Summary
本协议描述如何使用体外分离制剂来测量其眼球运动的运动学。大脑从颅骨切除后, 可以用电流刺激颅神经, 以量化眼睛的旋转和瞳孔大小的变化。
Abstract
在动物被安乐死后, 他们的组织开始死亡。海龟提供了一个优势, 因为他们的组织的生存时间较长, 特别是与热血脊椎动物相比。正因为如此, 在海龟体内进行的体外实验可以在较长时间内进行, 以调查神经信号和控制其目标动作。采用分离头制备方法, 测量了龟眼运动的运动学, 并对其进行了神经电信号调制。大脑从头骨中取出后, 将颅骨神经完整, 解剖头被放置在一个框架内以校准眼球运动。玻璃电极附着于颅神经 (动眼神经、滑车和展), 并以电流刺激以唤起眼球运动。我们用红外线视频跟踪系统和眼睛的量化旋转来监测眼球运动。电流脉冲的幅度, 频率, 和列车持续时间被用来观察对反应的影响。由于制剂与大脑分离, 进入肌肉靶的传出通路可以单独检查, 以便在没有中央处理的感官信息的情况下研究神经信号。
Introduction
在电生理实验中使用红耳滑块龟的基本原理:
红耳滑块龟 (Trachemys 龟线虫) 被认为是世界上最严重的入侵物种之一1 , 可以表明生态系统有问题。红耳滑块龟之所以如此成功的原因是很不清楚, 但它可能部分是由于他们的耐受生理和拥有的神经组织, 可以生存在缺氧条件下2,3,4.使用它们进行实验并不会威胁到他们的数量, 并以最小的努力, 电生理准备可以保持在延长的持续时间内可行, 只要18小时5,6。这种好处类似于使用无脊椎动物 (如小龙虾7) 的优势, 它也有能力抵御低氧水平的8。
眼球运动测量技术:
用非人类灵长类测量额眼动物眼球运动的方法得到了很好的发展9。眼睛在轨道旋转大约三个轴: 水平, 垂直和扭转。磁搜索线圈方法通常被认为是最可靠的测量旋转, 但侵入, 要求小线圈插入到动物的 scleras10,11。基于视频的系统也可以测量旋转, 具有非侵入性的优点。随着新的图像处理技术的发展, 增强了其功能, 使基于视频的系统成为考虑12、13、14的一种有吸引力的替代方案。
为测量 nonmammals 的眼球运动而开发的技术已经没有那么重要了。度量值要么是低分辨率, 要么仅描述部分旋转15、16、17、18。缺乏发展可以部分地归咎于训练 nonmammals 遵循视觉目标的困难。虽然眼球运动已在红耳滑块龟19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30, 由于训练动物跟踪目标的挑战, 他们的眼球运动的精确运动学是不好的理解。
红耳滑块龟一般被认为是侧眼脊椎动物, 但因为他们可以完全收回他们的头到他们的外壳31, 由甲壳的侧面视觉场显著闭塞发生32。结果是他们的视觉视线被逼向前方, 使它们的行为更像额眼哺乳动物。因此, 它们作为开发测量眼球运动方法的模型也提供了一个独特的进化视角。
本工作中描述的协议使用体外分离头准备, 以确定红耳滑块龟眼运动的运动学。大脑从头骨中解剖, 使脑神经完好无损。头部被放置在一个框架内, 以校准眼球运动, 并通过电刺激颅神经支配眼睛肌肉唤起反应。眼睛旋转的措施是由一个基于视频的系统, 使用软件算法, 跟踪黑暗的瞳孔和虹膜的标记。该制剂为测量眼外 (即、水平、垂直和扭转旋转) 的运动提供了一个机会:32和人工 (即, 瞳孔改变)33运动。
传出神经通路分析模型系统:
更普遍地说, 该方法为调查人员提供了一个机会, 研究传出神经信号如何产生眼球运动时, 肌肉从他们的放松状态开始, 并在缺乏综合感官信息处理的大脑32, 33。因此, 眼睛的运动学可以被检查在一个模型系统中, 他们是单独处理的传出神经通路离开大脑和 synapsing 到肌肉。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注: 红耳滑块龟, 男性和女性, 从供应商购买。海龟被安置在一个温暖的动物套房里, 里面有两个60加仑的浴缸, 装有砖群岛, 在 250 W 红外线灯下晒黑。环境保持在一个14/10 小时的光/暗循环, 水温在22摄氏度。灯在凌晨6:00 打开, 在下午8:00 关闭。装有过滤系统的坦克每周都被清理干净, 海龟每隔一天就被喂食ad 随意。对红耳滑块龟的护理和以下所描述的所有实验过程32,33是批准的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 在拉斐特学院。
1. 设备设置
- 准备龟铃的解决方案。按此顺序将以下内容添加到蒸馏水中: 氯化钠96.5 毫米 (58.44 克/摩尔), 氯化钾2.6 毫米 (74.56 克/摩尔), 氯化镁2.0 毫米 (203.31 克/摩尔), 碳酸氢钠31.5 毫米 (84.01 克/摩尔), 葡萄糖20.0 毫米 (180.16 克/摩尔), 浓缩盐酸调整 pH 值为 7.51, 氯化钙4.0 毫米 (110.98 克/摩尔) (见材料表)。在添加每个盐时混合溶液。
注意: 浓缩盐酸是危险的 (皮肤, 眼睛, 吸入和摄取危险)。 - 从5厘米长的毛细管玻璃 (参见材料表) 中, 通过对不同尺寸的内径进行火焰抛光, 以适应不同厚度的颅神经, 给出吸入电极的提示。
- 用一个小文件在一条毛细管玻璃上蚀刻一条线。放置在纸巾和打破一半。
- 慢慢地将毛细管玻璃的一端滚入本生燃烧器的火焰中。使用解剖范围和光纤光源定期检查刀尖的大小、平滑度和对称性 (请参阅材料表)。
注: 对于头部宽度介于20和30毫米之间的龟, 最佳拟合内径大小通常范围从0.4 到0.8 毫米为动眼神经神经 (nIII), 0.3 至0.6 毫米为滑车神经 (), 0.2 至0.4 毫米为展神经 (nVI)。
- 清洁和组织 Rongeurs, 钝解剖探针, microscissors, 细钳, 弯曲钳, 和刀柄与刀片 (见材料表) 的解剖。
注: 器械灭菌是可选的。
2. 麻醉和安乐死
- 把海龟放在冰桶里60分钟 cryoanesthetize。
- 弄死龟通过斩首使用一个小动物断头台 (见材料表)。
- 用小的称量铲轻轻地撬开动物的颚, 这样钩子就可以插入, 并在下颚尖下转动。
- 用稳定的压力拉动动物的头部通过断头台。迅速斩首的动物。
- 把放在解剖盘里。有足够的海龟手的解决方案, 以灌溉组织。Oxygenize 95/5% O2/CO2的解决方案 (请参见材料表)。
- 在盘子外面放置冰块, 保持4摄氏度的组织。
3. 解剖
- 利用解剖范围和光纤光源进行解剖。
- 取下下颌。在口腔中放置一个钝的解剖探针, 以提供更容易的头部处理。用手术刀把齿骨骨连接到颅骨上。用 rongeurs 把下颚从颅骨上拉出来。使用 rongeurs 的皮肤和肌肉从他们的附件在颅骨的背部和侧面区域。
- 取下脊椎柱。
- 识别颅骨尾部的椎柱。弯曲椎柱腹部以暴露脊髓。用 microscissors 剪脊髓。使用 rongeurs 从颅骨中取出椎柱和其他组织, caudally。
- 切断颅神经后从颅骨中取出大脑。
- 从孔大口径开始, 用 rongeurs 在背颅骨上切开两个切口。使伤口表面避免损害大脑下方。
- 用 rongeurs 小心拉下背颅骨。使用 microscissors 移除脑膜, 以暴露其余的大脑。删除足够的脑膜, 直到嗅球, 在前颅腔, 可以识别 (见图 1A)。如有必要, 继续用龟铃的解决方案来灌溉大脑。
- 使用弯曲钳轻轻拉大脑 caudally 和产生轻微的紧张的脑神经。小心地切断和删除的嗅觉灯泡和大脑与弯曲钳。
- 用 microscissors 轻轻地将中脑推向中线, 露出颅神经;nIII, 大约0.6 毫米, 可以看到在前的《圣经》, 和 nIII 的直径将略小于。在它们附加到中脑的地方剪切 nIII 和. 在另一侧重复此操作。
- 用 microscissors 切开左、右视神经 (nII)。然后将脑干倾斜到一侧。观察 nVI 从桥脑和髓质交界附近的腹面出现 (见图 1C);nVI 直径小, 约0.3 毫米左右 nVI。
- 用细钳和 microscissors 从龟中取出脑干的其余部分。一旦颅骨空了, 检查颅腔地板。确定 nIII、nVI 和。
- 用细钳和 microscissors 去除上、下眼盖。
4. 眼部运动的校准
- 使用刚性表 (请参阅材料表) 以支持框架和其他工具的放置。将放到框架卡盘中 , 使头部的背表面平行于地平线 , 用一个小气泡级在头骨上休息。大致定位在框架的水平和垂直旋转中心的眼睛之一。
- 将红外线摄像机安装在红外发光二极管 (LED) 上, 它是基于视频的眼球跟踪系统的一部分 (参见材料表), 距离龟眼大约12厘米。
- 把相机的角度看45度以上的眼睛视线。LED 应在11点位置时, 看相机镜头。将 LED 沿眼睛的光轴居中。相机将略微偏离轴 (从眼睛上方看)。
- 调整相机的距离从眼睛, 以便相机的看法是最大的填充眼球。确保眼睛的角 (canthi) 位于水平视图的边缘。
- 将摄像机连接到基于视频的眼睛跟踪系统来处理数据。将信号分割成 DVD 录音机以捕获原始视频。聚焦相机, 以获得清晰的眼睛图像。注意使用三度的线性调整 (x, y, z) 与框架提供的眼睛在相机视图的中心位置。
- 使用视频跟踪系统所提供的程序, 通过设置阈值和对比度来检测暗瞳孔。
- 使用鼠标, 点击 "视频" 菜单和 "模式" 选择 "高精度", 以捕获图像的采样率为30赫兹 (分辨率为640像素 x 480 线)。此外, 在 "视频" 下, 为 "瞳孔类型" 和 "椭圆 (旋转椭圆)" 选择 "暗瞳孔" 作为 "瞳孔分割法"。
- 在 "EyeCamera" 窗口中, 单击 "瞳孔搜索区域调整" 图标 (在中心有一个点的小垂直矩形)。使用鼠标拖动一个矩形来限制瞳孔周围的区域。避免可能与瞳孔混淆的暗区域。
- 在 "控件" 窗口中, 确认选中 "自动图像" 和 "正锁阈值跟踪" 框。单击 "自动阈值" 以优化扫描的密度, 这将显示为暗瞳孔上的绿色点。
- 校准视频显示的眼睛跟踪程序, 以旋转的框架12.5 ° (+/-) 围绕其水平轴和10° (+/-) 围绕其垂直轴。
- 在 "控件" 窗口中, 单击 "显示"。检查框中的 "凝视" 和 "传感" 的 "凝视点", "校验地区", 和 "几何网格"。在检查 "几何网格" 下的方框后, 会弹出一个窗口, 并说 "刺激显示几何必须在几何网格显示之前进行测量。你想现在这样做吗？为 "是" 选择 "Y"。
- 使用鼠标, 点击 "窗口" 菜单, 并选择 "刺激"。"刺激" 窗口将打开显示一个垂直和水平线交叉在中心的显示屏。将线条的长度测量到最近的 mm. 按键盘上的 "Esc" 退出 "刺激" 窗口。
- 使用鼠标, 点击 "刺激" 菜单, 并选择 "几何设置"。输入刚刚测量过的线条的长度。调整查看距离, 使水平线的度数/线等于25°, 垂直线的20°。单击 "存储" 按钮并关闭窗口。
- 在 "EyeSpace" 窗口中, 选择 "数据点" 的校准次数为 "9"。当海龟的眼睛定位在中心, 点击中心数据点, 并点击 "重新出现" 按钮。
注: "刺激" 窗口将打开, "准备就绪" 将出现在屏幕的中心。一个框将出现在中心位置, 然后消失。在它消失后, "刺激" 窗口将关闭。中心位置现在应该校准。 - 通过旋转框架右/左, +12.5 °/-12.5 °, 向上/向下 +10 °/-10 °来校准剩余的数据点, 重复该过程。
- 为了校准扭转旋转, 请使用基于视频的眼睛跟踪程序所提供的模板拟合算法。该算法根据虹膜的标记设置零位置, 并计算当标记从瞳孔质心偏移时的旋转角度。
- 使用鼠标指针, 点击 "窗口" 菜单, 并选择 "扭转"。单击 "扭" 窗口中的 "开始" 按钮。在 "EyeCamera" 窗口中, 将在眼睛的图像上显示一个弧线。
- 在虹膜中存在不规则标记的位置, 使用滑块调整圆弧的半径、角度和长度。选中 "实时图形" 和 "调整后自动设置" 框。如有必要, 调整 "控件" 窗口中的亮度和对比度, 并重新阈值暗瞳孔 (请参见步骤 4)。单击 "设置模板" 按钮。
- 将标尺放在与瞳孔相同的焦距平面上, 并记录完整相机视图的宽度。该值稍后将用于确定瞳孔的实际宽度。
5. 吸入电极在颅神经上的定位以唤起眼球运动
- 小心地放置一个针参考电极到连接或肌肉组织留在头部。
- 将吸入电极 (参见材料表) 置于颅神经上, 使用机器人和解剖范围安装在臂上。使用光纤光源来查看和引导放置。
- 将神经的大小与毛细管玻璃尖相匹配。尝试和错误是必要的, 以获得一个最好的配合周围的神经直径 (见步骤1.2 的大小建议)。将玻璃尖放到吸入电极上。填充吸入电极与响铃的解决方案, 并调整在注射器内的体积约一半的能力。
- 小心地移动电极的玻璃尖端使用机器人到一个位置在选定的神经的切口之上。确保铃声的解决方案填满头骨, 尖端在其表面下方。如有必要, 使用建模粘土来筑坝, 使铃声的溶液从颅骨漏出。
- 拉回注射器的柱塞。
注意: 真空会将神经吸收到毛细管尖端的末端。一个良好的配合是指的神经留在尖端, 很少或没有额外的真空应用。
6. 刺激颅神经及眼球运动分析
- 使用具有当前隔离装置的一般用途神经/肌肉刺激器 (请参阅材料表) 通过吸入电极刺激颅神经。
- 使用电缆将吸入电极连接到当前隔离装置。将引线从 pin 参考电极连接到隔离装置的接地连接。
- 使用刺激器和隔离装置上的刻度盘和开关选择电流的参数。使用的电流范围从1到100µA, 频率为10到400赫兹. 使用1或2毫秒的脉冲在列车持续 100, 500, 或 1000 ms。
- 记录刺激的时间。
注: 晶体管-晶体管-逻辑 (TTL) 脉冲与从刺激器的电流传递同步, 并通过电缆实时通信, 以视频为基础的眼球跟踪系统的输入通道。一个软件模块提供了与视频为基础的眼睛跟踪程序控制通信。- 要可视化当前应用程序的时间及其对眼球运动的影响, 请单击 "PenPlots" 菜单。选择 "x 凝视位置"、"Y 凝视位置"、"扭转" 和 "瞳孔宽度", 显示用于 X 和 Y 眼睛位置、扭转和瞳孔宽度的实时原始数据地块。还可以从 "PenPlots" 菜单中选择 "秒 & 标记", 以显示带有刻度线的计时图, 该图形以1秒的间隔显示。
注: 大写字母 "T" 将出现, 标记 TTL 脉冲的开始, 同时与当前应用程序一起发生。 - 要存储由电流诱发的眼球运动数据, 请单击 "文件" 菜单, 然后在 "数据" 下选择 "新数据文件"。输入一个文件名, 然后按 "Enter"。保存数据可以暂停, 然后使用键命令 ("Ctrl" + "p") 组合重新启动。实验会话完成后, 在 "数据" 下选择 "关闭数据文件" 菜单。
- 要帮助跟踪应用的电流类型, 请单击 "窗口" 菜单并选择 "数据垫"。将出现 "键盘/DataMarker" 窗口。点击一个字母或一个数字, 以确定当前刺激被传递到神经的参数。
注: 例如, "x" 可以代表10µA. 单击 "x" 可将其输入实时存储到数据文件中, 用于即席分析。它也出现在 "PenPlot" 为持续观察的 "秒 & 标记"。
- 要可视化当前应用程序的时间及其对眼球运动的影响, 请单击 "PenPlots" 菜单。选择 "x 凝视位置"、"Y 凝视位置"、"扭转" 和 "瞳孔宽度", 显示用于 X 和 Y 眼睛位置、扭转和瞳孔宽度的实时原始数据地块。还可以从 "PenPlots" 菜单中选择 "秒 & 标记", 以显示带有刻度线的计时图, 该图形以1秒的间隔显示。
- 分析眼部追踪系统的数据。
- 以文本分隔格式打开保存的数据文件, 并将其设置为一个可供选择的跨页程序, 以便组织数据并进行统计分析。
- 将文件中存储的瞳孔宽度值转换为实际大小 (mm)。
- 将 X 和 Y 眼睛位置和 torsions 的值转换为度数单位, 并使用约定来描述眼球运动;因此, 旋转的正方向: intorsion、仰角和内收;和负面的旋转方向: extorsion, 抑郁症和诱拐。
- 将页眉信息复制到新工作表中。这将包括屏幕大小 (宽度和高度) 和查看距离的值。以30赫兹速率收集的八列数据将跟随标题信息。
- 返回包含原始数据的工作表。在标题为 "标记" 的最后一栏中, 为 "X" 做一个 "查找", 以找到刺激应用于10µA 的位置. 发现 "T" 的发病率, 标志着当前刺激的开始。复制15行 (0.5 s) 的数据发生在 "t" 和90帧之后的 "t" (3.0 s);即, 3.5 的总计。将新工作表中的数据粘贴到页眉信息下。
- 在 "PupilWidth" 之后插入一个空列。在空白列中, 转换为 mm 的校准尺寸:
水平瞳孔直径 = "PupilWidth" x 相机视图宽度的尺寸 - 在 "X_Gaze" 和 "Y_Gaze" 之后插入2个空列。将位置正常化为查看屏幕的尺寸: 坐标 (0, 0), 在屏幕左上角延伸到 (1, 1) 在右下角。在第一个空白列中, 将位置转换为在屏幕中心有 (0、0) 的坐标系。包括转换到屏幕尺寸的 mm:
X = (0.5 x 宽度) – ("X_Gaze" x 宽度);Y = (0.5 x 高度) – ("Y_Gaze" x 高度)
注意: 手术顺序为左眼。该序列将需要逆转的右眼, 以便遵循的反绑架和积极的内收的公约。 - 在第二列中, 使用三角函数转换成角度 (°) 旋转:
水平旋转 = arctan (X/查看距离); 垂直旋转 = arctan (Y/查看距离) - 扭转已经显示单位的程度, 但要符合 intorsion 的积极性, 如果测量是在左眼, 乘以-1。对于右眼, 不需要乘法。程序代码顺时针旋转为正值。
- 绘制瞳孔直径和旋转作为时间的函数。
- 以文本分隔格式打开保存的数据文件, 并将其设置为一个可供选择的跨页程序, 以便组织数据并进行统计分析。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
图 1显示从描述解剖的视频中拍摄的图像的剧照。图像提供的神经的典型位置之前, 从大脑切割。
图 1: 从解剖视频中捕捉到的图像的剧照, 以显示视神经 (nII)、动眼神经 (nIII)、滑车神经 (展) 的位置, 以及神经 (nVI).(A) 图像, 在删除脑膜后带有标记的大脑区域。白色刻度条 = 10 毫米 (B) 图像显示了 nII、nIII 和 a 的位置, 它们连接到中脑的右侧 (在除去嗅觉灯泡和大脑之后)。(C) 图像显示 nVI 的位置, 它连接到脑干的左侧 (在中脑切除后)。在神经周围绘制白色虚线。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2显示了刺激 nIII 后瞳孔直径的平均值变化。虽然外在眼睛运动也被观察, 改变学生的位置, 行动的措施由虹膜的括约肌瞳孔保持可靠。措施是从一个准备和显示典型的可变性对反复的当前刺激反应。平均瞳孔直径从1.95 到0.01 毫米减少到 1.60 @ 0.01 毫米。狭窄的标准偏差表明电极对神经的成功配合。当测量在不同的准备 (N = 5), 典型的可变性是0.08 毫米。虽然仍然相对狭窄, 但其价值大约是单个制剂所观察到的变异的八倍。
图 2: 在全头准备过程中刺激动眼神经 (nIII) 诱发瞳孔收缩的例子.黑迹是平均瞳孔直径 (PD) 从六刺激在一个准备, 虚线显示 "标准偏差 (SD)"。x 轴上的矩形波形表示100赫兹的1毫秒脉冲的起始和偏移量, 其振幅为50µA。左下角的草图显示了在刺激之前眼睛中虹膜线的方向, 而底部的图像显示在 (a)、(B) 和刺激之后 (C) 之前的典型试验中仍然有框架。白色刻度条 = 1 毫米。此数字已在权限33中重印。请单击此处查看此图的较大版本.
瞳孔反应的测量不需要校准眼轮;但是, 如果测量外部运动, 则必须仔细地在框架中放置头部, 以允许在准备工作中进行比较 (图 3)。当头部被放置在与地平线平行的头骨背面的框架内时, 虹膜线会从地平线偏移到鼻孔。图 3D显示了准备过程中的典型偏移量 (28.6°)。对于三种不同的制剂, 平均偏移量为 30.1 9.0°。标准偏差内的偏移角度表示框架内可接受的配合。
图 3 : 位于框架内的独立准备 .(A) 白色矩形区域在设备设置的照片中显示的位置。(B) 放大的白色矩形视图 (七倍)。从鼻孔到瞳孔中心的图像上画点白色线, 与地平线水平。固体白线叠加和平行的虹膜线。(C) 动画的头部左侧。(D) 由视频跟踪系统的照相机捕获的眼睛的图像。黑色刻度条: B中的5毫米;D中的1毫米。此数字已使用权限32进行了修改。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4显示了十个准备工作所诱发的眼睛的平均旋转, 这是由于对上斜肌的刺激而引起的。典型的峰值旋转为 intorsion, 海拔和绑架 (在响应70µA, 橙色跟踪) 是 10.0 5.7°, 2.8 1.2°, 3.0 2.1°, 分别。对重复刺激的单次准备旋转的测量量是相似的, 但不变性 (例如, N = 5), 14.8 1.0°为 intorsion, 3.2 0.2°海拔, 2.4 0.2°为绑架。不同制剂间的多变性模式与单一制剂相比 (在一个对数单位内) 与观察到的瞳孔变化的测量结果比较: 对 intorsion 和海拔高度的6倍, 更大的11倍绑架。
图 4: 在10个准备工作 (六应用于左侧和四应用于右侧, 五个测试为每一个), 刺激左滑车神经后诱发的平均眼球旋转 (500 ms 100 赫兹列车 2 ms 脉冲).底部图的 x 轴上的矩形波形表示刺激的时间。左、右眼的反应并无显著差异。Intorsion 是伴随着海拔和绑架 (见上面的卡通的头上的看法, 龟, 其箭总结的组成部分的眼睛运动)。眼球运动振幅大致相当于七的电流振幅 (参见 "图例" 框中的代码)。此数字已在权限32中重印。请单击此处查看此图的较大版本.
与 nIII 相比, 这只限于高级斜肌, nVI 支配多肌肉, 所以运动更具挑战性的解释。所产生的眼球运动取决于所招聘的马达单位 (图 5) (请参见讨论)。因此, 从准备到准备的可变性可能变得很重要。例如, nVI 会唤起 intorsion、提升和诱拐 (图 5C)。绑架可能是由运动单位促进侧直肌的作用;intorsion 和海拔的结果, 而不是其他电机单位去的目标, 如牵引眼球或瞬膜。
图 5: 在100个准备工作中, 通过刺激三颅神经与10、50、400和四赫兹列车诱发的平均眼球运动反应.所有的刺激列车的持续时间为500毫秒, 包括2毫秒的脉冲, 振幅为70µA, 高于阈值。眼球运动显示为以前, 列A-C分别显示对 nIII、nVI 和的刺激的响应。此数字已在权限32中重印。请单击此处查看此图的较大版本.
由于 nIII 支配几个靶点 (直肌、下直肌、下斜、内侧直肌、括约肌瞳孔), 诱发运动的分析是最复杂的。对于图 5A中显示的示例, 将发生 extorsion、引用和提升。在此基础上, 合理的解释是, 这些动作大多是从下斜向内侧直肌的可能贡献。直肌和下直肌可相互抵消。nIII 的行动的更高的可变性可能起因于神经的更大分支和切口的位置为适合电极。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
关键步骤:
本议定书内的关键步骤如下: 1) 解剖和护理, 以保持横断神经的生存能力;2) 将吸入电极大小与颅神经匹配, 提供一致的反应;3) 将头部放置在框架内, 为眼睛的旋转提供适当的校准。
故障 排除：
解剖可能具有挑战性, 但在完成了几次之后, 这些步骤就应该变得相对笔直。如果神经出现不反应, 最可能的原因是解剖失败。在大脑的切除过程中, 只有最小的紧张和压力应用于神经切割过程中。用金属手术器械接触神经也应尽可能避免, 因此如果麻烦持续34, 玻璃挂钩和塑料钳可以替代金属工具。虽然龟组织有能力生存可变水平的氧气, 使用新鲜作出龟响铃的解决方案冒泡与 95/5% O2/CO2和冷冻是可取的;然而, 这并不那么重要。毕竟, 使用准备的优点是在不同的氧水平和温度波动下的生存能力2,3,4,35。更重要的是定期灌溉的准备与龟铃的解决方案, 以避免干燥的组织。
在进行实验之前, 为吸入电极制作一组不同尺寸的小贴士, 可以提高神经的良好配合几率。类似解剖, 火抛光的提示需要一些实践。保持头部与神经从先前的实验和使用它作为参考, 而使提示可以帮助。从小到大直径的大小, 并将它们存储在一些建模粘土上, 可以在实验中快速拟合。对于较小的提示, 需要更多的时间滚动提示到火焰。提示应该是没有裂缝, 并拥有平滑的边缘, 以允许一个良好的密封上的神经。
在框架中, 头的方向必须足够。如果没有, 测量轴将会倾斜。例如, 向右旋转大于左侧相同的增量, 表示眼睛的中心被偏移, 需要向右移一转。在旋转过程中, 保持来自瞳孔的可靠信号也会出现一些问题。用红外线 LED 来调节瞳孔的光照可以帮助取得更好的效果。
限制：
准备工作的缺点是很难识别出特定肌肉动作的运动学。这对于在 nIII 和 nVI 刺激后测量的运动尤其如此。解决个体肌肉活动的一个方法是对神经分支进行系统的 transections, 以隔离通向特定肌肉的通路。例如, 我们已经成功地切割 nIII 远端的睫状神经节和刺激短纤毛, 以隔离括约肌的行动瞳孔33,36。另一种方法是在激动剂和拮抗肌肉上安装应变测量系统, 然后与特定肌肉的活动相对应的运动37,38 。对于这种方法, 隔离一条通向特定肌肉的通路是不必要的。
该制剂还允许在相应的肌肉 (例如, 侧直肌与内侧直肌, 或括约肌扩张与括约肌的相反方向上的粘弹性元素相关的被动伸展作用瞳孔)39。为了分析粘弹性元素, 这里所描述的刺激横断神经所获得的反应可以与使用皮层区和小脑的制备方法进行比较;因此, 这使功能性神经集成商完好无损, 然后有可能刺激单个运动神经区域内的脑干支配每个肌肉40。
对其他脊椎动物模型的意义:
虽然 cryoanesthesia 是可以接受的海龟, 这种方法不能批准与工作的热血动物41,42。因此, 有必要以戊巴比妥或氯胺酮等药理制剂。然而, 代理混淆眼球运动43。尽管如此, 这种方法对于爬行动物是有用的, 可以应用于其他的眼侧眼睛非哺乳动物, 如两栖动物和鱼44,45, 因为它允许比较独立传出神经产生的行为路径, 由完整的动物32,33所做。
未来应用:
该制剂可作为神经组织生存能力的一种检测方法。一个协议可以被设计来系统地处理各种因素如何影响眼球运动。方法可以是简单的测试不同的温度或药理剂, 包括止痛药。因为运动更难解释为 nIII 和 nVI, 他们的使用是更有限的。因此, 《圣经〉可能是操纵的最佳选择。
然而, 为了解决单个肌肉运动学的刺激 nIII 和 nVI, 修改的准备将是必要的, 如使神经分支的系统切断, 或包括应变仪的靶向肌肉集合。最后, 在神经集成商保持完好的准备过程中测量反应, 能够确定粘弹性元素如何可能限制运动学的 quantifications。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢波莱特和丽莎 Pezzino 在这项研究中为秘书提供支持, 菲尔奥尔巴赫先生为技术支持。作者还感谢 Drs 和迈克尔. 琼斯 (圣路易斯大学医学院) 介绍我们到体外孤立的头部准备。支持这一合作的资金是由生物学系 (罗伯特-s 大通基金)、学术研究委员会和拉斐特大学的神经科学项目提供的。最后, 这项工作献给2016年9月28日去世的菲尔奥尔巴赫先生;他退役了扫描电子显微镜, 并确认其5轴阶段的用处, 以便在本议定书中使用。他的友谊和足智多谋将被大大地怀念。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red-eared slider turtles | Kons Scientific | Trachemys scripta elegans | Large size (carapace length 15-20 cm) |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5886 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | P5405 | |
| Magnesium choride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | M7304 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5761 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C5767 | |
| Concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich Co. LLC. | H7020 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C7902 | |
| pH meter | Oakton | pH 6+ | |
| Suction stimulation electrode | A-M Systems | 573000 | Bipolar suction electrode. Note that 573000 has been replaced with 573050. |
| Capillary glass | A-M systems | 626000 | Single-barrel borosilicate capillary glass without microfilament, length 10 cm, outside diameter 1.0 mm, inner diameter 0.50 mm |
| Alternative suction stimulation electrode | A-M Systems | 573050 | Bipolar suction electrode. Requires larger diameter capillary glass: 627000, outside diameter 1.2 mm, inner diameter 0.68 mm |
| Stereoscope | Lieca | GZ7 | Magnification range, 10x – 70x |
| Fiber optic light source | Amscope | HL250-A | 150W Fiber optical microscope illuminator light box |
| Rongeurs | Carolina Biological Supply Company | 625654 | stainless steel, straight spring, 5.25" |
| Blunt dissection probe | Carolina Biological Supply Company | 627405 | Huber mall probe, double-ended probe and seeker, 6" |
| Microscissors | Carolina Biological Supply Company | 623555 | Iris microdissecting scissors, stainless steel, 0.5" blades, 4.75" long |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich Co. LLC. | F6521 | Jewelers forceps, dumont No. 5, inox alloy, 4.25" |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich Co. LLC. | Z168696 | Medium tip, curved forceps, stainless steel, 4" |
| Scalpel handle | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2896 | Scalpel handles, No. 3, stainless steel |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2771 | Scalpel blades, No. 11, steel |
| Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1918 | Kleine guillotine type 7575 |
| Spatula | Sigma | Z648299 | Micro spoon and spatula weighing set. Use small spatula: 5.9” long x 0.07” diameter handle with square end: 0.17” x 1.3” long, other end round: 0.17” x 1.27” long |
| Hook | Autozone | 98069 | SureBilt hook and pick set. Use grinder to dull sharp points of hook to prevent injury to animals mouth. |
| 95/5% O2/CO2 | Airgas, Inc. | X02OX95C2003102 | 5% Carbon dioxide balance oxygen certified standard gas mixture, size 200 Cylinder, CGA-296 |
| Regulator | Airgas, Inc. | Y11244D296-AG | Single stage brass 0-100 psi analytical cylinder regulator CGA-296 with needle outlet. Use brass adjustable airline pipe valve to go from 3/8", inner diameter, vinyl airline tubing connected to regulator to a 3/16", inner diameter, airline connection going to airstone or glass pasteur pipette. |
| Adjustable airline pipe valve | Doctors Foster and Smith | CD-12061 | Brass valve |
| Rigid table | Unknown | Unknown | Auto-clave door laid on top of a sturdy table. Nine 5" diameter tennis balls isolate vibrations from the top surface of the table. |
| 5" tennis ball | Petco Animal Supplies, Inc. | 712868 | Petco Jumbo Pet Tennis Ball: balls are unsliced and held within an integrated frame on the underside part of the autoclave door. |
| Alternative vibration isolation table | Newport Corporation | INT1-36-6-N | Rigid vibration control system, integrity 1: Surface dimensions, 3' x 6' |
| Gimbal | ISI, International Scientific Instruments, Inc. | Stage from SUPER III-A Scanning EM | 5-axis eucentric stage: X, Y, and Z linear movements, ±20 mm, 0.1 mm precision; Rotations, vertical, ±10°, and horizontal, ±12.5°, with 1.25° precision. Note: from decommission instrument. |
| Chuck for gimbal | Unknown | Unknown | Chuck from an old microtome of unknown manufacture was machined to fit the shaft of the specimen holder of the Scanning EM stage |
| Alternative gimbal | ThorLabs, Inc. | GN2/M with MBT602/M | Dual-axis goniometer (GN2/M) mounted on 3-axis microblock stage with thumbscrew adjusters (MBT602/M): design a chuck to hold turtle head with eye at 12.7 mm above top surface of goniometer (distance to point of rotation) |
| Video-based eye tracking system | Arrington Research, Inc. | ViewPoint EyeTracker, PC-60 | Tracking method: Infrared video by dark pupil; Black and white camera (Item BC02): 30 Hz, 640 x 480; System requirements: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Visual range: Horizontal +/- 44°; vertical +/- 20°; Accuracy ~0.5°; Spatial resolution ~0.15°; Pupil size resolution ~0.03 mm; Eye data: X, Y position of gaze, pupil height and width, torsion, delta time, total time, and regions of interest (ROI); Real-time communication (Item 0022): 4-Channel AnalogOut with eight TTL input channels to mark codes into the data file |
| Multi-position magnetic base | Harbor Freight Tools | Pittsburg, item #5645 | Magnetic holder reaches up to 12" and produces 45 lbs. of magnetic pull. Use to position camera. Machine thread holes onto the end of the rod to mount cameras. |
| Micromanipulator | Kopf | 900 | 5 axis manipulation for mount of suction electrode: X, Y, Z linear travel, 2 axis of rotation |
| Dissection scope on boom | Lieca | GZ6 | Magnification range, 6.7x – 40x |
| Nerve/muscle stimulator | Astro-Med Grass Telefactor | Grass S88 | Dual pulse voltage stimulator: two output channels that can be operated independently or synchronized to generate non-isolated constant voltage pulses (10 mv to 150 V). Pulses can be single (10 μsec to 10 sec), repetitive (0.01 Hz to 1 KHz), and trains (1 ms to 10 s) and synchronized with TTL inputs and output. Send TTL outputs via the output channels of a DB25 connector to the TTL input channels of the ViewPoint EyeTracker. Note: Astro-Med Grass Telefactor is no longer in business. |
| Current isolation device | Astro-Med Grass Telefactor | PSIU6 | Current stimulus isolation unit: enables safe delivery of constant currents by the S88 to the preparation. The PSIU6 connects by a BNC cable to one of the output channels of the S88. Multiplier switches on the PSIU6 allow the S88 to generate a wide array of current amplitudes ranging from 0.1 µA to 15 mA. |
| Alternative nerve/muscle stimulator with isolation | A-M Systems | 2100 | Isolated Pulse Stimulator: Unit has built-in isolator to produce constant currents. |
References
- Kikillus, K. H., Hare, K. M., Hartley, S. Minimizing false-negatives when predicting the potential distribution of an invasive species: A bioclimatic envelope for the red-eared slider at global and regional scales. Anim Conserv. 13, 5-15 (2010).
- Lutz, P. L., Rosenthal, M., Sick, T. J. Living without oxygen: turtle brain as a model of anaerobic metabolism. Mol Physiol. 8, 411-425 (1985).
- Lutz, P. L., Milton, S. L. Negotiating brain anoxia survival in the turtle. J Exp Biol. 207, 3141-3147 (2004).
- Storey, K. B. Anoxia tolerance in turtles: Metabolic regulation and gene expression. Comp Biochem Physiol A-Mol Integr Physiol. 147 (2), 263-276 (2007).
- Granda, A. M., Dearworth, J. R., Subramaniam, B. Balanced interactions in ganglion-cell receptive fields. Vis Neurosci. 16, 319-332 (1999).
- Dearworth, J. R., Granda, A. M. Multiplied functions unify shapes of ganglion-cell receptive fields in retina of turtle. J Vis. 2 (3), 204-217 (2002).
- Nesbit, S. C., Van Hoof, A. G., Le, C. C., Dearworth Jr, J. R. Jr Extracellular recording of light responses from optic nerve fibers and the caudal photoreceptor in the crayfish. J Undergrad Neurosci Educ. 14 (1), A29-A38 (2015).
- McMahon, B. R. Respiratory and circulatory compensation to hypoxia in crustaceans. Resp Phsiol. 128 (3), 349-364 (2001).
- Leigh, R. J., Zee, D. S. The neurology of eye movements. , 3rd edition, Oxford University Press. New York. (1999).
- Robinson, D. A. A method of measuring eye movement using a scleral search coil in a magnetic field. IEEE Trans Biomed Eng. 10, 137-145 (1963).
- Judge, S. J., Richmond, B. J., Chu, F. C. Implantation of magnetic search coils for measurement of eye position: an improved method. Vis Res. 20, 535-538 (1980).
- Ong, J. K. Y., Halswanter, T. Measuring torsional eye movements by tracking stable iris features. J Neurosci Meth. 192, 261-267 (2010).
- Kimmel, D. L., Mammo, D., Newsome, W. T. Tracking the eye non-invasively: simultaneous comparison of the scleral search coil and optical tracking techniques in the macaque monkey. Front Behav Neurosci. 6 (49), 1-17 (2012).
- Otero-Millan, J., Roberts, D. C., Lasker, A., Zee, D. S., Kheradmand, A. Knowing what the brain is seeing in three dimensions: A novel, noninvasive, sensitive, accurate, and low-noise technique for measuring ocular torsion. J Vis. 15 (14), 1-15 (2015).
- Demski, L. S., Bauer, D. H. Eye movements evoked by electrical stimulation of the brain in anesthetized fishes. Brain Behav Evol. 11, 109-129 (1975).
- Gioanni, H., Bennis, M., Sansonetti, A. Visual and vestibular reflexes that stabilize gaze in the chameleon. Vis Neurosci. 10, 947-956 (1993).
- Straka, H., Dieringer, N. Basic organization principles of the VOR: lessons from frogs. Prog Neurobio. 73 (4), 259-309 (2004).
- Voss, J., Bischof, H. -J. Eye movements of laterally eyed birds are not independent. J Exp Biol. 212 (10), 1568-1575 (2009).
- Ariel, M. Independent eye movements in the turtle. Vis Neurosci. 5, 29-41 (1990).
- Ariel, M., Rosenberg, A. F. Effects of synaptic drugs on turtle optokinetic nystagmus and the spike responses of the basal optic nucleus. Vis Neurosci. 7, 431-440 (1991).
- Balaban, C. D., Ariel, M. A "beat-to-beat" interval generator for optokinetic nystagmus. Biol Cybern. 66, 203-216 (1992).
- Keifer, J. In vitro eye-blink reflex model: Role of excitatory amino acid receptors and labeling of network activity with sulforhodamine. Exp Brain Res. 97, 239-253 (1993).
- Keifer, J., Armstrong, K. E., Houk, J. C. In vitro classical conditioning of abducens nerve discharge in turtles. J Neurosci. 15, 5036-5048 (1995).
- Rosenberg, A. F., Ariel, M. A model for optokinetic eye movements in turtles that incorporates properties of retinal slip neurons. Vis Neurosci. 13, 375-383 (1996).
- Ariel, M. Open-loop optokinetic responses of the turtle. Vis Res. 37, 925-933 (1997).
- Anderson, C. W., Keifer, J. Properties of conditioned abducens nerve responses in a highly reduced in vitro brainstem preparation from the turtle. J Neurophysiol. 81, 1242-1250 (1999).
- Keifer, J. In vitro classical conditioning of the turtle eyeblink reflex: Approaching cellular mechanisms of acquisition. Cerebell. 2, 55-61 (2003).
- Zhu, D., Keifer, J. Pathways controlling trigeminal and auditory nerve-evoked abducens eyeblink reflexes in pond turtles. Brain Behav Evol. 64, 207-222 (2004).
- Jones, M. S., Ariel, M. The effects of unilateral eighth nerve block on fictive VOR in the turtle. Br Res. 1094, 149-162 (2006).
- Jones, M. S., Ariel, M. Morphology, intrinsic membrane properties, and rotation-evoked responses of trochlear motoneurons in the turtle. J Neurophysiol. 99 (3), 1187-1200 (2008).
- Krenz, J. G., Naylor, G. J. P., Shaffer, H. B., Janzen, F. J. Molecular phylogenetics and evolution of turtles. Mol Phylogenet Evol. 37 (1), 178-191 (2005).
- Dearworth, J. R. Jr, et al. Role of the trochlear nerve in eye abduction and frontal vision of the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Comp Neur. 52, 3464-3477 (2013).
- Dearworth, J. R. Jr, et al. Pupil constriction evoked in vitro by stimulation of the oculomotor nerve in the turtle (Trachemys scripta elegans). Vis Neurosci. 26, 309-318 (2009).
- Mead, K., et al. IFEL TOUR: a description of the introduction to FUN electrophysiology labs workshop at Bowdoin College, July 27-30, and the resultant faculty learning community. J Undergrad Neurosci Educ. 5, A42-A48 (2007).
- Jackson, D. C., Ultsch, G. R. Physiology of hibernation under the ice by turtles and frogs. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 313 (6), 311-327 (2010).
- Romano, J. M., Dearworth, J. R. Jr Pupil constriction evoked by stimulation of the ciliary nerve in the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Penns Acad Sci. 85, 4-8 (2011).
- Miller, J. M., Robins, D. Extraocular-muscle forces in alert monkey. Vis Res. 32, 1099-1113 (1992).
- Gamlin, P. D., Miller, J. M. Extraocular muscle motor units characterized by spike-triggered averaging in alert monkey. J Neurosci Meth. 204, 159-167 (2011).
- Quaia, C., Ying, H. S., Optican, L. M. The Viscoelastic properties of passive eye muscle in primates. III: Force elicited by natural elongations. PLOS ONE. 5, A236-A254 (2010).
- Anderson, S. R., et al. Dynamics of primate oculomotor plant revealed by effects of abducens microstimulation. J Neurophys. 101, 2907-2923 (2009).
- Maxwell, J. H. Anesthesia and surgery. Turtles: Perspective and Research. Harless, M., Morlock, H. , Wiley. New York. 127-152 (1979).
- AVMA Panel on Euthanasia. American Veterinary Medical Association. J Am Vet Med Assoc. 218 (5), 669-696 (2001).
- Clarke, R. J. Shaping the pupil's response to light in the hooded rat. Exp Br Res. 176, 641-651 (2007).
- Bennett, R. A. A review of anesthesia and chemical restraint in reptiles. J Zoo Wild Med. 22 (3), 282-303 (1991).
- Bickler, P. E., Buck, L. T. Hypoxia Tolerance in Reptiles, Amphibians, and Fishes: Life with Variable Oxygen Availability. Ann Rev Physiol. 69, 145-170 (2007).
