Summary
يهدف هذا البروتوكول إلى تحقيق الهندسة السطحية من جزيرات البنكرياس باستخدام نانوكواتينج ستاربيج أدرجت الهيبارين عن طريق الكيمياء بيورثوجونال الزائفة بين مجموعات نانوكواتينج-هيدروكسيسوكسينيميدي نومجموعات أمين من جزيرة ليلى غشاء الخلية.
Abstract
يمكن حماية الخلية السطحية هندسة الخلايا مزروع من المضيف محصنة ضد الهجوم. فإنه يمكن أيضا إعادة تشكيل المناظر الطبيعية الخلوية لتحسين وظيفة الاختلاس والبقاء على قيد الحياة بعد زرع الأعضاء. هذا البروتوكول يهدف إلى تحقيق الهندسة السطحية من جزيرات البنكرياس نانوكواتينج سامسونج ستاربيج أدرجت الهيبارين (Hep-شماعة) استخدام. لتوليد نانوكواتينج Hep-شماعة للهندسة السطحية جزيرة البنكرياس، تم تصنيعه الهيبارين سوكسينيميديل succinate (الهيبارين--دائرة الصحة الوطنية) أولاً قبل التعديل أفرقتها كاربوكسيلات استخدام N-(3-dimethylamino propyl)-ن '-إيثيل كاربودييميدي هيدروكلوريد (تنمية الصادرات) و N-هيدروكسيسوكسينيميدي (NHS). ثم شكلت الخليط شماعة Hep crosslinking الأمينية فونكتيوناليزيد نهاية ثمانية مسلحين ستاربيج (ستاربيج-(NH2)8) والهيبارين--دائرة الصحة الوطنية. لطلاء السطح جزيرة ليلى، عزلت الجزيرات الماوس عبر كولاجيناز الهضم وتنقية التدرج باستخدام هيستوباك. ثم يعاملون الجزر المنعزلة مع الحل شماعة Hep الباردة الجليد لمدة 10 دقيقة للسماح الربط التساهمي بين دائرة الصحة الوطنية والمجموعات أمين من غشاء الخلية جزيرة ليلى. نانوكواتينج مع Hep-شماعة تتحمل تعديل الحد الأدنى لحجم جزيرة ليلى ووحدة التخزين وهيبارينيزيشن من الجزر مع شماعة Hep قد يقلل أيضا من لحظة رد فعل التهابات الدم بوساطة أثناء زرع جزيرة ليلى. هذا النهج "سهلة--إلى--اعتماد" معتدل ما يكفي للهندسة السطحية للخلايا الحية دون المساس بسلامة الخلية. وبالنظر إلى أن الهيبارين قد أظهرت تقارب ملزمة السيتوكينات متعددة، نانوكواتينج Hep-شماعة كما يوفر منصة مفتوحة تتيح إدماج الوسطاء البيولوجية الوظيفية غير محدود وأسطح متعددة الطبقات للمعيشة سطح الخلية الهندسة الحيوية.
Introduction
محدود الفعالية العلاجية للعلاجات المستندة إلى الخلية باستبقاء خلية منخفضة وبقاء الفقراء1،2. من أجل تحسين نتائج العلاج خلية، والخلية الهندسة السطحية عن طريق التلاعب الانزيمية، تم تصريف الببتيد والكيمياء بيورثوجونال وتغليف المادية مع الحيوية المستغلة3،4، 5،6،،من78،،من910. البروتوكول الحالي يهدف إلى تحقيق الهندسة السطحية للخلايا الحية باستخدام أسلوب "سهلة--إلى--اعتماد" بتطبيق نانوكواتينج سامسونج ستاربيج أدرجت الهيبارين (الهيبارين-شماعة) سطح الخلية. هندسة السطح من جزيرات البنكرياس وعرضت هنا كمثال نظراً للطبيعة غير المتجانسة لجزر لانجرهانز وتحط نتائج زرع جزيرة السريرية الحالية.
وفي الواقع، زرع جزيرة السريرية تتم حاليا عن طريق الحقن المباشر للجزر الصغيرة المعزولة في الوريد البابي الكبدي وهذا الإجراء متوفر فقط للمرضى انتقائية بسبب ندرة المواد المانحة وانخفاض الفعالية العلاجية 11-تقليديا، كانت الجينات مادة بيولوجية الأكثر استخداماً لتغليف جزيرة ليلى وتعديل السطح، على الرغم من أنها أقل من مثالية بسبب عدم الاستقرار الكيميائي للجينات والمتصلة بالتهابات التليف12، 13. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع الحجم الطبيعي للجزر الصغيرة التي تتراوح ما بين 100 إلى 200 ميكرون، كبسولات رقيقة الجينات-جزيرة صغيرة جداً أكبر، تتراوح ما بين 400 و 800 ميكرون، التي تتجاوز المسافة نشرها الفسيولوجية للأوكسجين. تغليف جزيرة الامتثالي، أي.، تغليف الجزر دون تغيير كبير في حجم جزيرة ليلى، ووضعت بعد ذلك. وهكذا، ترسب نانوميمبرانيس تتألف من الوتد، تترافلورو، غشاء السيليكون أو نانوكواتينج متعدد الطبقات (يعرف أيضا باسم تقنية "طبقة بطبقة" [LBL]) أبلغ، الأمر الذي أدى إلى تحسن في المختبر بقاء جزيرة14 ،،من1516،،من1718، على الرغم من أن نهج LBL كثير من الأحيان يتطلب الجزيرات واسعة تسليم الفترة لترسب طبقات متعددة، مما قد يعرض للخطر بقاء جزيرة ليلى . وعلاوة على ذلك، تثير عدم استقرار نانوميمبرانيس التي تعتمد على التفاعلات الالكتروستاتيكي أو التساهمية بين طبقات بيوميمبراني أو التفاعلات مسعور بين نانوميمبرانيس وسطح جزيرة ليلى أيضا شواغل9،14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
عامل آخر يحد أن يرهن العلاجية نتيجة زرع جزيرة إينترابورتال هو لحظة الدم بوساطة التحريضية رد فعل (إيبمير) الناجمة عن الاتصال المباشر من الجزيرات مزروع بالدم، أسفر عن تراكم الصفائح الدموية، تخثر الدم ويضر المناعي أو التنشيط الخلوية غير مرغوب فيها9. لمعالجة هذه المشاكل، أعد نانوكواتينج رقيقة جداً تتكون من البولي إيثيلين على شكل نجمة غليكول (ستاربيج) للمنشأة توافق مع الحياة وبراعة كجزيرة الإسكان المواد. الهيبارين، جليكوسامينوجليكان نسبة عالية، وأدرج أيضا في نانوكواتينج ستاربيج لخصائصه المضادة للالتهابات، والمضادة تخثر والقدرة على تيسير الأوعية الدموية بتجنيد برو-الأوعية عوامل النمو22، 23.
Protocol
1-تلفيق أدرجت الهيبارين نانوكواتينج ستاربيج
-
التوليف من الهيبارين سوكسينيميديل succinate (الهيبارين--دائرة الصحة الوطنية)
- تزن بها ز 0.69 الهيبارين وتذوب في 2.0 مل الماء المثلج منزوع.
- تزن بها ز 0.23 لدائرة الصحة الوطنية وتذوب في 0.5 مل الماء المثلج منزوع في قارورة مستديرة القاع.
- تزن بها ز 0.77 لتنمية الصادرات وتذوب في 0.5 مل الماء المثلج منزوع في قارورة مستديرة القاع.
- مزيج من الحلول قارورة القاع المستديرة دائرة الصحة الوطنية، وتنمية الصادرات. اترك الحل المختلط على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- الطرد المركزي خليط "الصادرات دائرة الصحة الوطنية" في 5,031 س ز لمدة 10 دقيقة لإزالة الزائدة تنمية الصادرات ودائرة الصحة الوطنية.
- إضافة 30 مل إيثانول البارد إلى خليط الحل وأجهزة الطرد المركزي في 5,031 س ز لمدة 10 دقائق.
- كرر مرتين.
-
إعداد نانوكواتينج ستاربيج-الهيبارين
- إضافة مل 1.0 من 10% (w/v) ستاربيج-(NH2)8 قارورة مستديرة القاع.
- إضافة مل 0.67 من 10% (w/v) الهيبارين--دائرة الصحة الوطنية إلى قارورة أسفل الجولة نفسها.
- وضع مختلط حل ستاربيج-(NH2)8 والهيبارين--دائرة الصحة الوطنية في حاضنة عند 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للحصول على حل واضح مع اللزوجة.
ملاحظة: للتجارب التي كان الهيبارين المسمى فلوريسسينتلي (الاتحاد الماليزي-الهيبارين) المطلوبة، اختﻻق الإجراء هو نفسه إلا بعد أن تم حله (NH2)-شماعة-ستار8 في المياه. وتستكمل مع 5(6)- كاربوكسيفلوريسسين ن-سوكسينيميديل إستر 0.1% (نسبة المولى) ستاربيج-(NH2)8. )
-
وصف نانوكواتينج شماعة الهيبارين قبل "فورييه تحويل الأشعة تحت الحمراء الطيفي" (FT الأشعة تحت الحمراء)
- قبل البدء، شطف الجهاز هاون ومدقة والتكوير عقيق (أقراص صغيرة بقطر 13 مم) مع الأسيتون والمياه. الجاف للأواني في فرن قبل الاستخدام.
- ميكس حوالي 0.1 – 1% عينة شماعة الهيبارين مع 200-250 ملغ مسحوق ناعم شركة KBr.
- وضع شماعة الهيبارين وخليط KBr في الهاون عقيق وناعما يطحنون في الكريات الصغيرة مع أقطار 2 ميكرومتر.
- تحويل المزيج إلى جهاز بيليتينج. تطبيق قوة ضغط عالية (8 ر/سم2) في فراغ لمدة 1 – 2 دقيقة لتشكيل الكريات شفافة.
- اجذب الكريات عينة بعيداً عن الجهاز بيليتينج. احرص على عدم الانسحاب من الصعب جداً أن لا تحمل الشقوق.
- نقل الكريات العينة بعناية فائقة "المطياف فورييه الأشعة تحت الحمراء تحويل" لتحديد التركيب الكيميائي عينة.
-
دراسة هياكل المسامية الداخلية نانوكواتينج شماعة الهيبارين التي تم مسحها ضوئياً المجهر الإلكتروني (SEM)
- للإجراءات التالية، وإعداد لوحة الثقافة القياسية 48-بئر الخليوي والماصات.
- "الماصة؛" الحل كوبوليمر شماعة الهيبارين في آبار لوحة الثقافة 48-جيدا.
- تجميد اللوحة في-80 درجة مئوية ح 24.
- ليبوفيليزي العينات في-50 درجة مئوية في بيئة فراغ (0.1 السلطة الفلسطينية) ح 24.
- تنتشر عينات عبر السطح لزجة كعب الألومنيوم.
- معطف العينات مع الذهب ومراقبة تحت المجهر الإلكتروني الممسوحة ضوئياً لمراقبة الهياكل المسامية الداخلية.
-
فحص السطح نانوكواتينج شماعة الهيبارين مجهر القوة الذرية (AFM)
- تنظيف الشرائح الزجاجية السليكا مع الحل البيرانا (70 ٪ ح2هكذا4، 30 ٪ ح2س2) عند 80 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
- Sonicate الشرائح في الميثانول لمدة 10 دقائق ثم في التولوين لمدة 10 دقائق.
- الجاف للشرائح بالتجفيف الفراغ.
- يغسل الشرائح مع الكثير الحل 3-أمينوبروبيل-تريثوكسيسيلاني (2% في التولوين)، هزة بلطف.
- Sonicate الشرائح في الميثانول لمدة 10 دقائق ثم في التولوين لمدة 10 دقائق.
- المكان 100 ميليلتر من 3% الهيبارين-شماعة الحل عبر سطح الشرائح باستخدام ماصة قياسية.
- دراسة سطح الوتد الهيبارين تحت مجهر قوة ذرية (تردد مدوية من 50 – 80 كيلو هرتز، قوة ثابتة 0.350 ن م 21، نصيحة دائرة قطرها 600 nm).
2. الماوس جزيرة هندسة السطح مع الهيبارين-شماعة نانوكواتينج
-
جزيرة ليلى الماوس طلاء السطح مع الهيبارين-شماعة نانوكواتينج
- استخراج الجزيرات الماوس كولاجيناز الهضم وهيستوباك التدرج وتنقية كما سبق ذكره في جوف19.
- Handpick الجزيرات 200 تحت مجهر تشريح لأنبوب 1.5 مل.
- إضافة 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني للجزر الصغيرة وأجهزة الطرد المركزي في x 503 ز لمدة 1 دقيقة.
- الإقلاع المادة طافية وإضافة 250 ميليلتر من الحل الهيبارين-شماعة وإبقاء الخليط على الجليد لأدنى 10 ماصة صعودا وهبوطاً للسماح للجزر الصغيرة مزيج جيد مع الحل الهيبارين-الوتد.
- أجهزة الطرد المركزي في x 503 ز لمدة 1 دقيقة.
- إزالة المادة طافية وإضافة 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. "الماصة؛" صعودا ونزولاً مزيج جيد.
- الطرد المركزي في x 503 ز لمدة 1 دقيقة وإزالة المادة طافية والاحتفاظ الجزر الصغيرة لاستخدامها مرة أخرى. لفحص جزيرات الماوس المغلفة مع الهيبارين-شماعة، استخدمت الاتحاد الماليزي-الهيبارين-شماعة لطلاء جزيرة اتباع الخطوات التالية.
-
فحص جزيرات الماوس المغلفة مع نانوكواتينج الاتحاد الماليزي-الهيبارين-شماعة
- 1 – 2 مل من 1640 RPMI تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين للجزر الصغيرة المغلفة إضافة وتحويل هذه الجزر إلى طبق ثقافة بكتيرية عقيمة غير مشحونة.
- نلاحظ إشارات الاتحاد الماليزي-الهيبارين-شماعة المغلفة نانوكواتينج الجزر الصغيرة تحت مجهر مقلوب الأسفار التشكل والأسفار.
3-وظيفة الهيبارين-شماعة المغلفة الجزيرات الماوس مقارنة بالجزر الصغيرة غير المغلفة
-
جدوى جزيرات الهيبارين-شماعة مغلفة الماوس
- Handpick 20 الجزيرات الماوس الهيبارين-شماعة المغلفة ووضعها في بئر واحدة للوحة الثقافة خلية 96-جيدا.
- تعبئة ما مجموعة 10 آبار مع الهيبارين-شماعة مغلفة الماوس الجزيرات 20 لكل بئر.
- Handpick 20 جزيرات التحكم نونكواتيد ووضعها في بئر واحدة لوحة الثقافة نفس خلية 96-جيدا.
- تعبئة ما مجموعة 10 آبار مع 20 من الجزيرات التحكم نونكواتيد لكل بئر.
- وضع 200 ميليلتر من 1640 RPMI تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين في كل بئر من لوحة 96-جيدا يحتوي على الجزر الصغيرة، والحفاظ على الثقافة لمدة 14 يوما.
- استبدال وسائط الثقافة جزيرة ليلى كل يومين.
- علاج الجزر الصغيرة مع العيش/ميت تلطيخ كيت في نهاية مدة 14 يوما في الثقافة ولاحظ تحت مجهر مقلوب الأسفار.
- عد الخلايا بي+ (أحمر) داخل كل جزيرة تحت مجهر مقلوب fluorescence.
-
عودة التوعي من الهيبارين-شماعة مغلفة بالماوس جزيرات في المختبر
- قبل تبرد جميع اللدائن التجريبية بما في ذلك لوحة الثقافة وماصة نصائح على الأقل 12 ح قبل الاستخدام.
- ضع مكاناً جيدا 24 على لوح تبريد. إضافة 250 ميليلتر من الجليد الباردة ماتريجيل انخفض عامل النمو في كل من لوحة الثقافة خلية 24-جيدا جيدا. ضع لوحة 24-جيدا المغلفة عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- حين يتم وضع مصفوفة الحل في الثلاجة، تريبسينيزي جزيرة البنكرياس الماوس غشائي الخلايا ميل سفين 1 (MS1).
- إزالة كافة وسائط الثقافة من قارورة زراعة الأنسجة. شطف قارورة مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
- إزالة برنامج تلفزيوني وأضف 3 مل يدتا التربسين. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقيقة في حاضنة قياسية.
- طفيفة اضغط على أسفل قارورة فصل الخلايا، وإضافة 5 مل من المصل تستكمل وسائل الإعلام.
- جمع الخلايا إلى 15 مل أنبوبة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق.
- خلع المادة طافية وإضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني. "الماصة؛" صعودا ونزولاً مزيج جيد.
- الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق وتقلع المادة طافية.
- إضافة وسائط دميم تستكمل المصل في الأنبوب والبذور 50,000 الخلايا في كل من لوحة 24-جيدا الحل المغلفة مصفوفة جيدا.
- إضافة 5 الجزيرات الهيبارين-شماعة المغلفة أو التحكم نونكواتيد الجزر الصغيرة في كل بئر.
- إضافة وسائط دميم تستكمل المصل في كل بئر بما مجموعة 500 ميليلتر كل بئر.
- الاحتفال بتشكيل أنبوب بعد الحضانة ح 4 و 24 ساعة تحت مجهر خفيفة.
-
إفراز الأنسولين الجلوكوز-وحفز من الجزيرات الهيبارين-شماعة المغلفة
ملاحظة: لتقييم ما إذا كان نانوكواتينج سوف تؤثر على وظيفة الماوس الجزر الصغيرة، تم تقييم إفراز الأنسولين الجلوكوز-وحفز الهيبارين-شماعة المغلفة والجزر نونكواتيد.- Handpick 30 الجزيرات الهيبارين-شماعة المغلفة أو الجزر نونكواتيد التحكم في أنبوب 1.5 مل واحد. تعد كل من إجمالي 10 أنابيب للجزر الصغيرة المغلفة والجزر نونكواتيد.
- أضف 1 مل حل الملح الفسيولوجية وتستكمل مع 2 ملمول/لتر جلوكوز20 واحتضان في 37 درجة مئوية ح 2.
ملاحظة: لوصفه الحل الملح الفسيولوجي، يرجى الرجوع إلى الجدول 1. الحفاظ على الحد أقصى أنابيب فضفاضة أثناء الاحتضان في الحاضنة. - إزالة الحل قدر الإمكان.
- حفز الجزيرات بإضافة 600 ميليلتر من الحل الملح الفيزيولوجي وتستكمل مع 20 ملمول/لتر الجلوكوز في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- جمع 200 ميليلتر من المادة طافية من كل أنبوبة للأنسولين طقم أليسا الكمي استخدام الأنسولين تجارية أليسا.
Representative Results
نانوكواتينج شماعة الهيبارين تم تصنيعه بتصريف ستاربيج-(NH2)8 والهيبارين استخدام دائرة الصحة الوطنية وتنمية الصادرات كاقتران وكلاء (الشكل 1). فحص التركيب الكيميائي نانوكواتينج الهيبارين-شماعة متر، الأشعة تحت الحمراء وكما هو مبين في الشكل 2، يمكن ملاحظة قمم مميزة الهيبارين في سم 3,300-3,600-1، المطابق لمجموعات الهيدروكسيل الهيبارين (الشكل 2 أحمر). الانخفاض في السعة الذروة في سم 3,300 – 3,600– 1 (الشكل 2 الأزرق) يمثل الاقتران بين ستاربيج-(NH2)8 مجموعات أميد ومجموعة الكربونيل الهيبارين. السعة من ذروة سم 1,650-1 يناظر أميد الكربونيل تمتد الاهتزاز انخفض أيضا، مما يشير إلى رد فعل كاف بين مجموعات كاربوكسيلات الهيبارين مع سوكسيناتي سوكسينيميديل وأمين ستاربيج-(NH2) 8-فحص الهيكل السطحي من نانوكواتينج شماعة الهيبارين مجهر القوة الذرية وهو مبين من لو et al.، نانوكواتينج كان ما يقرب من 30 نانومتر في الطول و 2 ميكرومتر في العرض مع ميزات المسامية الصغيرة (البقع الداكنة) تتراوح بين بين 100 إلى 200 نانو متر في القطر10. كما تؤكد البيانات المستقاة من الفحص المجهري الإلكتروني الممسوحة ضوئياً بنية مسامية عالية المترابطة الهيبارين-شماعة (الشكل 3)، يوحي بأنها يمكن أن تكون مناسبة لبقاء الخلية أثناء الولادة الحية.
فحص طلاء السطح من الجزر المعزولة الماوس والنحو المبين في الشكل 4، طبقة رقيقة من نانوكواتينج، سيظهر بالأسفار الأخضر أودع بالتساوي عبر سطح الجزر الصغيرة المغلفة دون أحداث تغييرات واضحة على جزيرة ليلى/حجم وحدة التخزين. أثناء الطلاء، من المستحسن أن تبقى الجزر على الجليد للمحافظة على بقائها. وبالمثل، فترة طلاء، 10 دقيقة في هذه الحالة، كان أيضا الأمثل للسماح للحفاظ على بقاء الجزر الصغيرة. تجدر الإشارة إلى أن لمراقبة أفضل نانوكواتينج، الميكروسكوب الإلكتروني أن يفحص المقاطع العرضية للجزر الصغيرة المغلفة كما ذكر سابقا9،16 سيكون من الأنسب، على الرغم من أن يتم إنشاء البيانات من الجزر الصغيرة الثابتة والمضمنة بدلاً من الجزيرات المعيشة في الثقافة.
وكان فيما يتعلق البقاء على قيد الحياة والدالة المغلفة الجزر الصغيرة وجزيرة ليلى عودة التوعي ومهامها في المقررة في المختبر. النظر في الخصائص المفيدة الهيبارين، الروغان الهيبارين على سطح جزيرة يمكن أن تسهل عودة التوعي جزيرة ليلى في الثقافة، ومن ثم قدرته على البقاء. وقد لاحظنا أن الجزر الماوس الهيبارين-شماعة مغلفة معارضها بقاء جزيرة قوية في الثقافة (الشكل 5). إلى حد كبير أكثر تقدما بتشكيل الأوعية الدموية كان واضح أيضا من جزيرة ليلى خلايا بطانية (MS1) التي كانت مثقف يشترك مع الهيبارين-شماعة مغلفة بالجزر الصغيرة، أشارت إلى هياكل تشبه ميكروفيسيل ممدود وهياكل تشبه شبكة الأوعية الدموية (الرقم 6 ).
عملية نانوكواتينج التي تكبدتها لا تأثير الأنسولين الجلوكوز-وحفز قدرة الافرازية من الجزيرات الهيبارين-شماعة المغلفة. لوحظ انخفاض مستوى إفراز الأنسولين في كل معاملة الفئات عندما كانت perfused الجزر الصغيرة مع الحل الملح الفسيولوجية وتستكمل مع سوبستيمولاتوري مستوى الجلوكوز (2 ملمول/لتر؛ الشكل 7). عندما كانت تحفز الجزر الصغيرة على مستوى أعلاه فسيولوجية من الجلوكوز (20 ملمول/لتر جلوكوز)، لوحظت زيادة في إفراز الأنسولين في كل معاملة الجماعات.
رقم 1: التركيب الكيميائي لشماعة Hep نانوكواتينج للهندسة السطحية جزيرة البنكرياس. طلاء الجزيرة حققت crosslinking التساهمية بين الهيبارين--دائرة الصحة الوطنية والامينات الأولية داخل غشاء الخلية ونجمة-شماعة-(NH2)8. وتمتلك كل جزيء الهيبارين عدة مجموعات الكربوكسيل، الذي تم تعديله لجماعة دائرة الصحة الوطنية كل. مجموعات الكربوكسيل تنشيط المستشفيات سوف تتفاعل مع الأمينات الأولية للبروتين للروابط أميد النموذج، عبر التي استقرت نانوكواتينج شماعة Hep والجزر الصغيرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : المجففة طيف الأشعة تحت الحمراء نجمة-شماعة-(NH2)8، الهيبارين وشماعة Hep نانوكواتينج في الدولة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الممسوحة ضوئياً صور المجهر الإلكتروني لشماعة Hep في الدولة المجففة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
4 الرقم: الصور التمثيلية من الهيبارين-شماعة مغلفة بالجزر الصغيرة تحت المجهر fluorescence.
وكان الهيبارين المسمى مسبقاً مع الاتحاد الماليزي (يظهر باللون الأخضر). الصور هي الممثل للجزر 100. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
5 الرقم: الجزيرات الهيبارين-شماعة المغلفة أظهرت جدوى جزيرة قوية. (أ) البيانات المعروضة كالخطأ القياسي mean± من وسائل، n = 50 الجزيرات كل مجموعة. (ب) عرضت الخلايا الحية في الخلايا الخضراء والميت باللون الأحمر. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الصور هي الممثل للجزر الصغيرة 50. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: ييسر نانوكواتينج شماعة الهيبارين داخل جزيرة ريفاسكولاريسيشن- ماتريجيل أنبوب تشكيل خلايا MS1 مثقف يشترك مع الهيبارين-شماعة مغلفة الجزر الصغيرة والجزر الصغيرة التحكم نونكواتيد. أخذت الصور في 4 و 24 h. مقياس بار = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
7 الرقم: نانوكواتينج الهيبارين-شماعة تتحمل أي تغيير في وظيفة إفراز الأنسولين ايميا. الهيبارين-شماعة الجزر الصغيرة المغلفة والجزيرات التحكم نونكواتيد (30 كل) تعرضوا ل 2 mmol/لتر (شريط بيضاء) أو 20 الجلوكوز mmol/لتر (شريط أسود) عن 30 دقيقة إفراز الأنسولين استجابة ل 20 ملمول/لتر جلوكوز كانت قابلة للمقارنة بين المغلفة والتحكم في الجزر الصغيرة. تظهر البيانات ك ± يعني الخطأ القياسي للوسائل، n = 10. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
في هذه المقالة، نظهر "سهلة--إلى--اعتماد" نهج للمعيشة سطح الخلية الهندسية نانوكواتينج ستاربيج أدرجت الهيبارين عن طريق الكيمياء بيورثوجونال الزائفة بين مجموعات نانوكواتينج-هيدروكسيسوكسينيميدي ن أمين جماعات من جزيرة ليلى البنكرياس الغشاء السطحي. والواقع أن المجموعات الأمينية داخل أغشية الخلية بشدة رد الفعل، ونتيجة لذلك أبلغت دراسات سابقة عن التفاعلات بين المجموعات الأمينية الأساسية مع N-هيدروكسيسوكسينيميديل (NHS) إستر المنشط تحت الظروف الفسيولوجية14 ،،من1621. وعلاوة على ذلك، أفادت بحوث مستفيضة أن إدماج الهيبارين، جليكوسامينوجليكان نسبة عالية وعنصرا هاما من عناصر المصفوفة خارج الخلية، أثناء تغليف جزيرة صغيرة، يمكن أن يؤدي إلى زرع بعد تعزيز عودة التوعي وانخفاض22،إيبمير23. نظراً لتوافق مع الحياة الوتد وخصائص متعددي الهيبارين، استخدمنا شماعة المسلحة 8 القصوى الهيبارين تحميل خلال تلفيق نانوكواتينج. تعديل الهيبارين مع--دائرة الصحة الوطنية، التي سترد فيما بعد مع المجموعات2 -NH على غشاء الخلية جزيرة ليلى. بتمكين تكوين رابطة تساهمية بين-NH2 (من غشاء الخلية) ودائرة الصحة الوطنية--Hep-شماعة، الجزر الصغيرة سوف تكون سهولة "مغلفة" الوتد أدرجت الهيبارين، وبالتالي تشكيل طبقة رقيقة نانو (نانوكواتينج) على السطح الخارجي للبنكرياس الجزر الصغيرة.
أن النهج الحالي يختلف عن أساليب سبق نشرها أيضا تحديده شماعة البوليمر الرئيسية لجزيرة ليلى الكبسلة المصغرة في أن كيمياء بيورثوجونال الزائفة بين دائرة الصحة الوطنية--(من نانوكواتينج) و-NH2 الخلية جزيرة ليلى وقد استخدم الغشاء. ونظرا لأن استقرار جزيرة ليلى/خلية الطلاء، لا سيما في بيئة معقدة مثل البلازما، أمر حاسم لزرع ما بعد عودة التوعي والبقاء على قيد الحياة، وتشكيل بين دائرة الصحة الوطنية--NH2 سيكون أكثر استقرارا بالمقارنة مع مسعور التفاعل بين الوتد وغشاء الخلية24، التفاعلات الالكتروستاتيكي9،15،24،،من2526 أو الصلة البيولوجية بين البيوتين ستريبتافيدين14.
وبالإضافة إلى ذلك، على النقيض من جزيرة ليلى طلاء نهج يعتمد على نهج LBL مع الفترة التعامل مع جزيرة ممتدة لترسيب طبقة متعددة14،16،25، هذا الأسلوب أيضا يتطلب الحد الأدنى فترة طلاء التجهيز وقصيرة جداً من الجزر المعزولة. كل هذه العوامل ضرورية للبقاء على قيد الحياة بعد زرع جزيرة ليلى نظراً لبقاء الجزر الصغيرة غالباً ما سبق عزلة جزيرة التالية الشبهة بسبب تلف ECM أثناء الهضم الأنزيمي. ومع ذلك، هو القيد واحد من النهج الحالي، خلافا LBL، عبر التي يمكن التحكم في سمك الطلاء الخارجي بزيادة أو خفض عدد ترسيب طبقة، لا تتناسب مع سمك نانوكواتينج Hep-شماعة في الوقت الحاضر.
وعلاوة على ذلك، سبب حالة خفيفة حيث قابلاً للتفاعل الكيميائي بين دائرة الصحة الوطنية--ويجري فيه2 -NH، النهج الحالي للخلية الحية سطح الهندسة لا تقتصر على جزيرات البنكرياس، ولكن معظم الخلايا العلاج. بالإضافة إلى ذلك، وبالنظر إلى أن الهيبارين هو معروف للتفاعل مع مجموعة من السيتوكينات وجزيئات نشطة بيولوجيا، نانوكواتينج Hep-شماعة يعرض أيضا منصة مفتوحة له إمكانية إدراج الوسطاء البيولوجية غير محدود، وكذلك واجهات للهندسة سطح الخلية أكثر تعقيداً.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن ممتنون للدعم المالي للصناديق العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (31770968) وبرنامج بحوث تيانجين لمؤسسة التطبيق والتكنولوجيا المتقدمة (17JCZDJC33400).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| PBS | Hyclone | AAJ207798 | |
| Streptozototin | Sigma | S0130 | |
| Histopaque | Sigma | 10831 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 31800022 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Cell Dissociation Solution | GIBCO, by Life Technologies | 13150-016 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12800017 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644 | |
| 488 phalloidin | Sigma | A12379 | |
| CFSE | Sigma | 21888-25mg-F | |
| Annexin V/PI apoptosis kit | Dojindo | AD10 | |
| DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Collagenase from Clostridium, Type XI | Sigma | C7657 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| NHS | Sigma-Aldrich | 56480 | |
| EDC | Sigma-Aldrich | 3449 | |
| 8-armed PEG | J&K Scientific Ltd | 1685176 | |
| FAM | Sigma-Aldrich | M041100 | |
| 5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21888 | |
| KBr | J&K Scientific Ltd | 32036 | |
| 3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| toluene | J&K Scientific Ltd | S-15497-20X | |
| Live/dead staining kit | Biovision, US | K501 | |
| BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reduced | BD Bioscience | 354230 | |
| Sodium chloride, 99.5% | J&K Scientific Ltd | 105864 | |
| Potassium chloride, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 991468 | |
| Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 988639 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 182158 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 128839 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis | J&K Scientific Ltd | 119370 | |
| Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2 | J&K Scientific Ltd | 21114 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | V900933 | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA kit | Millipore-linco | EZRMI-13K |
References
- Ke, T., et al. Netrin-1 ameliorates myocardial infarction-induced myocardial injury: mechanisms of action in rats and diabetic mice. Hum Gene Ther. 25 (9), 787-797 (2014).
- Ke, T., et al. Co-transplantation of skin-derived precursors and collagen sponge facilitates diabetic wound healing by promoting local vascular regeneration. Cell Physiol Biochem. 37 (5), 1725-1737 (2015).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287 (5460), 2007-2010 (2000).
- Sarkar, D., et al. Engineered cell homing. Blood. 118 (25), 184-191 (2011).
- Kato, M., Mrksich, M. Rewiring cell adhesion. J Am Chem Soc. 126 (21), 6504-6505 (2004).
- Cheng, H., et al. Stem cell membrane engineering for cell rolling using peptide conjugation and tuning of cell-selectin interaction kinetics. Biomaterials. 33 (20), 5004-5012 (2012).
- Merzaban, J. S., et al. Cell surface glycan engineering of neural stem cells augments neurotropism and improves recovery in a murine model of multiple sclerosis. Glycobiology. 25 (12), 1392-1409 (2015).
- Silvescu, C. I., Sackstein, R. G-CSF induces membrane expression of a myeloperoxidase glycvariant that operates as an E-selectin ligand on human myeloid cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10696-10701 (2014).
- Zhi, Z. L., et al. Assembly of bioactive multilayered nanocoatings on pancreatic islet cells: incorporation of alpha1-antitrypsin into the coatings. Chem Commun (Camb). 51 (53), 10652-10655 (2015).
- Lou, S., et al. Pancreatic islet surface bioengineering with a heparin-incorporated starPEG nanofilm. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 78, 24-31 (2017).
- Orlando, G., et al. Cell replacement strategies aimed at reconstitution of the beta-cell compartment in type 1 diabetes. Diabetes. 63 (5), 1433-1444 (2014).
- Kollmer, M., et al. Long-term function of alginate-encapsulated islets. Tissue Eng Part B Rev. 22 (1), 34-36 (2015).
- Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. J Diabetes Complications. 29 (5), 737-743 (2015).
- Kizilel, S., et al. Encapsulation of pancreatic islets with nano-thin functional polyethylene glycol coatings for enhanced insulin secretion. Tissue Eng. Part A. 16, 2217-2228 (2010).
- Zhi, Z. L., et al. Nano-scale encapsulation enhances allograft survival and function of islets transplanted in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 55, 1081-1090 (2012).
- Gattas-Asfura, K. M., Stabler, C. L. Layer-by-layer deposition of antifouling coatings on stainless steel via catechol-amine reaction. ACS Appl. Mater. Interfaces. 5, 9964-9974 (2013).
- Kollmer, M., et al. Long-term function of alginate-encapsulated islets. Tissue Eng. Part B Rev. 22 (1), 34-46 (2015).
- Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. J. Diabetes Complicat. 29, 737-747 (2015).
- Zmuda, E. J., et al. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Gey, G. O., Gey, M. K. The maintenance of human normal cells and tumor cells in continuous culture. I. Preliminary report: Cultivation of mesoblastic tumors and normal tissue and notes on methods of cultivation. Am. J. Cancer. 27, 45-76 (1936).
- Chen, X., et al. Site-selective azide incorporation into endogenous RNase A via a "chemistry" approach. Org. Biomol. Chem. 11, 353-361 (2013).
- Cabric, S., et al. Anchoring of vascular endothelial growth factor to surface-immobilized heparin on pancreatic islets: implications for stimulating islet angiogenesis. Tissue Eng. Part A. 16, 961-970 (2010).
- Cabric, S., et al. Islet surface heparinization prevents the instant blood-mediated inflammatory reaction in islet transplantation. Diabetes. 56, 2008-2015 (2007).
- Asif, S., et al. Heparinization of cell surfaces with short peptide-conjugated PEG-lipid regulates thromboinflammation in transplantation of human MSCs and hepatocytes. Acta Biomater. 35, 194-205 (2016).
- Teramura, Y., et al. Microencapsulation of cells, including islets, within stable ultra-thin membrane of maleimide-conjugated PEG-lipid with multifunctional crosslinkers. Biomaterials. 34 (11), 2683-2893 (2013).
- Zhi, Z., et al. Multilayer nanoencapsulation: A nanomedicine technology for diabetes research and management. Diabetes Res. Clin. Pract. 100, 162-169 (2013).
