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Bioengineering

मानव अग्ंयाशय न्यूरो-द्वीपीय नेटवर्क के उच्च संकल्प 3d इमेजिंग

Published: January 29, 2018 doi: 10.3791/56859
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1, 4, 5, 4, 1
1Department of Pathology, Immunology and Experimental Medicine, University of Florida, 2Heller School for Social Policy and Management, Brandeis University, 3Department of Medicine, College of Medicine, University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, University of Florida, 5Department of Pediatrics, College of Medicine, University of Florida

Summary

यहाँ, हम अनुकूलित निष्क्रिय समाशोधन विधियों का उपयोग तीन आयामों (3 डी) में छवि मानव अग्ंयाशय वर्गों के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस पांडुलिपि निष्क्रिय ऑप्टिकल समाशोधन के लिए इन प्रक्रियाओं को दर्शाता है एकाधिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस के बाद स्वायत्त और संवेदी तंत्रिका नेटवर्क innervating मानव टाप के प्रमुख तत्वों की पहचान दाग ।

Abstract

पारंपरिक ऊतकीय तरीकों का प्रयोग, शोधकर्ताओं ने अपनी छवि पूरे ऊतकों या बड़े पैमाने पर 3 डी में अंगों की क्षमता में बाधा है । ऊतकीय अनुभाग आमतौर पर शीशे की स्लाइड्स पर formalin निश्चित आयल अनुभाग के रूप में < 20 µm तक सीमित होते है या मुक्त-फ़्लोटिंग निश्चित अनुभागों के लिए < 500 µm । इसलिए, व्यापक प्रयासों धारावाहिक और बड़े पैमाने पर छवि पुनर्निर्माण के लिए नमूनों के लिए 3 डी विश्राम विधियों > 500 पारंपरिक तरीकों का उपयोग कर µm के लिए आवश्यक हैं । इसके अलावा, ऊतकों, विशेष रूप से लिपिड के भीतर अणुओं से प्रकाश तितर बितर, एक गहराई के लिए इमेजिंग रोकता है > सबसे फोकल सूक्ष्मदर्शी के साथ 150 µm । प्रकाश तितर बितर कम करने के लिए और डीप टिशू इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए सरल फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग, विभिंन ऑप्टिकल समाशोधन विधियों कि कुतर और मानव ऊतक विसर्जन द्वारा तय नमूनों के लिए प्रासंगिक है विकसित किया गया है । कई तरीकों से संबंधित है और सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के साथ acrylamide और ऊतक समाशोधन के साथ प्रोटीन crosslinking का उपयोग करें । अंय ऑप्टिकल समाशोधन तकनीक विभिंन सॉल्वैंट्स इस्तेमाल किया, हालांकि प्रत्येक संशोधन विभिंन फायदे और नुकसान था । यहां, एक अनुकूलित निष्क्रिय ऑप्टिकल क्लियरिंग विधि मानव अग्ंयाशय इन्नेर्वतिओन के अध्ययन के लिए और विशेष रूप से मानव टाप के इन्नेर्वतिओन के पूछताछ के लिए वर्णन किया गया है ।

Introduction

हाल ही में जब तक, 3 आयामी (3 डी) बड़े ऊतकों या पूरे अंगों के पुनर्निर्माण श्रमसाध्य धारावाहिक के माध्यम से प्रदर्शन किया गया था, धुंधला, और कई वर्गों के छवि पुनर्निर्माण । इन तरीकों सीरियल वर्गों, एंटीबॉडी के साथ गरीब ऊतक पैठ की एक बड़ी संख्या पर निर्भरता सहित कई नुकसान था, और प्रकाश बिखरने ऊतकों के भीतर गहरी इमेजिंग को रोकने । अधिक से अधिक प्रकाश और एंटीबॉडी प्रवेश के लिए अनुमति देने के लिए, शोधकर्ताओं ने रासायनिक तरीकों को विकसित करने के लिए प्रोटीन एंटीजन संरक्षित जबकि प्रकाश बिखरने लिपिड के बहुमत को हटाने. कई संबंधित तरीकों से स्पष्ट लिपिड विमर्श Acrylamide-संकर कठोर इमेजिंग ऊतक hYdrogel (स्पष्टता), निष्क्रिय स्पष्टता तकनीक (संधि), और छिड़काव में सहायक एजेंट रिहाई सीटू (पार्स) (में समीक्षा की 1,2 ,3,4,5,6) । स्पष्टता विधि एक formaldehyde का उपयोग कर प्रोटीन के स्थिरीकरण पर आधारित है, acrylamide, और बीआईएस hydrogel एक एसडीएस समाधान में ट्रो का उपयोग कर लिपिड हटाने के द्वारा पीछा किया2. बाद में पेसिव समाशोधन और उन्नत इमेजिंग7के लिए इस approach संशोधित किया गया था । इसके अलावा अनुकूलन बीआईएस के उंमूलन के लिए नेतृत्व किया और hydrogel समाधान में paraformaldehyde के प्रतिशत अलग (1-4%) एक तकनीक के लिए सबसे कम समाशोधन समय के साथ इष्टतम प्रतिजन स्थिरीकरण प्राप्त करने के लिए समझौता8 । जल्दी इन ऑप्टिकल समाशोधन तकनीक शामिल कार्बनिक या अंय यौगिकों कि मुश्किल के साथ काम करने के लिए और ट्रांसजेनिक माउस मॉडलों में अंतर्जात फ्लोरोसेंट प्रोटीन बुझती विकसित करने का प्रयास करता है । इन अतिरिक्त तरीकों में शामिल तराजू, अबाधित मस्तिष्क/शरीर कॉकटेल और गणनात्मक विश्लेषण (घन), स्विच और विलायक मंजूरी दे दी अंगों (डिस्को) तरीकों के आयामी इमेजिंग, विभिंन लाभ और नुकसान के साथ सभी9, 10,11,12. मूल स्पष्टता विधि लिपिड में विकसित-रिच माउस मस्तिष्क ऊतक और ऑप्टिकल क्लियरिंग तरीकों मानव ऊतकों में सीमित परीक्षण किया था7,8,11,13,14 .

ऑप्टिकल समाशोधन विधियों बरकरार माउस केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के रूप में लंबी दूरी पर नसों अनुरेखण के लिए आदर्श होते हैं । अग्ंयाशय अच्छी तरह से दोनों स्वायत्त और संवेदी तंत्रिका प्रणालियों द्वारा innervated है । अग्नाशय के अंत तक डिब्बे, आइलेट्स के टाप, पूरे अंग का एक बहुत छोटा सा हिस्सा शामिल (1-2%) और टाप आकार में विविधता जाना जाता है (५०-२५० µm), अंत में कोशिका अनुपात, और मधुमेह में विशेष रूप से घनत्व (15 में समीक्षित ,16). एक प्रोटोकॉल विकसित करने में, कई ऑप्टिकल समाशोधन विधियों मानव अग्ंयाशय और एक समझौता प्रक्रिया के लिए परीक्षण किया गया समय का सबसे अच्छा संतुलन प्रदान करने के लिए स्पष्ट (~ 2 सप्ताह) नसों और टाप के उत्कृष्ट रूपात्मक संरक्षण के साथ पाया गया था । अंतिम अनुकूलित प्रक्रिया यहाँ बड़े पैमाने पर (मिलीमीटर दूरी) और कई बरकरार अग्नाशय के टाप के उच्च संकल्प 3 डी इमेजिंग के लिए न्यूरो-द्वीपीय नेटवर्क के विरेखांकन में वर्णित है । तकनीक मानव अग्न्याशय के लिए उपयुक्त तुरंत निर्धारण के बाद या भंडारण के बाद के रूप में अच्छी तरह के रूप में तटस्थ बफर formalin में तय नमूनों और आयल मोम में एंबेडेड है । नमूने फोकल या lightsheet माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग के लिए उपयुक्त हैं ।

Protocol

सभी प्रयोगों विश्वविद्यालय फ्लोरिडा संस्थागत समीक्षा बोर्ड और संघीय दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया ।

सावधानी: Paraformaldehyde और acrylamide विषाक्त अड़चन हैं । उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (लैब कोट, दस्ताने, नेत्र संरक्षण) के साथ एक धुएं डाकू में रिएजेंट संभाल ।

1. Formaldehyde के Deparaffinization-फिक्स्ड ऊतकों (ताजा ऊतकों के साथ काम कर रहे हैं, तो चरण 2 को छोड़)

  1. एक नया उस्तरा ब्लेड या स्केलपेल का उपयोग करने के लिए ऊतक की सतह को सीधा तेल के माध्यम से कटौती । यह ढीला खत्म करने के लिए ऊतक के किनारे पर आयल काटें । का प्रयोग करें संदंश या एक रंग धीरे ढीला करने के लिए और ऊतक को हटाने के लिए ऑप्टिकली मंजूरी दे दी । धीरे से एक रंग (आंकड़ा 1a) का उपयोग कर ऊतक से अतिरिक्त तेल परिमार्जन ।
  2. xylene के साथ एक ग्लास कंटेनर भरें (के बारे में 30 मिलीलीटर के लिए एक 3 एक्स 3 एक्स 3 मिमी खंड ऊतक) और इस समाधान में ऊतक गर्मी कमरे के तापमान पर 24 घंटे (आरटी) ।
  3. 1.2.1 के रूप में एक ही मात्रा के साथ ताजा xylene के साथ एक और गिलास कंटेनर भरें । स्थानांतरण और इस समाधान में आरटी पर 24 ज के लिए ऊतक मशीन ।
  4. 1.2.1 के रूप में एक ही मात्रा के साथ एक शंकु ट्यूब में १००% इथेनॉल प्लेस । स्थानांतरण और इस समाधान में आरटी पर 24 ज के लिए ऊतक मशीन ।
  5. 1.2.1 के रूप में एक ही मात्रा के साथ एक शंकु ट्यूब में ९५% इथेनॉल प्लेस । स्थानांतरण और इस समाधान में आरटी पर 24 ज के लिए ऊतक मशीन ।
  6. 1.2.1 के रूप में एक ही मात्रा के साथ एक शंकु ट्यूब में ७०% इथेनॉल प्लेस । स्थानांतरण और इस समाधान में आरटी पर 24 ज के लिए ऊतक मशीन ।
  7. ०.०१ मीटर फॉस्फेट में ऊतक कुल्ला खारा (पंजाब) और ०.०१ मीटर पंजाब में एक शंकु ट्यूब में जगह equilibrate के लिए 24 ज पर आरटी । सुनिश्चित करें कि ऊतक आयल (आंकड़ा 1b, दायां पैनल) से मुक्त है ।

2. तैयार 4% Paraformaldehyde (पीएफए) निर्धारण

  1. पिपेट 10 मिलीलीटर 16% पीएफए एक ५०-एमएल शंकु ट्यूब में, 4 मिलीलीटर ०.१ एम पंजाबियों जोड़ें, और 26 मिलीलीटर आसुत जल (ddH2O) जोड़ें । कैप बंद करें और संक्षेप में मिलाएं ।
  2. 4% पीएफए का बड़ा वॉल्यूम आगे और aliquots में जम कर बनाया जा सकता है । Aliquots कमरे के तापमान पर 1 दिन के लिए अच्छा कर रहे हैं (आरटी), 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह, और 1 महीने में-20 डिग्री सेल्सियस.

3. अग्ंयाशय निर्धारण

  1. अग्ंयाशय के नमूने को ठीक करें (≤ 1 x 1 x 2 cm) ४८ एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर हौसले से तैयार 4% पीएफए में । यदि नमूना 1 x 1 x 2 सेमी से बड़ा है, तो छोटे टुकड़ों में टुकड़े करने के लिए एक स्केलपेल या उस्तरा ब्लेड का उपयोग करें 1 सेमी मोटी से अधिक नहीं । ०.०१ एम पंजाबियों के तीन परिवर्तन में ऊतक के नमूने को धोने के लिए ंयूनतम 15 मिनट प्रत्येक धोने और दुकान में 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में ०.०१% पीएफए/0.01 एम पंजाब या ०.५% सोडियम azide/0.01 एम पंजाबियों उपयोग तक ।
  2. निर्धारण के बाद, आगे की प्रक्रिया के लिए 1-2 mm मोटी वर्गों में ऊतक अनुभाग । एक vibratome का उपयोग करने के लिए भी अनुभाग में सहायता ।
    नोट: वर्गों की अंतिम संख्या शुरू नमूना के आकार पर निर्भर करेगा ।

4. Hydrogel में ऊतक एंबेड

  1. २०० मिलीलीटर की 4% acrylamide/1% paraformaldehyde (A4P1) hydrogel मोनोमर समाधान निम्नानुसार तैयार करें:
    1. एक चुंबकीय हलचल प्लेट के शीर्ष पर एक बाल्टी में बर्फ पर एक कुप्पी रखें । सुनिश्चित करें कि कुप्पी सपाट बैठी है और एक चुंबकीय हलचल पट्टी जोड़ें ।
    2. निम्न क्रम में जोड़ें: १४७.८ मिलीलीटर शीत (4-8 डिग्री सेल्सियस) ddH2O, 20 मिलीलीटर ०.१ मीटर पंजाब, 20 मिलीलीटर शीत (4-8 ° c) ४०% acrylamide समाधान, १२.२ मिलीलीटर 16% पीएफए समाधान, और २५० मिलीग्राम VA-०४४ सर्जक । एक चुंबकीय हलचल बार के साथ पूरे hydrogel समाधान मिश्रण कम से कम 10 मिनट के लिए और अगले कदम के लिए बर्फ पर समाधान छोड़ दें ।
  2. बर्फ में एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब hydrogel समाधान युक्त कुप्पी के बगल में रखें । पिपेट ट्यूब में मोनोमर समाधान के 14 मिलीलीटर और 1-2 mm मोटी निश्चित ऊतक नमूने का एक टुकड़ा जोड़ें । फिर कैप ट्यूब ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए मोनोमर समाधान में नमूना मशीन और प्रकाश से बचाने के लिए । Aliquot किसी भी शेष मोनोमर समाधान और स्टोर पर-20 ° c भविष्य के उपयोग के लिए ।

5. Degas को मोनोमर समाधान और Polymerize को Hydrogel

  1. गैसीय एन28का उपयोग कर hydrogel मोनोमर समाधान से ऑक्सीजन निकालें ।
    1. बर्फ की एक बाल्टी तैयार है और बर्फ पर hydrogel मोनोमर समाधान में नमूना जगह है ।
    2. इकट्ठा 2-3, नमूना, आयल फिल्म, और एक टाइमर प्रति 18 गेज hypodermic सुई । नाइट्रोजन टैंक के लिए टयूबिंग कनेक्ट इतना है कि नाइट्रोजन प्रवाह कर सकते हैं । जबकि बर्फ पर नमूना रखते हुए, ध्यान से एक शंकु एक तरफ नमूना युक्त ट्यूब की टोपी पियर्स और एक hypodermic सुई प्रेस के माध्यम से जब तक यह तरल मोनोमर समाधान की सतह के नीचे है ।
    3. टोपी की विपरीत दिशा को छिन्न-भिन्न करने के लिए एक अन्य hypodermic सुई का प्रयोग करें, लेकिन इसे जलमग्न होने की अनुमति न दें ।
      नोट: दूसरी सुई ट्यूब वेंट करेंगे ।
    4. hypodermic सुई hydrogel के नीचे जलमग्न करने के लिए नाइट्रोजन टैंक से टयूबिंग कनेक्ट और धीरे से यह तरल के माध्यम से तेजी से bubbling है जब तक नाइट्रोजन पर बारी.
    5. 10 मिनट के लिए तरल के माध्यम से नाइट्रोजन बुलबुले के लिए अनुमति दें ।
  2. एक बार ऑक्सीजन हटा दिया जाता है, जल्दी से दोनों सुइयों को दूर करने और ट्यूब और पर्यावरण के बीच atmosphere के किसी भी विनिमय को रोकने के लिए एक आयल फिल्म के साथ टोपी को कवर किया । degassed नमूना एक मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए 3 ज hydrogel polymerize के लिए जगह है ।

6. ऊतक समाशोधन

  1. ५०० मिलीलीटर समाशोधन समाधान (पीएच ८.५ पर 4% एसडीएस) तैयार करें । करने के लिए ~ ३०० एमएल के ddH2हे, जोड़ें ५० मिलीलीटर ०.१ एम पंजाबियों और 20 ग्राम एसडीएस पाउडर जबकि एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ सरगर्मी । सोडियम हीड्राकसीड और हाइड्रोक्लोरिक एसिड का उपयोग पीएच ८.५ के लिए समाधान को समायोजित करें । अंतिम वॉल्यूम ५०० mL होने तक ddH2O जोड़ें ।
  2. बहुलकीकरण के बाद, अतिरिक्त hydrogel दूर डालो और इसे एक रासायनिक अपशिष्ट कंटेनर में त्यागें । एक कागज तौलिया का प्रयोग करें धीरे नमूने से दूर hydrogel पोंछ और एक रासायनिक अपशिष्ट कंटेनर में त्यागें ।
  3. ०.०१ मीटर पंजाबियों के 3-5 बाजारों में नमूना धो 15 मिनट के लिए प्रत्येक धो चरण के लिए (रासायनिक अपशिष्ट में धो तरल पदार्थ त्यागें) । एक ५०-एमएल शंकु ट्यूब में नमूने समाशोधन बफर के ४० मिलीलीटर के साथ स्थानांतरण ।
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर समाशोधन बफर में नमूना मशीन और हर दूसरे दिन ताजा समाशोधन बफर के लिए नमूना बदल जाते हैं ।
    1. नमूना आकार (~ 8 सप्ताह के लिए 3 मिमी x 3 मिमी x 3 मिमी नमूना) के आधार पर 2-8 सप्ताह के लिए समाशोधन बफ़र में नमूने को उचित समाशोधन सुनिश्चित करने के लिए छोड़ दें ।
    2. ऊतक समाशोधन की निगरानी और जब पूरा बंद करो । सुनिश्चित करें कि नमूना उचित समाशोधन के लिए जांच करने के लिए प्रकाश को पकड़ कर पर्याप्त रूप से पारदर्शी है (आमतौर पर कुछ भूरे रंग रिसाव क्षेत्रों में बने रहेंगे) ।
      नोट: एक से अधिक-खाली नमूना किनारों पर मैदान में दिखाई देगा और बनावट बहुत नरम जब संदंश के साथ उठाया जाएगा । इस नमूने के लिए असमान स्पष्ट करने के लिए आम है । इसके अलावा, ऊतक पूरी तरह से पारदर्शी नहीं होगा जब तक बढ़ते मीडिया में रखा (डालें, चित्रा 1C) ।

7. मल्टीपल इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. ६० rpm पर एक शेखर पर नमूने धो ४० मिलीलीटर ०.०१ मीटर के साथ एक दिन के लिए RT पर ताजा बफर अक्सर बदलने के लिए (4-5 कुल में बफर परिवर्तन, ४० मिलीलीटर प्रत्येक धोने, अंतिम धोने तक हर ज बदल) । अंतिम धोने चलो आरटी पर रात भर जारी है ।
  2. समझौता धुंधला बफर तैयार । को ५०० एमएल ०.०१ एम पंजाबस, जोड़ ५० मिलीग्राम सोडियम azide और ०.५ एमएल TritonX-१०० । अच्छी तरह मिलाएं ।
  3. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ नमूना मशीन ।
    1. 2% सामांय सीरम जोड़ें (माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में एक ही प्रजाति) एक 2-एमएल फ्लैट नीचे ट्यूब में आधार समझौते धुंधला बफर करने के लिए (1 मिलीलीटर कुल मात्रा प्रति नमूना/ट्यूब) की सिफारिश की है ।
    2. 2% सीरम/समझौता धुंधला बफर करने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें । लगभग का प्रयोग करें 5x समझौता के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी की राशि के रूप में मानक immunohistochemistry के लिए इस्तेमाल किया जाएगा (यानी अगर एक एंटीबॉडी मानक immunohistochemistry के लिए 1:500 पतला है, उपयोग 1:100 समझौता दाग के लिए) ।
    3. एक रंग का प्रयोग करें धोने बफर से नमूना हटाने और एक कागज तौलिया पर अतिरिक्त बफर बंद ढाब, तो एक प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ ट्यूब में जगह है ।
  4. 2-4 आरटी पर ६० rpm पर एक शेखर पर दिन की मशीन । धो नमूने अच्छी तरह से आर टी पर एक शेखर पर ०.०१ मीटर में ६० rpm पर नए सिरे से बफर 4-5 बार बदलने और के रूप में ७.१ कदम के रूप में रातोंरात पर अंतिम धोने छोड़ने पर ।
  5. माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन नमूने ।
    1. 2% सामांय सीरम जोड़ें (माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में एक ही प्रजाति) एक 2-एमएल फ्लैट नीचे ट्यूब में आधार समझौते धुंधला बफर करने के लिए (1 मिलीलीटर कुल मात्रा नमूने के अनुसार सिफारिश की है/
    2. 1:200 की एकाग्रता में माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें (1 मिलीलीटर बफर में 5 µ एल).
      नोट: छोटे प्रारूप एंटीबॉडी पसंद कर रहे हैं, साथ ही उच्च पार adsorbed एंटीबॉडी अगर एक से अधिक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर.
    3. एक रंग का प्रयोग करें धोने बफर से नमूना हटाने और एक कागज तौलिया पर अतिरिक्त बफर बंद ढाब, तो एक माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ ट्यूब में जगह है ।
  6. 2 दिनों के लिए ६० rpm पर एक शेखर पर आरटी में मशीन और प्रकाश से नमूने की रक्षा करना ।
  7. नमूनों को अच्छी तरह से धो लें, ७.१ के रूप में कदम में ६० rpm में एक शेखर पर आरटी में ०.०१ M पंजाबियों को ताजा बफर 4-5 बार बदल रहा है और रातोंरात पर अंतिम धोने छोड़ने, धोने के दौरान प्रकाश से बचाने के लिए ।

8. इमेजिंग के लिए बढ़ते नमूने

  1. अपवर्तन सूचकांक मिलान समाधान (रिम्स) बफ़र तैयार करें ।
    1. बाहर गैर के 11 जी ईओण घनत्व ढाल मध्यम वजन (जैसे, Histodenz) और ध्यान से एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब को हस्तांतरण ।
    2. जोड़ें ~ 5 मिलीलीटर ०.०२ एम फॉस्फेट बफर (पंजाब)8 एक रंग का उपयोग करने के लिए पाउडर गैर ईओण घनत्व ढाल माध्यम से हवा जारी ।
      नोट: समाधान बहुत चिपचिपा हो जाएगा, अच्छी तरह से मिश्रण ।
    3. अधिक पंजाब, एक रंग के साथ मिश्रण और ट्यूब में रंग बंद अतिरिक्त परिमार्जन का उपयोग कर 10 मिलीलीटर के लिए मात्रा लाओ ।
    4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर रिम्स में भंग, पलटना और जरूरत के रूप में धीरे मिश्रण जब तक ।
  2. रिम्स में नमूनों का स्थानांतरण । ऐसा करने के लिए, पिपेट 1 एमएल एक 2-एमएल फ्लैट नीचे ट्यूब में रिम्स । एक रंग का प्रयोग करें धोने बफर से नमूना हटाने और एक कागज तौलिया पर अतिरिक्त बफर बंद ढाब, तो रिम्स समाधान के साथ ट्यूब में जगह है ।
    1. धीरे से रिम्स में नमूना जलमग्न करने के लिए ट्यूब नल. रिम्स में नमूने इमेजिंग से पहले 2-4 दिनों के लिए आरटी पर प्रकाश से सुरक्षित बेंच पर रखें ।
  3. छवि के लिए, एक 8-अच्छी तरह से coverslip नीचे चैंबर स्लाइड में रिम्स की एक छोटी राशि जगह है । केवल नीचे कोट करने के लिए पर्याप्त जोड़ने के लिए, अधिक नमूना एक औंधा गुंजाइश पर यह छवि के लिए और अधिक मुश्किल बना फ्लोट करने के लिए कारण होगा. अच्छी तरह से नमूना जोड़ें और इमेजिंग के लिए स्लाइड कैप ।

9. इमेजिंग

  1. फोकल माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग सॉफ्टवेयर
    1. उत्तेजना और fluorophores के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के लिए उचित पराबैंगनीकिरण का चयन करने के लिए समझौता नमूनों दाग इस्तेमाल किया । अधिग्रहण सॉफ्टवेयर की सेटिंग्स को समायोजित करें ताकि चैनलों के बीच किसी भी ओवरलैप को समाप्त किया जाए । यदि आवश्यक हो तो अलग पटरियों का उपयोग करें (जब दो fluorophores समान उत्तेजना स्पेक्ट्रा है).
    2. छवि प्राप्ति सेट अप करें
      1. अधिकतम अधिग्रहण गति, 16 बिट, 4 या अधिक औसत, और १०२४ x १०२४ संकल्प या बेहतर चुनें ।
      2. इमेज्ड होने के लिए ऑब्जेक्ट में ज़ूम करें ।
        नोट: यह फोटो ब्लीचिंग कम करने के लिए अधिग्रहण समय में कमी होगी और यह भी फ़ाइल आकार और बहाव संपादन में कमी.
    3. z-स्टैक सेटअप ।
      1. उपयोग किए जा रहे उद्देश्य के लिए इष्टतम अनुभाग का चयन करें । यदि deconvolution बाद में वांछित है, तो 1 µm जैसे इष्टतम से छोटे z-चरण का उपयोग करें ।
      2. z-स्टैक सुधार का उपयोग करें ।
        1. ऊतक की सतह के निकटतम शुरू और उद्देश्य के रूप में लाभ में वृद्धि z-विमान के माध्यम से केंद्रित है और सुधार जोड़ने । सुधार के लिए लेजर सेटिंग्स बदल नहीं है!
        2. एक औसत, ५१२ x ५१२ रिज़ॉल्यूशन और अधिकतम प्राप्ति गति के साथ एक परीक्षण स्टैक प्राप्त करें । 3 डी में छवि की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि वहां बराबर चमक अंतिम उच्च संकल्प z-स्टैक प्राप्त करने से पहले प्रत्येक रंग के लिए ढेर भर में है ।
  2. Lightsheet इमेजिंग
    1. सुनिश्चित करें कि नमूनों को रिम्स में equilibrated के लिए इमेजिंग के लिए किया गया है, जो न्यूनतम 24 ज. आदर्श रूप में, नमूनों को इमेजिंग चैंबर में ताजा रिम्स में स्थानांतरित करें और कम से कम एक दिन के लिए कक्ष में equilibrate करने की अनुमति दें ।
    2. इमेजिंग के लिए नमूना माउंट
      1. का चयन करें सबसे छोटी (काला) केशिका नमूना माउंट करने के लिए
      2. पुटी का उपयोग करें या एक डिश नमूना पकड़ जबकि केशिका के अंत करने के लिए सुपर गोंद लागू करने के लिए । संभव के रूप में ऊतक के थोड़ा सतह के रूप में छू केशिका करने के लिए ऊतक गोंद ।
      3. इमेजिंग के लिए नमूना संमिलित करें ।
    3. धुरी स्कैन विकल्प का उपयोग कर ऑप्टिकली नमूनों को मंजूरी दी के लिए उपयुक्त 5x या 25X उद्देश्यों का उपयोग कर छवि । यदि छाया या धुंधला होता है, तो नमूना घुमाएं और पुन: प्रयास करें, या नमूना रिम्स में equilibrate करने के लिए जारी रखने दें ।
      नोट: एक 1 मिमी स्टैक आम तौर पर सेटिंग्स के आधार पर, से कम पांच मिनट में प्राप्त किया जा सकता है ।
    4. छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके छवि स्टैक देखें और संपादित करें.

Representative Results

इन धुंधला प्रक्रियाओं को मानव अग्ंयाशय के एक बड़े पैमाने पर परीक्षा प्रदान करने के लिए टाप और संबद्ध स्वायत्त और संवेदी नेटवर्क की जांच विकसित की गई । कई प्रक्रियाओं स्पष्टता7, iDISCO17सहित परीक्षण किया गया, और समझौता विधि के साथ8 समझौता सबसे अच्छा मानव अग्ंयाशय और फोकल इमेजिंग के लिए उपयुक्त पाया ।

प्राथमिक एंटीबॉडी शुरू में उपयुक्त सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के नमूनों (माउस मस्तिष्क, अन्य) के साथ निश्चित मानव अग्ंयाशय के नमूनों पर परीक्षण किया गया । प्राथमिक एंटीबॉडी और सुझाव दिया कमजोरियां सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं, हालांकि प्रत्येक प्रयोगशाला के लिए बहुत संख्या और ऊतक स्रोत के आधार पर एंटीबॉडी कमजोर पड़ने का अनुकूलन की उंमीद कर सकते हैं । प्राथमिक एंटीबॉडी बहुत-से-बहुत भिन्नता धुंधला तीव्रता और विशिष्टता को प्रभावित कर सकते हैं, और पूर्व रिएजेंट के साथ के रूप में दाग तीव्रता का एक ही डिग्री प्राप्त करने के लिए सत्यापन की आवश्यकता होती है.

मानव अग्ंयाशय में, टाप इंसुलिन, ग्लूकागन, और secretogranin 3 (चित्रा 2) द्वारा delineated थे । Schwann कोशिकाओं glial fibrillary एसिड प्रोटीन (GFAP, चित्रा 2 और चित्रा 3) का उपयोग delineated थे । नसों parasympathetic मार्कर vasoactive आंत्र पेप्टाइड (वीआईपी) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ सना हुआ Lightsheet (चित्र बी) पर imaged थे । सहानुभूति नसों tyrosine hydroxylase के लिए दाग के साथ देखा जा सकता है (नहीं दिखाया गया है) ।

Figure 1
चित्र 1. मानव अग्ंयाशय ऑप्टिकल समाशोधन । (क) एक उस्तरा ब्लेड में कटौती और ऊतक अनुभाग को हटाने और ऊतक (नीचे पैनलों) से दूर अतिरिक्त तेल परिमार्जन से पहले तेल एंबेडेड ऊतक (शीर्ष पैनलों) के एक वर्ग को ढीला करने के लिए प्रयोग किया जाता है । प्रतिनिधि ऊतक नमूने (बी बाएं, सी ऊपर) और बाद (बी सही, सी मध्य) आयल-एंबेडेड ऊतक के ऑप्टिकल समाशोधन, के रूप में प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित से पहले दिखाया जाता है । साफ, निश्चित ऊतक समाशोधन के बाद पूरी तरह से पारदर्शी नहीं है (बी सही, सी ऊपर) और अक्सर ऊतक सूजन की सराहना की जा सकती है (सी, मध्य पैनल). साफ ऊतक रिम्स में equilibration के बाद पूरी तरह से पारदर्शी हो जाता है (सी, लोअर पैनल). स्केल बार्स: ५०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. मानव न्यूरो-द्वीपीय नेटवर्क । मानव अग्ंयाशय नमूनों nPOD अंग दाताओं से या अभिलेखीय तेल-एंबेडेड ऊतकों से वर्णित के रूप में मंजूरी दे दी गई । (A-D) Schwann कोशिकाओं (GFAP +, सफेद) और अंत में स्रावी कोशिकाओं इंसुलिन (लाल) और ग्लूकागन (हरा) द्वारा दाग दिखाए जाते हैं । (क) फोकल माइक्रोस्कोपी और अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (मिप) से पता चलता है Schwann कोशिकाओं की अनुरेखण (GFAP +) तंत्रिकाओं पर दौड़ के बगल में रक्त वाहिकाओं के लिए टाप परिधि और में विस्तार टाप । इनसेट उच्च संकल्प प्राप्त दर्शाता है और GFAP + Schwann कोशिकाओं और अंत में स्रावी कोशिकाओं के बीच संपर्क से पता चलता है । (ख) पैनल की एक 3d छवि (स्केल: x = ५० µm, y = 20 µm, z = 25 µm) a. एक तेल संधि नमूना फोकल माइक्रोस्कोप के माध्यम से imaged दिखाया गया है और एक अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण के रूप में प्रस्तुत किया (C) और 3 डी में (D), स्केल: x, y = ५० µm, z = 25 µm). स्केल बार्स a, C: ५० µm. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3.3 डी दृश्य और सिलाई. तीन सिले छवि ढेर Schwann कोशिकाओं GFAP और फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग दाग का अधिग्रहण किया और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में एक neurite अनुरेखक प्लगइन का उपयोग कर पता लगाया गया । (A) ट्रेस का 3d भरण दिखाया गया है (स्केल पट्टियां: x = १५० µm, y = २०० µm (०.२ mm), z = १२० µm) (B) एक संधि नमूना वीआईपी एंटीबॉडी से सना हुआ और एक lightsheet माइक्रोस्कोप का उपयोग करके imaged किया गया । स्टैक > 1 मिमी गहराई में है और तंत्रिका तंतुओं स्पष्ट रूप से उच्च संकल्प में देखा जाता है । एक डक्ट (डी, अग्रभूमि) और एक नाड़ीग्रंथि (जी, पृष्ठभूमि) लपेटन फाइबर देखा जा सकता है (बड़े ग्रिड: x, y, z = २०० µm; टिक मार्क्स: x, y, z = ४० µm) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

नए ऑप्टिकल क्लियरिंग पद्धतियों की उपलब्धता ने पशु मॉडलों में केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका प्रणालियों की अभूतपूर्व बड़े पैमाने पर परीक्षाओं की अनुमति दी है । मानव अग्ंयाशय के समग्र इन्नेर्वतिओन पैटर्न बड़े पैमाने पर उच्च गुणवत्ता वाले नमूनों को प्राप्त करने में ऊतक घनत्व और कठिनाइयों के कारण बेरोज़गार हैं । यह प्रोटोकॉल या तो फिक्स्ड या आयल-एंबेडेड अभिलेखीय नमूनों से मानव अग्ंयाशय के ऊतकों के लिए एक अनुकूलित ऊतक समाशोधन प्रोटोकॉल प्रदान करता है ।

समाशोधन समय नमूना आकार पर निर्भर करता है, निर्धारण प्रकार, अवधि, भंडारण की अवधि और 1-8 सप्ताह की आवश्यकता हो सकती है, तो निंनलिखित विचार महत्वपूर्ण हैं । यह 4% पीएफए निर्धारण के बाद जल्द ही ऊतकों को साफ करने के लिए सबसे अच्छा है यदि संभव हो तो क्योंकि लंबी अवधि के भंडारण समाशोधन समय बढ़ जाती है । समाशोधन समय को कम करने के लिए, hydrogel मोनोमर में पीएफए की मात्रा मानव अग्ंयाशय के लिए निर्धारण कदम में 1% के लिए इस्तेमाल के रूप में 4% से कम किया गया था । अन्य ऊतकों, विशेष रूप से माउस के ऊतकों के लिए, प्रतिजनों को संरक्षित करने के लिए पर्याप्त hydrogel कठोरता प्रदान करने के लिए आवश्यक पीएफए की मात्रा empirically निर्धारित किया जाना चाहिए । पर्याप्त समाशोधन के बाद से भी आवश्यक है एंटीबॉडी प्रवेश खराब ऊतकों और माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा धुंधला सतह को मंजूरी दे दी है में कम हो गई है । समाशोधन समाधान हर दूसरे दिन बदलने (या, यहां तक कि दैनिक) सबसे अच्छा पीएच निरंतर और डिटर्जेंट ताजा रखने के लिए है । इसके विपरीत, अधिक समाशोधन नकारात्मक प्रभावों सेलुलर आकृति विज्ञान और बढ़ जाती है ऊतक friability । के बाद से कुछ अग्ंयाशय के नमूने असमान जीर्ण अग्नाशयशोथ या अंय विकृतियों से फाइब्रोसिस के क्षेत्रों जैसे अंतर्निहित विकृतियों के कारण स्पष्ट, यह अक्सर इस प्रक्रिया की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है । vibratome मोटी वर्गों का उपयोग भी वर्दी की मोटाई बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अभी तक आवश्यक नहीं हैं । समाशोधन प्रक्रिया की निगरानी, नमूने के माध्यम से आसानी से प्रकाश गुजरता के रूप में के रूप में जल्द ही डिटर्जेंट से हटा रहे हैं, नमूना पर्याप्त मंजूरी दे दी है कि यह सुनिश्चित करता है.

एंटीबॉडी प्रवेश और सतह धुंधला समझौता नमूनों के साथ विचार करने के लिए महत्वपूर्ण मुद्दे हैं । अच्छा एंटीबॉडी प्रवेश सुनिश्चित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ नमूने की मशीन कम 2 दिनों के लिए । विभिंन एंटीबॉडी अलग प्रसार दर है और व्यक्तिगत रूप से अनुकूलित किया जाना चाहिए, लेकिन सबसे एंटीबॉडी के लिए, 4 दिन एक 1 मिमी3 नमूना में पूर्ण प्रवेश के लिए पर्याप्त अवधि थी । यदि सतह धुंधला एक समस्या है, विशेष रूप से Lightsheet इमेजिंग के लिए, नमूना आधे में कटौती की जा सकती है, या सतह धुंधला के बाद दूर विदारक । छोटे प्रारूप एंटीबॉडी जब उपलब्ध करने के लिए ऊतक प्रवेश8के साथ सहायता की उंमीद होगी । Preconjugated एंटीबॉडी के रूप में अच्छी तरह से काम करने के लिए प्रकट नहीं है एक ही unconjugated क्लोन और उच्च पृष्ठभूमि से विशिष्ट बाध्यकारी और गरीब ऊतक प्रवेश देखा जा सकता है अगर वे सब पर काम करते हैं । preconjugated एंटीबॉडी के साथ बेहतर सफलता के लिए, वृद्धि सीरम और TritonX-धुंधला बफर में १०० सांद्रता और अब (> 4 दिन) की गर्मी का उपयोग करें । दाग के बाद, रिम्स में कई दिनों के लिए नमूना की मशीन महत्वपूर्ण है । मंजूरी दे दी है पंजाब और रिम्स में सूजन ऊतकों उन्हें मूल आकार में वापस हटना करने के लिए कारण बनता है. विशेष रूप से lightsheet इमेजिंग के साथ, नमूना इमेजिंग से पहले पूरी तरह से equilibrated होना चाहिए ।

जब फोकल माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग नमूने, सुधार हर बार एक नई स्थिति चुना जाता है सेट किया जाना चाहिए । ऊतक के प्रत्येक क्षेत्र के लिए ऊतक आवश्यक समायोजन भर में तीव्रता धुंधला में विभिन्न अधिग्रहण गहराई और भिन्नता छवि बेहतर हो. इसी तरह, माध्यमिक इस्तेमाल किया एंटीबॉडी सावधानी से विचार किया जाना चाहिए । वर्णक्रमीय मिश्रण समझौता नमूनों में चुनौती दे रहा है, तो fluorophores उचित रूप से एक कम उत्तेजना या उत्सर्जन के लिए चुना जाना चाहिए एक उज्ज्वल संकेत है जब फोकल माइक्रोस्कोप पर उत्सर्जन को छानने के लिए ओवरलैप सुनिश्चित करें । प्रत्येक आवेदन के लिए, एक संतुलन संकल्प, इमेजिंग गति, और शोर में कमी के बीच मारा जाना चाहिए ताकि सबसे अच्छी गुणवत्ता की छवि फोटो ब्लीचिंग के बिना प्राप्त किया जा सकता है । संकल्प से अधिक १०२४ x १०२४ मानव आंख द्वारा detectable नहीं है, लेकिन कुछ अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक हो सकता है अगर एक दाग की ठहराव की जरूरत है ।

वहां कई बातों पर विचार जब एक ऑप्टिकल समाशोधन तकनीक का चयन कर रहे है और जब अंय अधिक परंपरागत तरीकों पर ऑप्टिकल समाशोधन चुनने । कम बहुतायत प्रतिजनों नहीं किया जा सकता है पता लगाने में इमानदारी विधि का उपयोग कर इस प्रकार वहां antigen पता लगाने पर सीमाएं हैं । कुछ एंटीजन जैसे प्रतिरक्षा एंटीजन (CD3, सीडी, सीडी, आदि) इमानदारी विधि से नष्ट हो जाते हैं और उन्हें पता लगाने के लिए उपलब्ध उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी के बावजूद undetectable होते हैं । इस विधि की एक और सीमा दाता अग्ंयाशय जो धुंधला समाशोधन के बाद जब तक विचार मुश्किल है के बीच अंतर्निहित परिवर्तनशीलता है । प्रत्येक दाता ऊतक स्पष्ट और प्रक्रियाओं के बीच इसी तरह दाग जाता है, लेकिन विभिंन दाता ऊतकों को साफ करने के बाद व्यापक रूप से समाशोधन बार और ऊतक आकृति विज्ञान की गुणवत्ता बदलती है । संग्रह ऊतक का उपयोग करने की क्षमता इस सीमा को कम कर सकते हैं अगर एक रोगी अग्ंयाशय नमूनों की एक बड़ी संख्या के लिए पर्याप्त उपयोग हो सकता है हालांकि यह अच्छी तरह से जांच नहीं की गई है । समझौता प्रोटोकॉल की सूचना के साथ साथ सस्ती और आसानी से मानक प्रयोगशाला उपकरणों के साथ लागू पाया गया था । मंजूरी दे दी नमूनों पारंपरिक फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से इमेजिंग के लिए उपयुक्त थे, साथ ही 2-फोटॉन और Lightsheet प्रौद्योगिकियों और मानव अग्ंयाशय के बड़े वर्गों में नसों और टाप के उच्च संकल्प 3 डी छवियों प्रदान की है । इस प्रक्रिया के भविष्य के अनुप्रयोगों दोनों रिसाव और अंत-स्रावी डिब्बों और प्रकार में टाप अध्ययन के लिए भ्रूण अग्न्याशय के विकास पर अध्ययन में शामिल 1 और प्रकार 2 मधुमेह.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक डॉ एन फू और यूसुफ Canzano तकनीकी सहायता के लिए धंयवाद, अमूल्य सलाह के लिए डॉ जेनिफर Treweek, और डॉ क्रिस्टिन Overton और डॉ कार्ल Deisseroth स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय स्पष्टता कार्यशाला के माध्यम से MCT को प्रशिक्षण के लिए । JDRF nPOD और अंग खरीद संगठनों ने ऊतक के नमूने प्रदान किए. यह काम JDRF (47-2014-1), Helmsley चैरिटेबल ट्रस्ट (HCT २०१५-PG-T1D052) और NIDDK 1OT2 TR001773 को MCT द्वारा वित्तपोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x phosphate buffered saline (PBS) Fisher BP399-1 Buffers
Sodium phosphate dibasic anhydrous Fisher S375-500 PB buffer (RIMS)
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma 71507-250 PB buffer (RIMS)
16% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15714-5 Immersion fixation, hydrogel, storage solution
40% acrylamide Bio-Rad 161-0140 Hydrogel
2% bis-acrylamide Bio-Rad 161-0142 Hydrogel
VA-044 initiator Wako Pure Chemical Industries, Ltd. VA044 Hydrogel
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-5 Clearing buffer
Sodium azide Sigma S8032 Sample storage buffer
18 gauge needles Fisher 14-840-91 Degassing hydrogel solution
N2 tank AirGas various Degassing hydrogel solution
Triton X-100 Sigma-Aldrich 100 ml Buffers
Goat, normal serum Vector S-1000 Use as 2% in blocking buffer
Histodenz Sigma D2158-100G RIMS
8-well chamber slides Ibidi 80827 Imaging
Laser scanning confocal microscope Zeiss 710 Imaging
LightSheet microscope Zeiss Z1 Imaging
Name Company Catalog Number Comments
Primary Antibody
CD45 Bioss bs-4820R-A488 Host: Rabbit
Dilution: 1:100
Comments: Did not work
CD45 DAKO M0754 Host: Mouse
Dilution: 1:200
Comments: Did not work
GFAP DAKO Z0334 Host: Rabbit
Dilution: 1:50
Comments: Worked
Glucagon BD Biosciences 565891 Host: Mouse
Dilution: 1:50
Comments: Worked
Glucagon Cell Signaling 2760S Host: Rabbit
Dilution: 1:200
Comments: Did not work
Glucagon Abcam ab10988 Host: Mouse
Dilution: 1:200
Comments: Worked
Insulin DAKO A0564 Host: Guinea Pig
Dilution: 1:200
Comments: Worked
NCAM (CD56) DAKO M730429-2 Host: Mouse
Dilution: 1:50
Comments: Did not work
NCAM (CD56)-FITC conjugate DAKO M730429-2 Host: Mouse
Dilution: 1:50
Comments: Did not work
Peripherin EnCor RPCA-Peri Host: Rabbit
Dilution: 1:100
Comments: Worked
PGP9.5 DAKO Z5116 Host: Rabbit
Dilution: 1:50
Comments: Did not work
Secretogranin 3 Sigma HPA006880 Host: Rabbit
Dilution: 1:200
Comments: Worked
Smooth muscle actin Sigma A5228; C6198 (Cy5) Host: Mouse
Dilution: 1:200; 1:200
Comments: Worked; Conjugated worked better than unconjugated
Substance P BioRad 8450-0505 Host: Rat
Dilution: 1:200
Comments: Worked
Tyrosine Hydroxylase Millipore AB152 Host: Rabbit
Dilution: 1:200
Comments: Worked
Tyrosine Hydroxylase Abcam Ab76442 Host: Chicken
Dilution: 1:100
Comments: Worked, but weak staining
Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) Immunostar 20077 Host: Rabbit
Dilution: 1:100
Comments: Worked
Vesicular Acetylcholine Transporter (VAChT) Synaptic Systems 139103 Host: Rabbit
Dilution: 1:50
Comments: Worked
Secondary Antibody
Guinea pig IgG ThermoFisher Scientific Various Host: Goat
Dilution: 1:200
Comments: AlexaFluor conjugates
Mouse IgG ThermoFisher Scientific Various Host: Goat
Dilution: 1:200
Comments: AlexaFluor conjugates
Rabbit IgG ThermoFisher Scientific Various Host: Goat
Dilution: 1:200
Comments: AlexaFluor conjugates
Rat IgG ThermoFisher Scientific Various Host: Goat, Donkey
Dilution: 1:200
Comments: AlexaFluor conjugates
Chicken IgG ThermoFisher Scientific Various Host: Goat
Dilution: 1:200
Comments: AlexaFluor conjugates

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References

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Butterworth, E., Dickerson, W.,… More

Butterworth, E., Dickerson, W., Vijay, V., Weitzel, K., Cooper, J., Atkinson, E. W., Coleman, J. E., Otto, K. J., Campbell-Thompson, M. High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network. J. Vis. Exp. (131), e56859, doi:10.3791/56859 (2018).

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