Summary
Здесь мы представляем оптимизированный протокол к разделам изображение поджелудочной железы человека в трех измерениях (3D) с использованием пассивной очистки методы. Эта рукопись демонстрирует эти процедуры для пассивных оптических очистки, последовали несколько иммунофлюоресценции, пятнать для выявления ключевых элементов, вегетативная и сенсорные нейронных сетей, иннервирующих человеческих островках.
Abstract
С помощью традиционных методов гистологические, исследователи препятствует их способность изображения всего тканей или органов в крупномасштабных 3D. Гистологические срезы, обычно ограничиваются < 20 мкм как формалин фиксированной парафин раздел на стеклянных вставках или < 500 мкм для свободного плавания фиксированной секций. Таким образом, значительные усилия требуются для последовательного секционирование и методы реконструкции крупномасштабных изображений воссоздать 3D для образцов > 500 мкм с использованием традиционных методов. Кроме того, свет рассеивается из макромолекул в тканях, особенно липиды, предотвращает изображений на глубине > 150 мкм с наиболее конфокальные микроскопы. Для уменьшения рассеивания света для глубоких тканей изображений с помощью простой confocal микроскопии, различные методы оптической расчистки были разработаны и что соответствующие для грызунов и человеческие ткани образцов фиксируются путем погружения. Несколько методов связаны и использовать белка сшивки с акриламида и ткани, сняв с додецилового сульфата натрия (SDS). Другие методы очистки оптических используются различные растворители, хотя каждой модификации имеют различные преимущества и недостатки. Здесь оптимизированный пассивных оптических расчистки метод описан для исследования иннервации поджелудочной железы человека и конкретно для допроса иннервации человека островков.
Introduction
До недавнего времени, 3-мерные (3D) реконструкции крупных тканей или целых органов была проведена через кропотливого серийный секционирование, окрашивание и реконструкции изображения нескольких разделов. Эти методы имеют ряд недостатков, включая зависимость от большое количество последовательных секций, проникновение бедных ткани антитела, и светорассеянию предотвращение глубоких изображений в тканях. Чтобы обеспечить больше света и проникновения антитела, исследователи разработали химические методы для сохранения белков антигенов при удалении большинство светорассеивающего липидов. Некоторые связанные методы являются Clear Lipid-Exchanged акриламида гибридизированных жесткой ткани Imaging гидрогеля (прозрачность), пассивный ясности техника (Пакт) и при содействии перфузии агент выпуска в situ (PARS) (обзор в 1,2 ,-3,-4,-5,-6). ЯСНОСТЬ метод основан на стабилизации белков с помощью формальдегида, акриламида и бис гидрогеля следуют липидов удаления с помощью электрофореза SDS решение2. Этот подход был позднее изменен для пассивного очистка и передовых тепловизионных7. Дальнейшая оптимизация привело к ликвидации бис и различные проценты параформальдегида в решении гидрогеля (1-4%) для получения оптимального антигена стабилизации с минимальным временем очистки для называемый пакт 8. Ранние попытки разработать эти методы очистки оптических участие органических или других соединений, которые было трудно работать с и закаленных эндогенного флуоресцентных белков в трансгенные мыши модели. Эти дополнительные методы включали весов, беспрепятственный мозга/тело коктейли и вычислительные анализ (КУБИЧЕСКИЙ), переключатель и Dimensional Imaging of Solvent-Cleared органов (диско) методы, все с различными плюсы и минусы в9, 10,,1112. Оригинальный метод ЯСНОСТИ был разработан в ткани мозга мыши липидов богатых и методы оптической расчистки ограничила тестирования в тканях человека7,8,11,13,14 .
Методы очистки оптических идеальны для трассировки нервы на большие расстояния как нетронутыми мыши центральной нервной системы. Поджелудочной железы также иннервируются вегетативной и сенсорные нервные системы. Отсеке поджелудочной железы эндокринной, островки Лангерганса, составляют весьма небольшую часть всего органа (1-2%), и островки известны гетерогенность в размерах (50-250 мкм), эндокринные клетки пропорции и плотности, особенно при сахарном диабете (обзор в 15 ,-16). При разработке протокола, несколько методы оптической расчистки были протестированы для человека поджелудочной железы и процедура Пакт был найден предоставлять наилучший баланс времени для очистки (~ 2 недели) с отличным морфологических сохранением нервов и островков. Окончательный оптимизированная процедура описана здесь разграничения нейро островной сети для крупномасштабных (миллиметр расстояния) и с высоким разрешением 3D визуализации нескольких нетронутыми панкреатических островков. Техника подходит для человека поджелудочной железы сразу после фиксации или после хранения, а также образцы фиксированной в нейтральных буферизации формалином и встроенных в парафин. Образцы предназначены для визуализации, конфокальная или lightsheet микроскопии.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с университета штата Флорида институциональных Наблюдательный Совет и федеральных руководящих принципов.
Предупреждение: Параформальдегида акриламида и токсичных раздражителей. Обработайте реагентов в Зонта с соответствующие средства индивидуальной защиты (лаборатории пальто, перчатки, средства защиты глаз).
1. депарафинизации формальдегида Исправлена тканей (при работе с свежими тканей, перейдите к шагу 2)
- Используйте новое лезвие бритвы или скальпель прорезать парафина перпендикулярно поверхности ткани. Вырежьте парафина на краю ткани, чтобы закончить, ослабление его. Используйте щипцы или шпателем для Осторожно ослабьте и удалите ткани оптически очищается. Аккуратно очистите избыток парафин из ткани с помощью шпателя (рис. 1A).
- Заполнить стеклянную тару с ксилола (около 30 мл на 3 x 3 x 3 мм в разделе ткани) и инкубировать ткани в это решение в течение 24 ч при комнатной температуре (RT).
- Заполните другой стеклянной тары с свежими ксилол с того же объема, как 1.2.1. Передача и инкубировать ткани в это решение в течение 24 ч в рт.
- Место 100% этанола в коническую пробирку с того же объема, как 1.2.1. Передача и инкубировать ткани в это решение в течение 24 ч в рт.
- Место 95% этанола в коническую пробирку с того же объема, как 1.2.1. Передача и инкубировать ткани в это решение в течение 24 ч в рт.
- Место 70% этанола в коническую пробирку с того же объема, как 1.2.1. Передача и инкубировать ткани в это решение в течение 24 ч в рт.
- Полоскания тканей в фосфата 0,01 М буфер солевой раствор (PBS) и место в 0,01 М PBS в коническую пробирку, чтобы сбалансировать для 24 h на RT. Убедитесь что ткани бесплатно парафина (рис. 1B, правая панель).
2. Подготовьте фиксатором параформальдегида (PFA) 4%
- Пипетка 10 мл 16% ПФА в 50-мл Конические трубки, добавить 4 мл 0,1 М PBS, а 26 мл дистиллированной деионизированной воды (ddH2O). Закройте крышку и перемешать кратко.
- Большие объемы 4% PFA может производиться вперед и замороженных в аликвоты. Аликвоты хороши для 1 дня при комнатной температуре (RT), одну неделю на 4 ° C и 1 месяца при температуре-20 ° C.
3. поджелудочная железа фиксации
- Исправьте пример поджелудочной железы (≤ 1 x 1 x 2 см) в свежеприготовленные 4% PFA при 4 ° C в течение 48 часов. Если образец больше чем 1 x 1 x 2 см, использовать скальпелем или лезвием бритвы для рассечения в более мелкие кусочки толщиной не более 1 см. Вымойте образца ткани в три изменения 0,01 М PBS для по крайней мере 15 минут каждый мыть и хранить в 15 мл пластиковых пробирок в 0.01% PFA/0.01 М PBS или 0,5% натрия азид/0.01 М PBS до использования.
- После фиксации в разделе ткани в 1-2 мм толщиной разделы для дальнейшей обработки. Используйте vibratome для оказания помощи в даже секционирование.
Примечание: Окончательное количество секций будет зависеть от размера отправной образца.
4. внедрить ткани в Гидрогель
- 200 мл раствора гидрогеля мономера акриламида/1% параформальдегида (A4P1) 4% готовят следующим образом:
- Место колбу на льду в ведро с верхней плиты магнитные перемешать. Убедитесь, что плоские сидит колбу и добавить панель магнитные перемешать.
- Добавьте следующее в порядке: 147,8 мл холодной ddH2O (4-8 ° C), 20 мл 0,1 М PBS, холодный (4-8 ° C) 20 мл 40% акриламида раствор, 12,2 мл раствора PFA 16% и инициатор 250 мг VA-044. Mix решение всего гидрогеля с магнитной перемешать бар для по крайней мере 10 мин и оставьте раствор на льду для следующего шага.
- Место 15 мл конические пробки во льду рядом с флакон, содержащий решение гидрогеля. Пипетка 14 мл раствора мономера в трубку и добавить одну часть образца толщиной фиксированной ткани 1-2 мм. Затем крышку трубки.
- Инкубировать образцов в растворе мономер для 3 дней при температуре 4 ° C и защищать от света. Аликвота оставшиеся мономера решения и хранить при температуре-20 ° C для использования в будущем.
5. дегазировать мономера решения и полимеризоваться Гидрогель
- Удаления кислорода из гидрогеля мономера решения с использованием газообразных N28.
- Подготовить ведро льда и поместите образец в решении мономера гидрогеля на льду.
- Сбор 2-3, 18-калибровочного иглы для каждого образца, парафин фильм и таймер. Соединение труб с азота танк, чтобы азота может течь. При сохранении образца на льду, тщательно проколоть крышечка коническая трубка, содержащая образец на одной стороне и нажмите одну подкожную иглу пока он находится под поверхностью раствора жидкого мономера.
- Использовать другой подкожных игл для прокола противоположной стороне крышку, но не позволяют ему стать погружен.
Примечание: Вторая игла будет вентиляционные трубы. - Подключите труб из бака азота для подкожных иглы погруженным под гидрогеля и медленно включите азота до тех пор, пока он кипит неуклонно через жидкости.
- Разрешить азота в пузырь через жидкости для 10 мин.
- Как только кислород удаляется, быстро удалить обе иглы и заглушка с парафином фильм, чтобы предотвратить любой дальнейший обмен газов между трубой и окружающей среды. Поместите образец разгазированной в инкубаторе при 37 ° C 3 h для полимеризации гидрогеля.
6. ткани очистка
- Подготовка 500 мл, очистка раствора (4% SDS в рН 8,5). ~ 300 мл ddH2O добавьте 50 мл 0,1 М PBS и 20 g SDS порошок, помешивая магнитной перемешать бар. Настройка решения с помощью гидроксида натрия и соляной кислоты до pH 8,5. Добавьте ddH2O до тех пор, пока конечный объем составляет 500 мл.
- После полимеризации слейте излишки гидрогеля и выбросьте его в контейнер химических отходов. Используйте бумажную салфетку, аккуратно протрите прочь гидрогеля из образца и отменить в контейнер химических отходов.
- Помойте образец в 3-5 обмены 0,01 М PBS (отменить мыть жидкости в химических отходов) для 15 мин каждый шаг мыть. Передача образцов в 50 мл конические с 40 мл очистка буфера.
- Инкубировать образец в очистка буфера при 37 ° C и изменить образец на свежие очистка буфера каждый день.
- Оставьте образец в очистка буфера для 2-8 недель в зависимости от размера выборки (~ 8 недель для 3 мм × 3 мм × 3 мм образца) для обеспечения надлежащей очистки.
- Контролировать очистки ткани и остановки, когда полный. Убедитесь, что образец адекватно прозрачным, удерживая его до света для проверки надлежащей очистки (обычно некоторые загар окраски останется в экзокринных областях).
Примечание: Пример чрезмерно очищается появится изношен на краях и текстура будет очень мягкими, когда взял с щипцами. Она является общей для образца очистить неравномерно. Кроме того ткань не будет полностью прозрачным, до тех пор, пока в монтаж СМИ (вставка, Рисунок 1 c).
7. несколько иммунофлуоресценции
- Вымойте образцы на шейкер на 60 об/мин на RT на один день с 40 мл 0,01 М PBS меняется свежие буфер часто (4-5 буфера изменения в всего, 40 мл каждого мытья, меняется каждый час до окончательного мыть). Пусть окончательный мыть продолжить на ночь на RT.
- Подготовьте Пакт, окрашивание буфера. В 500 мл 0,01 М PBS добавьте азид натрия 50 мг и 0,5 мл TritonX-100. Хорошо перемешайте.
- Инкубируйте образца с первичных антител.
- Добавить 2% нормальной сыворотки (же видов как вторичное антитело) базового Пакт, окрашивание буфера в плоское дно 2-мл пробирку (по крайней мере 1 мл общий объем рекомендуется за образец/трубки).
- Добавьте основное антитело в 2% сыворотки/Пакт пятнать буфера. Используйте примерно 5 x количество первичных антител для окрашивания Пакт, как будет использоваться для стандартных иммуногистохимия (т.е. Если антитела разбавленных 1: 500 для стандартных иммуногистохимии, использование масштаба 1: 100 для окрашивания пакт).
- Чтобы удалить образец из буфера мытья и dab излишки буфера покинуть на бумажное полотенце, а затем поместить в трубку с раствором основное антитело лопаточкой.
- Проинкубируйте 2-4 дня в РТ на шейкер на 60 об/мин. Тщательно вымойте образцы на RT на шейкер на 60 об/мин в 0,01 М PBS меняется свежие буфер 4 - 5 раз и оставив последний мыть на ночь как шаг 7.1.
- Проинкубируйте образцы с вторичные антитела.
- Добавить 2% нормальной сыворотки (же видов как вторичное антитело) базового Пакт, окрашивание буфера в плоское дно 2-мл пробирку (общий объем 1 мл рекомендуется за образец/трубки).
- Добавление вторичного антитела в концентрации 1: 200 (5 мкл в буфере 1 мл).
Примечание: Малый формат антитела являются предпочтительным, а также весьма кросс адсорбированные антител при использовании более чем одного основного антитела. - Чтобы удалить образец из буфера мытья и dab излишки буфера покинуть на бумажное полотенце, а затем поместить в трубку с раствором вторичное антитело лопаточкой.
- Инкубируйте на RT на шейкер на 60 об/мин в течение 2 дней и защиты образца от света.
- Тщательно промойте образцы, как шаг 7.1, в РТ на шейкер на 60 об/мин в 0,01 М PBS меняется на свежие буфер 4 - 5 раз и оставляя окончательный мыть на ночь, защищать от света во время мойки.
8. Монтаж образцы для изображений
- Подготовьте преломления буфер соответствующего решения (колеса).
- Весят из 11 g неионных плотность градиента среды (например, Histodenz) и тщательно передачи в 50-мл Конические трубки.
- Добавьте ~ 5 мл 0,02 М фосфатного буфера (PB)8 с помощью шпателя для выпуска воздуха из среднего градиента неионных плотность порошка.
Примечание: Решение будет очень вязкой, хорошо перемешать. - Довести объем до 10 мл, с использованием более PB, смешать с помощью шпателя и скрести избыток от шпателя в трубу.
- Инкубировать колеса при 37 ° C, до растворения, инвертировать и осторожно перемешать при необходимости.
- Передача образцов в колеса. Чтобы сделать это, Пипетка колеса 1 мл в 2-мл пробирку с плоским дном. Чтобы удалить образец из буфера мытья и dab излишки буфера покинуть на бумажное полотенце, а затем поместить в трубку с колеса решения лопаточкой.
- Аккуратно нажмите трубки погружаться в образце в колеса. Поместите образцы в колеса на скамейке, защищенном от света на RT для 2-4 дня до изображений.
- Для изображений, место небольшое количество колеса в coverslip 8-Ну нижней палаты слайд. Только добавить просто достаточно, чтобы покрыть дно, больше вызовет образца до плавать, затрудняя изображения на Перевернутый сферы. Добавить образец в колодец и крышка слайд для воображения.
9. изображений
- Конфокальная микроскопия и обработки изображений
- Выберите соответствующие лазеры для возбуждения и выбросов спектры флуорофоров, используется для пятно образцы Пакт. Настройте параметры приобретения программного обеспечения, таким образом, чтобы устранить любое дублирование между каналами. Использование отдельных треков при необходимости (когда два флуорофоров имеют аналогичные спектры возбуждения).
- Настройка загрузки изображений
- Выберите скорость максимальная приобретения, 16 бит, 4 или более средние и разрешение 1024 x 1024 или лучше.
- Увеличить в объект для записи образа.
Примечание: Это позволит уменьшить время аэросъёмки для уменьшения обесцвечивания фото и также уменьшить размер файла и ниже по течению редактирования.
- Установка z стека.
- Выберите оптимальный секционирование для достижения цели используются. Если позднее Деконволюция, используйте z шаг меньше оптимального например 1 мкм.
- Использование z стека коррекции.
- Начало ближайшего поверхности ткани и увеличить прибыль, как цель фокусируется через z плоскость и добавлять исправления. Не изменяйте параметры лазера для коррекции!
- Приобрести проверка стека с одной средней, 512 x 512 резолюции и максимальной скоростью. Проверьте изображение в 3D, чтобы убедиться, что есть равные яркость во всем стеке для каждого цвета до получения окончательного разрешением z стека.
- Lightsheet изображений
- Убедитесь, что образцы достижение равновесного для визуализации для по крайней мере за 24 ч. в идеале были уровня в колеса, передавать образцы свежие колеса в тепловизионной камере и позволяют сбалансировать в камере для по крайней мере в день.
- Смонтировать образца для изображений
- Выберите наименьший (черный) капилляра для монтирования образца
- Использование замазки или блюдо провести образца при применении супер клей в конец капилляра. Приклейте ткань для капиллярной, касаясь как мало поверхности ткани как можно.
- Вставка образца для изображений.
- Изображение с помощью 5 X или 25 X целей подходит для оптически свободные образцы с использованием pivot сканирования вариант. Если затенение или размытия происходит, вращать образец и попробуйте еще раз или пусть образец продолжать сбалансировать в колеса.
Примечание: 1 мм стек обычно могут быть приобретены в менее чем пяти минут, в зависимости от настройки. - Просмотр и редактирование стеки изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображения.
Representative Results
Эти окрашивание процедуры были разработаны для обеспечения крупномасштабного обследования человека поджелудочной железы для изучения островков и связанные вегетативные и сенсорных сетей. Несколько процедур были протестированы, включая ясность7, iDISCO17, и8 Пакта с методом Пакта нашли лучший подходит для человека поджелудочной железы и конфокальная томография.
Первичного антитела первоначально были протестированы на фиксированной образцы человеческого поджелудочной железы с подходящей положительных и отрицательных контрольных образцов (мыши мозга, другие). Первичных антител и предложил разведений, перечислены в Таблице материалы, хотя каждая лаборатория можете ожидать, чтобы оптимизировать разбавления антитела в зависимости от числа и тканей источник много. Основное антитело лот для лота изменения могут повлиять на интенсивность окрашивания и специфику и требуют проверки для достижения той же степенью интенсивности пятно с бывшим реагентов.
В человеческой поджелудочной железы были определены островков, инсулина, глюкагона и secretogranin 3 (рис. 2). Шванновские клетки были определены с использованием глиальных фибриллово кислоты белка (СВМС, рис. 2 и рис. 3A). Нервы, окрашенных с антителами против парасимпатические маркер вазоактивный интестинальный пептид (VIP) были образы на Lightsheet (рис. 3B). Симпатические нервы может рассматриваться с пятная для тирозин-гидроксилазы (не показан).
Рисунок 1. Поджелудочной железы человека оптических расчистки. (A) лезвием бритвы используется для вырезания и ослабить раздел парафин врезанных тканей (верхней панели) перед извлечением разделе ткани и выскабливание прочь избыток парафин из ткани (нижней панели). Образцы тканей представителя показаны до (вверху слева, C B) и (B правом, Ближний C) оптических очистки парафин врезанных тканей, как описано в разделе протокол. Очищенный, фиксированной ткани не является полностью прозрачной после очистки (B правильно, C сверху) и часто ткани отек может быть высоко (C, средняя группа). Очищенное ткани становится полностью прозрачным после уравновешивания в колеса (C, Нижняя панель). Масштаб бары: 500 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Нейро островной сети человека. Образцы человеческого поджелудочной железы были сняты как описано nPOD органа доноров или из архивных парафин врезанных тканей. (A-D) Шванновские клетки (СВМС +, белый) и эндокринные клетки отображаются окрашенные (красный) инсулин и глюкагон (зеленый). (A) Confocal микроскопии и максимальная интенсивность проекции (MIP) показывает трассировки клеток Шванн (СВМС +) на нервы пробегает рядом с кровеносных сосудов на периферии островок и расширение в островки. Врезные демонстрирует высокое разрешение получено и показывает контакт между СВМС + Шванновские клетки и эндокринные клетки. (B) 3D изображение группы (масштаб: x = 50 мкм, y = 20 мкм, z = 25 мкм) A. Парафин Пакт образец показан образ через confocal микроскопии и представлены как Макс интенсивности проекции (C) и в 3D (D), масштаб: x, y = 50 мкм, z = 25 мкм). Масштаб бары , C: 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рис. 3D визуализации и сшивание. Три стеки нашит изображения были приобретены Шванновские клетки окрашенных с помощью СВМС и confocal микроскопии и проследить с помощью трассировщика плагин neurite в программное обеспечение для анализа изображений. (A) 3D заливкой трассировки отображается (масштаб бары: x = 150 мкм, y = 200 мкм (0,2 мм), z = 120 мкм) (B) Пакт образец был окрашенных с VIP антитела и образы с помощью микроскопа lightsheet. Стек > 1 мм в глубину и нервных волокон отчетливо видны в высоком разрешении. Волокон, упаковка воздуховод (D, переднего плана) и ганглий (G, фон) можно увидеть (крупная сетка: x, y, z = 200 мкм; деления: x, y, z = 40 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Наличие новых методов очистки оптических позволило беспрецедентное крупномасштабных обследований Центральной и периферической нервной системы в моделях животных. Общая иннервация шаблонов человеческого поджелудочной железы во многом неизведанные благодаря плотности ткани и трудностями в приобретении высококачественных biospecimens. Этот протокол предоставляет оптимизированные ткани, очистка протокол для человека поджелудочной железы ткани от фиксированной или парафин врезанных архивных образцов.
Очистка время зависит от размера выборки, фиксирующие типа, продолжительность, продолжительность хранения и могут потребовать 1-8 недель, так что следующие соображения имеют решающее значение. Лучше очистить ткани вскоре после фиксации PFA 4%, если это возможно, потому что длительного хранения увеличивает время очистки. Чтобы свести к минимуму время очистки, количество ПФА в гидрогеля мономера была снижена с 4%, используемому в фиксации шаг 1% для человека поджелудочной железы. Для других тканей, особенно мыши тканей, количество PFA, необходимо обеспечить достаточную жесткость Гидрогель для сохранения антигены должна определяться эмпирически. Надлежащей очистки также важно, так как антитела проникновение уменьшается в плохо очищенных тканях и увеличивается поверхность, окрашивание, вторичные антитела. Изменение очистки решения каждый другой день (или даже ежедневно) лучше держать константу рН и моющего средства свежие. Напротив, чрезмерно очистка негативно влияет клеточной морфологии и увеличивает рыхлости тканей. Поскольку некоторые образцы поджелудочной железы очистить неравномерно вследствие присущего патологий, таких как регионы фиброза от хронического панкреатита или других патологий, важно часто контролировать этот процесс. Использование vibratome толстые разделов может также использоваться для единообразной толщины, но не требуются. Наблюдение за процессом очистки, поэтому образцы удаляются из моющего средства, как только свет проходит легко через образец, гарантирует, что пример достаточно очищается.
Антитела проникновения и пятнать поверхности являются важными вопросами для рассмотрения с образцами Пакт. Чтобы обеспечить хорошее антитело проникновения, важно для инкубации пробы с основного антитела для по крайней мере 2 дней. Различные антитела имеют различные диффузии ставки и должны быть оптимизированы отдельно, но для большинства антител, 4 дня было достаточной продолжительности для полного проникновения в 1 мм3 образца. Если поверхности окраски является проблемой, особенно для Lightsheet изображений, образец может быть пополам, или поверхности расчлененный прочь после окрашивания. Ожидается, что малый формат антител при наличии будет помочь с ткани проникновения8. Preconjugated антитела, по-видимому, не работают так же неконъюгированной клон и повышенный фон от неспецифического связывания и бедных проникновения ткани может быть отмечено, если они работают на всех. Для повышения успеха с preconjugated антител, увеличить сыворотки и концентрации TritonX-100 в окрашивание буфер и использовать больше инкубаций (> 4 дня). После окрашивания, важно инкубации образца в колеса на несколько дней. Зыбь очищается тканей в PBS и колеса инкубации заставляет их сокращаться обратно к исходному размеру. Особенно с lightsheet изображений, образец должен быть полностью достижение равновесного уровня до изображений.
При визуализации образцы конфокального микроскопа, исправление необходимо задать каждый раз, когда выбирается новая позиция. Различные приобретения глубины и вариации в пятнать интенсивности по всей ткани требует корректировки для каждой области ткани, чтобы быть imaged оптимально. Аналогичным образом необходимо тщательно рассмотреть вторичные антитела, которые используются. Спектральная расслоение является сложной в образцах Пакт, поэтому флуорофоров должны быть надлежащим образом выбраны для низкой возбуждения или выбросов дублирования для обеспечения яркий сигнал при фильтрации выбросов на confocal микроскопа. Для каждого приложения должен быть баланс между резолюции, скорость обработки изображений и снижения уровня шума, чтобы лучшее качество изображения могут быть приобретены без фото отбеливания. Больше, чем 1024 x 1024 резолюции не обнаруживаемых человеческого глаза, но могут быть необходимы для определенных приложений, если требуется количественная оценка пятно.
Есть много вещей, чтобы рассмотреть при выборе метод очистки оптических и при выборе оптических расчистки над другими более традиционными методами. Низкие изобилии антигены не могут обнаружить с помощью метода Пакт, таким образом, существуют ограничения на обнаружения антигена. Определенные антигены как иммунологический антигены (CD3, CD4, CD8, и т.д.) уничтожаются методом Пакт и неопределяемого несмотря на высокое качество антитела для выявления их. Еще одним ограничением этого метода является присущих изменчивости между донорами поджелудочная железа, которые трудно различить до и после очистки пятнать. Каждый донорской ткани, как правило, очистить и пятно так же между процедурами, но ткани различных доноров имеют широко разное время очистки и качества морфологии тканей после очистки. Возможность использования архивных тканей может смягчить это ограничение, если одно может иметь надлежащий доступ к большое количество образцов пациента поджелудочной железы, хотя это не было тщательно расследовано. Было установлено, что протокол Пакт, сообщили здесь быть недорогим и легко реализовано со стандартным лабораторным оборудованием. Свободные образцы были пригодны для изображений через традиционные confocal микроскопии, а также 2-Фотон и Lightsheet технологий и предоставляет высокое разрешение 3D изображения нервов и островков в больших разделах человека поджелудочной железы. Будущего применения этой процедуры включают в себя исследования на развитие плода поджелудочной железы эндокринной и экзокринной отсеков и островок исследований типа 1 и типа 2 диабет.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Доктор Энн фу и Джозеф Canzano для оказания технической помощи, д-р Дженнифер Treweek за ценные советы и д-р Кристин Овертон и д-р Карл Deisseroth для обучения MCT через семинар Стэнфордского университета ЯСНОСТИ. JDRF nPOD и орган закупок организаций представили образцы тканей. Эта работа финансировалась JDRF (47-2014-1), Хэлмсли благотворительный фонд (HCT 2015-PG-T1D052) и TR001773 1OT2 NIDDK в MCT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | Buffers |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | S375-500 | PB buffer (RIMS) |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | 71507-250 | PB buffer (RIMS) |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | Immersion fixation, hydrogel, storage solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | Hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | Hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | Hydrogel |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | Clearing buffer |
| Sodium azide | Sigma | S8032 | Sample storage buffer |
| 18 gauge needles | Fisher | 14-840-91 | Degassing hydrogel solution |
| N2 tank | AirGas | various | Degassing hydrogel solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 100 ml | Buffers |
| Goat, normal serum | Vector | S-1000 | Use as 2% in blocking buffer |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | RIMS |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80827 | Imaging |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 710 | Imaging |
| LightSheet microscope | Zeiss | Z1 | Imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibody | |||
| CD45 | Bioss | bs-4820R-A488 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Did not work |
| CD45 | DAKO | M0754 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| GFAP | DAKO | Z0334 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | BD Biosciences | 565891 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | Cell Signaling | 2760S | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| Glucagon | Abcam | ab10988 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Insulin | DAKO | A0564 | Host: Guinea Pig Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| NCAM (CD56) | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| NCAM (CD56)-FITC conjugate | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Peripherin | EnCor | RPCA-Peri | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| PGP9.5 | DAKO | Z5116 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Secretogranin 3 | Sigma | HPA006880 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Smooth muscle actin | Sigma | A5228; C6198 (Cy5) | Host: Mouse Dilution: 1:200; 1:200 Comments: Worked; Conjugated worked better than unconjugated |
| Substance P | BioRad | 8450-0505 | Host: Rat Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Abcam | Ab76442 | Host: Chicken Dilution: 1:100 Comments: Worked, but weak staining |
| Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) | Immunostar | 20077 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| Vesicular Acetylcholine Transporter (VAChT) | Synaptic Systems | 139103 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Secondary Antibody | |||
| Guinea pig IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Mouse IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rat IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat, Donkey Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Chicken IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
References
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Orlich, M., Kiefer, F. A qualitative comparison of ten tissue clearing techniques. Histol Histopathol. , 11903 (2017).
- Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Curr Opin Biotechnol. 40, 193-207 (2016).
- Hsueh, B., et al. Pathways to clinical CLARITY: volumetric analysis of irregular, soft, and heterogeneous tissues in development and disease. Sci Rep. 7 (1), 5899 (2017).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
- Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Campbell-Thompson, M. Organ donor specimens: What can they tell us about type 1 diabetes? Pediatr Diabetes. 16 (5), 320-330 (2015).
- Kim, A., et al. Computer-assisted large-scale visualization and quantification of pancreatic islet mass, size distribution and architecture. J Vis Exp. (49), (2011).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
