afleidbare DNA methylering bewerken in het genoom worden gesmolten. Dergelijke precieze chemische-afleidbare epigenome remodelleren gereedschap kan algemeen worden toegepast om ondubbelzinnig de betrekkingen epigenotype-fenotype bij zoogdieren sonde zonder te veranderen van de genetische code.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

    Acknowledgments

    Wij danken de financiële ondersteunt van het National Institutes of Health verlenen (R01GM112003 naar YZ), de Stichting Welch (BE-1913 naar YZ), de American Cancer Society (RSG-16-215-01 TBE aan YZ), de kankerpreventie en Research Institute of Texas (RR140053 naar YH, RP170660 naar YZ), de American Heart Association (16IRG27250155 naar YH), en het programma van de toekenning van het onderzoek in samenwerkingsverband van John S. Dunn Foundation.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668027
    Rapamycin Sigma-Aldrich 37094
    Paraformaldehyde, 16% Solution VWR 100503-916
    Triton X-100 Amresco 0694-1L
    Hydrochloric Acid Amresco 0369-500ML
    Albumin, Bovine Amresco 0332-100G
    Tween 20 Amresco 0777-1L
    5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) Active Motif 39769
    Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008
    4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) Biotium 40043
    SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) SHEL LAB SVAC1E
    UltraPure SSC, 20X Thermo Fisher Scientific 15557036
    Bio-Dot Apparatus BIO-RAD 1706545
    Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 Millipore MABE146
    Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S
    Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S
    West-Q Pico Dura ECL Solution Gendepot W3653-100

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Li, E., Zhang, Y. DNA methylation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133 (2014).
    2. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
    3. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
    4. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
    5. Spruijt, C. G., et al. Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives. Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).
    6. Lio, C. W., et al. Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility. eLife. 5, e18290 (2016).
    7. Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).
    8. Su, M., et al. 5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).
    9. Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).
    10. Huang, Y., Rao, A. Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer. Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).
    11. Lu, X., Zhao, B. S., He, C. TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases. Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).
    12. Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).
    13. Hashimoto, H., et al. Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA. Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).
    14. Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
    15. Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).
    16. Ibrahimi, A., et al. Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences. Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).
    17. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6 (4), e18556 (2011).
    18. Lee, M., et al. Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling. J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).
    19. Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).
    20. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).

    Tags

    Chemie kwestie 130 methylation van DNA epigenetica chromatine toegankelijkheid DNA demethylatie chemische biologie TET2 5-hydroxymethylcytosine transcriptie genexpressie epigenome bewerken
    Een gemanipuleerde Split-TET2 enzym voor chemische-afleidbare DNA Hydroxymethylation en epigenetische Remodeling
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Lee, M., Zhou, Y., Huang, Y. An… More

    Lee, M., Zhou, Y., Huang, Y. An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling. J. Vis. Exp. (130), e56858, doi:10.3791/56858 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter