Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

אנזים פיצול-TET2 הנדסה כימית-inducible DNA Hydroxymethylation, שיפוץ Epigenetic

Published: December 18, 2017 doi: 10.3791/56858
Automatic Translation
1, 2, 1
1Centre for Epigenetics and Disease Prevention, Department of Molecular and Cellular Medicine, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University, 2Centre for Translational Cancer Research, Department of Medical Physiology, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University

Summary

פרוטוקולים מפורט ידביקו אנזים פיצול מהונדסים-TET2 (סיידר) בתרבית של תאים עבור hydroxymethylation כימיים של הדנ א inducible ובניה epigenetic מוצגים.

Abstract

מתילציה DNA הוא שינוי epigenetic heritable ויציבה הגנום יונקים, והוא מעורב בוויסות ביטוי גנים לשלוט תאיים. ההיפוך של מתילציה DNA, או ה-DNA demethylation, מתווך על ידי משפחת חלבונים 10-11 טרנסלוקציה (ט) dioxygenases. למרות נרחב דווח כי חריגה מתילציה DNA ו demethylation קשורים עם ליקויים התפתחותיים, סרטן, כמה שינויים epigenetic אלה תורמות בצורה ישירה משינוי עוקבות בהתקדמות ביטוי או מחלה ג'ין עדיין לא ברור, בעיקר בשל העדר כלי אמין במדויק להוסיף או להסיר שינויים DNA הגנום ברזולוציה שהוגדרו הטמפורלי, מרחבית. כדי להתגבר על המשוכה הזו, תיכננו אנזים פיצול-TET2 כדי לאפשר שליטה הטמפורלי של חמצון 5-methylcytosine (5mC) ו שיפוץ עוקבות של הברית epigenetic בתרבית של תאים על-ידי פשוט הוספת כימיקלים. כאן, אנו מתארים שיטות היכרות עם כלי שיפוץ epigenome כימית-inducible (סיידר), המבוסס על אנזים פיצול מהונדסים-TET2, לתוך תאים בתרבית של וכימות הייצור inducible כימי של 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) עם immunostaining, cytometry זרימה או וזמינותו של נקודה-כתם. כלי זה epigenome כימית-inducible שיפוץ תוכלו למצוא לשימוש נרחב חוקר מערכות סלולריות מבלי לשנות את הקוד הגנטי, וכן בודק את הקשרים epigenotype−phenotype במערכות ביולוגיות שונות.

Introduction

מתילציה DNA, בעיקר מתייחס התוספת של קבוצת מתיל למיקום פחמן 5 של ציטוזין לטופס 5-methylcytosine (5mC), על ידי ה-DNA מתיל-transferases (DNMTs). 5mC משמש סימן epigenetic הגדולות הגנום יונקים כי לעיתים קרובות אותות עבור דיכוי גנים ברמת השעתוק, שמושרש איון transposon להשתיק1. ההיפוך של מתילציה DNA מתווך על ידי משפחת חלבונים 10-העלפים טרנסלוקציה (ט). אנזימים ט שייכים הברזל (II) ו- 2-oxoglutarate dioxygenases תלויים אשר לעודד חמצון רצופים של 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), 5-carboxycytosine (5caC). 5mC בתיווך ט חמצון כופה על שכבה נוספת של שליטה epigenetic על הגנום יונקים. גילוי ט עוררה עניין אינטנסיבי בתחום epigenetic לחשוף את תפקודים ביולוגיים של חלבונים ט ו 5hmC מוצר קטליטי גדולה שלהם. 5hmC אינה רק ביניים במהלך בתיווך ט הפעיל DNA demethylation2,3,4, אלא גם פועלת כמו אורווה epigenetic לסמן5,6,7,8 . למרות hydroxymethylation ה-DNA הוא מאוד מתואם עם ביטוי גנים וסוטה שינויים ב- DNA hydroxymethylation משויכים כמה הפרעות האדם9,10,11, הקשרים סיבתי בין שינויים epigenetic על ה-DNA על הפנוטיפים לעיתים קרובות להישאר מאתגר שתוקם, אשר יכול להיות חלקית המיוחס חוסר כלי אמין במדויק להוסיף או להסיר שינויים DNA הגנום-שהוגדרו הטמפורלי, מרחבית רזולוציה.

כאן אנחנו מדווחים על השימוש epigenome כימית-inducible שיפוץ כלי (סיידר) להתגבר על המשוכה מול מחקרים של קשרים סיבתי בין שעתוק DNA hydroxymethylation, ג'ין. העיצוב מבוסס על ההנחה כי תחום קטליטי של TET2 (TET2CD) ניתן לפצל לשני מקטעים שאינם פעילים כשאני לידי ביטוי בתרבית של תאים, תפקידה אנזימטי ניתן לשחזר על-ידי נקיטת גישה dimerization כימית inducible ( איור 1A). להקים מערכת פיצול-TET2CD, בחרנו 6 אתרי ב TET2CD, מורכב של אזור עשיר Cys קיפול כפול גדילי β-סליל (DSBH), על בסיס מבנה קריסטל המדווחת של מתחם TET2-DNA חסר מורכבות נמוכה באזור12. גן סינתטי קידוד dimerization rapamycin-inducible מודול FK506 מחייב חלבון 12 (FKBP12) ובתחום FKBP rapamycin מחייב (FRB) של מטרת יונקים rapamycin14,15, יחד עם פפטיד שהפריד עצמית T2A מפוליפפטיד רצף16,17, הוכנס בנפרד האתרים שנבחרו פיצול בתוך TET2CD. הבחירה של TET2 המטרה הנדסה מבוססת על השיקולים הבאים. מוטציות הראשון, סומאטית TET2 עם צמצום והמצוות DNA hydroxymethylation הם נצפו לעתים קרובות בהפרעות האנושי, כולל הפרעות מיאלואידית סרטן10, אשר מספק מידע שימושי באתרי רגיש כדי להימנע במשך ההכנסה. שנית, חלק גדול של התחום קטליטי TET2, במיוחד באזור מורכבות נמוכה, היא לוותר על הפונקציה אנזימטי12, ובכך מאפשר לנו מלאכה של TET2-פיצול הממוזערת עבור שינויים epigenetic inducible. לאחר הקרנת בונה מעל 15, מבנה זה הציג שחזור rapamycin-inducible הגבוהה של פעילותה אנזימטי למערכת יונקים היה נבחר, כמנהל סיידר18. אנחנו מתארים בזאת את השימוש מתויג mCherry סיידר כדי להשיג inducible DNA hydroxymethylation ובניה epigenetic עם rapamycin, להציג שלוש שיטות אימות 5hmC בתיווך סיידר ייצור מערכת סלולרית דגם HEK293T.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תא תרבות, פלסמיד תרביות תאים, אינדוקציה כימי

  1. תרבות תא חסיד קו (למשל, האדם מתחלקים הכליה תא HEK293T) הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM), בתוספת 10% לא פעיל חום העובר שור סרום 100 פניצילין U/mL, סטרפטומיצין ב 37 ° C עם 5% CO2.
  2. Transfect תאים עם פלסמיד סיידר.
    1. לפחות 18 h לפני תרביות תאים, זרע 0.3 x 106 תאים 2.5 מ של DMEM המתאים לכל טוב בצלחת 6-ובכן, דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להגיע confluency 60-80%.
    2. לחמם הכימית תרביות תאים לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
    3. µL 250 במקום ללא סרום בינוני בשפופרת סטרילי.
      הערה: סכום זה הוא מותאם לצלחת 6-ובכן עם 80% confluency. אם יש צורך, באופן פרופורציונלי להתאים את הכמויות בינוני לפי הגדלים של צלחות או מספרי הטלפון הנייד.
    4. להוסיף 2.5 µg של פלסמיד קידוד סיידר18 או את תחום קטליטי TET2 (TET2CD כפקד חיובי)12,13 בתוך המדיום ללא סרום, בעדינות לערבב על ידי pipetting.
    5. מוסיפים את µL 7.5 של תרביות תאים ריאגנט לתערובת DNA מדולל ומערבבים בעדינות על-ידי pipetting.
    6. דגירה התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20-30 דקות.
    7. שנה מדיה מראש ומחוממת, להוסיף את התערובת drop-wise הבארות ולאחר לנער בעדינות את הצלחת תרבות תא לפיזור אחיד של תרביות תאים ריאגנט של ה-DNA תערובת.
    8. דגירה התאים ואת תערובת בין לילה, ולאחר מכן החלף הכימית תרביות תאים המכילים מדיה עם 2 מ של טרי DMEM מלאה.
  3. אינדוקציה כימי
    1. שתדללו 2 מ מ של המניה rapamycin (מומס דימתיל סולפוקסיד) ריכוז של 20 מיקרומטר המתאים בינוני מלא.
    2. להוסיף 20 µL של rapamycin מדולל לתאים transfected בהשתתפות 2 mL בינוני להגיע ריכוז סופי של 200 ננומטר.
      הערה: לאחר דגירה של 48 שעות, תאים הם מוכנים כימות של דור 5hmC או יישומים אחרים במורד הזרם. במידת הצורך, אינדוקציה יכול להיות במעקב על ידי הוצאת תאי כל 3 שעות על 5hmC כימות עוד יותר, כפי שמתואר להלן ויעילות המוצג באיור1.
    3. על כימות יותר של יעילות אינדוקציה 5hmC, זרע נפרדים בארות כדי לעקוב אחר תאים כל 3 שעות.

2. כימות של ייצור Rapamycin-induced 5hmC על ידי Immunostaining

  1. 5hmC immunofluorescence מכתים
    הערה: להוסיף כמויות מספיקות של הפתרון קיבעון, המורכבת paraformaldehyde 4%, 0.2% חומרים פעילי שטח (כגון טריטון X-100) ב- PBS עם HCl N 3, כדי לכסות את כל התאים בצלחת. לדוגמה, µL 500 של פתרון יהיה מספיק טוב בצלחת 6-. טוב. בצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר.
    1. כדי לתקן תאים, להוסיף paraformaldehyde 4% ב- PBS לתאים שטופלו rapamycin למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. עבור קבוצת בקרה, להשתמש בתאים המבטאים mCherry-סיידר ללא טיפול rapamycin. לא להתסיס.
      התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל. לענוד הגנה הולמת.
    2. למחוק פתרון מקבע. דגירה תאים קבוע עם חומרים פעילי שטח 0.2% ב- PBS למשך 30 דקות כדי permeabilize את קרום התא.
    3. למחוק פתרון permeabilization. להוסיף 3 N HCl תאים permeabilized, תקופת דגירה של 15 דקות denature את ה-DNA.
    4. להתעלם HCl. הוסף 100 מ מ טריס-HCl מאגר (pH 8.0) על התאים במשך 10 דקות על נטרול של pH.
    5. למחוק את כל הפתרון. לשטוף את התאים ביסודיות עם PBS במשך 3 - 5 פעמים. הסר PBS ביסודיות.
      הערה: להוסיף כמויות מספיקות של PBS על כל צעד לשטוף. לדוגמה, 1 מ"ל של PBS מספיקה צלחת 6-. טוב.
    6. לחסום תאים על-ידי הוספת המאגר חסימה הכוללת BSA 1% ל- 0.05% של חומרים פעילי שטח (כגון Tween 20) ב- PBS עבור h 1 ברעידות עדין.
    7. לבטל את הפתרון חסימה. להוסיף הנוגדן 5hmC מדולל (1:200) התאים, תקופת דגירה של 2 h בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 º C.
    8. לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים למשך 15 דקות.
    9. להוסיף על fluorophore מדולל (FITC)-מצומדת נוגדנים משניים (1:200) על התאים ואת תקופת דגירה של 1 h.
    10. לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים בהרחבה כדי להסיר שאריות נוגדנים.
    11. להוסיף 250 ננוגרם למ"ל של 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) כדי להכתים את הגרעין של 5 דק. הסר הפתרון מוכתמים.
    12. הר המנה תרבות שקופיות או זכוכית-התחתון עם immunostained תאים עבור הדמיה קונפוקלי. תוצאה נציג היה באיור איור 1B.
  2. Cytometry זרימה
    הערה: השתמש צלחת תחתית עגולה 96-ובכן מכתימים שהפרוצדורה הבאה. בדרך כלל, µL 150 של ריאגנטים מספיקה עבור כל טוב.
    1. Resuspend תאים transfected ו הנוצרות על-ידי rapamycin במאגר FACS (PBS עם BSA 1%, 2 מ מ EDTA). עבור קבוצת בקרה, השתמש לבטא סיידר תאים ללא טיפול rapamycin.
    2. לתקן, permeabilize את התאים כפי שמתואר בשלב 2.1.
    3. להוסיף 2 N HCl לתאים כדי denature את ה-DNA למשך 10 דקות.
    4. למחוק HCl. נטרול וחסום את התאים כפי שמתואר בשלב 2.1.
    5. להוסיף של נוגדן anti מדולל-5hmC (1:200) התאים, תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר או ללון ב- 4 מעלות צלזיוס.
    6. לשטוף את התאים באמצעות מאגר FACS שלוש פעמים. הסר את מאגר FACS ביסודיות.
    7. להוסיף על fluorophore מדולל (FITC)-מצומדת נוגדנים משניים (1:400) עבור תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) ניתוח ולאחר תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.
    8. לשטוף את התאים באמצעות מאגר FACS שלוש פעמים.
    9. דוגמאות מוכנים לניתוח FACS. תוצאה נציג היה באיור איור 1C-D.

3. dot-כתם Assay לכמת 5hmC ו- 5-methylcytosine (5mC) סכומים

  1. לבודד דנ א גנומי מתאי transfected ו הנוצרות על-ידי rapamycin באמצעות ערכת חילוץ DNA מסחרי. עבור קבוצת בקרה, השתמש transfected סיידר תאים ללא טיפול rapamycin.
  2. מחממים תנור ואקום ל 80 ° C ומשרים קדם ממברנה ניטרוצלולוזה מזוקק פעמיים H2O ואחר ב 6 x מאגר תמיסת מלח-נתרן ציטראט (האס) למשך 10 דקות.
  3. לטעון µL 60 של כמויות שוות של DNA (סה כ 2 µg במאגר טה) על צלחת PCR 96-ובכן. להוסיף 30 µL טה מאגר (10 מ מ טריס-HCl, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0) הבארות מנוחה.
  4. להפוך דילולים טורי כפולה אנכית על הצלחת 96-ובכן על-ידי העברת 30 µL של פתרון בשורה 1 לאותו מיקום עמודה בשורה 2. לערבב שוב, להעביר 30 µL של פתרון הבארות בשורה הבאים עד שהגיע לגבול.
הסר את µL בשלושים.
  • להוסיף 20 µL של EDTA NaOH ו- 10 מ"מ 1 מ' מכל קידוח, לאטום את הצלחת, מחממים את התערובת למשך 10 דקות ב 95 ° C כדי לחלוטין denature דופלקס של ה-DNA.
  • מיד לקרר את הדוגמאות על קרח, להוסיף 50 µL של 2 מ' הקר אמוניום אצטט (pH 7.0), דגירה על קרח למשך 10 דקות.
    הערה: השלבים 3.7-3.10 כרוכה בשימוש של ואקום.
  • להרכיב את המנגנון חשופה נקודה עם ממברנה טרום רטוב ולהסיר שיורית המאגר באמצעות ואקום מלא.
  • לשטוף את הקרום על-ידי הוספת 200 µL טה מאגר כל טוב של המנגנון חשופה נקודה. הפעל ואקום להסיר את מאגר טה.
  • לטעון denatured דנ א (להכין השלבים הקודמים 3.1-3.6) כל טוב של המנגנון חשופה נקודה. הפעל ואקום להסיר את הפתרון.
  • לשטוף את הקרום על-ידי הוספת µL 200 של 2 x פתרונות שיורית האס ולהסיר לחלוטין באמצעות ואקום.
  • לפרק את המנגנון חשופה נקודה, להוציא את הקרום ולשטוף את הקרום כל 20 מ של 2 x SSC.
  • מילה נהדרת קרום כעשרים דקות.
  • אופים את הקרום ב 80 ° C תחת ואקום כבר שעתיים.
  • הוסף את הפתרון חסימה (5% חלב רזה TBST) למוח, תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.
  • לבטל את הפתרון חסימה. הוספת 5hmC מדולל (1:5, 000) או 5mC (1:1, 000) נוגדנים למוח דגירה בין לילה ב 4 º C.
  • לשטוף את הקרום עם TBST שלוש פעמים במשך 10 דקות להסיר את שאריות נוגדנים. הסר TBST ביסודיות.
  • הוספת נוגדן משני מצומדת HRP (1:10, 000 עבור אנטי-ארנב HRP(5hmC) או 1:3,000 על העכבר אנטי HRP(5mC)) למוח דגירה לשעה בטמפרטורת החדר.
  • לשטוף את הקרום עם TBST שלוש פעמים במשך 10 דקות.
  • הוסף ECL המערבי סופג המצע למוח על ויזואליזציה של אותות 5hmC באמצעות גלאי chemiluminescence. תוצאה נציג היה באיור איור 1E.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    המרה כימית 5mC-אל-5hmC inducible הניתנים לאימות על ידי immunostaining ברמה תא בודד, ניתוח cytometry זרימה על אוכלוסיות transfected תא (mCherry-חיוביים), או assay דוט-חשופה יותר כמותיים כמופיע באיור1. תחום קטליטי של TET2, או TET2CD, שימשו לאורך כל תקופת המחקר כפקד חיובי. ראה הפניות 18-20 פרטים נוספים לגבי מיפוי הגנום כולו rapamycin-induced שינויים בנגישות 5hmC וכרומטין.

    Figure 1
    איור 1: בתיווך סיידר hydroxymethylation DNA inducible בתאים HEK293T. (א) העיצוב של כלי איחוי (סיידר) epigenome כימית-inducible בהתבסס על פיצול האנזים TET2. (B) נציג immunostaining תוצאות בתאים HEK293T לבטא סיידר-mCherry לפני (החלונית העליונה) ואחרי (החלונית התחתונה) rapamycin טיפול (200 ננומטר). ירוק, 5hmC, אדום, סיידר-mCherry, כחול, דאפי מכתים של גרעין האטום. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (ג) 5hmC בתיווך כימות של סיידר הייצור על ידי ניתוח cytometry זרימה. תאים HEK293T transfected עם סיידר-mCherry של TET2CD-mCherry (כמו בקרה חיובית) היו מוכתמים נוגדן anti-5hmc העיקרי של נוגדן משני התווית על-ידי FITC. רק TET2 (mCherry), 5hmC (FITC) תאי זוגית-חיוביות היו מגודרת ומצוינות. (ד) מסלול הזמן כימיים inducible הייצור של 5hmC בתאים HEK293T לבטא סיידר בעקבות ניהול או נסיגה של rapamycin (200 ננומטר). n = 5, הנתונים המוצג כ זאת אומרת ± ש (E) נקודה-כתם assay לכמת rapamycin-inducible שינויים ברמות 5hmC בתאים HEK293T. HEK293T התאים היו transfected עם הבונה סיידר או TET2CD. Oligonucleotide סינתטי עם כמות ידועה של 5hmC שימש פקד חיובי (שורה עליונה). הפקד הטעינה דמיינו ידי אתילן כחול צביעה של סכומים כוללים של DNA קלט היה מוצגים בחלונית התחתונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    כאן אנחנו יש מאויר השימוש של אנזים פיצול מהונדסים-TET2 כדי להשיג שליטה הטמפורלי של דנ א hydroxymethylation. בעקבות הגילוי של משפחת ט 5-methycytosine dioxygenase, בוצעו מחקרים רבים לפענח בפונקציות ביולוגיות של חלבונים ט ו שלהם מוצר קטליטי גדולה 5hmC1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11. עם זאת, שליטה טמפורלית ומדויק על שינויים DNA הגנום ממשיכה להיות אתגר בדרישה עבור השדה. מערכת סיידר שלנו היא אחת ממערכות כמה ניצול DNA מהונדס שינוי אנזים כדי למלא את הפער הטכני הזה. הפרוטוקול המתואר במסמך זה בעיקר המותאם במיוחד עבור דגם מערכות סלולריות, כגון כליות עובריים אנושיים (HEK) 293T והקווים התא הלה. Rapamycin ריכוז וזמן הטיפול ייתכן שיהיה צורך להתאימם כדי להשיג ביצועים מיטביים סוגי תאים שונים. כדי לגלות את נקודת הזמן אינדוקציה 5hmC הטוב ביותר, ניסוי כמובן זמן, כפי שהסברנו בסעיף 1.3.3, מומלץ מאוד. Immunofluorescence מכתים של 5hmC בתאים transfected יכול לשמש גם המדידה הנוח ביותר. עבור ניתוח כמותי יותר, וזמינותו נקודה-כתם מומלץ אבל זה עלול לקחת יותר מפרך הליכים. עבור מבחני דוט-כתם, הכמויות של DNA קלט חייב להיות אופטימיזציה עבור סוגי תאים שונים. ניסוי טיטור זהיר באמצעות דילול טורי 2-fold עם משתנה כמויות טעינת ה-DNA, הוא מומלץ מאוד.

    מערכת סיידר ניתן להשתמש בהרחבה לנתח את הקשר בין DNA hydroxymethylation לבין פנוטיפי שינויים במערכות ביולוגיות שונות. להלן מפורטות למופת במורד הזרם ליישומים או שאלות ניתן לטפל באמצעות מערכת סיידר.

    איך 5mC בתיווך ט חמצון תשנה את הנוף מתילציה של הדנ א במערכת התאית דגם שונים? זו עכשיו ניתן בקלות לטפל על-ידי השוואת DNA methylome של hydroxymethylome לפני ואחרי טיפול rapamycin. איך תשנה דנ א hydroxymethylation על שינויים נגישות ו היסטון כרומטין? השוואה בין האטא ק-seq שבב-Seq תוצאות באותו התא לפני ואחרי מינהל rapamycin יגיד את התשובה. מאז ט חלבונים לשחק תפקיד מדכאים סוגים מסוימים של סרטן, זה יהיה מעניין לבחון כיצד כימי inducible שיקום של חלבון ט, 5hmC הייצור לפגוע הגידול. בהתחשב בתפקיד ט/5hmC ב התמיינות תאי גזע, זה נשאר להיות נחוש הפקה 5hmC איך חנותם מבוקר בשלב transitionary מוגדרים ישפיעו על מפרט שושלת היוחסין של תאי גזע במהלך הפיתוח.

    במתכונתה הנוכחית, המערכת סיידר בלבד ניתן להשתמש לזירוז באופן גלובלי המרה 5mc-אל-5hmC. באופן אידיאלי, סיידר יכולה נכרכים עם Cas9 catalytically-לא פעיל או orthologues שלה, אשר יאפשר מיקוד ספציפי לוקוסים ועריכה inducible DNA מתילציה הגנום. Epigenome כימית-inducible מדויק כזה שיפוץ כלי ניתן להחיל באופן נרחב כדי חד משמעית לחקור את היחסים epigenotype-פנוטיפ ביונקים מבלי לשנות את הקוד הגנטי.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

    Acknowledgments

    אנו מודים הפיננסי תומך של מכוני הבריאות הלאומיים הענק (R01GM112003 כדי yz ימאהה), קרן Welch (להיות-1913 על yz ימאהה) האגודה האמריקנית לסרטן (TBE RSG-16-215-01 כדי yz ימאהה), מניעת סרטן, מכון המחקר של טקסס (RR140053 ל יד הנדיב, RP170660 כדי yz ימאהה), איגוד הלב האמריקאי (16IRG27250155 על יד הנדיב), לבין התוכנית פרס קרן דן ג'ון ס מחקר משותף.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668027
    Rapamycin Sigma-Aldrich 37094
    Paraformaldehyde, 16% Solution VWR 100503-916
    Triton X-100 Amresco 0694-1L
    Hydrochloric Acid Amresco 0369-500ML
    Albumin, Bovine Amresco 0332-100G
    Tween 20 Amresco 0777-1L
    5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) Active Motif 39769
    Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008
    4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) Biotium 40043
    SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) SHEL LAB SVAC1E
    UltraPure SSC, 20X Thermo Fisher Scientific 15557036
    Bio-Dot Apparatus BIO-RAD 1706545
    Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 Millipore MABE146
    Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S
    Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S
    West-Q Pico Dura ECL Solution Gendepot W3653-100

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Li, E., Zhang, Y. DNA methylation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133 (2014).
    2. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
    3. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
    4. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
    5. Spruijt, C. G., et al. Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives. Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).
    6. Lio, C. W., et al. Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility. eLife. 5, e18290 (2016).
    7. Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).
    8. Su, M., et al. 5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).
    9. Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).
    10. Huang, Y., Rao, A. Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer. Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).
    11. Lu, X., Zhao, B. S., He, C. TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases. Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).
    12. Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).
    13. Hashimoto, H., et al. Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA. Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).
    14. Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
    15. Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).
    16. Ibrahimi, A., et al. Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences. Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).
    17. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6 (4), e18556 (2011).
    18. Lee, M., et al. Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling. J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).
    19. Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).
    20. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).

    Tags

    כימיה גיליון 130 מתילציה DNA אפיגנטיקה נגישות כרומטין אן demethylation ביולוגיה כימית TET2 5-hydroxymethylcytosine שעתוק ביטוי גנים epigenome עריכה
    אנזים פיצול-TET2 הנדסה כימית-inducible DNA Hydroxymethylation, שיפוץ Epigenetic
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Lee, M., Zhou, Y., Huang, Y. An… More

    Lee, M., Zhou, Y., Huang, Y. An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling. J. Vis. Exp. (130), e56858, doi:10.3791/56858 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter