Summary
Hier präsentieren wir Ihnen einen Protokoll zum menschlichen Bauchspeicheldrüse Bildausschnitte in drei Dimensionen (3D) mit optimierten passiven clearing-Methoden. Diese Handschrift zeigt diese Verfahren für passive optische Clearing folgten mehrere Immunfluoreszenz Färbung um Schlüsselelemente der autonomen und sensorische neuronale Netze innervieren menschlichen Inselchen zu identifizieren.
Abstract
Mit traditionellen histologischen Methoden, Forscher sind in ihrer Fähigkeit, ganze Bild behindert Geweben oder Organen im großen 3D. Histologischen Abschnitte beschränken sich im Allgemeinen auf < 20 µm als Formalin fixiert Paraffin Abschnitt auf Objektträgern oder < 500 µm für frei schwebenden festen Abschnitte. Daher sind umfangreiche Anstrengungen erforderlich für serielle Schnitt und große Bild Rekonstruktionsmethoden 3D für Proben neu erstellen > 500 µm, die mit traditionellen Methoden. Darüber hinaus verhindert leichte Streuungen von Makromolekülen in den Geweben, vor allem Lipide Bildgebung bis zu einer Tiefe > 150 µm mit meist konfokale Mikroskope. Um Streulicht zu reduzieren und Tiefenmassage Bildgebung mit einfachen konfokalen Mikroskopie ermöglichen, sind verschiedene optische Clearing Methoden entstanden, dass durch Untertauchen für Nager und menschlichen Gewebeproben befestigt sind. Mehrere Methoden sind verwandt und Protein Vernetzung mit Acrylamid und Gewebe clearing mit Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) verwenden. Andere optische Clearing-Techniken verwendet verschiedene Lösungsmittel, obwohl jede Änderung verschiedene vor- und Nachteile hatte. Hier wird eine optimierte passive optische Clearing-Methode für Studien der menschlichen Bauchspeicheldrüse Innervation und speziell zum Verhör von der Innervation der menschlichen Inseln beschrieben.
Introduction
Bis vor kurzem wurde die 3-dimensionale (3D) Rekonstruktion des großen Gewebe oder ganzer Organe durch mühsame seriellen Schnitt, Färbung und Bildrekonstruktion aus mehreren Teilen durchgeführt. Diese Methoden hatten einige Nachteile einschließlich Vertrauen auf eine große Anzahl von Schnittserien, schlechte Gewebe eindringen mit Antikörpern und Lichtstreuung Tiefe Bildgebung in den Geweben zu verhindern. Um mehr Licht und Antikörper eindringen zu ermöglichen, entwickelten die Forscher chemische Methoden, um Protein-Antigene zu bewahren und gleichzeitig die Mehrheit der Lichtstreuung Lipide entfernen. Mehrere verwandte Methoden sind Clear Lipid-Exchanged Acrylamid-hybridisiert starre Imaging Gewebe hYdrogel (Klarheit), Passive Klarheit Technik ("Pakt") und Perfusions-gestützte Agent Release in Situ (PARS) (rezensiert in 1,2 ,3,4,5,6). Die Klarheit-Methode basiert auf Stabilisierung von Proteinen mit Formaldehyd, Acrylamid und BIZ Hydrogel gefolgt von Lipid-Entfernung mit Elektrophorese in einem SDS-Lösung2. Dieser Ansatz wurde später geändert für Passive clearing und advanced imaging7. Eine weitere Optimierung führte zu die Beseitigung der BIZ und unterschiedliche Prozentsätze von Paraformaldehyd in der Hydrogel-Lösung (1-4 %), optimale Antigen Stabilisierung zu erhalten mit der kürzesten Clearing-Zeit für eine Technik namens Pakt 8. Frühe Versuche, diese optische Clearing-Techniken entwickeln beteiligt organische oder andere Substanzen, die schwer zu arbeiten und abgeschreckt endogenen fluoreszierende Proteine in transgenen Mausmodellen waren. Diese zusätzlichen Methoden enthalten Skalen, ungehindert Gehirn/Körper-Cocktails und Computational Analysis (kubisch), Schalter und Dimensional Imaging of Solvent-Cleared Organe (DISCO) Methoden, alle mit verschiedenen vor- und Nachteile9, 10,11,12. Die ursprüngliche Klarheit-Methode wurde in Hirngewebe lipidreichen Maus entwickelt und optische Clearing Methoden hatten wenig Tests in menschlichen Geweben7,8,11,13,14 .
Optische Clearing Methoden eignen sich für die Ablaufverfolgung Nerven über weite Strecken wie in das zentrale Nervensystem intakt Maus. Die Bauchspeicheldrüse ist auch von autonomen und sensorische Nervensystem innerviert. Die pankreatische endokrine Fach, Langerhans-Inseln, umfassen einen sehr kleinen Teil des gesamten Organs (1-2 %) und Inselchen kenne Heterogenität in Größen (50-250 µm), endokrine Zelle Proportionen und Dichte besonders bei Diabetes (rezensiert in 15 ,16). Bei der Entwicklung eines Protokolls, mehrere optische Clearing-Methoden wurden für menschlichen Bauchspeicheldrüse getestet und ein Pakt-Verfahren wurde festgestellt, dass das beste Verhältnis von Zeit (~ 2 Wochen) bieten mit hervorragenden morphologischen Erhaltung der Nerven und Inselchen. Die endgültige optimierte Vorgehensweise wird hier in der Abgrenzung des Neuro-insularen Netzwerks für groß angelegte (Millimeter Abstand) und hochauflösende 3D-Bildgebung mehrere intakte Pankreas Inseln. Die Technik eignet sich für menschliche Bauchspeicheldrüse unmittelbar nach der Fixierung oder nach Lagerung sowie Proben in neutral gepuffertem Formalin fixiert und in Paraffin Wachs eingebettet. Die Proben eignen sich für die Bildgebung durch konfokale oder Lichtscheibe Mikroskopie.
Protocol
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der University of Florida Institutional Review Board und Richtlinien des Bundes durchgeführt.
Achtung: Paraformaldehyd und Acrylamid sind giftige Reizstoffe. Reagenzien in einer Abzugshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Kittel, Handschuhe, Augenschutz) zu behandeln.
(1) 4.wenn der Formaldehyd-feste Gewebe (wenn mit frischem Gewebe arbeiten, überspringen Sie Schritt 2)
- Verwenden Sie eine neue Rasierklinge oder einem Skalpell durchtrennen das Paraffin senkrecht zur Oberfläche des Gewebes. Schneiden Sie das Paraffin an den Rand des Gewebes zu beenden, es zu lösen. Verwenden Sie Zange oder einem Spatel vorsichtig lösen und entfernen das Gewebe optisch gelöscht werden. Reiben Sie sanft überschüssiges Paraffin aus dem Gewebe mit einem Spatel (Abbildung 1A).
- Füllen Sie einen Glasbehälter mit Xylol (ca. 30 mL für ein 3 x 3 x 3 mm-Abschnitt des Gewebes) und inkubieren Sie das Gewebe in dieser Lösung für 24 h bei Raumtemperatur (RT).
- Füllen Sie ein weiteres Glas-Container mit frischen Xylol mit dem gleichen Volumen als 1.2.1. Übertragen und das Gewebe in dieser Lösung für 24 h bei RT inkubieren
- Setzen Sie 100 % Ethanol in einem konischen Rohr mit dem gleichen Volumen als 1.2.1. Übertragen und das Gewebe in dieser Lösung für 24 h bei RT inkubieren
- Platz 95 % Ethanol in einem konischen Rohr mit dem gleichen Volumen als 1.2.1. Übertragen und das Gewebe in dieser Lösung für 24 h bei RT inkubieren
- Legen Sie 70 % Ethanol in einem konischen Rohr mit dem gleichen Volumen als 1.2.1. Übertragen und das Gewebe in dieser Lösung für 24 h bei RT inkubieren
- Spülen Sie das Gewebe in 0,01 M Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Platz in 0,01 M PBS in einer konischen Röhre zu equilibrate 24 h bei RT. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe frei von Paraffin (Abbildung 1 b, rechts).
2. bereiten Sie 4 % Paraformaldehyd (PFA) Fixativ
- Pipette 10 mL 16 % PFA in ein 50 mL konische Rohr 4 mL 0,1 M PBS und hinzufügen 26 mL destilliertem, entionisiertem Wasser (DdH2O). Schließen Sie den Deckel und kurz mixen.
- Größere Mengen von 4 % PFA voraus und gefroren in Aliquote erfolgen. Aliquote eignen sich für 1 Tag bei Raumtemperatur (RT), eine Woche bei 4 ° C und 1 Monat bei-20 ° C.
3. die Bauchspeicheldrüse Fixierung
- Fixieren die Bauchspeicheldrüse Probe (≤ 1 x 1 x 2 cm) in frisch zubereitete 4 % PFA bei 4 ° C für 48 h. Die Probe ist größer als 1 x 1 x 2 cm, einem Skalpell oder einer Rasierklinge verwenden, um in kleineren sezieren Stücke nicht mehr als 1 cm dick. Gewebeprobe in drei Änderungen von 0,01 M PBS mindestens 15 min lang zu jedem Waschgang waschen und Lagern in 15 mL Zentrifugenröhrchen in 0,01 % PFA/0,01 M PBS oder 0,5 % Natrium-Azid/0,01 M PBS bis zur Verwendung.
- Nach der Fixierung Abschnitt des Gewebes in 1-2 mm dicke Schichten für die Weiterverarbeitung. Verwenden Sie eine Vibratome, bei der sogar schneiden.
Hinweis: Die endgültige Anzahl der Abschnitte hängt von der Größe der Stichprobe ab.
(4) Gewebe in Hydrogel einbetten
- 200 mL 4 % Acrylamid/1 % Paraformaldehyd (A4P1) Hydrogel Monomer Lösung wie folgt vorbereiten:
- Platzieren Sie ein Fläschchen auf dem Eis in einem Eimer auf der Oberseite eine magnetische rühren-Platte. Stellen Sie sicher, dass der Kolben flach sitzt, und fügen Sie eine magnetische Stir Bar.
- Fügen Sie die folgenden in der Reihenfolge: 147,8 mL kalten (4-8 ° C) ddH2O, 20 mL 0,1 M PBS, 20 mL kalten (4-8 ° C) 40 % Acrylamid-Lösung, 12,2 mL 16 % PFA Lösung und 250 mg VA-044-Initiator. Mischen Sie die gesamte Hydrogel-Lösung mit einer magnetischen Stir Bar mindestens 10 min lang und lassen Sie die Lösung auf dem Eis für den nächsten Schritt.
- Legen Sie eine 15 mL konische Rohr in das Eis neben der Küvette mit der Hydrogel-Lösung. Pipette 14 mL Monomer-Lösung in das Rohr und fügen Sie ein Stück von 1-2 mm dicken festen Gewebeprobe. Dann Röhrchen Sie das.
- Inkubation der Probe im Monomer Lösung für 3 Tage bei 4 ° C und vor Licht schützen. Aliquoten alle verbleibenden Monomer Lösung und bei-20 ° C für eine spätere Verwendung speichern.
(5) Entgasen der Monomer-Lösung und polymerisieren Hydrogel
- Die Hydrogel-Monomer-Lösung mit gasförmigen N28entziehen Sie Sauerstoff.
- Bereiten Sie einen Eimer mit Eis und legen Sie die Probe in der Hydrogel-Monomer-Lösung auf dem Eis.
- Sammeln Sie 2-3, 18-Gauge Injektionsnadeln pro Sample, Paraffin-Film und ein Timer. Verbinden Sie den Schlauch mit der Stickstofftank, so dass der Stickstoff fließen kann. Halten Sie die Probe auf dem Eis und durchbohren Sie sorgfältig die Kappe einer konischen Röhre mit der Probe auf der einen Seite und drücken Sie eine subkutane Nadel durch bis es unter der Oberfläche der flüssige Monomer-Lösung ist.
- Verwenden Sie eine andere Injektionsnadel auf um die gegenüberliegende Seite der GAP zu durchbohren, aber es getaucht werden darf nicht.
Hinweis: Die zweite Nadel wird den Schlauch entlüften. - Verbinden Sie den Schlauch aus dem Stickstofftank mit der Injektionsnadel unter Wasser unter das Hydrogel und drehen Sie langsam auf den Stickstoff, bis es stetig durch die Flüssigkeit sprudeln wird.
- Lassen Sie den Stickstoff durch die Flüssigkeit für 10 min Blasen wirft.
- Nach dem Entfernen des Sauerstoffs schnell entfernen beide Nadeln und Abdeckkappe mit einem Paraffin-Film, weiteren Austausch von Gasen zwischen dem Rohr und der Umwelt zu verhindern. Legen Sie die entgast Probe in einem Inkubator bei 37 ° C für 3 h das Hydrogel polymerisieren.
(6) Gewebe Clearing
- Bereiten Sie 500 mL clearing-Lösung (4 % SDS bei pH 8,5). ~ 300 mL DdH2O fügen Sie 50 mL 0,1 M PBS und 20 g SDS Pulver unter Rühren mit einem magnetischen Rühren hinzu. Passen Sie die Lösung mit Natronlauge und Salzsäure auf pH 8,5. Fügen Sie DdH2O hinzu, bis das endgültige Volumen 500 mL ist.
- Nach der Polymerisation überschüssige Hydrogel wegschütten und in einen chemischen Abfallbehälter entsorgen. Verwenden Sie ein Papiertuch sanft abwischen entfernt Hydrogel aus der Probe und in einen chemischen Abfallbehälter entsorgen.
- Waschen Sie der Probe in 3-5 Austausch von 0,01 M PBS (verwerfen waschen Flüssigkeit in die chemische Abfälle) für 15 min jedem Waschschritt. Übertragen Sie die Probe in ein 50 mL konische Röhrchen mit 40 mL Puffer löschen.
- Inkubieren Sie die Probe im Clearing Puffer bei 37 ° C und ändern Sie Probe in frischen Clearing Puffer jeden zweiten Tag.
- Lassen Sie die Probe im Clearing-Puffer für 2 bis 8 Wochen je nach Größe der Stichprobe (~ 8 Wochen für eine 3 x 3 mm x 3 mm Probe) dafür richtige Clearing.
- Überwachen Sie Gewebe-Clearing zu und beenden Sie, wenn Sie fertig sind. Sicherzustellen, dass die Stichprobe hinreichend transparent ist, durch hielt es gegen das Licht, für einen entsprechenden Ausgleich zu überprüfen (in der Regel einige Tan Färbung bleibt in den exokrinen Regionen).
Hinweis: Eine über geräumte Probe erscheint an den Rändern ausgefranst und die Textur sehr weich, wenn mit der Pinzette abgeholt werden. Es ist üblich, dass die Probe um ungleichmäßig zu löschen. Die Gewebe werden auch nicht vollständig transparent bis platziert in der Montage von Medien (Insert, Abbildung 1).
7. mehrere Immunfluoreszenz
- Waschen Sie die Proben auf einem Schüttler bei 60 u/min bei RT für einen Tag mit 40 mL 0,01 M PBS Wechsel zu frischen Puffer oft (4-5 Puffer ändert in insgesamt 40 mL jedem Wechsel jede Uhr bis der letzte Wäsche waschen). Lassen Sie die letzte Wäsche über Nacht bei RT weiter
- Bereiten Sie Pakt Färbung Puffer. 500 mL 0,01 M PBS fügen Sie hinzu, 50 mg Natriumazid und 0,5 mL TritonX-100. Mischen Sie gut.
- Inkubation der Probe mit primären Antikörper.
- Der Basis Pakt Färbung Puffer in einer flachen Boden 2-mL-Tube 2 % normalen Serum (Artgenossen als sekundäre Antikörper) hinzufügen (mindestens 1 mL Gesamtvolumen pro Probenröhrchen/empfohlen).
- Die 2 % Serum/Pakt Färbung Puffer fügen Sie Primärantikörper hinzu. Verwenden Sie ca. 5 x die Menge der Primärantikörper für Pakt Färbung, wie für standard Immunohistochemistry verwendet werden würde, (d.h. wenn ein Antikörper verdünnt 1: 500 für standard Immunohistochemistry, Einsatz 1: 100 für Pakt Färbung ist).
- Entfernen die Probe aus der Waschpuffer und den überschüssigen Puffer auf ein Papiertuch abtupfen, dann legen Sie in das Rohr mit einer primären Antikörper-Lösung mit einem Spatel.
- Inkubieren Sie 2-4 Tage bei RT auf einen Shaker bei 60 u/min. Waschen Sie Proben bei RT auf einen Shaker bei 60 u/min in 0,01 M PBS in frischen Puffer 4 - 5 Mal ändern und verlassen die letzten Waschen über Nacht wie in Schritt 7.1 gründlich.
- Inkubieren Sie Proben mit Sekundärantikörper.
- Der Basis Pakt Färbung Puffer in einer flachen Boden 2-mL-Tube 2 % normalen Serum (Artgenossen als sekundäre Antikörper) hinzufügen (1 mL Gesamtvolumen pro Probenröhrchen/empfohlen).
- Fügen Sie sekundäre Antikörper in einer Konzentration von 1: 200 (5 µl in 1 mL Puffer).
Hinweis: Kleinformat Antikörper sind bevorzugt, als auch hoch Kreuz adsorbiert Antikörper, wenn mehr als eine primäre Antikörper zu verwenden. - Waschpuffer Probe entnehmen und den überschüssigen Puffer auf ein Papiertuch abtupfen, dann legen Sie in das Rohr mit einer sekundären Antikörperlösung mit einem Spatel.
- 2 Tage bei RT auf einen Shaker bei 60 u/min inkubieren und die Probe vor Licht schützen.
- Waschen Sie die Proben, wie in Schritt 7.1, bei RT auf einen Shaker bei 60 u/min in 0,01 M PBS ändern auf den frischen Puffer 4 - 5 Mal und verlassen das Finale waschen Sie, über Nacht, während Waschungen vor Licht schützen.
8. Montage Proben für die Bildgebung
- Bereiten Sie den Brechungsindex abgestimmte Lösung (RIMS) Puffer.
- Wiegen Sie 11 g nichtionischen Dichte Gradienten Medium (z. B. Histodenz) und übertragen Sie sorgfältig auf eine 50 mL konische Rohr.
- Fügen Sie ~ 5 mL 0,02 M Phosphat-Puffer (PB)8 mit einem Spatel um Luft aus dem Pulver nichtionischen Dichte Gradienten Medium lösen.
Hinweis: Die Lösung ist sehr zähflüssig, gut mischen. - Bringen Sie die Lautstärke auf 10 mL mit mehr PB mit einem Spatel mischen Sie und kratzen Sie den Überschuss aus dem Spatel in die Röhre.
- Brüten Sie Felgen bei 37 ° C bis aufgelöst, umkehren Sie und mischen Sie vorsichtig, je nach Bedarf.
- Übertragen Sie Proben in Felgen. Dazu 1 mL Felgen pipette in ein 2-mL-flach-Boden-Rohr. Einem Spatel Waschpuffer Probe entnehmen und den überschüssigen Puffer auf ein Papiertuch abtupfen, dann in der Röhre mit Felgen-Lösung.
- Klopfen Sie leicht das Rohr zur Probe in Felgen zu tauchen. Legen Sie Proben in Felgen auf der Bank lichtgeschützt bei RT für 2 bis 4 Tage vor der Bildgebung.
- Um Bild, legen Sie eine kleine Menge von Felgen in einer 8-Brunnen Deckglas unteren Kammer Folie. Nur fügen Sie gerade genug, um den unteren Mantel, mehr wird dazu führen, dass die Probe zu schweben auf einen umgekehrten Bereich Bild erschwert. Fügen Sie die Probe zum Brunnen und Kappe der Folie für die Bildgebung.
(9) Bildgebung
- Konfokale Mikroskopie und imaging-software
- Wählen Sie geeignete Laser für die Erregung und Emissionsspektren von der Fluorophore verwendet, um den Pakt Proben zu beflecken. Passen Sie die Einstellungen der Datenerfassungs-Software, so dass Überschneidungen zwischen den Kanälen beseitigt ist. Verwenden Sie separate Spuren bei Bedarf (wenn zwei Fluorophore ähnliche Erregung Spektren haben).
- Richten Sie die Bildaufnahme
- Maximale Geschwindigkeit, 16-Bit, 4 oder mehr Durchschnitte und Auflösung 1024 x 1024 wählen oder besser.
- Zoomen Sie in das Objekt abgebildet werden.
Hinweis: Dies verringert Erfassungszeit zu reduzieren Foto bleichen und auch zu verringern, Dateigröße und nachgelagerte Bearbeitung.
- Richten Sie den Z-Stapel.
- Wählen Sie den optimalen Schnitt für das Ziel verwendet wird. Später Wunsch Dekonvolution mithilfe eines Z-Schritts kleiner als optimale wie 1 µm.
- Verwenden Sie die Z-Stapel-Korrektur.
- Beginnen Sie am nächsten der Oberfläche des Gewebes und erhöhen Sie den Gewinn zu, da das Ziel durch die Z-Ebene konzentriert und fügen Sie Korrekturen hinzu. Verändern Sie nicht die Lasereinstellungen für die Korrektur!
- Erwerben Sie einen Test-Stack mit einem Durchschnitt, Auflösung von 512 x 512 und maximale Geschwindigkeit. Überprüfen Sie das Bild in 3D, um sicherzustellen, dass vor dem Erwerb des endgültige hochauflösende Z-Stapels gleicher Helligkeit während der Stapel für jede Farbe gibt.
- Lichtscheibe Imaging
- Sicherstellen Sie, dass die Proben haben in Felgen für imaging für mindestens 24 h im Idealfall equilibriert wurde, die Proben an frische Felgen in der bildgebenden Kammer übertragen und für mindestens einen Tag in der Kammer equilibrate erlauben.
- Montieren Sie die Probe für die Bildgebung
- Wählen Sie die kleinste (schwarze) Kapillare, Probe zu montieren
- Verwenden Sie Kitt oder eine Schüssel, um die Probe zu halten, während der Anwendung von Superkleber bis zum Ende der Kapillare. Kleben Sie das Gewebe in der Kapillare eine Oberfläche des Gewebes möglichst so wenig zu berühren.
- Legen Sie die Probe für die Bildgebung.
- Bild mit 5 X oder 25 X Ziele geeignet für optisch geräumte Proben mit den Drehpunkt Option scannen. Tritt shadowing oder Unschärfe, drehen die Probe und versuchen Sie es erneut, oder lassen Sie die Probe in Felgen equilibrate weiterhin.
Hinweis: Ein Stapel von 1 mm kann in der Regel in weniger als fünf Minuten, abhängig von den Einstellungen erworben werden. - Zeigen Sie an und bearbeiten Sie die Bild-Stacks mit der Bildanalyse-Software.
Representative Results
Diese Färbung Verfahren wurden entwickelt, um eine groß angelegte Untersuchung der menschlichen Bauchspeicheldrüse, Inselchen und damit verbundenen autonomen und sensorischen Netzwerke zu untersuchen geben. Mehrere Verfahren wurden getestet, darunter Klarheit7, iDISCO17, und Pakt8 mit der Pakt-Methode fanden am besten geeignet für menschlichen Pankreas und confocal Imaging.
Primäre Antikörper wurden zunächst getestet auf menschlichen Bauchspeicheldrüse Proben mit geeigneten positiven und negativen Kontrollproben behoben (Maus Gehirn, andere). Den primären Antikörper und empfohlenen Verdünnungen sind in Tabelle von Materialien, aufgeführt, obwohl jedes Labor erwarten kann, Antikörper-Verdünnungen abhängig von Anzahl und Gewebe Quelle viel zu optimieren. Primärantikörper Charge zu Charge Variation kann Einfluss auf die Intensität der Färbung und der Spezifität und verlangen Validierung, den gleichen Grad der Fleck Intensität wie bei früheren Reagenzien zu erreichen.
In der menschlichen Bauchspeicheldrüse waren Inselchen durch Insulin, Glukagon und Secretogranin 3 (Abbildung 2) abgegrenzt. Schwann-Zellen wurden mit glial fibrillary Acid Protein (GFAP, Abbildung 2 und Abbildung 3A) abgegrenzt. Nerven, gebeizt mit Antikörpern gegen das parasympathische Marker Vasoaktive intestinale Peptid (VIP) wurden auf die Lichtscheibe (Abb. 3 b) abgebildet. Sympathische Nerven können gesehen werden, mit beflecken für Tyrosin-Hydroxylase (nicht dargestellt).
Abbildung 1: Menschlichen Bauchspeicheldrüse optische Clearing. (A) eine Rasierklinge dient zum Schneiden und lösen einen Abschnitt von Paraffin-eingebetteten Gewebe (Paneele) vor dem Abschnitt Gewebe entfernen und Schaben entfernt überschüssiges Paraffin aus dem Gewebe (untere Verkleidungen). Repräsentative Gewebeproben werden vor (B, C oben links) und nach (rechts B, C Mitte) optische Clearing von Paraffin-eingebetteten Gewebe, wie beschrieben im Abschnitt Protokoll angezeigt. Das geräumte, feste Gewebe ist nicht vollständig transparent nach dem Löschen (B rechts, C oben) und oft Gewebe Schwellung kann sein geschätzt (C, mittleren Bereich). Die geräumte Gewebe wird vollständig transparent nach Gleichgewichtherstellung in Felgen (C, unten). Skalieren Sie Bars: 500 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Netzwerk für menschliche Neuro-insular. Menschlichen Bauchspeicheldrüse Proben wurden gelöscht, wie aus Organspendern nPOD oder Archivierung Paraffin-eingebetteten Gewebe beschrieben. (A-D) Schwann-Zellen (GFAP + weiß) und endokrine Zellen gefärbt (rot) Insulin und Glukagon (grün) angezeigt. (A) Confocal Mikroskopie und maximale Intensität Projektion (MIP) zeigt Rückverfolgung von Schwann-Zellen (GFAP +) auf die Nerven coursing neben Blutgefäße an der Peripherie der Insel und erstreckt sich in den kleinen Inseln. Der Inset zeigt hochauflösende erhalten und Kontakt zwischen GFAP + Schwann-Zellen und endokrinen Zellen zeigt. (B) ein 3D-Bild des Panels (Skala: X = 50 µm, y = 20 µm, Z = 25 µm) A. Eine Paraffin-Pakt Probe zeigt abgebildeten über konfokalen Mikroskopie und präsentiert als maximale Intensität Projektion (C) und in 3D (D), skalieren: X, y = 50 µm, Z = 25 µm). Skala bars A, C: 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. 3D Visualisierung und Nähten. Drei gestickte Bild Stacks wurden von Schwann-Zellen befleckt mit GFAP und konfokale Mikroskopie und verfolgt mit einem Neurit Tracer-Plugin in der Bildanalyse-Software erworben. (A) die 3D Füllung der Ablaufverfolgung wird angezeigt (skalieren Bars: X = 150 µm, y = 200 µm (0,2 mm), Z = 120 µm) (B) A Pakt Probe war fleckig mit VIP-Antikörper und unter Verwendung eines Mikroskops Lichtscheibe abgebildet. Der Stapel ist > 1 mm in der Tiefe und Nervenfasern sind deutlich in hoher Auflösung zu sehen. Fasern, die Umhüllung ein Rohr (D, Vordergrund) und ein Ganglion (G, Hintergrund) zu sehen (großes Raster: X, y, Z = 200 µm; Teilstriche: X, y, Z = 40 µm). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Verfügbarkeit der neuen optischen Clearing Methoden hat noch nie da gewesenen groß angelegte Untersuchungen des zentralen und peripheren Nervensystems in Tiermodellen gestattet. Das Gesamtmuster der Innervation der menschlichen Bauchspeicheldrüse sind weitgehend unerforscht, durch dichte Gewebe und Schwierigkeiten bei der Beschaffung von qualitativ hochwertigen Bioproben. Dieses Protokoll bietet eine optimierte Gewebe clearing-Protokoll für die menschlichen Pankreas-Gewebe aus festen oder Paraffin-eingebetteten Archivierung Proben.
Clearing-Zeit hängt von der Stichprobengröße, Fixativ Typ, Dauer, Lagerdauer und erfordern 1-8 Wochen, so dass die folgenden Überlegungen entscheidend sind. Es ist am besten Gewebe möglichst bald nach der 4 % PFA Fixierung zu löschen, weil Langzeitspeicher Clearing Zeit erhöht. Zur Minimierung von Clearing-Zeit wurde die Höhe der PFA in das Hydrogel-Monomer von 4 % wie in der Fixierung Schritt auf 1 % der menschlichen Bauchspeicheldrüse verwendet verringert. Andere Gewebe, vor allem Maus Gewebe, muss die Höhe der PFA ausreichende Hydrogel Steifigkeit vorzusehen, Antigene zu bewahren empirisch ermittelt werden. Angemessene Clearing ist auch wesentlich, da Antikörper Eindringen in schlecht geräumten Gewebe reduziert und Oberfläche, die durch sekundäre Antikörper Färbung wird erhöht. Ändern der Clearing-Lösung ist jeden anderen Tag (oder sogar täglich) am besten, um den pH-Wert konstant und Waschmittel frisch zu halten. Im Gegensatz dazu über clearing negativ wirkt sich zellulären Morphologie und Gewebe Sprödigkeit erhöht. Da einige Proben der Bauchspeicheldrüse ungleich aufgrund der inhärenten Pathologien wie Regionen der Fibrose von chronischer Pankreatitis oder andere Pathologien klar, ist es wichtig, diesen Prozess häufig zu überwachen. Verwendung von dicken Vibratome Abschnitte können auch zur einheitlichere dicken machen aber sind nicht erforderlich. Überwachung der Clearing-Prozess so Proben aus Reinigungsmittel entfernt werden, sobald Licht durch die Probe leicht geht sorgt dafür, dass die Stichprobe ausreichend geklärt ist.
Antikörper-Durchdringung und Oberfläche Färbung sind wichtige Themen mit Pakt Proben zu betrachten. Um gute Antikörper eindringen zu gewährleisten, ist es wichtig, die Proben mit dem primären Antikörper für mindestens 2 Tage bebrüten. Verschiedene Antikörper haben unterschiedliche Verbreitung Tarife und individuell optimiert werden sollte, aber für die meisten Antikörper, 4 Tage war ausreichend lang für volle Penetration in einer 1 mm3 Probe. Wenn Oberfläche Färbung ein Problem ist, vor allem für die Lichtscheibe Bildgebung kann die Probe in zwei Hälften geschnitten werden, oder die Oberfläche seziert entfernt nach der Färbung. Kleinformat-Antikörper bei Verfügbarkeit würde voraussichtlich mit Gewebe eindringen8zu unterstützen. Preconjugated Antikörper scheinen nicht zu arbeiten, sowie die gleiche unconjugated Klon und höheren Hintergrund von unspezifischen Bindung und ärmeren Gewebe eindringen kann beobachtet werden, ob sie überhaupt funktionieren. Für besseren Erfolg mit preconjugated Antikörper erhöht Serum und TritonX-100-Konzentrationen in der Färbung zu puffern und längere Inkubationen verwenden (> 4 Tage). Nach dem Färben, ist Inkubation der Probe in Felgen für mehrere Tage von entscheidender Bedeutung. Geräumte Gewebe anschwellen in PBS und Felgen Inkubation bewirkt, dass sie wieder zur ursprünglichen Größe zu schrumpfen. Vor allem mit Lichtscheibe Bildgebung, sollte die Probe vollständig vor Bildgebung equilibriert werden.
Beim Proben auf das konfokale Mikroskop abbilden, muss die Korrektur jedes Mal festgelegt werden, die eine neue Position gewählt wird. Verschiedene Tiefen Erwerb und Variation in der Färbung Intensität durch das Gewebe erfordert Anpassungen für jeden Bereich des Gewebes zu optimal abgebildet werden. Ebenso müssen der Sekundärantikörper verwendet sorgfältig betrachtet werden. Spektrale Entmischung ist im Pakt Proben, schwierig, so dass Fluorophore angemessen für eine niedrige Erregung oder Emission Überlappung sicherstellen ein helles Signal bei Emissionen auf die confocal Mikroskop Filtern ausgewählt werden müssen. Für jede Anwendung muss ein Gleichgewicht zwischen Auflösung, bildgebenden Geschwindigkeit und Rauschunterdrückung gefunden werden, so dass die bestmögliche Bildqualität ohne Foto bleichen erworben werden kann. Größer als 1024 x 1024 Auflösung ist nicht nachweisbar durch das menschliche Auge aber möglicherweise für bestimmte Anwendungen erforderlich, ggf. Quantifizierung des Fleckes.
Es gibt viele Dinge zu beachten bei der Auswahl einer optischen Clearing-Technik und bei der Auswahl von optischen Ausgleich gegenüber anderen traditionelleren Methoden. Niedrige Fülle Antigene möglicherweise nicht nachweisbar mit der Pakt-Methode, so gibt es Beschränkungen der Antigennachweis. Bestimmte Antigene wie immunologische Antigene (CD3, CD4, CD8, etc.) werden durch den Pakt Methode zerstört und sind nicht nachweisbar, trotz hoher Qualität Antikörper zur Verfügung, um sie zu erkennen. Eine weitere Einschränkung dieser Methode ist die inhärente Variabilität zwischen Spender Bauchspeicheldrüsen, die schwierig, erst nach dem Löschen Färbung zu erkennen sind. Jede Spendergewebe neigt dazu, klar und Flecken in ähnlicher Weise zwischen Verfahren, aber verschiedene Spender Gewebe haben sehr unterschiedliche Clearing-Zeiten und Gewebe Morphologie Qualität nach der Reinigung. Die Fähigkeit zur Archivierung Gewebe Nutzung kann diese Einschränkung mildern, wenn man angemessenen Zugang zu einer großen Anzahl von Patienten Bauchspeicheldrüse Proben haben kann, obwohl dies nicht gründlich untersucht worden ist. Der Pakt-Protokoll berichtet hierin erwies sich günstig und ohne weiteres mit standard Laborgeräten durchgeführt werden. Geräumte Proben eigneten sich für Bildgebung über traditionelle konfokalen Mikroskopie, sowie 2-Photonen und Lichtscheibe Technologien und lieferte hochauflösende 3D Bilder von Nerven und Inselchen in weiten Teilen der menschlichen Bauchspeicheldrüse. Zukünftige Anwendungen dieses Verfahrens sind Studien über die Entwicklung des fetalen Pankreas exokrine und endokrine Fächer und Inselchen Studien bei Typ 1 und Typ 2 Diabetes.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Ann Fu und Joseph Canzano für technische Hilfe, Dr. Jennifer Treweek für wertvolle Ratschläge und Dr. Kristin Overton und Dr. Karl Deisseroth für die Ausbildung zum MCT durch die Stanford University Klarheit-Werkstatt. JDRF nPOD und die Orgel Beschaffung Organisationen zur Verfügung gestellt Gewebeproben. Diese Arbeit wurde von JDRF (47-2014-1), Helmsley Charitable Trust (HCT 2015-PG-T1D052) und NIDDK 1OT2 TR001773, MCT finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | Buffers |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | S375-500 | PB buffer (RIMS) |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | 71507-250 | PB buffer (RIMS) |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | Immersion fixation, hydrogel, storage solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | Hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | Hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | Hydrogel |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | Clearing buffer |
| Sodium azide | Sigma | S8032 | Sample storage buffer |
| 18 gauge needles | Fisher | 14-840-91 | Degassing hydrogel solution |
| N2 tank | AirGas | various | Degassing hydrogel solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 100 ml | Buffers |
| Goat, normal serum | Vector | S-1000 | Use as 2% in blocking buffer |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | RIMS |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80827 | Imaging |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 710 | Imaging |
| LightSheet microscope | Zeiss | Z1 | Imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibody | |||
| CD45 | Bioss | bs-4820R-A488 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Did not work |
| CD45 | DAKO | M0754 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| GFAP | DAKO | Z0334 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | BD Biosciences | 565891 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | Cell Signaling | 2760S | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| Glucagon | Abcam | ab10988 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Insulin | DAKO | A0564 | Host: Guinea Pig Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| NCAM (CD56) | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| NCAM (CD56)-FITC conjugate | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Peripherin | EnCor | RPCA-Peri | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| PGP9.5 | DAKO | Z5116 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Secretogranin 3 | Sigma | HPA006880 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Smooth muscle actin | Sigma | A5228; C6198 (Cy5) | Host: Mouse Dilution: 1:200; 1:200 Comments: Worked; Conjugated worked better than unconjugated |
| Substance P | BioRad | 8450-0505 | Host: Rat Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Abcam | Ab76442 | Host: Chicken Dilution: 1:100 Comments: Worked, but weak staining |
| Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) | Immunostar | 20077 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| Vesicular Acetylcholine Transporter (VAChT) | Synaptic Systems | 139103 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Secondary Antibody | |||
| Guinea pig IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Mouse IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rat IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat, Donkey Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Chicken IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
References
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Orlich, M., Kiefer, F. A qualitative comparison of ten tissue clearing techniques. Histol Histopathol. , 11903 (2017).
- Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Curr Opin Biotechnol. 40, 193-207 (2016).
- Hsueh, B., et al. Pathways to clinical CLARITY: volumetric analysis of irregular, soft, and heterogeneous tissues in development and disease. Sci Rep. 7 (1), 5899 (2017).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
- Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Campbell-Thompson, M. Organ donor specimens: What can they tell us about type 1 diabetes? Pediatr Diabetes. 16 (5), 320-330 (2015).
- Kim, A., et al. Computer-assisted large-scale visualization and quantification of pancreatic islet mass, size distribution and architecture. J Vis Exp. (49), (2011).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
