Summary
여기, 우리는 프로토콜 사용 하 여 3 차원 (3D) 이미지 인간의 췌 섹션을 최적화 수동 삭제 방법 제시. 이 원고에서는 수동 광 비운 뒤에 여러 면역 형광 인간의 독도 innervating 자율 고 감각 신경 네트워크의 핵심 요소를 식별 하기 위해 얼룩에 대 한이 절차를 보여 줍니다.
Abstract
전통적인 조직학 방법을 사용 하 여, 연구원은 그들의 능력을 이미지 전체에 방해는 조직이 나 장기 대규모 3d에서. 조직학 단면도 일반적으로 < 20 µ m로 포 르 말린 고정 파라핀 섹션 유리 슬라이드에 또는 < 부동성 고정된 섹션에 대 한 500 µ m. 따라서, 광범위 한 노력은 직렬 단면화 및 샘플에 대 한 3D를 다시 대규모 이미지 재건 방법 > 전통적인 방법을 사용 하 여 500 µ m. 또한, 내 조직, 특히 지질, 고분자에서 빛 없앤다 방지 깊이 영상 > 가장 confocal 현미경으로 150 µ m. 빛 분산을 줄이고 간단한 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 깊은 조직 이미징 수 있도록, 다양 한 광학 개간 방법 그는 설치류와 인간의 조직 샘플에 대 한 관련 고정 침수에 의해 개발 되어 왔다. 여러 가지 방법을 관련 고 아크릴 아 미드와 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)와 지우기 조직 단백질 가교를 사용 합니다. 다른 광학 개간 기술 사용 다양 한 용 매 다양 한 장점과 단점 각 수정 했다. 여기, 인간의 췌 장 신경 분포의 연구와 인간의 독도의 신경 분포의 심문을 위해 특별히 최적화 된 수동 광 개간 방법 설명 되어 있습니다.
Introduction
최근까지, 큰 조직 또는 전체 장기의 3 차원 (3D) 재건 힘 드는 직렬 단면, 얼룩, 및 여러 섹션의 이미지 재건을 통해 수행 되었다. 이러한 방법은 직렬 섹션, 항 체, 및 비 산 방지 조직 내의 깊은 이미징 빛 가난한 조직 침투의 많은 수에 대 한 신뢰를 포함 하 여 몇 불리가 있었다. 있도록 큰 빛과 항 체 침투, 연구원 지질 빛 산란의 대부분을 제거 하는 동안 단백질 항 원을 보존 하기 위해 화학 방법을 개발. 여러 메서드는 엄밀한 이미징 조직 Clear Lipid-Exchanged 아크릴 때 교배 히드로 (선명도), 수동 선명도 기법 (협정), 및 관류 기반 에이전트 출시 원래의 (동위) ( 1,2 검토 관련 ,,34,,56). 선명도 메서드는 포름알데히드, 아크릴, 및 두번째 히드로 지질 제거 SDS 솔루션2전기 이동 법을 사용 하 여 다음을 사용 하 여 단백질의 안정화를 기반으로 합니다. 이 방법은 수동 삭제에 대 한 수정 나중 되었고 고급 이미징7. 추가 최적화 주도하 고 두번째의 paraformaldehyde 히드로 솔루션 (1-4%)의 다양 한 비율로 최적의 항 안정화를 협정 8이라는 기법에 대 한 짧은 청소 시간. 이러한 광학 개간 기술을 개발 초기 시도 관련 작업을 담금질된 생 형광 단백질 유전자 변형 마우스 모델에서 어려운 유기 또는 다른 화합물. 이러한 추가 메서드 포함 비늘, 가리지 두뇌/신체 칵테일과 Computational 분석 (큐빅), 스위치 및 Dimensional Imaging of Solvent-Cleared 기관 (디스코) 방법, 모두와 함께 다양 한 장점과 단점9, 10,,1112. 원래 선명도 방법은 지질이 풍부한 마우스 뇌 조직에서 개발 되었다 및 광학 개간 방법 인간의 조직7,,811,13,14에서에서 테스트 제한 했다 .
광학 개간 방법 그대로 마우스 중앙 신경 시스템에서 긴 거리 추적 신경에 이상적입니다. 췌 잘 자율 신경 및 감각 신경 시스템에 의해 innervated입니다. 전체 기관 (1-2%)의 아주 작은 부분을 구성 하는 췌 장 내 분 비 실, 독도 Langerhans 및 독도 크기 (50-250 µ m), 내 분 비 세포 비율, 및 ( 15에서에서 검토 한 결과 당뇨병에 특히 밀도에 알고 있다 ,16). 프로토콜 개발, 인간의 췌 장에 대 한 여러 가지 광학 개간 방법을 테스트 하 고 협정 절차 신경 및 독도의 우수한 형태 보존 시간 (~ 2 주)를 최고의 균형을 발견. 여기에 설명 된 마지막 최적화 절차는 대 한 신경 섬 네트워크의 묘사에 대규모 (밀리미터 거리) 및 여러 그대로 췌 장 독도의 고해상도 3D 이미징. 후 샘플으로 저장 중립 버퍼링 된 포 르 말린 고정 파라핀 왁 스에 포함 된 기술은 인간의 췌 장 바로 다음 고정 또는 적당 하다. 샘플은 여 confocal 영상에 대 한 적합 한 또는 lightsheet 현미경 검사 법.
Protocol
모든 실험은 플로리다의 대학 기관 검토 위원회 및 연방 정부의 지침에 따라 실시 했다.
주의: Paraformaldehyde 및 아크릴은 독성 irritants입니다. 적절 한 개인 보호 장비 (실험실 외 투, 장갑, 눈 보호)와 증기 두건에서 시 약을 처리 합니다.
1. 포름알데히드 고정 조직 deparaffinization (신선한 조직 작업 하는 경우 2 단계로 건너)
- 새로운 면도날 또는 메스를 사용 하 여 조직의 표면에 수직인는 파라핀을 극복. 조직 풀어 마무리의 가장자리에는 파라핀을 잘라. 부드럽게 느슨하게 하 고 허가를 받아야하는 광학 조직을 제거 겸 자 또는 주걱을 사용 합니다. 부드럽게 주걱 (그림 1A)를 사용 하 여 조직에서 초과 파라핀 다쳤어요.
- 크 실 렌 (3 x 3 x 3 m m 부분의 조직에 대 한 약 30 mL)와 함께 유리 용기를 실 온 (RT)에서 24 시간이 솔루션 조직을 품 어.
- 1.2.1와 같은 볼륨으로 신선한 자일 렌으로 다른 유리 용기를 채우십시오. 전송 및 실시간에 24 h에 대 한이 솔루션에서 조직을 품 어
- 1.2.1와 같은 볼륨으로 원뿔 관으로 100% 에탄올을 놓습니다. 전송 및 실시간에 24 h에 대 한이 솔루션에서 조직을 품 어
- 1.2.1와 같은 볼륨으로 원뿔 튜브에 95% 에탄올을 놓습니다. 전송 및 실시간에 24 h에 대 한이 솔루션에서 조직을 품 어
- 1.2.1와 같은 볼륨으로 원뿔 관으로 70% 에탄올을 놓습니다. 전송 및 실시간에 24 h에 대 한이 솔루션에서 조직을 품 어
- 린스 0.01 M 인산에서 조직 버퍼링 식 염 수 (PBS) 및 조직 파라핀 (그림 1B, 오른쪽 패널)의 무료는 실시간 확인에서 24 h에 대 한 equilibrate를 원뿔 튜브에 0.01 M PBS에서.
2. 준비 4 %Paraformaldehyde (PFA) 정착 제
- 플라스틱 10 mL 16% PFA 50 mL 원뿔 튜브로 4 mL 0.1 M PBS, 추가 하 고 추가 26 mL 증류수 이온 (ddH2O). 뚜껑 닫고 잠시 혼합.
- 4%의 더 큰 볼륨 미리와 aliquots에서 냉동 PFA는 만들 수 있습니다. 4 ° C에서 1 주 및 1 개월-20 ° c.에 aliquots는 실 온 (RT)에서 1 일에 대 한 좋은
3. 췌 장 고정
- 갓된 4%에서 췌 샘플 (1 x 1 x 2 cm ≤) 수정 PFA 48 h 4 ° C에서. 샘플 1 x 1 x 2 cm를 사용 하 여 메스 또는 면도칼으로 작은 해 부 보다 큰 경우 개 더 이상으로 보다 1 ㎝ 두께. 각 씻어 적어도 15 분 동안 0.01 M PBS의 세 가지 변화에서 조직 샘플을 세척 하 고 사용까지 0.01 %PFA / 0.01 M PBS 또는 0.5% 나트륨 아 지 드/0.01 M PBS에에서 15 mL 원심 분리기 튜브에 저장.
- 고정, 후 추가 처리를 위해 1-2 m m 두꺼운 섹션으로 조직 섹션. 하도 단면에 vibratome를 사용 합니다.
참고: 섹션의 마지막 수 시작 샘플의 크기에 따라 달라 집니다.
4. 하이드로 겔에 조직 포함
- 다음과 같이 4% 아크릴/1 %paraformaldehyde (A4P1) 하이드로 겔 단위체 솔루션 200ml를 준비:
- 마그네틱 볶음 판 위에 양동이에 얼음에 플라스 크를 놓습니다. 플라스 크는 평평 앉아 있는지 확인 하 고 자기 볶음 바 추가 합니다.
- 다음 순서로 추가: 147.8 mL 감기 (4-8 ° C) ddH2O, 20 mL 0.1 M PBS, 20 mL 감기 (4-8 ° C) 40% 아크릴 솔루션, 12.2 mL 16 %PFA 솔루션, 및 250 mg 버지니아-044 초기자. 적어도 10 분 동안 자기 볶음 바 전체 히드로 솔루션을 혼합 하 고 단계에 대 한 얼음에 솔루션을 떠나.
- 하이드로 겔 솔루션을 포함 하는 플라스 크가 옆에 얼음에는 장소 15 mL 원뿔 튜브. 단량체 솔루션의 14 mL 튜브에 플라스틱 고 1-2 m m 두께 고정된 조직 샘플의 한 조각을 추가 합니다. 다음 모자는 튜브.
- 4 ° C에서 3 일 동안 단위체 솔루션에서 샘플을 품 어 고 빛 으로부터 보호 합니다. Aliquot 어떤 나머지 모노 머 솔루션 및 나중에 사용-20 ° C에서 저장.
5. 드 모노 머 솔루션 및 유해는 하이드로 겔
- 가스 N28을 사용 하 여 하이드로 겔 단위체 솔루션에서 산소를 제거 합니다.
- 얼음 양동이 준비 하 고 얼음에 하이드로 겔 단위체 솔루션에는 샘플을 배치.
- 샘플, 파라핀, 필름과 타이머 당 2-3, 18-게이지 피하 주사 바늘을 수집 합니다. 질소 흐름 수 있도록 질소 탱크에 있는 튜브를 연결 합니다. 얼음에 샘플을 유지 하면서 신중 하 게 한쪽에 샘플을 포함 하는 원뿔 튜브의 뚜껑을 뚫 고 때까지 통해 피하 바늘은 액체 단량체 솔루션의 표면 아래를 누릅니다.
- 펑크는 캡의 반대 측에 다른 피하 주사를 사용 하지만 침수 될 그것을 허용 하지 마십시오.
참고: 두 번째 바늘 튜브를 환기 합니다. - 피하 주사는 히드로 아래 물속에 질소 탱크에서 튜브를 연결 하 고 천천히 때까지 액체를 통해 꾸준히 버블링은 질소를 켭니다.
- 10 분 동안 액체를 통해 거품을 질소를 허용 합니다.
- 산소 제거 되 면 신속 하 게 두 바늘을 제거 하 고 커버 튜브와 환경 사이 가스의 어떤 더 교류를 방지 하기 위해 파라핀 영화와 모자. 3 h는 히드로 유해를 37 ° C에서 인큐베이터에 degassed 샘플을 놓습니다.
6. 조직 개간
- 500 mL 지우기 솔루션 (pH 8.5에서 4 %SDS)를 준비 합니다. DdH2O ~ 300 mL, 50 mL 0.1 M PBS와 20 g SDS 분말 자석 저 어 바 교 반 하면서 추가 합니다. 수산화 나트륨과 염 산이 pH 8.5 사용 하 여 솔루션을 조정 합니다. 마지막 볼륨은 500 mL까지 ddH2O를 추가 합니다.
- 중 합, 후 멀리 초과 하이드로 겔을 부 어 하 고 화학 폐기물 용기에 그것을 삭제 합니다. 부드럽게 샘플에서 멀리 하이드로 겔을 닦아 하 고 화학 폐기물 용기에 폐기 종이 타월을 사용 합니다.
- 각 세척 단계 샘플 0.01 M PBS의 3-5 교류에 (삭제 세척 액체 화학 폐기물에) 15 분 동안 씻어. 버퍼를 비운의 40 mL 50 mL 원뿔 튜브에 샘플을 전송 합니다.
- 37 ° C에서 개간 버퍼에 샘플을 품 어 하 고 매일 신선한 개간 버퍼에 샘플을 변경 합니다.
- 적절 한 청소를 보장 하기 위해 개간 버퍼 (~ 8 주가 3 mm x 3 mm x 3 mm 샘플) 샘플 크기에 따라 2-8 주에 대 한 샘플을 둡니다.
- 모니터링 조직 개간 하 고 완료 되 면 중지 합니다. 샘플 확인 하기 위해 적절 한 개간 빛까지 개최 하 여 적절 하 게 투명 인지 확인 (일반적으로 일부 황갈색 색소에에서 남아 exocrine 지역).
참고:-선택된 샘플 가장자리에 닳은 나타나고 텍스처 집게로 집어 매우 부드러운 될 것입니다. 균등 하 게 취소를 샘플에 대 한 일반적입니다. 또한, 조직 설치 미디어 (삽입, 그림 1C)에 배치 될 때까지 완전히 투명 하 게 되지 않습니다.
7. 여러 면역 형광 검사
- 씻어 60 rpm에서 통에 샘플 RT에서 하루 동안 40 mL 0.01 M PBS (4-5 버퍼 변경 총, 40 mL에 각 세척, 최종 세척까지 모든 h 변경) 종종 신선한 버퍼에 변경. 실시간에서 밤새 계속 최종 세척 하자
- 협정 얼룩 버퍼를 준비 합니다. 500 mL 0.01 M PBS, 50 mg 나트륨 아 지 드와 0.5 mL TritonX-100 추가. 잘 믹스.
- 1 차 항 체와 함께 샘플을 품 어.
- 2 mL 플랫 바닥 튜브에 버퍼를 얼룩 기본 협정을 2% 정상 혈 청 (동일한 종으로 이차 항 체)를 추가 (1 mL 전체 볼륨 샘플/튜브 당 권장).
- 2% 세럼/협정 버퍼 얼룩에 1 차적인 항 체를 추가 합니다. 협정 얼룩에 대 한 1 차적인 항 체의 양 x 약 5를 사용 하 여 표준 immunohistochemistry (즉 경우 항 체를 위한 표준 immunohistochemistry, 협정 얼룩에 대 한 사용 1: 100 희석된 1: 500) 사용 될 것 이다.
- 워시 버퍼에서 샘플을 제거 하 고 종이 타월에 초과 버퍼에서 소량 다음 주 항 체 솔루션 튜브에는 주걱을 사용 합니다.
- 2-4 일 60 rpm에서 통에 RT에서 품 어. 4-5 시간 신선한 버퍼를 변경 하 고 마지막 세척 단계 7.1에서 하룻밤 사이에 떠나는 0.01 M PBS에서 60 rpm에서 통에 RT에서 샘플을 철저히 씻으십시오.
- 이차 항 체와 함께 샘플을 품 어.
- 2 mL 플랫 바닥 튜브에 버퍼를 얼룩 기본 협정을 2% 정상 혈 청 (동일한 종으로 이차 항 체)를 추가 (1 mL 전체 볼륨 샘플/튜브 당 권장).
- 1: 200 (1 mL 버퍼에서 5 µ l)의 농도에 2 차 항 체를 추가 합니다.
참고: 작은 형식 항 체는, 뿐만 아니라 매우 크로스 흡착 항 체 경우 하나 이상의 기본 항 체를 사용 하 여. - 워시 버퍼에서 샘플을 제거 하 고 종이 타월에 초과 버퍼에서 소량 다음 이차 항 체 솔루션 튜브에는 주걱을 사용 합니다.
- 2 일 동안 60 rpm에서 통에 RT에서 incubate 고 빛에서 샘플을 보호 합니다.
- 샘플을 철저 하 게 세척, 단계 7.1 시간 4-5 신선한 버퍼를 변경 하 고 떠나는 마지막 0.01 M PBS에서 60 rpm에서 통에 RT에서 하룻밤 사이에 세척, 세척 하는 동안 빛에서 보호.
8. 영상에 대 한 샘플 장착
- 굴절률 정합된 솔루션 (RIMS) 버퍼를 준비 합니다.
- 신중 하 게 50 mL 원뿔 튜브에 전송 및 비 이온 밀도 그라데이션 매체 (예: Histodenz)의 11 g으로 무게.
- ~ 5 mL 0.02 M 인산 버퍼 (PB)8 분말 비 이온 밀도 그라데이션 매체에서 공기를 해제 하는 주걱을 사용 하 여 추가 합니다.
참고: 솔루션은 아주 점성, 잘 혼합. - 10 ml 더 많은 PB를 사용 하 여 볼륨을가지고, 주걱으로 혼합 하 고 튜브에는 주걱을 초과 다쳤어요.
- 해산 때까지 37 ° C에서 바퀴를 품 어, 반전 하 고 필요에 따라 부드럽게 혼합.
- 테두리에 샘플을 전송 합니다. 이렇게, 1 mL를 플라스틱 2 mL 평면 하단 튜브로 바퀴. 워시 버퍼에서 샘플을 제거 하 고 종이 타월에 초과 버퍼에서 소량 다음 테두리 솔루션 튜브에는 주걱을 사용 합니다.
- 부드럽게 잠수함 테두리에 샘플 튜브를 누릅니다. RT에 빛에서 이미징 하기 전에 2-4 일에 대 한 보호는 벤치에 테두리에 샘플을 배치 합니다.
- 이미지, 적은 양의 8 잘 coverslip 아래쪽 챔버 슬라이드에 테두리를 배치 합니다. 코트 바닥을 충분히 추가, 더 많은 샘플 거꾸로 범위에 이미지를 더 어렵게 하는 float 하면. 우물에 샘플을 추가 하 고 슬라이드 이미징에 대 한 모자.
9입니다. 영상
- Confocal 현미경 검사 법 및 이미징 소프트웨어
- 여기 및 협정 샘플 얼룩 사용 fluorophores의 방출 스펙트럼에 대 한 적절 한 레이저를 선택 합니다. 채널 간의 모든 중복 제거 수집 소프트웨어의 설정을 조정 합니다. (두 fluorophores 비슷한 흥분 스펙트럼 때) 필요한 경우 별도 트랙 사용 합니다.
- 이미지 수집 설정
- 최대 수집 속도, 16 비트, 4 이상의 평균, 및 1024 x 1024 해상도 선택 하거나 더 나은 합니다.
- 개체 수 이미지를 확대 합니다.
참고:이 하 사진 표백 줄일 또한 파일 크기와 다운스트림 편집 수집 시간을 줄일 것 이다.
- Z-스택 설치.
- 사용 되 고 목표에 대 한 최적의 단면을 선택 합니다. Deconvolution 나중에 필요한 경우 사용 하 여 z-단계 1 µ m 등 최적의 보다 작은.
- Z-스택 보정을 사용 합니다.
- 직물의 표면에 가장 가까운 시작 및 목표 z-비행기를 통해 초점을 맞추고 이득을 증가 하 고 수정 추가. 정정에 대 한 레이저 설정을 변경 하지 마십시오!
- 취득 한 평균, 512 x 512 해상도와 최대 수집 속도 테스트 스택. 최종 높은 해상도 z-스택을 취득 하기 전에 각 색상에 대 한 전역 동등한 밝기는 되도록 3d에서 이미지를 확인 하십시오.
- Lightsheet 영상
- 샘플 이상적으로 적어도 24 h. 이미지에 대 한 테두리에 equilibrated 되었습니다 이미징 챔버에 신선한 테두리에 샘플을 전송 고 적어도 하루에 대 한 챔버에 equilibrate 수 있게 확인 하십시오.
- 이미징에 대 한 샘플을 탑재
- 샘플을 탑재를 작은 (블랙) 모 세관을 선택
- 퍼 티 또는 접시를 사용 하 여 모 세관의 끝에 슈퍼 접착제를 적용 하는 동안 샘플을. 감동 만큼 가능한 조직의 표면 모 세관에 조직 접착제.
- 이미징에 대 한 예제를 삽입 합니다.
- 이미지 광학 허가 샘플 피벗을 사용 하 여 스캔 옵션에 대 한 5 X 또는 적합 한 25 X 목표를 사용 하 여. 숨김 또는 흐리게 경우 샘플을 회전 다시 시도, 또는 바퀴에 equilibrate 계속 샘플을 보자.
참고: 1 스택 5 분, 설정에 따라 일반적으로 취득 수 있습니다. - 보기 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 스택 편집.
Representative Results
이러한 착 절차는 독도 관련 된 자율 고 감각 네트워크를 검사 하는 인간의 췌의 대규모 시험을 제공 하기 위해 개발 되었다. 선명도7,17, iDISCO 포함 하 여 여러 절차를 테스트 하 고 최고의 발견 협정 방법으로 협정8 인간의 췌 장 및 confocal 영상에 적합.
1 차 항 체 처음 테스트에 적합 한 긍정적이 고 부정적인 제어 샘플 인간의 췌 샘플 고정 (뇌, 마우스 다른). 각 실험실 많은 번호와 조직 소스에 따라 항 체 희석 최적화를 기대할 수 있지만 주 항 체 및 제안된 희석 재료의 테이블에 나열 됩니다. 1 차적인 항 체 로트 변형 영향을 얼룩 강렬과 특이성, 고 전 시 약으로 얼룩 강도의 동일한 정도 달성 하기 위해 확인을 요구 수 있습니다.
인간의 췌에서 독도 인슐린, 글 루카 곤, 및 secretogranin 3 (그림 2)에 의해 구분 된 했다. Schwann 세포 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP, 그림 2 및 그림 3A)를 사용 하 여 구분 된 했다. 신경 부 교감 신경 마커 vasoactive 창 자 펩 티 드 (VIP)에 대 한 항 체로 얼룩진 Lightsheet (그림 3B)에 몇 군데 있었다. 교감 신경은 티로신 hydroxylase (표시 되지 않음)에 대 한 얼룩으로 볼 수 있습니다.
그림 1입니다. 인간의 췌 광학 개간. (A) 면도날 잘라내어 조직 단면도 제거 하 고 조직 (하단 패널)에서 멀리 초과 파라핀 된다고 하기 전에 파라핀 끼워 넣어진 조직 (상단 패널)의 섹션을 느슨하게 사용 됩니다. 대표 조직 샘플 (오른쪽 B, C 가운데) 광 개간 프로토콜 섹션에 설명 된 대로 파라핀 끼워 넣어진 조직의 전후 (B 왼쪽된, C 위쪽) 에 표시 됩니다. 취소, 고정 조직 (B, C 최고) 와 종종 조직 후 완전히 투명 하지 않습니다 붓기 수 있습니다 (C, 중간 패널)평가. 허가 조직 바퀴 (C, 하단 패널)에서 평형 후 완전히 투명 하 게 된다. 바 규모: 500 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 인간의 신경 섬 네트워크. NPOD 장기 기증자 또는 보관 파라핀 끼워 넣어진 조직에서 설명 된 대로 인간의 췌 샘플 삭제 했다. (A-D) Schwann 세포 (GFAP + 흰색) 하 고 내 분 비 세포 (빨간색) 인슐린과 글 루카 곤 (녹색)으로 얼룩진 표시 됩니다. (A) Confocal 현미경 검사 법 및 최대 강도 투영 (MIP) 섬 주변에서 혈관 옆 전기가 하 고는 독도에 신경에 Schwann 세포 GFAP (+)의 추적을 보여줍니다. 삽입 된 높은 해상도 고 GFAP + Schwann 세포와 내 분 비 세포 사이 접촉을 보여줍니다 보여줍니다. (B) 패널의 3D 이미지 (규모: x = 50 µ m, y = 20 µ m, z = 25 µ m) a. 파라핀 협정 샘플 confocal 현미경 검사 법을 통해 이미지 표시 됩니다 고 최대 강도 프로젝션 (C) 과 3 차원 (D)에 제시, 확장: x, y = 50 µ m, z = 25 µ m). 스케일 바 , C: 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3. 3D 시각화 및 바느질. 3 바느질된 이미지 스택은 Schwann 세포 GFAP confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 스테인드 및 이미지 분석 소프트웨어에 neurite 추적기 플러그인을 사용 하 여 추적의 인수 했다. (A) 추적의 3D 채우기가 표시 됩니다 (막대를 확장: x = 150 µ m, y = 200 µ m (0.2 m m), z = 120 µ m) (B) A 협정 샘플과 VIP 항 체로 얼룩진 했다 lightsheet 현미경을 사용 하 여 몇 군데. 스택이 > 1 mm 깊이 신경 섬유에 높은 해상도에서 명확 하 게 볼 수 있습니다. 섬유 포장 (D, 전경) 덕트와 신경 절 (G, 배경)를 볼 수 있습니다 (큰 그리드: x, y, z = 200 µ m; 눈금 표시: x, y, z = 40 µ m). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
새로운 광학 개간 방법의 동물 모델에는 중앙의 전례 없는 대규모 시험 및 주변 신경 시스템을 허용 하고있다. 인간의 췌 장의 전반적인 신경 분포 패턴 조직 밀도 높은 품질 biospecimens 인수에 어려움으로 인해 크게 탐험 되지 않습니다. 이 프로토콜은 고정 또는 파라핀 끼워 넣어진 보관 샘플에서 인간의 췌 장 조직에 대 한 프로토콜을 삭제 하는 최적화 된 조직에 제공 합니다.
시간을 지우기 샘플 크기, 통 유형, 기간, 저장 기간에 따라 달라 집니다 고 다음 고려 사항은 중요 한 그래서 1-8 주를 요구할 수 있습니다. 가능 하면 장기 보관 개간 시간 증가 하기 때문에 4 %PFA 고정 후 곧 조직을 지우려면 최상 이다. 청소 시간을 최소화 하기 위해 하이드로 겔 단위체에 PFA의 금액 1%로 고정 단계에서 사용 되는 인간의 췌 장 4%에서 감소 했다. 다른 조직, 특히 마우스 조직에 대 한 PFA 항을 유지 하기 위해 충분 한 하이드로 겔 강성을 제공 하기 위해 필요한 금액은 실험적으로 결정 되어야 합니다. 적절 한 개간 때문에 항 체 침투 제대로 삭제 된 조직에 감소 되 고 2 차 항 체에 의해 얼룩 표면 증가 또한 필수적 이다. 청소 솔루션을 변경 모든 다른 일 (또는, 심지어 매일)이 pH 상수와 세제를 신선한 유지 좋습니다. 반대로, 부정적인-지우기 세포 형태에 미치는 영향 및 조직 friability 증가. 이후 일부 췌 장 샘플 취소 하지 섬유 증 만성 췌 장 염에서의 지역 등 고유한 병 리 또는 다른 병 리 균등 하 게, 그것은 자주이 프로세스를 모니터링 하는 것이 중요. Vibratome 두꺼운 섹션의 사용 하 여 균일 한 두께 만들기 위해 사용할 수 있습니다 아직 필요 하지 않습니다. 최대한 빨리 빛 샘플, 쉽게 통과 샘플 세제에서 제거 됩니다 개간 과정 모니터링 샘플 충분히 지워집니다 보장 합니다.
항 체 침투 및 표면 얼룩 협정 예제와 함께 고려해 야 할 중요 한 문제가 있습니다. 좋은 항 체 침투를 위해, 그것은 적어도 2 일 동안 1 차 항 체와 함께 샘플을 품 어 중요입니다. 다양 한 항 체 다른 보급률 있고 개별적으로 최적화 해야 하지만 대부분 항 체, 4 일 1 m m3 샘플에서 전체 침투에 대 한 충분 한 기간. 표면 얼룩이 지는 문제는, 특히 Lightsheet 이미징에 대 한 샘플, 절반 절단 될 수 있습니다 또는 표면 얼룩 후 멀리 해 부. 작은 형식 항 체 사용 가능한 경우 조직 침투8을 지원 하기 위해 예상 될 것 이다. Preconjugated 항 체 같은 결합형된 복제 뿐만 아니라 작동 표시 되지 않습니다 및 일반적인 바인딩 및 빈약한 조직 침투에서 높은 배경 수 만약 그들이 모든 일을 관찰. Preconjugated 항 체와 함께 향상 된 성공, 증가 혈 청 및 TritonX-100 농도 얼룩이 지기에서 버퍼 긴 외피를 사용 (> 4 일). 얼룩, 후 몇 일 동안 바퀴에 샘플의 인큐베이션이 중요 합니다. PBS 및 테두리 외피에 허가 조직 팽창 발생 다시 원래 크기로 축소 합니다. Lightsheet 영상와 특히 샘플 완전히 이미징 하기 전에 equilibrated 되어야 한다.
Confocal 현미경에 샘플 이미지 때 수정에 새 위치를 선택 때마다가 설정 해야 합니다. 다양 한 수집 깊이 강도 조직 전체를 얼룩에 최적의 이미지를 조직의 각 영역에 대 한 조정이 필요로 합니다. 마찬가지로, 사용 하는 2 차 항 체는 신중 하 게 고려 되어야 한다. 스펙트럼 unmixing fluorophores 밝은 신호를 필터링 하는 confocal 현미경에 방출 되도록 낮은 여기 또는 오버랩 적절 하 게 선택 되어야 한다 그래서 협정 샘플, 도전 이다. 사진-표백 하지 않고 최고의 품질 이미지를 얻을 수 있다 그래야 각 응용 프로그램에 대 한 균형 해상도, 이미징 속도 및 소음 감소 사이 삼진 해야 합니다. 해상도 1024 x 1024 보다 큰 인간의 눈으로 감지 하지만 얼룩의 정량화는 필요한 경우 특정 응용 프로그램에 필요한 있을 수 있습니다.
광학 개간 기술을 선택할 때 그리고 다른 전통적인 방법을 통해 광학 개간을 선택할 때 고려해 야 할 많은 것 들이 있다. 낮은 풍부 항 따라서 있다 항 원 탐지에 대 한 제한 협정 방법을 사용 하 여 감지 하지 않을 수 있습니다. 특정 항 원 면역 항 원 (CD3, CD4, CD8, 등) 같은 협정 방법으로 파괴 하 고 그들을 감지 사용할 수 있는 고품질 항 체에도 불구 하 고 감지 되지 않습니다. 이 방법의 또 다른 한계는 기증자 췌 얼룩을 지운 후 때까지 분별 하기 어려운 사이 고유의 가변성. 각 기증자 조직 명확 하 고 절차, 사이 유사 하 게 얼룩 경향이 있다 하지만 다른 기증자 조직 널리 다양 한 청소 시간 및 조직의 형태학 품질 개간 후. 비록이 철저 하 게 조사 하지는 하나 환자 췌 샘플의 많은 수에 대 한 적절 한 액세스를 가질 수 있다면 보관 조직을 사용 하는 능력이이 제한을 완화 수 있습니다. 여기 보고 협정 프로토콜 저렴 하 고 쉽게 표준 실험실 장비로 구현 될 발견 됐다. 선택된 샘플 전통적인 confocal 현미경 검사 법, 2 광자 및 Lightsheet 기술을 통해 영상에 적합 되었고 고해상도 신경 및 인간의 췌의 큰 섹션에 독도의 3D 이미지를 제공. 이 절차의 미래 응용 프로그램 태아 췌 장 외 분 비 및 내 분 비 구획 및 타입-1에에서 섬 연구 및 2 형 당뇨병의 개발에 대 한 연구를 포함합니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 박사 앤 푸와 기술 지원에 대 한 조셉 Canzano, 박사 제니퍼 Treweek 귀중 한 조언, 그리고 닥터 크리스틴 Overton 및 MCT 스탠포드 대학 선명도 워크샵을 통해 교육에 대 한 박사 칼 Deisseroth 감사합니다. JDRF nPOD 및 장기 조달 조직 조직 샘플을 제공합니다. 이 작품은 JDRF (47-2014-1), 헴 슬 리 자선 신탁 (HCT 2015-PG-T1D052) 및 MCT에 NIDDK 1OT2 TR001773에 의해 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | Buffers |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | S375-500 | PB buffer (RIMS) |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | 71507-250 | PB buffer (RIMS) |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | Immersion fixation, hydrogel, storage solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | Hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | Hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | Hydrogel |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | Clearing buffer |
| Sodium azide | Sigma | S8032 | Sample storage buffer |
| 18 gauge needles | Fisher | 14-840-91 | Degassing hydrogel solution |
| N2 tank | AirGas | various | Degassing hydrogel solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 100 ml | Buffers |
| Goat, normal serum | Vector | S-1000 | Use as 2% in blocking buffer |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | RIMS |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80827 | Imaging |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 710 | Imaging |
| LightSheet microscope | Zeiss | Z1 | Imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibody | |||
| CD45 | Bioss | bs-4820R-A488 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Did not work |
| CD45 | DAKO | M0754 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| GFAP | DAKO | Z0334 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | BD Biosciences | 565891 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | Cell Signaling | 2760S | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| Glucagon | Abcam | ab10988 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Insulin | DAKO | A0564 | Host: Guinea Pig Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| NCAM (CD56) | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| NCAM (CD56)-FITC conjugate | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Peripherin | EnCor | RPCA-Peri | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| PGP9.5 | DAKO | Z5116 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Secretogranin 3 | Sigma | HPA006880 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Smooth muscle actin | Sigma | A5228; C6198 (Cy5) | Host: Mouse Dilution: 1:200; 1:200 Comments: Worked; Conjugated worked better than unconjugated |
| Substance P | BioRad | 8450-0505 | Host: Rat Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Abcam | Ab76442 | Host: Chicken Dilution: 1:100 Comments: Worked, but weak staining |
| Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) | Immunostar | 20077 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| Vesicular Acetylcholine Transporter (VAChT) | Synaptic Systems | 139103 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Secondary Antibody | |||
| Guinea pig IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Mouse IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rat IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat, Donkey Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Chicken IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
References
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