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Neuroscience

नेत्र कीनेमेटीक्स द्वारा मापा इन विट्रो कछुए में कपाल नसों की उत्तेजना

Published: June 2, 2018 doi: 10.3791/56864
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biology and Neuroscience Program, Lafayette College, 2Department of Information Technology, Computer Science, and Digital Media, Juniata College

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे का उपयोग करने के लिए एक इन विट्रो अलग कछुआ सिर तैयार करने के लिए उनकी आंख आंदोलनों के कीनेमेटीक्स उपाय । cranium से मस्तिष्क को हटाने के बाद, कपाल नसों धाराओं के साथ प्रेरित किया जा सकता है आंख और पुतली आकार में परिवर्तन के घुमाव मात्रा ।

Abstract

जानवरों के euthanized के बाद, उनके ऊतकों मरने लगते हैं । कछुए क्योंकि गर्म खून रीढ़ की तुलना में, खासकर जब उनके ऊतकों का एक लंबे समय तक जीवित रहने का एक लाभ प्रदान करते हैं । इस वजह से, इन विट्रो में कछुओं में प्रयोग समय की विस्तारित अवधि के लिए तंत्रिका संकेतों और उनके लक्ष्य कार्यों के नियंत्रण की जांच के लिए किया जा सकता है । एक अलग सिर तैयारी का उपयोग करना, हम कछुए में नेत्र आंदोलनों के कीनेमेटीक्स मापा, और बिजली के संकेतों से उनके मॉडुलन कपाल नसों द्वारा किए गए. खोपड़ी से मस्तिष्क निकाले जाने के बाद कपाल की नसों को ज्यों का त्यों छोड़ना पड़ा, उस विच्छेदित सिर को आँख आंदोलनों की जांच करने के लिए एक जिंबल में रखा गया । कांच इलेक्ट्रोड कपाल नसों से जुड़े थे (oculomotor, trochlear, और abducens) और आंख आंदोलनों पैदा करने के लिए धाराओं के साथ उत्तेजित. हम एक अवरक्त वीडियो ट्रैकिंग प्रणाली और आंखों के quantified घुमाव के साथ आंख आंदोलनों पर नजर रखी । आयाम, आवृत्तियों, और ट्रेन अवधियों की एक सीमा के साथ वर्तमान दालों प्रतिक्रियाओं पर प्रभाव का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया. क्योंकि तैयारी मस्तिष्क से अलग है, efferent मार्ग मांसपेशी लक्ष्य के लिए जा रहा अलगाव में जांच की जा सकती है केंद्रीय संसाधित संवेदी सूचना के अभाव में तंत्रिका संकेतन की जांच ।

Introduction

Electrophysiological प्रयोगों में लाल-कान स्लाइडर कछुए का उपयोग करने के लिए तर्क:

लाल-कान स्लाइडर कछुए (Trachemys scripta एलिगेंस), दुनिया के सबसे आक्रामक प्रजातियों में से एक माना जाता है1 और संकेत मिलता है कि एक पारिस्थितिकी तंत्र मुसीबत में है सकते हैं । कारण है कि लाल कान स्लाइडर कछुए तो सफल रहे है खराब समझ है लेकिन यह भाग में हो सकता है उनके सहिष्णु शरीर क्रिया विज्ञान और तंत्रिका ऊतकों कि hypoxic शर्तों के तहत जीवित रह सकते है के अधिकार के कारण हो2,3,4 . प्रयोग के लिए उनका उपयोग उनकी संख्या को खतरा नहीं है और ंयूनतम प्रयासों के साथ, electrophysiological तैयारी विस्तारित अवधि के दौरान व्यवहार्य रह सकते हैं, के रूप में लंबे समय के रूप में 18 घंटे5,6। लाभ invertebrate जानवरों जैसे बिठाते7, जो भी ऑक्सीजन के निम्न स्तर को झेलने की क्षमता है8के रूप में उपयोग करने का लाभ के समान है ।

नेत्र आंदोलनों को मापने के लिए तकनीक:

सामने आंख आंदोलनों को मापने के दृष्टिकोण-गैर मानव रहनुमाओं का उपयोग कर जानवरों आंखों अच्छी तरह से9विकसित किया गया है । क्षैतिज, ऊर्ध्वाधर, और मरोड़: आंख तीन अक्षों के आसपास की कक्षा में घूमता है । चुंबकीय खोज कुंडल विधि आम तौर पर माना जाता है rotations मापने के लिए सबसे अधिक विश्वसनीय है, लेकिन इनवेसिव, छोटे कुंडल की आवश्यकता के लिए पशुओं के scleras में डाला10,11। वीडियो आधारित प्रणालियों भी घुमाव उपाय कर सकते है और गैर इनवेसिव होने का फायदा है । अभिनव छवि प्रसंस्करण के साथ बेहतर कैमरों के विकास के लिए अपनी कार्यक्षमता में वृद्धि की है वीडियो बनाने आधारित प्रणालियों एक आकर्षक विकल्प के लिए12,13,14पर विचार करें ।

स्तनधारियों में नेत्र आंदोलनों को मापने के लिए विकसित तकनीक बहुत कम महत्वपूर्ण रहा है । उपाय या तो कम संकल्प कर रहे है या केवल घुमाव के कुछ वर्णन15,16,17,18। विकास की कमी को आंशिक रूप से प्रशिक्षण में कठिनाई पर दोषी ठहराया जा सकता है स्तनधारी दृश्य लक्ष्य का पालन करें । हालांकि नेत्र आंदोलनों अच्छी तरह से लाल-कान स्लाइडर कछुओं में अध्ययन किया गया है19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30, क्योंकि लक्ष्य को ट्रैक करने के लिए पशुओं को प्रशिक्षण देने में चुनौती की वजह से उनकी नजर आंदोलनों की सटीक कीनेमेटीक्स खराब हो जाती है समझ.

लाल-कान स्लाइडर कछुए आम तौर पर विचार कर रहे है पार्श्व रीढ़ आंखों, लेकिन क्योंकि वे पूरी तरह से उनके खोल में उनके सिर मुकर सकते है31, carapace द्वारा पार्श्व दृश्य क्षेत्रों के महत्वपूर्ण रोड़ा होता है३२। परिणाम यह है कि उनकी दृष्टि की दृश्य पंक्ति सामने की ओर मजबूर है, जिससे उंहें और अधिक ललाट की तरह व्यवहार-स्तनधारियों आंखों । इसलिए, नेत्र आंदोलनों को मापने के लिए दृष्टिकोण विकसित करने के लिए एक मॉडल के रूप में उनके उपयोग भी एक अनूठा विकासवादी परिप्रेक्ष्य प्रदान करता है ।

इस काम में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करता है एक इन विट्रो अलग सिर तैयार करने के लिए लाल-कान स्लाइडर कछुओं में आंख आंदोलनों के कीनेमेटीक्स की पहचान । दिमाग कपाल की नसों को अक्षुण्ण छोड़कर खोपड़ी से विच्छेदित हो जाता है. सिर एक जिंबल में आँख आंदोलनों जांचना और आंख की मांसपेशियों innervating कपाल नसों की बिजली की उत्तेजना से प्रतिक्रियाओं पैदा करने के लिए रखा जाता है । आंखों से घुमाव के उपाय एक वीडियो आधारित प्रणाली द्वारा किया जाता है, सॉफ्टवेयर एल्गोरिदम का उपयोग कर, जो अंधेरे छात्र और आईरिस के चिह्नों को ट्रैक. तैयारी दोनों extraocular (यानी, क्षैतिज, ऊर्ध्वाधर, और मरोड़ घुमाव के कीनेमेटीक्स को मापने का अवसर प्रदान करता है३२ और intraocular (यानी, पुतला परिवर्तन)३३ आंदोलनों ।

Efferent तंत्रिका रास्ते के विश्लेषण के लिए मॉडल प्रणाली:

अधिक आम तौर पर, दृष्टिकोण जांचकर्ताओं के लिए अध्ययन कैसे efferent तंत्रिका संकेतों आंख आंदोलनों उत्पंन जब मांसपेशियों को अपने आराम राज्यों से शुरू और एकीकृत संवेदी सूचना के अभाव में मस्तिष्क को संसाधित करने का मौका प्रदान करता है३२, ३३. इसलिए, आंख कीनेमेटीक्स एक मॉडल प्रणाली है जिसमें वे केवल मस्तिष्क और मांसपेशियों पर synapsing छोड़ने efferent तंत्रिका मार्ग द्वारा संसाधित कर रहे हैं में जांच की जा सकती है ।

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Protocol

नोट: लाल-कान स्लाइडर कछुए, दोनों पुरुष और महिला, एक विक्रेता से खरीदा गया था । कछुए एक गर्म पशु २ ६०-गैलन sunning के लिए ईंट द्वीपों के साथ २५०-W अवरक्त रोशनी के तहत सुसज्जित टब युक्त सुइट में स्थित थे । पर्यावरण 22 डिग्री सेल्सियस पर पानी के तापमान के साथ एक 14/10-h प्रकाश/अंधेरे चक्र पर बनाए रखा गया था । लाइट्स को 6:00 बजे चालू किया गया और 8:00 बजे बंद कर दिया गया. छानने प्रणाली से सुसज्जित टैंक साप्ताहिक साफ किया गया, और कछुए हर दूसरे दिन विज्ञापन libitum खिलाया गया । लाल-कान स्लाइडर कछुए की देखभाल और निंनलिखित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के सभी यहां वर्णित है३२,३३ Lafayette कॉलेज में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. उपकरण सेटअप

  1. कछुआ घंटी का समाधान तैयार करें । इस क्रम में आसुत जल के लिए निंनलिखित जोड़ें: सोडियम क्लोराइड ९६.५ mm (५८.४४ g/मॉल), पोटेशियम क्लोराइड २.६ mm (७४.५६ g/मॉल), मैग्नीशियम क्लोराइड २.० mm (२०३.३१ g/मोल), सोडियम बिकारबोनिट ३१.५ mm (८४.०१ g/मोल), डेक्सट्रोज २०.० mm (१८०.१६ g/मॉल), केंद्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड ७.५१ के लिए पीएच को समायोजित करने के लिए, और कैल्शियम क्लोराइड ४.० mM (११०.९८ g// सामग्री की तालिकादेखें) । घोल को एक नमक जोड़ते समय मिलाएं ।
    चेतावनी: केंद्रित एचसीएल खतरनाक है (त्वचा, आंखें, साँस लेना, और घूस खतरों).
  2. 5 से सक्शन इलेक्ट्रोड के लिए युक्तियाँ-सेमी लंबे केशिका ग्लास ( सामग्री की तालिकादेखें), आग द्वारा भीतरी व्यास के विभिन्न आकारों को चमकाने के क्रम में अलग मोटाई की कपाल नसों को समायोजित करने के लिए ।
    1. केशिका कांच का एक टुकड़ा भर में एक लाइन खोदना करने के लिए एक छोटी सी फ़ाइल का उपयोग करें । टिशू पेपर में लगाएं और आधे में तोड़ें ।
    2. धीरे से एक Bunsen बर्नर की लौ में केशिका कांच के सिरों में से एक रोल । आवधिक आकार, चिकनाई के लिए टिप की जांच, और एक विच्छेदन गुंजाइश और एक फाइबर ऑप्टिक प्रकाश स्रोत का उपयोग कर समरूपता ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
      नोट: 20 और 30 मिमी के बीच सिर चौड़ाई के साथ कछुए के लिए, इष्टतम फिटिंग भीतरी व्यास आकार आम तौर पर ०.४ से ०.८ मिमी के लिए oculomotor तंत्रिका (nIII), ०.३ trochlear तंत्रिका (एनआईवी) के लिए ०.६ मिमी के लिए, और ०.२ abducens तंत्रिका (nVI) के लिए ०.४ मिमी के लिए रेंज ।
  3. स्वच्छ और व्यवस्थित Rongeurs, एक कुंद विच्छेदन जांच, microscissors, ठीक संदंश, घुमावदार संदंश, और एक स्केलपेल ब्लेड के साथ संभाल ( सामग्री की तालिकादेखें) विच्छेदन के लिए.
    नोट: उपकरणों की नसबंदी वैकल्पिक है ।

2. संज्ञाहरण और इच्छामृत्यु

  1. यह cryoanesthetize करने के लिए ६० मिनट के लिए एक बर्फ की बाल्टी में कछुए प्लेस ।
  2. एक छोटे जानवर गिलोटिन का उपयोग कर decapitation द्वारा कछुए Euthanize ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    1. धीरे से एक छोटा सा वजन रंग के साथ खुले पशु के जबड़े को खोदकर इतना है कि एक हुक डाला जा सकता है और ऊपरी जबड़े की नोक के नीचे फिट करने के लिए बदल दिया ।
    2. गिलोटिन के माध्यम से जानवर के सिर का विस्तार करने के लिए स्थिर दबाव के साथ खींचो । तेजी से जानवर decapitate ।
  3. एक विच्छेदित डिश में कछुआ सिर प्लेस । हाथ पर पर्याप्त कछुआ घंटी है ऊतक समाधान है । Oxygenize 95/5% O2/CO2 के साथ समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  4. डिश के बाहर चारों ओर बर्फ रखकर 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक बनाए रखें ।

3. विच्छेदन

  1. एक फाइबर ऑप्टिक प्रकाश स्रोत के साथ विच्छेदन गुंजाइश का उपयोग करने के लिए बाहर ले विच्छेदन ।
  2. निचले जबड़े को हटा दें । सिर के आसान हैंडलिंग प्रदान करने के लिए मुंह के माध्यम से एक कुंद विच्छेदन जांच प्लेस । एक स्केलपेल के साथ cranium को सेंधा हड्डी जोड़ने संयुक्त कट । निचले जबड़े को cranium से दूर खींचने के लिए rongeurs का प्रयोग करें । rongeurs का प्रयोग करें cranium के पृष्ठीय और पार्श्व क्षेत्रों में अपने अनुलग्नकों से त्वचा और मांसपेशियों को खींचने के लिए ।
  3. कशेरुका स्तंभ को निकालें ।
    1. cranium के caudal छोर पर कशेरुका स्तंभ को पहचानें । स्पाइनल कॉर्ड को बेनकाब करने के लिए कशेरुका कॉलम ventrally को मोड़ें । रीढ़ की हड्डी को गोली चलाना microscissors का प्रयोग करें । caudally खींचकर cranium से कशेरुका कॉलम और अन्य टिशू को निकालने के लिए rongeurs का प्रयोग करें ।
  4. कपाल नसों को काटने के बाद cranium से मस्तिष्क को हटा दें ।
    1. फोरमेन मैग्नम पर शुरू, rongeurs का उपयोग करने के लिए पृष्ठीय cranium पर दो चीरा काट । नीचे मस्तिष्क को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए सतही कटौती करें ।
    2. rongeurs का प्रयोग ध्यान से पृष्ठीय cranium खींचने के लिए । मस्तिष्क के बाकी हिस्सों को बेनकाब करने के लिए meninx को दूर करने के लिए microscissors का प्रयोग करें । घ्राण बल्ब तक पर्याप्त meninx निकालें, पूर्वकाल कपाल गुहा में, पहचाना जा सकता है ( चित्र 1aदेखें) । कछुआ घंटी के समाधान के साथ मस्तिष्क की सिंचाई के लिए जारी रखें, के रूप में आवश्यक है ।
    3. घुमावदार संदंश का उपयोग करने के लिए धीरे मस्तिष्क caudally खींच और कपाल नसों पर मामूली तनाव का उत्पादन । ध्यान से दूर कट और घ्राण बल्ब और घुमावदार संदंश के साथ मस्तिष्क हटा दें ।
    4. microscissors का प्रयोग धीरे कपाल नसों को बेनकाब करने के लिए midline की ओर midbrain धक्का; nIII, के बारे में ०.६ mm, एनआईवी के सामने देखा जा सकता है, और एनआईवी का व्यास nIII से थोड़ा कम हो जाएगा । कट nIII और एनआईवी जहां वे midbrain को देते है ( चित्र 1bदेखें) । इसे दूसरी तरफ दोहराएं ।
    5. microscissors के साथ बाएं और दाएं ऑप्टिक नर्व (निी) को काट लें । फिर brainstem को एक तरफ झुकाएं । pons और मज्जा के जंक्शन के पास ventral सतह से उभरते nVI का निरीक्षण करें (देखें चित्रा 1C); nVI का व्यास छोटा और लगभग ०.३ मि. ली. दोनों बाएं और दाएं nVI को काट लें ।
    6. brainstem के बचे हुए हिस्सों को कछुए से महीन संदंश और microscissors के साथ निकालें । एक बार cranium खाली है, कपाल गुहा फर्श की जांच । nIII, एनआईवी, और nVI की पहचान करें ।
  5. ऊपरी और निचले आंख-ढक्कन ठीक संदंश और microscissors के साथ निकालें ।

4. नेत्र आंदोलनों के अंशांकन

  1. जिंबल और अन्य उपकरणों की नियुक्ति का समर्थन करने के लिए एक कठोर मेज ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें । जिंबल चक में कछुए सिर प्लेस इतना है कि सिर के पृष्ठीय सतह एक छोटे बुलबुले खोपड़ी भर में आराम के स्तर का उपयोग कर क्षितिज के समानांतर है । मोटे तौर पर जिंबल की क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर घुमाव के केंद्र में आंखों में से एक की स्थिति ।
  2. अवरक्त कैमरा, एक अवरक्त प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी), जो वीडियो का हिस्सा है आंख पर नज़र रखने प्रणाली ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ सज्जित जगह है कछुआ आंख से लगभग 12 सेमी की दूरी पर देखने ।
    1. कैमरे के आंख की दृष्टि की रेखा से ऊपर ४५ डिग्री कोण । एलईडी 11 बजे की स्थिति में होना चाहिए जब कैमरे के लेंस को देख रहे हैं । आंख की ऑप्टिकल धुरी के साथ एलईडी केंद्र । कैमरा (आंख के ऊपर से देखा के रूप में) धुरी से थोड़ा दूर हो जाएगा ।
    2. आंखों से कैमरे की दूरी को समायोजित करें ताकि कैमरा देखने के लिए अधिक से अधिक गोलक से भरा है । सुनिश्चित करें कि आंखों के कोनों (canthi) क्षैतिज दृश्य के किनारों पर हैं ।
  3. डेटा को प्रोसेस करने के लिए कैमरा को वीडियो-आधारित नज़र ट्रैकिंग सिस्टम से कनेक्ट करें. कच्चे वीडियो पर कब्जा करने के लिए एक डीवीडी-रिकॉर्डर के लिए संकेत विभाजित । आंख की एक स्पष्ट छवि प्राप्त करने के लिए कैमरा ध्यान केंद्रित । ठीक करने के लिए ध्यान रखना-कैमरा दृश्य के केंद्र पर आंख की स्थिति रैखिक समायोजन के तीन डिग्री (एक्स, वाई, जेड) जिंबल के साथ प्रदान का उपयोग कर ।
  4. दहलीज और इसके विपरीत सेट करके अंधेरे पुतले का पता लगाने के उचित वीडियो के साथ प्रदान की प्रोग्राम का उपयोग कर-नेत्र ट्रैकिंग प्रणाली पर आधारित है ।
    1. माउस का प्रयोग, "वीडियो" मेनू पर क्लिक करें और के तहत "मोड" का चयन करें "उच्च परिशुद्धता" 30 हर्ट्ज के एक नमूना दर (६४० पिक्सल x ४८० लाइनों के संकल्प) पर छवियों को पकड़ने के लिए । इसके अलावा "वीडियो" के तहत, "शिष्य प्रकार" और "दीर्घवृत्त (घुमाया दीर्घवृत्त)" के लिए "पुतला विभाजन विधि" के लिए "डार्क शिष्य" का चयन करें ।
    2. "EyeCamera" विंडो में, "शिष्य खोज क्षेत्र समायोजन" चिह्न (केंद्र में एक डॉट के साथ छोटा अनुलंब आयत) पर क्लिक करें । माउस का प्रयोग करें बाहर एक आयत है कि पुतले के आसपास एक क्षेत्र सीमा खींचें । अंधेरे क्षेत्रों है कि पुतले के साथ भ्रमित किया जा सकता से बचें ।
    3. "नियंत्रण" विंडो में, "ऑटो छवि" और "सकारात्मक-लॉक थ्रेशोल्ड-ट्रैकिंग" के लिए बक्से की पुष्टि करें कि जाँच की जाती है । "ऑटो दहलीज" पर क्लिक करें स्कैनिंग के घनत्व का अनुकूलन करने के लिए, जो डार्क पुतली पर हरी डॉट्स के रूप में दिखाएगा ।
  5. वीडियो-आधारित नेत्र ट्रैकिंग कार्यक्रम के जिंबल १२.५ ° के घुमाव के लिए वीडियो-प्रदर्शन जांचना (+/-) इसके क्षैतिज अक्ष के आसपास और अपने ऊर्ध्वाधर अक्ष के आसपास 10 ° (+/
    1. "नियंत्रण" विंडो में, "प्रदर्शन" पर क्लिक करें । दोनों के तहत बक्से की जांच करें "टकटकी" और "Stim" के लिए "टकटकी बिंदु", "कालिब क्षेत्र", और "ज्यामिति ग्रिड" । "ज्यामिति ग्रिड" के तहत बक्से की जांच के बाद, एक विंडो पॉप अप और कहना होगा, "उत्तेजना प्रदर्शन ज्यामिति ज्यामिति ग्रिड प्रदर्शित किया जा सकता से पहले मापा जाना चाहिए । क्या आप अब ऐसा करना चाहते हैं? " हां के लिए "Y" का चयन करें ।
    2. माउस का प्रयोग, "Windows" मेनू पर क्लिक करें और चुनें "उत्तेजना" । "उत्तेजना" खिड़की के प्रदर्शन के केंद्र पर एक ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज लाइन पार दिखा खुल जाएगा । निकटतम mm करने के लिए पंक्तियों की लंबाई को मापने । "उत्तेजना" विंडो से बाहर निकलने के लिए कुंजीपटल पर "Esc" दबाएँ ।
    3. माउस का प्रयोग, "उत्तेजना" मेनू पर क्लिक करें और चुनें "ज्यामिति सेटअप" । इनपुट लाइनों है कि सिर्फ मापा गया की लंबाई । को देखने दूरी इतना समायोजित करें कि डिग्री/रेखा के बराबर क्षैतिज रेखा के लिए 25 ° और ऊर्ध्वाधर लाइन के लिए 20 डिग्री । "स्टोर" बटन पर क्लिक करें और खिड़की बंद करो ।
    4. "EyeSpace" विंडो में, अंशांकन "डेटा बिंदु" "9" करने के लिए की संख्या का चयन करें । कछुए की आंख के साथ केंद्र पर तैनात, केंद्र डेटा बिंदु पर क्लिक करें और क्लिक करें "फिर से मौजूद" बटन ।
      नोट: "उत्तेजना" खिड़की खुल जाएगा, और "तैयार हो जाओ" स्क्रीन के केंद्र में दिखाई देगा । केंद्र स्थान पर एक बॉक्स दिखाई देगा और फिर अदृश्य हो जाएगा । इसके गायब होने पर, "उत्तेजना" खिड़की बंद हो जाएगा । केंद्र की स्थिति पर अब तुले हुए होना चाहिए.
    5. जिंबल दाएँ/बाएँ, + १२.५ °/-१२.५ °, और ऊपर/नीचे + 10 °/-10 ° शेष डेटा बिंदुओं जांचना करने के लिए घूर्णन प्रक्रिया को दोहराएँ ।
  6. मरोड़ रोटेशन जांचना, वीडियो आधारित नेत्र ट्रैकिंग कार्यक्रम के साथ प्रदान की फिटिंग एल्गोरिथ्म टेम्पलेट का उपयोग करें । एल्गोरिथ्म आईरिस के चिह्नों के आधार पर एक शूंय स्थिति सेट करता है और चिह्नों के पुतले के केन्द्रक से ऑफसेट होने पर रोटेशन के एक कोण की गणना करती है ।
    1. माउस सूचक का उपयोग करना, "Windows" मेनू पर क्लिक करें और चुनें "मरोड़". "मरोड़" विंडो में "START" बटन पर क्लिक करें । "EyeCamera" विंडो में, एक चाप आंख की छवि पर दिखाई देगा ।
    2. परिधि, कोण, और एक स्थान है जहां अनियमित चिह्नों आईरिस में मौजूद है पर स्लाइडर्स का उपयोग कर चाप की लंबाई समायोजित करें । "वास्तविक समय ग्राफिक्स" और "समायोजित करने के बाद स्वत: सेट" के लिए बक्से की जाँच करें । यदि आवश्यक हो, तो नियंत्रण विंडो में चमक और कंट्रास्ट समायोजित करें और डार्क पुतली को फिर से थ्रेशोल्ड करें (चरण 4 देखें). "सेट टेम्पलेट" बटन पर क्लिक करें.
  7. पुतले के रूप में एक ही फोकल विमान में एक शासक प्लेस और पूर्ण कैमरा देखने की चौड़ाई रिकॉर्ड । बाद में पुतले की वास्तविक चौड़ाई निर्धारित करने के लिए मान का उपयोग किया जाएगा ।

5. कपाल तंत्रिका पर सक्शन इलेक्ट्रोड की स्थिति नेत्र आंदोलनों पैदा करने के लिए

  1. ध्यान से संयोजी या मांसपेशियों के सिर पर शेष ऊतक में एक पिन संदर्भ इलेक्ट्रोड जगह.
  2. सक्शन इलेक्ट्रोड प्लेस ( सामग्री की तालिकादेखें) कपाल तंत्रिका पर एक micromanipulator और विच्छेदन क्षेत्र का उपयोग कर एक उफान पर घुड़सवार. एक फाइबर ऑप्टिक प्रकाश स्रोत का उपयोग करने के लिए देखने और प्लेसमेंट का मार्गदर्शन ।
    1. एक केशिका ग्लास टिप करने के लिए एक तंत्रिका के आकार मैच । परीक्षण और त्रुटि एक तंत्रिका के व्यास के चारों ओर एक सबसे अच्छा फिट प्राप्त करने के लिए आवश्यक है (आकार सिफारिशों के लिए कदम १.२ देखें) । सक्शन इलेक्ट्रोड पर ग्लास टिप प्लेस । घंटी के समाधान के साथ सक्शन इलेक्ट्रोड भरें और अपनी क्षमता के बारे में आधा करने के लिए सिरिंज के भीतर की मात्रा को समायोजित.
    2. ध्यान से चयनित तंत्रिका के कट-अंत के ऊपर एक स्थिति के लिए micromanipulator का उपयोग इलेक्ट्रोड के कांच टिप ले जाएँ. सुनिश्चित करें कि घंटी समाधान cranium भरता है और टिप अपनी सतह से नीचे है । यदि आवश्यक हो तो, जहां रिंगर समाधान cranium से बाहर टपक रहा है स्थानों को बांध करने के लिए क्ले मॉडलिंग का उपयोग करें ।
    3. सिरिंज के गोताख़ोर पर वापस खींचो.
      नोट: वैक्यूम केशिका टिप के अंत में तंत्रिका आकर्षित करेगा । एक अच्छा फिट कम या कोई अतिरिक्त लागू निर्वात के साथ टिप के भीतर शेष तंत्रिका द्वारा संकेत दिया है ।

6. कपाल तंत्रिका की उत्तेजना और आँख आंदोलनों का विश्लेषण

  1. एक मौजूदा अलगाव डिवाइस के साथ एक सामान्य प्रयोजन तंत्रिका/मांसपेशी उत्तेजक का प्रयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) चूषण इलेक्ट्रोड के माध्यम से कपाल तंत्रिका को उत्तेजित करने के लिए ।
    1. एक केबल का उपयोग कर वर्तमान आइसोलेशन डिवाइस के लिए चूषण इलेक्ट्रोड कनेक्ट करें । लीड से कनेक्ट करें पिन संदर्भ इलेक्ट्रोड आइसोलेशन डिवाइस के लिए जमीन कनेक्शन के लिए ।
    2. नंबर डायल करता है और उत्तेजित करता है और अलगाव डिवाइस पर स्विच का उपयोग कर धाराओं के मापदंडों का चयन करें । धाराओं की एक श्रृंखला का उपयोग करें 1 से १०० µA, आवृत्ति के साथ 10 करने के लिए ४०० हर्ट्ज. १००, ५००, या १,००० एमएस स्थायी ट्रेनों में 1-या 2-एमएस पल्स का उपयोग करें.
  2. उत्तेजना के समय रिकॉर्ड ।
    नोट: ट्रांजिस्टर-ट्रांजिस्टर-तर्क (TTL) दालें उत्तेजितकर्ता से धाराओं के उद्धार के साथ सिंक्रनाइज़ और वीडियो आधारित आँख ट्रैकिंग प्रणाली के इनपुट चैनलों के लिए एक केबल के माध्यम से वास्तविक समय में संवाद कर रहे हैं. एक सॉफ्टवेयर मॉड्यूल वीडियो आधारित नेत्र ट्रैकिंग कार्यक्रम के साथ प्रदान की संचार नियंत्रण ।
    1. वर्तमान अनुप्रयोगों के समय कल्पना और आंख आंदोलनों पर उनके प्रभाव, "PenPlots" मेनू पर क्लिक करें । चुनें "एक्स टकटकी स्थिति", "Y टकटकी स्थिति", "मरोड़", और "शिष्य चौड़ाई" के लिए वास्तविक समय X और Y आंख पदों, मरोड़, और शिष्य चौड़ाई के लिए कच्चे डेटा भूखंडों को दिखाने के लिए । इसके अलावा 1 एस अंतराल पर दिखाई देते हैं, जो टिक मार्क्स के साथ एक समय भूखंड दिखाने के लिए "PenPlots" मेनू से "सेकंड और मार्करों" का चयन करें.
      नोट: एक कैपिटल अक्षर "T" TTL पल्स की शुरुआत को चिह्नित करते हुए दिखाई देगा, जो वर्तमान अनुप्रयोग के साथ एक साथ उत्पंन हो रहा है ।
    2. धाराओं द्वारा पैदा नेत्र आंदोलनों के डेटा स्टोर करने के लिए, "फ़ाइल" मेनू पर क्लिक करें और "डेटा" के तहत "नई डेटा फ़ाइल" का चयन. इनपुट फ़ाइल का नाम और प्रेस "दर्ज करें" । डेटा सहेज कर रोका जा सकता है और उसके बाद कुंजी आदेश, "Ctrl" + "p" के संयोजन का उपयोग कर पुनरारंभ । एक प्रयोगात्मक सत्र पूरा हो गया है, "डेटा" के अंतर्गत "बंद डेटा फ़ाइल" बंद "फ़ाइल" मेनू का चयन करें.
    3. लागू की गई धाराओं के प्रकार का ट्रैक रखने में मदद करने के लिए, "Windows" मेनू पर क्लिक करें और "डेटा पैड" चुनें. "कीपैड/DataMarker" विंडो दिखाई देगा । एक पत्र या वर्तमान उत्तेजना के मापदंडों की पहचान करने के लिए एक नंबर पर क्लिक करें तंत्रिका को दिया जा रहा है ।
      नोट: उदाहरण के लिए, "x" 10 µA के लिए खड़े हो सकते हैं । "x" पर क्लिक करके डेटा फ़ाइल में अपनी प्रविष्टि को पोस्ट हॉक विश्लेषण के लिए रीयल-टाइम में संग्रहीत करता है । यह भी चल रहे निरीक्षण के लिए "सेकंड और मार्करों" के लिए "PenPlot" पर प्रकट होता है ।
  3. नेत्र ट्रैकर प्रणाली से डेटा का विश्लेषण करें ।
    1. सहेजा गया डेटा फ़ाइल खोलें, जो किसी पाठ सीमांकित स्वरूप में है, डेटा को व्यवस्थित करने और सांख्यिकीय विश्लेषण को पूरा करने के लिए पसंद की एक स्प्रेड पत्रक प्रोग्राम में है ।
      1. मिमी में असली आकार के लिए फ़ाइल में संग्रहीत पुतली चौड़ाई मूल्यों कन्वर्ट.
      2. एक्स और वाई नेत्र पदों और मरोड़ के मूल्यों की डिग्री की इकाइयों को कन्वर्ट और आँख आंदोलनों का वर्णन करने के लिए सम्मेलनों का उपयोग; इसलिए, घुमाव की सकारात्मक दिशाओं: मरोड़ना, ऊंचाई, और adduction; और घुमाव के नकारात्मक दिशाओं: extorsion, अवसाद, और अपहरण ।
    2. किसी नए कार्यपत्रक पर शीर्ष लेख जानकारी की प्रतिलिपि बनाएं । यह स्क्रीन आकार (चौड़ाई और ऊंचाई) और देखने दूरी के लिए मान शामिल होंगे । 30 हर्ट्ज की दर से एकत्र डेटा के आठ कॉलम हेडर जानकारी के नीचे का पालन करेंगे.
    3. raw डेटा वाले कार्यपत्रक पर वापस जाएँ. एक "खोजें" के लिए पिछले कॉलम शीर्षक "मार्कर" जहां उत्तेजना 10 µA के साथ लागू किया गया था खोजने के लिए "" टी "की घटना का पता लगाएं, वर्तमान उत्तेजना की शुरुआत अंकन । "t" से पहले होने वाले डेटा की 15 पंक्तियों (०.५ s) और "t" (३.० s) के बाद ९० फ़्रेम्स की प्रतिलिपि बनाएं; यानी, ३.५ एस टोटल. शीर्ष लेख जानकारी के नीचे नए कार्यपत्रक में डेटा चिपकाएं ।
    4. "PupilWidth" के बाद कोई रिक्त स्तंभ संमिलित करें । रिक्त स्तंभ में, mm में नपे आयाम में कनवर्ट करें:
      क्षैतिज पुतली व्यास = "PupilWidth" कैमरा दृश्य चौड़ाई के आयाम ×
    5. दोनों "X_Gaze" और "Y_Gaze" के बाद 2 रिक्त स्तंभ संमिलित करें । पदों को देखने स्क्रीन के आयामों को सामान्य: निर्देशांक (0, 0) नीचे दाईं ओर (1, 1) करने के लिए विस्तार करने के लिए स्क्रीन के शीर्ष पर छोड़ दिया. पहली रिक्त कॉलम में, स्क्रीन के केंद्र में एक समंवय प्रणाली (0, 0) होने के लिए पदों का अनुवाद करें । मिमी में स्क्रीन के आयामों के लिए रूपांतरण शामिल हैं:
      X = (०.५ × चौड़ाई) – ("X_Gaze" × चौड़ाई); Y = (०.५ × ऊँचाई) – ("Y_Gaze" × ऊँचाई)
      नोट: आपरेशन के अनुक्रम बाईं आंख के लिए है । अनुक्रम adduction के लिए अपहरण और धनात्मकता के लिए नकारात्मकता की परंपरा का पालन करने के क्रम में सही आँख के लिए उलट करने की आवश्यकता होगी ।
    6. दूसरे स्तंभों में, रोटेशन के कोण (°) में कनवर्ट करने के लिए त्रिकोणमिति फ़ंक्शंस का उपयोग करें:
      क्षैतिज रोटेशन = arctan (X/viewing दूरी); अनुलंब घुमाव = arctan (Y/viewing दूरी)
    7. मरोड़ पहले से ही डिग्री की इकाइयों में दिखाया गया है, लेकिन मरोड़ के लिए धनात्मकता के कन्वेंशन के अनुरूप है, अगर मापने बाईं आंख पर किया जाता है, द्वारा गुणा-1. सही आँख के लिए, कोई गुणन आवश्यक है । कार्यक्रम के रूप में सकारात्मक घड़ी रोटेशन कोड ।
    8. समय के एक समारोह के रूप में पुतला व्यास और घुमाव प्लाट ।

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Representative Results

चित्रा 1 एक विच्छेदन का वर्णन वीडियो से लिया छवियों के स्टिल्स दिखाता है. छवियों मस्तिष्क से काटने से पहले नसों के विशिष्ट स्थानों प्रदान करते हैं ।

Figure 1
चित्र 1: विच्छेदन के वीडियो से कैप्चर किए गए चित्रों की स्टिल्स ऑप्टिक नर्व (निी), oculomotor नर्व (nIII), trochlear नर्व (एनआईवी), और abducens नर्व (nVI) के स्थानों को दर्शाती हैं. (A) meninx को हटाने के बाद मस्तिष्क के लेबल क्षेत्रों के साथ छवि । सफेद स्केल बार = 10 मिमी. (B) छवि निी, nIII, और एनआईवी का स्थान दिखाता है जहां वे midbrain के दाईं ओर (घ्राण बल्ब और मस्तिष्क को हटाने के बाद) से कनेक्ट होते हैं । (ग) छवि nVI के स्थान को दिखाती है जहां यह brainstem के बायीं ओर से जुड़ती है (midbrain को हटाने के बाद) । सफेद धराशायी लाइनों नसों के आसपास तैयार कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 2 nIII उत्तेजक के बाद होने वाली पुतली व्यास में मतलब परिवर्तन से पता चलता है. हालांकि बाह्य नेत्र आंदोलनों भी मनाया जाता है, जो पुतला के स्थान को बदलने के लिए, आईरिस के लुगदी pupillae द्वारा कार्रवाई के उपाय विश्वसनीय रहता है । उपाय एक तैयारी से कर रहे है और दोहराया वर्तमान उत्तेजना के लिए प्रतिक्रियाओं की विशिष्ट परिवर्तनशीलता दिखाओ । मतलब शिष्य व्यास १.९५ ± ०.०१ mm से १.६० ± ०.०१ मिमी कम है । संकीर्ण मानक विचलन तंत्रिका करने के लिए इलेक्ट्रोड के एक सफल फिट इंगित करता है । जब विभिंन तैयारी के बीच मापने (N = 5), ठेठ परिवर्तनशीलता ± ०.०८ mm है । हालांकि अभी भी अपेक्षाकृत संकीर्ण, मूल्य के बारे में आठ बार परिवर्तनशीलता से अधिक एक ही तैयारी से मनाया जाता है ।

Figure 2
चित्रा 2: पूरे सिर तैयारी में oculomotor तंत्रिका (nIII) उत्तेजक द्वारा पैदा की पुतली कसना का उदाहरण । काले ट्रेस एक तैयारी में छह उत्तेजना से मतलब शिष्य व्यास (पीडी) है, और लाइनों को धराशायी मानक विचलन (एसडी) दिखाएँ । एक्स-अक्ष पर आयताकार तरंग शुरुआत और ५० µA के एक आयाम के साथ 1-ms दालों की एक १००-हर्ट्ज ट्रेन की ऑफसेट का अर्थ है । निचले बाएं पर स्केच आंखों में आईरिस लाइन के उंमुखीकरण से पहले उत्तेजना से पता चलता है, और नीचे छवियों को दिखाने के पहले अभी भी एक प्रतिनिधि परीक्षण से फ्रेम में (a), के दौरान (ख), और उत्तेजना (सी) के बाद । सफेद स्केल बार = 1 मिमी । यह आंकड़ा३३अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

शिष्य प्रतिक्रियाओं के उपाय आँख घुमाव के अंशांकन की आवश्यकता नहीं है; हालांकि, अगर बाह्य आंदोलनों को मापने, एक जिंबल में सिर की नियुक्ति सावधानी से तैयारी के बीच तुलना की अनुमति के लिए किया जाना चाहिए (चित्रा 3) । जब सिर जिंबल में क्षितिज के साथ खोपड़ी समानांतर की पृष्ठीय सतह के साथ रखा जाता है, आईरिस पंक्ति नाक की ओर क्षितिज से ऑफसेट है । चित्रा 3d एक ठेठ ऑफसेट (२८.६ °) एक तैयारी में दिखाता है । तीन अलग तैयारी के लिए मतलब ऑफसेट ३०.१ ± ९.० ° था । मानक विचलन के भीतर ऑफसेट का एक कोण जिंबल के भीतर स्वीकार्य फिट इंगित करता है ।

Figure 3
चित्रा 3: एक अलग कछुआ सिर जिंबल में तैनात तैयारी । (A) सफेद आयत का क्षेत्र उपकरण सेटअप की एक तस्वीर में कछुआ सिर के स्थान को दिखाता है । (ख) सफ़ेद आयत का बढ़ाया हुआ दृश्य (सात बार) । बिंदीदार सफेद लाइन नाक से पुतली केंद्र के लिए छवि पर तैयार की है और क्षितिज के साथ स्तर है । एक ठोस सफेद रेखा आरोपित और आईरिस लाइन के समानांतर है । (C) सिर के बायीं ओर का कार्टून । (घ) वीडियो के कैमरे द्वारा कब्जा कर लिया आंख ट्रैकिंग प्रणाली के आधार पर आंख की छवि । काले स्केल बार: Bमें 5 मिमी; Dमें 1 मिमी । यह आंकड़ा३२अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 4 दस बेहतर परोक्ष मांसपेशी के लिए जा एनआईवी की उत्तेजना से पैदा की तैयारी से आंखों का मतलब rotations दिखाता है । µA के लिए ठेठ पीक घुमाव, ऊंचाई, और अपहरण (७० के जवाब में, ऑरेंज ट्रेस) १०.० ± ५.७ °, २.८ ± १.२ °, और ३.० ± २.१ ° क्रमशः कर रहे हैं । एक ही तैयारी में rotations के लिए मापा परिमाण के लिए दोहराया उत्तेजना समान है लेकिन कम परिवर्तनशीलता के साथ (उदा, N = 5), १४.८ ± १.० ° के लिए, ३.२ ± ०.२ ° ऊंचाई, और अपहरण के लिए २.४ ± ०.२ ° । एक ही तैयारी की तुलना में अलग तैयारी के बीच variabilities के पैटर्न (एक लघुगणक इकाई के भीतर) के लिए क्या पुतला परिवर्तन के उपायों के लिए मनाया जाता है तुलना में है: 6 बार दोनों के लिए अधिक से अधिक और पदोंनति, 11 बार के लिए अधिक से अधिक अपहरण.

Figure 4
चित्रा 4: मतलब आंख rotations ५०० के साथ छोड़ दिया trochlear तंत्रिका उत्तेजक के बाद पैदा (एनआईवी)-ms १००-2 की हर्ट्ज गाड़ियों-10 की तैयारी में एमएस पल्स (छह बाईं ओर के लिए आवेदन किया और चार सही पक्ष के लिए आवेदन किया, पांच परीक्षण प्रत्येक के लिए मापा) । नीचे भूखंड के एक्स अक्ष पर आयताकार तरंग उत्तेजना के समय को नोट । बाएं और दाएं आंखों से प्रतिक्रियाएं एक दूसरे से काफी अलग नहीं थीं । मरोड़ और अपहरण के साथ किया गया था (सिर से ऊपर के कार्टून देख-कछुआ, जिनके तीर आंख आंदोलनों के घटकों को संक्षेप में देखने पर) । आंख आंदोलन आयाम मोटे तौर पर सात वर्तमान एनआईवी के लिए लागू आयाम से मेल खाती है (लीजेंड बॉक्स में कोड देखें) । यह आंकड़ा३२अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

एनआईवी के विपरीत, जो केवल बेहतर परोक्ष मांसपेशी, nIII और nVI अंदर आना कई मांसपेशियों को जाता है तो आंदोलनों की व्याख्या करने के लिए और अधिक चुनौतीपूर्ण हैं । परिणामी नेत्र आंदोलनों क्या मोटर इकाइयों (चित्रा 5) ( चर्चादेखें) भर्ती कर रहे हैं पर निर्भर करते हैं । नतीजतन, तैयारी से परिवर्तनशीलता महत्वपूर्ण बन सकता है । उदाहरण के लिए, nVI, ऊंचाई, और अपहरण (चित्रा 5C) आह्वान । अपहरण के पार्श्व rectus की कार्रवाई को बढ़ावा देने के मोटर इकाइयों से होने की संभावना है; इस तरह के ट्रैक्टर bulbi या nictitating झिल्ली के रूप में लक्ष्य के लिए जा रहा अंय मोटर इकाइयों से मरोड़ और पदोंनति के बजाय परिणाम ।

Figure 5
चित्रा 5: मतलब आंख आंदोलन प्रतिक्रियाएं 10 के साथ तीन कपाल नसों उत्तेजक द्वारा पैदा-, ५०-, १००-, और ४००-चार की तैयारी में हर्ट्ज गाड़ियों । उत्तेजना गाड़ियों के सभी ५०० की अवधि में एमएस थे, ७० µA, दहलीज के ऊपर एक मूल्य के आयाम के साथ 2-एमएस पल्स से मिलकर । नेत्र आंदोलनों से पहले के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं, कॉलम एक-सी nIII, एनआईवी, और nVI, क्रमशः की उत्तेजना को दिखा प्रतिक्रियाओं के साथ । यह आंकड़ा३२अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

क्योंकि nIII innervates कई लक्ष्यों (सुपीरियर rectus, अवर rectus, अवर परोक्ष, औसत दर्जे का rectus, और लुगदी pupillae), पैदा आंदोलनों के विश्लेषण सबसे जटिल हैं । चित्र 5, extorsion, adduction में दिखाए गए उदाहरण के लिए, और ऊंचाई होती है । इस के आधार पर, एक उचित व्याख्या है कि कार्रवाई औसत दर्जे का rectus से संभव योगदान के साथ अवर परोक्ष से ज्यादातर रहे हैं । सुपीरियर rectus और अवर rectus एक दूसरे को रद्द कर सकते हैं । nIII के लिए कार्यों की एक उच्च परिवर्तनशीलता की संभावना तंत्रिका की अधिक से अधिक शाखाओं से उपजी और इलेक्ट्रोड फिटिंग के लिए कटौती के स्थान.

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Discussion

महत्वपूर्ण कदम:

इस प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम निंनलिखित हैं: 1) विच्छेदन और transected नसों की व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए लिया गया ध्यान; 2) कपाल नसों को सक्शन इलेक्ट्रोड द्वारा आकार के मिलान अनुरूप प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए; और 3) जिंबल में सिर के स्थान पर आंख के घुमाव के पर्याप्त अंशांकन प्रदान करने के लिए ।

समस्या निवारण:

विच्छेदन चुनौतीपूर्ण हो सकता है, लेकिन इसे कुछ समय पूरा करने के बाद, कदम अपेक्षाकृत सीधे आगे हो जाना चाहिए । नसों गैर-उत्तरदायी दिखाई देते हैं, तो सबसे संभावित कारण विच्छेदन की विफलता है । मस्तिष्क को हटाने के दौरान केवल न्यूनतम तनाव और दबाव को अपने काटने के दौरान नसों के लिए लागू किया जाना चाहिए । धातु शल्य चिकित्सा उपकरणों के साथ नसों को छूने से भी जितना संभव हो बचा जाना चाहिए, और इसलिए कांच हुक और प्लास्टिक संदंश धातु उपकरणों के लिए स्थानापन्न कर सकते हैं अगर मुसीबतों३४जारी रहती है । हालांकि कछुए के ऊतकों को ऑक्सीजन के चर स्तर को जीवित करने की क्षमता है, हौसले से बनाया कछुआ घंटी के समाधान का उपयोग 95/5% हे2/CO2 के साथ bubbled और ठंडा उचित है; हालांकि, यह कम महत्वपूर्ण है । सब के बाद, तैयारी का उपयोग करने का लाभ ऑक्सीजन के स्तर और तापमान में उतार चढ़ाव2,3,4,३५के तहत जीवित है । अधिक महत्वपूर्ण है कछुए रिंगर समाधान के साथ तैयारी की आवधिक सिंचाई ऊतक बाहर सुखाने से बचने के लिए है ।

एक प्रयोग बाहर ले जाने के लिए पहले से चूषण इलेक्ट्रोड के लिए अलग आकार के सुझावों का एक सेट बनाना तंत्रिका के लिए एक अच्छा फिट की संभावना में सुधार होगा । विच्छेदन के समान, आग चमकाने युक्तियां कुछ अभ्यास लेता है । एक पूर्व प्रयोग से नसों के साथ एक सिर के संरक्षण और यह एक संदर्भ के रूप में उपयोग करते हुए सुझावों की मदद कर सकते हैं । छोटे से बड़े व्यास आकार के सुझावों की व्यवस्था और उंहें कुछ मॉडलिंग क्ले पर भंडारण एक प्रयोग के दौरान जल्दी फिटिंग के लिए अनुमति देता है । छोटे सुझावों के लिए, और अधिक समय लपटें में युक्तियां रोलिंग की आवश्यकता है । युक्तियां दरारें से मुक्त होना चाहिए और चिकनी किनारों के अधिकारी को तंत्रिका पर एक अच्छी मुहर के लिए अनुमति देते हैं ।

जिंबल में सिर का ओरिएंटेशन पर्याप्त होना चाहिए । नहीं तो माप की धुरी टेढ़ी हो जाएगी । उदाहरण के लिए, दाईं ओर एक घुमाव जो बाईं ओर समान वृद्धि से अधिक है, इंगित करता है कि आँख का केंद्र ऑफ़सेट है और दाईं ओर खिसकाया जाना आवश्यक है. कुछ मुसीबत भी रोटेशन के दौरान पुतला से एक विश्वसनीय संकेत बनाए रखने में हो सकता है । अवरक्त द्वारा पुतले की रोशनी का समायोजन थोड़ा बेहतर परिणाम प्राप्त करने में मदद कर सकते हैं एलईडी ।

सीमाओं:

तैयारी की एक कमी विशिष्ट मांसपेशियों द्वारा कार्यों के कीनेमेटीक्स की पहचान करने में कठिनाई है । यह nIII और nVI की उत्तेजना के बाद मापा आंदोलनों के लिए विशेष रूप से सच है । व्यक्तिगत मांसपेशी कार्रवाई को हल करने के लिए एक रास्ता एक विशेष मांसपेशी के लिए यात्रा मार्ग को अलग करने के क्रम में तंत्रिका शाखाओं के व्यवस्थित transections बनाने के लिए है । उदाहरण के लिए, हम सिलिअरी गैंग्लिया के लिए बाहर nIII काटने में सफल रहे है और लघु सिलिअरी तंत्रिका उत्तेजक को लुगदी pupillae३३,३६की कार्रवाई को अलग । एक और दृष्टिकोण दोनों एगोनिस्ट और विरोधी की मांसपेशियों पर एक तनाव गेज प्रणाली माउंट और फिर विशिष्ट मांसपेशियों की गतिविधियों के साथ आंदोलनों के अनुरूप है३७,३८ । उस विधि के लिए, एक विशिष्ट मांसपेशी के लिए यात्रा मार्ग के अलगाव के रूप में आवश्यक नहीं होगा ।

तैयारी भी निष्क्रिय विस्को-लोचदार इसी मांसपेशियों पर विपरीत दिशाओं में अभिनय तत्वों के साथ जुड़े खींच के लिए अनुमति देता है (जैसे, rectus औसत दर्जे का rectus मांसपेशियों, या लुगदी फैलाव बनाम लुगदी pupillae )३९। बाहर विस्को-लोचदार तत्वों को पार्स करने के लिए, यहां वर्णित के रूप में transected नसों उत्तेजक द्वारा प्राप्त प्रतिक्रियाओं उन एक तैयारी है जिसमें subcortical क्षेत्रों और सेरिबैलम sparred है का उपयोग कर प्राप्त की तुलना में किया जा सकता है; इसलिए यह कार्यात्मक तंत्रिका एकीकरण बरकरार रहता है, और फिर यह brainstem innervating प्रत्येक मांसपेशी४०के भीतर एकल motoneuron क्षेत्रों को उत्तेजित करने के लिए संभव है ।

अंय हड्डीवाला मॉडल के संबंध में महत्व:

हालांकि cryoanesthesia कछुए के लिए स्वीकार्य है, इस दृष्टिकोण को गर्म खून जानवरों में काम के साथ अनुमोदित नहीं किया जा सकता है४१,४२। इसलिए, एक औषधीय एजेंट जैसे pentobarbital या ketamine आवश्यक है । एजेंटों, हालांकि, नेत्र आंदोलनों४३पाया । फिर भी, दृष्टिकोण सरीसृप के लिए उपयोगी है और अंय पार्श्व के लिए लागू किया जा सकता है गैर आंखों mammalians, जैसे उभयचर और मछली के४४,४५, क्योंकि यह एक पृथक efferent तंत्रिका द्वारा उत्पंन व्यवहार की तुलना की अनुमति देता है एक बरकरार पशु३२,३३द्वारा किए गए उन लोगों के लिए मार्ग ।

भविष्य अनुप्रयोगों:

तैयारी तंत्रिका ऊतक जीवित रहने के लिए एक परख के रूप में सेवा कर सकता है । एक प्रोटोकॉल को व्यवस्थित कैसे विभिंन कारकों नेत्र आंदोलनों को प्रभावित पता डिजाइन किया जा सकता है । दृष्टिकोण अलग तापमान या एनाल्जेसिक सहित औषधीय एजेंटों के परीक्षण के रूप में के रूप में सरल हो सकता है । क्योंकि आंदोलनों nIII और nVI के लिए व्याख्या करने के लिए और अधिक कठिन हैं, उनका उपयोग अधिक सीमित है । इसलिए, एनआईवी संभावना हेरफेर के लिए सबसे अच्छा विकल्प होगा ।

हालांकि, nIII और nVI उत्तेजक से व्यक्तिगत मांसपेशी कीनेमेटीक्स परिणामी को हल करने के लिए, तैयारी के संशोधन आवश्यक होगा, जैसे नसों की शाखाओं का एक व्यवस्थित transection बनाने या लक्षित मांसपेशी सेट पर तनाव गेज सहित । अंत में, एक तैयारी में प्रतिक्रियाओं को मापने जहां तंत्रिका एकीकरण बरकरार रखा जाता है कैसे विस्को-लोचदार तत्वों का निर्धारण सक्षम होगा संभवतः कीनेमेटीक्स के quantifications सीमित हो सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक श्रीमती Paulette McKenna और लिसा Pezzino धंयवाद सचिवीय समर्थन के लिए इस अध्ययन में, और तकनीकी सहायता के लिए श्री फिल Auerbach । लेखक भी डीआरएस का शुक्रिया अदा करते हैं । माइकल एरियल और माइकल एस जोंस (सेंट लुई चिकित्सा विश्वविद्यालय के स्कूल) हमें शुरू करने के लिए इन विट्रो अलग सिर तैयार करने के लिए । इस सहयोग के समर्थन के लिए धन जीवविज्ञान विभाग (रॉबर्ट एस चेस फंड), अकादमिक अनुसंधान समिति, और Lafayette कॉलेज में तंत्रिका विज्ञान कार्यक्रम द्वारा प्रदान किया गया था । अंत में, यह काम श्री फिल Auerbach, जो निधन 28 सितंबर २०१६ को समर्पित है; वह एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप कार्यमुक्त और इस प्रोटोकॉल में उपयोग के लिए अपनी 5 अक्ष चरण की उपयोगिता को मांयता दी । उनकी दोस्ती और उपाय कुशलता बहुत याद किया जाएगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Red-eared slider turtles Kons Scientific Trachemys scripta elegans Large size (carapace length 15-20 cm)
Sodium chloride Sigma-Aldrich Co. LLC. S5886
Potassium chloride Sigma-Aldrich Co. LLC. P5405
Magnesium choride Sigma-Aldrich Co. LLC. M7304
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich Co. LLC. S5761
Dextrose Sigma-Aldrich Co. LLC. C5767
Concentrated hydrochloric acid Sigma-Aldrich Co. LLC. H7020
Calcium chloride Sigma-Aldrich Co. LLC. C7902
pH meter Oakton pH 6+
Suction stimulation electrode A-M Systems 573000 Bipolar suction electrode. Note that 573000 has been replaced with 573050.
Capillary glass A-M systems 626000 Single-barrel borosilicate capillary glass without microfilament, length 10 cm, outside diameter 1.0 mm, inner diameter 0.50 mm
Alternative suction stimulation electrode A-M Systems 573050 Bipolar suction electrode. Requires larger diameter capillary glass: 627000, outside diameter 1.2 mm, inner diameter 0.68 mm
Stereoscope Lieca GZ7 Magnification range, 10x – 70x
Fiber optic light source Amscope HL250-A 150W Fiber optical microscope illuminator light box
Rongeurs Carolina Biological Supply Company 625654 stainless steel, straight spring, 5.25"
Blunt dissection probe Carolina Biological Supply Company 627405 Huber mall probe, double-ended probe and seeker, 6"
Microscissors Carolina Biological Supply Company 623555 Iris microdissecting scissors, stainless steel, 0.5" blades, 4.75" long
Fine forceps Sigma-Aldrich Co. LLC. F6521 Jewelers forceps, dumont No. 5, inox alloy, 4.25"
Curved forceps Sigma-Aldrich Co. LLC. Z168696 Medium tip, curved forceps, stainless steel, 4"
Scalpel handle Sigma-Aldrich Co. LLC. S2896 Scalpel handles, No. 3, stainless steel
Scalpel blade Sigma-Aldrich Co. LLC. S2771 Scalpel blades, No. 11, steel
Guillotine Harvard Apparatus 73-1918 Kleine guillotine type 7575
Spatula Sigma Z648299 Micro spoon and spatula weighing set. Use small spatula: 5.9” long x 0.07” diameter handle with square end: 0.17” x 1.3” long, other end round: 0.17” x 1.27” long
Hook Autozone 98069 SureBilt hook and pick set. Use grinder to dull sharp points of hook to prevent injury to animals mouth.
95/5% O2/CO2 Airgas, Inc. X02OX95C2003102 5% Carbon dioxide balance oxygen certified standard gas mixture, size 200 Cylinder, CGA-296
Regulator Airgas, Inc. Y11244D296-AG Single stage brass 0-100 psi analytical cylinder regulator CGA-296 with needle outlet. Use brass adjustable airline pipe valve to go from 3/8", inner diameter, vinyl airline tubing connected to regulator to a 3/16", inner diameter, airline connection going to airstone or glass pasteur pipette.
Adjustable airline pipe valve Doctors Foster and Smith CD-12061 Brass valve
Rigid table Unknown Unknown Auto-clave door laid on top of a sturdy table. Nine 5" diameter tennis balls isolate vibrations from the top surface of the table.
5" tennis ball Petco Animal Supplies, Inc. 712868 Petco Jumbo Pet Tennis Ball: balls are unsliced and held within an integrated frame on the underside part of the autoclave door.
Alternative vibration isolation table Newport Corporation INT1-36-6-N Rigid vibration control system, integrity 1: Surface dimensions, 3' x 6'
Gimbal ISI, International Scientific Instruments, Inc. Stage from SUPER III-A Scanning EM 5-axis eucentric stage: X, Y, and Z linear movements, ±20 mm, 0.1 mm precision; Rotations, vertical, ±10°, and horizontal, ±12.5°, with 1.25° precision. Note: from decommission instrument.
Chuck for gimbal Unknown Unknown Chuck from an old microtome of unknown manufacture was machined to fit the shaft of the specimen holder of the Scanning EM stage
Alternative gimbal ThorLabs, Inc. GN2/M with MBT602/M Dual-axis goniometer (GN2/M) mounted on 3-axis microblock stage with thumbscrew adjusters (MBT602/M): design a chuck to hold turtle head with eye at 12.7 mm above top surface of goniometer (distance to point of rotation)
Video-based eye tracking system Arrington Research, Inc. ViewPoint EyeTracker, PC-60 Tracking method: Infrared video by dark pupil; Black and white camera (Item BC02): 30 Hz, 640 x 480; System requirements: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Visual range: Horizontal +/- 44°; vertical +/- 20°; Accuracy ~0.5°; Spatial resolution ~0.15°; Pupil size resolution ~0.03 mm; Eye data: X, Y position of gaze, pupil height and width, torsion, delta time, total time, and regions of interest (ROI); Real-time communication (Item 0022): 4-Channel AnalogOut with eight TTL input channels to mark codes into the data file
Multi-position magnetic base Harbor Freight Tools Pittsburg, item #5645 Magnetic holder reaches up to 12" and produces 45 lbs. of magnetic pull. Use to position camera. Machine thread holes onto the end of the rod to mount cameras.
Micromanipulator Kopf 900 5 axis manipulation for mount of suction electrode: X, Y, Z linear travel, 2 axis of rotation
Dissection scope on boom Lieca GZ6 Magnification range, 6.7x – 40x
Nerve/muscle stimulator Astro-Med Grass Telefactor Grass S88 Dual pulse voltage stimulator: two output channels that can be operated independently or synchronized to generate non-isolated constant voltage pulses (10 mv to 150 V). Pulses can be single (10 μsec to 10 sec), repetitive (0.01 Hz to 1 KHz), and trains (1 ms to 10 s) and synchronized with TTL inputs and output. Send TTL outputs via the output channels of a DB25 connector to the TTL input channels of the ViewPoint EyeTracker. Note: Astro-Med Grass Telefactor is no longer in business.
Current isolation device Astro-Med Grass Telefactor PSIU6 Current stimulus isolation unit: enables safe delivery of constant currents by the S88 to the preparation. The PSIU6 connects by a BNC cable to one of the output channels of the S88. Multiplier switches on the PSIU6 allow the S88 to generate a wide array of current amplitudes ranging from 0.1 µA to 15 mA.
Alternative nerve/muscle stimulator with isolation A-M Systems 2100 Isolated Pulse Stimulator: Unit has built-in isolator to produce constant currents.

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References

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  2. Lutz, P. L., Rosenthal, M., Sick, T. J. Living without oxygen: turtle brain as a model of anaerobic metabolism. Mol Physiol. 8, 411-425 (1985).
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  4. Storey, K. B. Anoxia tolerance in turtles: Metabolic regulation and gene expression. Comp Biochem Physiol A-Mol Integr Physiol. 147 (2), 263-276 (2007).
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नेत्र कीनेमेटीक्स द्वारा मापा <em>इन विट्रो</em> कछुए में कपाल नसों की उत्तेजना
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Cano Garcia, M., Nesbit, S. C., Le,… More

Cano Garcia, M., Nesbit, S. C., Le, C. C., Dearworth Jr., J. R. Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle. J. Vis. Exp. (136), e56864, doi:10.3791/56864 (2018).

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