Summary
Her presenterer vi en protokollen bilde menneskelige bukspyttkjertelen delene i tre dimensjoner (3D) med optimalisert passiv fjerne metoder. Dette manuskriptet viser disse prosedyrene for passiv optisk clearing etterfulgt av flere immunofluorescence flekker for å identifisere viktige elementer av autonome og sensoriske nevrale nettverk innervating menneskelige holmer.
Abstract
Bruke tradisjonelle histologiske metoder, forskere er hemmet i å bilde hele vev eller organer i store 3D. Histologiske delene er vanligvis begrenset til < 20 µm som formalin fast parafin delen på glass lysbilder eller < 500 µm frittflytende fast deler. Derfor omfattende arbeid kreves for seriell snitting og store bildet gjenoppbygging metoder å gjenskape 3D for prøver > 500 µm bruke tradisjonelle metoder. I tillegg lys Scattere fra makromolekyler i vev, spesielt lipider, hindrer imaging til et dyp > 150 µm med mest AC confocal mikroskop. Redusere lyse scatter og tillate dype vev bildevisning enkel AC confocal mikroskopi, har ulike optisk clearing metoder blitt utviklet som er relevante for gnager og menneskelig vevsprøver løst ved nedsenkning. Flere metoder er relatert, og bruke protein crosslinking akrylamid og vev fjerne med natrium dodecyl sulfate (SDS). Andre optisk clearing teknikker brukt ulike løsemidler om hver endring hadde forskjellige fordeler og ulemper. Her, er en optimalisert passiv optisk avregning metoden beskrevet for studier av den menneskelige bukspyttkjertelen gir og spesielt for avhør av innervering av menneskelig holmer.
Introduction
Inntil nylig, ble 3-dimensjonale (3D) rekonstruksjon av store vev eller hele organer utført gjennom arbeidskrevende føljetong skjæring, flekker og bildet gjenoppbygging av inndelingene. Disse metodene hadde mange ulemper, inkludert avhengighet av et stort antall serielle seksjoner, dårlig vev penetrasjon med antistoffer og lys spredning forebygge dyp bildebehandling i vev. For å gi større lys og antistoff penetrasjon, utviklet forskere kjemiske metoder for å bevare protein antigener under fjerning flertallet av lys-spredning lipider. Flere relaterte metoder er Clear Lipid-Exchanged akrylamid-hybridiserte stive Imaging vev hYdrogel (KLARHET), passiv klarhet teknikk (pakt) og perfusjon-assistert Agent utgivelsen i situ (PARS) (omtalt i 1,2 ,3,4,5,6). Metoden KLARHET er basert på stabilisering av proteiner en formaldehyd, akrylamid og bis hydrogel etterfulgt av lipid fjerning ved hjelp av geleelektroforese i en SDS løsning2. Denne tilnærmingen ble senere endret for passiv clearing og avansert bildebehandling7. Ytterligere optimalisering førte til eliminering av bis og varierende prosentdeler paraformaldehyde i hydrogel løsningen (1-4%) å få optimal antigen stabilisering med kortest clearing tid for en teknikk som kalles PAKTEN 8. Tidlige forsøk på å utvikle disse optisk clearing teknikker involvert organisk eller andre forbindelser som var vanskelig å jobbe med og let endogene fluorescerende proteiner i transgene musen modeller. Disse andre metodene inkludert skalaer, uhindret hjernen/kropp cocktailer og Computational analyse (KUBIKKMETER), BRYTERE og Dimensional Imaging of Solvent-Cleared organer (DISCO) metoder, alle med ulike fordeler og ulemper9, 10,11,12. Den opprinnelige KLARHET metoden ble utviklet i lipid-rik musen hjernevevet og optisk clearing metoder hadde begrenset testing i menneskelig vev7,8,11,13,14 .
Optisk clearing metoder er ideelle for sporing nerver over lange avstander som intakt musen sentralnervesystemet. Bukspyttkjertelen er godt innerveres av både autonome og sensoriske nervesystemet. Bukspyttkjertelen endokrine rommet, holmer Langerhans, utgjør en svært liten del av hele orgel (1-2%) og holmer har kjent heterogene i størrelse (50-250 µm), endokrine celle proporsjoner og tetthet i diabetes (omtalt i 15 ,16). Utvikle en protokoll, flere optiske clearing metoder ble testet for menneskelig bukspyttkjertelen og en pakt prosedyre ble funnet for å gi den beste balansen mellom tid for å fjerne (~ 2 uker) med utmerket morfologiske bevaring av nerver og holmer. Siste optimalisert prosedyren er beskrevet her i avgrensning av Nevro-isolerte nettverket for store (millimeter avstander) og høyoppløselig 3D-bildebehandling av flere intakt bukspyttkjertelen holmer. Teknikken er egnet for menneskelig bukspyttkjertelen umiddelbart etter fiksering eller etter lagring samt prøver fast i nøytral bufrede formalin og innebygd i parafin voks. Prøvene egner seg for tenkelig av AC confocal eller lightsheet mikroskopi.
Protocol
Alle eksperimentene ble utført i samsvar med University of Florida institusjonelle Review Board og føderale retningslinjer.
Forsiktig: Paraformaldehyde og akrylamid er giftig irritanter. Håndtere reagenser i avtrekksvifte med riktig personlig verneutstyr (laboratoriefrakk, hansker, vernebriller).
1. deparaffinization av formaldehyd-fast vev (Hvis arbeider med friskt vev, gå til trinn 2)
- Bruk en ny barberblad eller skalpell for å skjære gjennom parafinen vinkelrett på overflaten av vev. Kuttet parafinen på kanten av vevet å fullføre løsne den. Bruk tang eller spatula forsiktig løsne og fjerne vevet tømmes optisk. Forsiktig skrape overflødig parafin fra vev ved hjelp av en slikkepott (figur 1A).
- Fyll en glassbeholder med xylen (ca 30 mL for 3 x 3 x 3 mm delen av vev) og ruge vevet i denne løsningen for 24 timer ved romtemperatur (RT).
- Fyll en glassbeholder med fersk xylen med samme volum som 1.2.1. Overføre og ruge vevet i denne løsningen for 24 h på RT.
- Plass 100% etanol i en konisk rør med samme volum som 1.2.1. Overføre og ruge vevet i denne løsningen for 24 h på RT.
- Plass 95% etanol i en konisk rør med samme volum som 1.2.1. Overføre og ruge vevet i denne løsningen for 24 h på RT.
- Plass 70% etanol i en konisk rør med samme volum som 1.2.1. Overføre og ruge vevet i denne løsningen for 24 h på RT.
- Skyll vevet i 0.01 M fosfat bufret saltvann (PBS) og plass i 0.01 M PBS i et konisk rør til equilibrate 24 h på RT. sikre at vevet er fri for parafin (figur 1B, høyre panel).
2. Forbered 4% Paraformaldehyde (PFA) bindemiddel
- Pipetter 10 mL 16% PFA til en 50-mL konisk tube, legge 4 mL 0.1 M PBS, og legge til 26 mL destillert deionisert vann (ddH2O). Lukk lokket og bland kort.
- Større mengder 4% PFA kan gjøres videre og frosne i dele. Dele er god for en dag ved romtemperatur (RT), en uke på 4 ° C og 1 måned på 20 ° C.
3. bukspyttkjertelen fiksering
- Fikse bukspyttkjertelen prøven (≤ 1 x 1 x 2 cm) i nylagde 4% PFA ved 4 ° C i 48 timer. Hvis prøven er større enn 1 x 1 x 2 cm, bruke en skalpell eller barberblad for å dissekere i mindre biter ikke mer enn 1 cm tykk. Vask Vevsprøve i tre endringer av 0,01 M PBS i minst 15 min hver vask og lagre i 15 mL sentrifuge røret i 0,01% PFA/0,01 M PBS eller 0,5% natrium azide/0,01 M PBS før bruk.
- Etter fiksering, avsnitt vevet i 1-2 mm tykk seksjoner for videre behandling. Bruke en vibratome skal selv snitting.
Merk: Det endelige antallet inndelinger vil avhenge av størrelsen på Start prøven.
4. bygge vev i Hydrogel
- Forbered 200 mL 4% akrylamid/1% paraformaldehyde (A4P1) hydrogel monomer løsningen som følger:
- Plass en kolbe på isen i en bøtte på en magnetic røre plate. Kontroller at kolbe sitter flatt og legge en magnetic røre bar.
- Legg til følgende i rekkefølge: 147.8 mL kaldt (4-8 ° C) ddH2O, 20 mL 0.1 M PBS, 20 mL kaldt (4-8 ° C) 40% akrylamid løsning, 12.2 mL 16% PFA løsning og 250 mg VA-044 initiatoren. Bland hele hydrogel løsningen med magnetic røre bar på minst 10 min og la løsningen på is for neste trinn.
- Plass en 15-mL konisk rør i isen siden kolbe som inneholder hydrogel løsningen. Pipetter 14 mL monomer løsning i røret og legge til en del av 1-2 mm tykk fast Vevsprøve. Deretter lokket røret.
- Inkuber eksemplet i monomer løsning for 3 dager på 4 ° C, og beskytte mot lyset. Aliquot alle gjenværende monomer løsning og butikk på 20 ° C for fremtidig bruk.
5. degas Monomer løsningen og danner Hydrogel
- Fjern oksygen fra hydrogel monomer løsningen bruker gass N28.
- Forberede en bøtte med is og plasser prøven i hydrogel monomer løsningen på is.
- Samle 2-3, 18-gauge sprøyte nåler per eksempel, parafin film og en tidtaker. Koble slangen til nitrogen tanken slik at nitrogen kan flyte. Samtidig prøven på is, nøye pierce hetten av et konisk rør som inneholder utvalget på den ene siden og trykk på en hypodermic nålen gjennom til den er under overflaten av væske monomer løsningen.
- Bruk en sprøyte nål for å punktere motsatt side av hetten, men ikke la den bli neddykket.
Merk: Andre nålen vil vent røret. - Koble slangen fra nitrogen tanken å sprøyte nålen senkes under hydrogel og langsomt slå på nitrogen før det er bobler jevnt gjennom væsken.
- Tillate nitrogen å boble gjennom væsken i 10 min.
- Når oksygen er fjernet, raskt fjerne pinner og dekke lokket med en parafin film å forhindre alle fremme utveksling av gasser mellom røret og miljø. Plass degassed prøven i en inkubator ved 37 ° C i 3t til danner hydrogel.
6. vev Clearing
- Forberede 500 mL fjerne løsning (4% SDS ved pH 8.5). Legge til 50 mL 0.1 M PBS og 20 g SDS pulver under omrøring med magnetic røre bar ~ 300 mL ddH2O. Justere løsningen bruker natriumhydroksid og saltsyre til pH 8.5. Legge til ddH2O til det siste bindet er 500 mL.
- Etter polymerisasjon, hell bort overflødig hydrogel og kaste den inn i en kjemisk avfall container. Bruk et papirhåndkle til å forsiktig tørke bort hydrogel fra utvalget og kast i en kjemisk avfall beholder.
- Vask prøven i 3-5 utvekslinger på 0,01 M PBS (kast væsken i kjemisk avfall) i 15 min steg vask. Overføre prøven til en 50-mL konisk tube med 40 mL tømme bufferen.
- Inkuber prøven i tømme bufferen på 37 ° C og endre utvalget til frisk tømme bufferen annenhver dag.
- La prøven i tømme bufferen for 2-8 uker, avhengig av utvalgsstørrelsen (~ 8 uker for en 3 mm x 3 mm x 3 mm eksempel) for å sikre riktig clearing.
- Overvåke vev clearing og stoppe når fullstendig. Kontroller at prøven er tilstrekkelig gjennomsiktig ved å holde opp mot lyset etter riktig clearing (vanligvis noen tan farge vil forbli i exocrine områder).
Merk: En over ryddet prøve vises frynsete på kantene og strukturen vil bli veldig myk når plukket opp med tang. Det er vanlig for eksempel fjerne ujevnt. Også kan vevet ikke helt gjennomsiktig til plassert i montering media (Sett inn, figur 1 c).
7. flere Immunofluorescence
- Vask prøvene i en shaker på 60 rpm på RT for en dag med 40 mL 0,01 M PBS endre til frisk bufferen ofte (4-5 buffer endringer i totalt, 40 mL hver vask, endre hver h til siste vask). La siste vask fortsette over natten på RT.
- Forberede PAKTEN flekker buffer. Legge til 50 mg Natriumazid og 0,5 mL TritonX-100 500 mL 0,01 M PBS. Bland godt.
- Inkuber prøven med primære antistoffer.
- Legge til 2% normal serum (samme arten som sekundær antistoffer) base PAKTEN flekker buffer i en 2-mL flat bunn tube (minst 1 mL totalvolum anbefales per eksempel/rør).
- Legg til primære antistoff 2% serum/PAKTEN flekker buffer. Bruk ca 5 x antall primære antistoff for PAKTEN flekker som brukes for standard immunohistochemistry (Hvis et antistoff er utvannet 1:500 for standard immunohistochemistry, bruk 1: 100 til PAKTEN farging).
- Bruk en slikkepott til å fjerne prøven fra vaskebuffer dab overflødig bufferen av på et papirhåndkle, og plasser i røret med en primær antistoff løsning.
- Inkuber 2-4 dager RT på en shaker på 60 rpm. Vask eksempler på RT på en shaker på 60 rpm i 0.01 M PBS endring til frisk bufferen 4 - 5 ganger og forlate siste vask på natten som i trinn 7.1.
- Inkuber prøver med sekundær antistoffer.
- Legge til 2% normal serum (samme arten som sekundær antistoffer) base PAKTEN flekker buffer i en 2-mL flat bunn tube (1 mL totalvolum anbefales per eksempel/rør).
- Legge til sekundære antistoffer i en konsentrasjon av 1:200 (5 µl 1 mL buffer).
Merk: Småformat antistoffer er foretrukket som svært kryss-adsorbert antistoffer hvis bruker mer enn én primær antistoff. - Bruk en slikkepott til å fjerne prøven fra vaskebuffer dab overflødig bufferen av på et papirhåndkle, og plasser i røret med en sekundær antistoff løsning.
- Ruge på RT på en shaker på 60 rpm for 2 dager og beskytte prøven fra lys.
- Vask prøvene, som i trinn 7.1, på RT på en shaker på 60 rpm i 0.01 M PBS endre til frisk bufferen 4 - 5 ganger og forlot finalen vask på natten, beskytte mot lys under vasker.
8. montering prøver for Imaging
- Forberede brytningsindeks matchet løsning (FELGER) bufferen.
- Veie ut 11 g av ikke-ioniske tetthet gradert medium (f.eks Histodenz) og nøye overføre til en 50-mL konisk rør.
- Legge ~ 5 mL 0.02 M fosfat buffer (PB)8 ved hjelp av en slikkepott for å slippe luften fra pulver ikke-ioniske tetthet gradert medium.
Merk: Løsningen vil være svært tyktflytende, bland godt. - Bringe volumet til 10 mL bruker flere PB, bland med en slikkepott og skrape overskytende av spatula inn i røret.
- Inkuber FELGER på 37 ° C til oppløst, inverter og bland forsiktig etter behov.
- Overføre prøver til FELGER. Gjør Pipetter 1 mL hjulkapsler i en 2-mL flat bunn rør. Bruk en slikkepott til å fjerne prøven fra vaskebuffer dab overflødig bufferen av på et papirhåndkle, og plasser i røret med FELGER løsning.
- Forsiktig Tapp røret for å senke eksemplet i FELGER. Sett prøvene i FELGER på benken beskyttet mot lyset på RT for 2-4 dager før bildebehandling.
- For å bilde, plassere en liten mengde hjulkapsler i en 8-vel dekkglassvæske bunnen kammer lysbilde. Bare Legg akkurat nok til pels bunnen, mer får prøve å flyte gjør det vanskeligere å image på en invertert omfang. Legge til utvalget i brønnen og lue lysbildet for bildebehandling.
9. imaging
- AC confocal mikroskopi og tenkelig programvare
- Velg passende lasere for eksitasjon og utslipp spektra av fluorophores brukes stain PAKTEN prøvene. Juster innstillingene for oppkjøpet programvaren slik at eventuelle overlapp mellom kanaler er eliminert. Bruk separate spor om nødvendig (når to fluorophores har samme excitation spectra).
- Definere bildeopptak
- Velg maksimal oppkjøpet hastighet, 16 bit, 4 eller flere gjennomsnitt og oppløsning på 1024 x 1024 eller bedre.
- Zoome inn objektet som skal avbildes.
Merk: Dette vil redusere anskaffet å redusere Foto-bleking og også redusere filstørrelsen og nedstrøms redigering.
- Oppsett z-stakken.
- Velg den beste snittestillingen for målsettingen som brukes. Hvis deconvolution ønskes senere, bruk en z-trinn mindre enn optimal som 1 µm.
- Bruk z stabel korreksjon.
- Starte nærmeste overflaten av vev og øke gevinsten som målet fokuserer gjennom z-flyet og legge til rettelser. Ikke endre laser innstillingene for korreksjon!
- Få en test stabel med en gjennomsnittlig, 512 x 512 oppløsning og maksimal oppkjøpet hastighet. Sjekk bildet i 3D å sørge for at det er like lysstyrke i hele stakken for hver farge før anskaffe siste høyoppløselig z-stakken.
- Lightsheet Imaging
- Kontroller at prøvene har vært equilibrated i FELGER for imaging for minst 24 h. ideelt, overføre prøvene til frisk HJULKAPSLER i tenkelig kammeret og la equilibrate i kammeret for minst en dag.
- Montere utvalget for bildebehandling
- Velg den minste (svart) kapillar montere prøven
- Bruk putty eller en rett til å holde prøven mens søknad superlim til slutten av av kapillær. Lim vev av kapillær berøre så lite en av vev som mulig.
- Sett inn utvalget for bildebehandling.
- Bilde med 5 X eller 25 X mål egnet for optisk ryddet prøver ved pivot skanning alternativet. Hvis det oppstår skygge eller sløret, rotere prøven og prøv på nytt, eller la prøven fortsette å equilibrate i FELGER.
Merk: En 1 mm stabel kan vanligvis ervervet i mindre enn fem minutter, avhengig av innstillingene. - Vis og Rediger bildestakker ved hjelp av image analyseprogramvare.
Representative Results
Prosedyrene flekker ble utviklet for å gi en omfattende undersøkelse av menneskelig bukspyttkjertelen undersøke holmer og tilknyttede autonome og sensorisk nettverk. Flere prosedyrer ble testet inkludert KLARHET7iDISCO17, og PAKTEN8 med metoden PAKTEN funnet best egnet for menneskelig bukspyttkjertelen og AC confocal bildebehandling.
Primære antistoffer ble opprinnelig testet på fast menneskelige bukspyttkjertelen prøver med egnet positive og negative kontroll prøver (mus hjernen, andre). Den primære antistoffer og foreslåtte fortynninger er oppført i Tabellen for materiale, selv om hvert laboratorium kan forvente å optimalisere antistoff fortynninger avhenger mye tall og vev kilde. Primære antistoff parti til parti variasjonen kan påvirke flekker intensiteten og spesifisitet, og hit å oppnå samme grad av flekken intensitet som med tidligere reagenser.
I menneskelige bukspyttkjertelen, var holmer preget av insulin og glukagon secretogranin 3 (figur 2). Schwann cellene var avgrenset med glial fibrillary syre protein (GFAP, figur 2 og figur 3A). Nerver med antistoffer mot parasympatiske markør vasoactive intestinal peptid (VIP) ble fotografert på Lightsheet (figur 3B). Sympatiske nerver kan sees med flekker for tyrosin hydroksylase (vises ikke).
Figur 1. Menneskelige bukspyttkjertelen optisk clearing. (A) et barberblad til å kutte og løsne en del av parafin-embedded vev (topp panel) før snittet vev og skrape bort overflødig parafin fra vev (bunnen panel). Representant vevsprøver vises før (B venstre, C øverst) og etter (høyre B, C midten) optisk clearing av parafin-embedded vev, som beskrevet i delen protokollen. Ryddet, fast vev er ikke helt gjennomsiktig etter (B rett, C toppen) og ofte vev hevelse kan være verdsatt (C, midtre panelet). Ryddet vev blir helt gjennomsiktig etter balanse i FELGER (C, nedre panel). Skalere barer: 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Menneskelige Nevro-isolerte nettverket. Menneskelige bukspyttkjertelen prøver ble tømt som beskrevet fra nPOD orgel givere eller arkivering parafin-embedded vev. (A-D) Schwann celler (GFAP +, hvit) og endokrine celler vises farget av insulin (rød) og glukagon (grønn). (A) Confocal mikroskopi og maksimal intensitet projeksjon (MIP) viser sporing av Schwann celler (GFAP +) på nervene løpe ved blodkar i Holme periferien og utvide til øyene. Rammemargen viser høy oppløsning oppnås og viser kontakt mellom GFAP + Schwann cellene og endokrine. (B) et 3D-bilde av panelet (skala: x = 50 µm, y = 20 µm, z = 25 µm) A. En parafin-PAKTEN prøve vises fotografert via AC confocal mikroskopi og presentert som en maks intensitet projeksjon (C) og i 3D (D), skalere: x, y = 50 µm, z = 25 µm). Skala barer , C: 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. 3D-visualisering og sømmer. Tre sydd bildestakker ble kjøpt opp av Schwann celler farget GFAP og AC confocal mikroskopi og spores ved hjelp av en neurite tracer plugin i bildet analyseprogramvare. (A) 3D fyll av spor vises (skala barer: x = 150 µm, y = 200 µm (0.2 mm), z = 120 µm) (B) en pakt prøven var farget med VIP antistoff og fotografert bruker lightsheet mikroskop. Stakken er > 1 mm i dybde og nerve fiber er tydelig i høy oppløsning. Fiber innpakning et rør (D, forgrunnen) og en ganglion (G, bakgrunn) kan sees (stort rutenett: x, y, z = 200 µm; aksemerke: x, y, z = 40 µm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Tilgjengeligheten av nye optiske clearing metoder har tillatt enestående storskala undersøkelser av sentralt og perifere nervesystem i dyremodeller. Samlet gir mønstre av menneskelig bukspyttkjertelen er stort sett uutforsket vevs tetthet og vanskeligheter i å anskaffe høykvalitets biospecimens. Denne protokollen gir en optimalisert vev fjerne protokoll for menneskelig bukspyttkjertelen vev fra enten faste eller parafin-embedded arkivering prøver.
Fjerne tid avhenger utvalgsstørrelsen, etappe, den stabiliserende type, varighet, lagring varighet og krever 1-8 uker, slik følgende vurderinger er kritiske. Det er best å fjerne vev etter 4% PFA fiksering hvis mulig fordi langtidslagring øker tiden clearing. For å minimere tiden clearing, ble mengden PFA i hydrogel monomer redusert fra 4% som brukes i fiksering trinn 1% for menneskelig bukspyttkjertelen. For andre vev, spesielt musen vev, må mengden PFA må gi tilstrekkelig hydrogel stivhet å bevare antigener bestemmes empirisk. Tilstrekkelig clearing er også viktig siden antistoff penetrasjon reduseres i dårlig ryddet vev og overflaten farging av sekundær antistoffer er økt. Det er best å holde pH konstant og vaskemiddel frisk endre clearing løsningen hver andre dag (eller selv daglig). Derimot over fjerne negativt påvirker mobilnettet morfologi og øker vev friability. Siden eksempler bukspyttkjertelen fjerner ujevnt på grunn av iboende patologi som regioner av fibrose fra kronisk pankreatitt eller andre patologi, er det viktig å overvåke ofte denne prosessen. Bruk av vibratome tykke snitt kan også brukes til å lage uniform tykkelser, men kreves ikke. Overvåking clearing prosessen, så prøvene blir fjernet fra vaskemiddel når lys går lett gjennom utvalget, sikrer at prøven er tilstrekkelig klarert.
Antistoff gjennomtrenging og overflate flekker er viktig hensyn som må tas med PAKTEN prøver. For å sikre god antistoff penetrasjon, er det avgjørende å ruge prøver med primære antistoffer i minst 2 dager. Ulike antistoffer har forskjellige spredningen priser og bør optimeres individuelt, men for de fleste antistoffer, 4 dager var tilstrekkelig varighet for full penetrasjon i en 1 mm3 prøve. Hvis overflaten flekker er et problem, spesielt for Lightsheet avbildning, prøven kan bli kuttet i to, eller overflaten dissekert bort etter farging. Småformat antistoffer foreligger forventes å hjelpe med vev penetrasjon8. Preconjugated antistoffer virker ikke fungerer som den samme unconjugated klone og høyere bakgrunn fra uspesifikke bindende og dårligere vev penetrasjon kan være observert hvis de fungerer i det hele tatt. For bedre suksess med preconjugated antistoffer, øke serum og TritonX-100-konsentrasjoner hos den flekker bufferen og bruke lengre incubations (> 4 dager). Etter er inkubasjon av eksemplet i FELGER i flere dager avgjørende. Ryddet vev svelle i PBS og FELGER inkubasjon forårsaker dem til å tilbake til opprinnelig størrelse. Spesielt med lightsheet bildebehandling, skal utvalget være fullt equilibrated før bildebehandling.
Når imaging eksempler på AC confocal mikroskopet, må korreksjon angis hver gang en ny plassering er valgt. Ulike oppkjøpet dypet og variasjon i flekker intensitet gjennom vevet nødvendiggjør justeringer for hvert område i vevet til å avbildes optimalt. Likeledes, sekundær antistoffer brukes må nøye vurderes. Spectral unmixing er utfordrende i PAKTEN prøver, så fluorophores må velges riktig for en lav eksitasjon eller utslipp overlapping å sikre et lys signal når filtrering utslipp på AC confocal mikroskopet. For hvert program, må en balanse bli slått mellom oppløsning, tenkelig hastighet og støyreduksjon slik at best bilderesultat kan skaffes uten bilde-bleking. Oppløsning større enn 1024 x 1024 er ikke oppdages av øyet, men kan være nødvendige for visse programmer hvis kvantifisering av en flekk er nødvendig.
Det er mange ting å vurdere når du velger en optisk clearing teknikk og når du velger optisk clearing over andre mer tradisjonelle metoder. Lav overflod antigener kan ikke være synlig med metoden PAKTEN dermed finnes det begrensninger på antigen gjenkjenning. Visse antigener som immunologiske antigener (CD3, CD4, CD8, etc.) er ødelagt av metoden PAKTEN og er undetectable til tross for høy kvalitet antistoffer tilgjengelig å oppdage dem. En annen begrensning av denne metoden er iboende variasjon mellom donor pancreases som er vanskelig å skjelne før etter fjerne flekker. Hver giver vev pleier å fjerne og flekker på samme måte mellom prosedyrer, men forskjellige donor vev har vidt forskjellige clearing ganger og vev morfologi kvalitet etter avregning. Muligheten til å bruke arkivering vev kan redusere denne begrensningen hvis man kan ha tilstrekkelig tilgang til et stort antall pasienten bukspyttkjertelen prøver om dette ikke har blitt grundig undersøkt. PAKTEN protokollen rapporterte her ble funnet for å være billig og lett gjennomført med standard laboratorieutstyr. Ryddet prøver var egnet for tenkelig via tradisjonelle AC confocal mikroskopi, samt 2-foton og Lightsheet teknologi og gitt høyoppløselig 3D-bilder av nerver og holmer i store deler av menneskelig bukspyttkjertelen. Fremtidige anvendelser av denne prosedyren inkluderer studier på utvikling av fetal bukspyttkjertelen for både exocrine og endokrine rom og Holme studier i type 1 og type 2 diabetes.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Ann Fu og Joseph Canzano for kundestøtte, Dr. Jennifer Treweek for uvurderlig råd og Dr. Kristin Overton og Dr. Karl Deisseroth for trening til MCT gjennom Stanford University KLARHET verkstedet. JDRF nPOD og orgel innkjøp organisasjonene gitt vevsprøver. Dette arbeidet ble finansiert av JDRF (47-2014-1), Helmsley Charitable Trust (HCT 2015-PG-T1D052) og NIDDK 1OT2 TR001773 til MCT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | Buffers |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | S375-500 | PB buffer (RIMS) |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | 71507-250 | PB buffer (RIMS) |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | Immersion fixation, hydrogel, storage solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | Hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | Hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | Hydrogel |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | Clearing buffer |
| Sodium azide | Sigma | S8032 | Sample storage buffer |
| 18 gauge needles | Fisher | 14-840-91 | Degassing hydrogel solution |
| N2 tank | AirGas | various | Degassing hydrogel solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 100 ml | Buffers |
| Goat, normal serum | Vector | S-1000 | Use as 2% in blocking buffer |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | RIMS |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80827 | Imaging |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 710 | Imaging |
| LightSheet microscope | Zeiss | Z1 | Imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibody | |||
| CD45 | Bioss | bs-4820R-A488 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Did not work |
| CD45 | DAKO | M0754 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| GFAP | DAKO | Z0334 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | BD Biosciences | 565891 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | Cell Signaling | 2760S | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| Glucagon | Abcam | ab10988 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Insulin | DAKO | A0564 | Host: Guinea Pig Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| NCAM (CD56) | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| NCAM (CD56)-FITC conjugate | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Peripherin | EnCor | RPCA-Peri | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| PGP9.5 | DAKO | Z5116 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Secretogranin 3 | Sigma | HPA006880 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Smooth muscle actin | Sigma | A5228; C6198 (Cy5) | Host: Mouse Dilution: 1:200; 1:200 Comments: Worked; Conjugated worked better than unconjugated |
| Substance P | BioRad | 8450-0505 | Host: Rat Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Abcam | Ab76442 | Host: Chicken Dilution: 1:100 Comments: Worked, but weak staining |
| Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) | Immunostar | 20077 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| Vesicular Acetylcholine Transporter (VAChT) | Synaptic Systems | 139103 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Secondary Antibody | |||
| Guinea pig IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Mouse IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rat IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat, Donkey Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Chicken IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
References
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Orlich, M., Kiefer, F. A qualitative comparison of ten tissue clearing techniques. Histol Histopathol. , 11903 (2017).
- Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Curr Opin Biotechnol. 40, 193-207 (2016).
- Hsueh, B., et al. Pathways to clinical CLARITY: volumetric analysis of irregular, soft, and heterogeneous tissues in development and disease. Sci Rep. 7 (1), 5899 (2017).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
- Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Campbell-Thompson, M. Organ donor specimens: What can they tell us about type 1 diabetes? Pediatr Diabetes. 16 (5), 320-330 (2015).
- Kim, A., et al. Computer-assisted large-scale visualization and quantification of pancreatic islet mass, size distribution and architecture. J Vis Exp. (49), (2011).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
