Summary
このプロトコルを目指して、ナノコーティングのN-グループと膵島のアミン グループ間の擬似 bioorthogonal 化学を介してヘパリン含有 starPEG ナノコーティングを使用して膵島の表面加工細胞膜。
Abstract
細胞表層工学は、ホストの免疫の攻撃から注入された細胞を保護します。移植機能を改善するために細胞の風景を変形することがも、移植後の生存。このプロトコルは、極薄ヘパリン-株式会社 starPEG (Hep PEG) ナノコーティングを使用して膵島の表面加工を目指しています。ヘパリン染色コハク酸 (ヘパリン-NHS) 膵島表面工学 Hep ペグ ナノコーティングを生成するためのカルボキシル基を n--(3-dimethylamino propyl) を使用しての改造によって合成されたN'-エチル カルボジイミド塩酸 (EDC) とNヒドロキシスクシンイミド (NHS)。Hep PEG 混合物はアミノ末端 8 武装 starPEG (starPEG-(NH2)8) とヘパリン NHS の架橋によって形成されたし。膵島の表面コーティング、マウスの膵島はコラゲナーゼの消化力と Histopaque を使用してグラデーションの浄化によって分離されました。膵島は、NHS と膵島細胞膜のアミン グループの結合を許可する 10 分間氷冷 Hep PEG 溶液と扱われたし。Hep ペグとナノコーティングは膵島のサイズに最小限の変更とボリュームと Hep ペグと小島のパリン投与群も膵島移植中にインスタントの血液を介した炎症反応を減らすことができます。この「簡単-導入するため"のアプローチ、細胞生存率を損なうことなく生きている細胞の表面加工の穏やかなです。無制限機能生物学的仲介人および生活のため多層表面の結合を可能にするオープンなプラットフォームを提供します、また Hep ペグ ナノコーティングをヘパリンが複数サイトカインに結合親和性を示していることを考えると、細胞表面バイオ エンジニア リング。
Introduction
細胞ベースの治療法の治療効果は、低細胞保持と貧しい人々 の生存1,2によって制限されます。細胞療法の転帰を改善、細胞表層工学酵素操作を介して、するためにペプチド共役、bioorthogonal 化学、生体材料の物理的なカプセル化されて悪用された3,4、 5,6,7,8,9,10。現在のプロトコルは、極薄ヘパリン-株式会社 starPEG (ヘパリン-PEG) ナノコーティングを細胞表面に適用することによって「簡単-導入するため「法を用いた生細胞の表面加工を目指しています。膵島の表面加工が発表されたランゲルハンス島と現在臨床膵島移植の中傷の成果の異種の性質として紹介。
確かに、臨床膵島移植、肝門脈に膵島を直接注入によって実行されます現在、この操作はのみ選択的患者のドナー材料と低治療有効性の不足のため11. アルギン酸の炎症関連線維症の12、化学的不安定性による理想的な未満が従来、アルギン酸がカプセル化膵島と表面改質のための最も一般的に使用される生体材料にされています。 13。さらに、100 に 200 μ m の間の範囲島の本来のサイズと比較して、アルギン酸アイレット マイクロ カプセルが大きくなり、400 と 800 μ m の間で及ぶこれは酸素の生理学的な拡散距離を超えます。等角アイレット カプセル化、すなわち。 はそれから開発され、膵島ボリュームの大幅な変更することなく島をカプセル化します。したがって、ナノの成膜から成るペグ、テトラフルオロ エチレン、シリコン膜や多層ナノコーティング (「--層」[LBL] 技法として知られている) が報告されたが、改良体外アイレット生存14 の結果17,18,, ,,1516LBL は頻繁にアプローチが必要な広範な膵島の生存を危険にさらす可能性があります複数のレイヤーの沈着量の期間を渡す.また、生体膜層のナノと膵島の表面の疎水性相互作用静電または共有結合性の相互作用に依存するナノの不安定性も懸念9,14を発生させます,15,16,22,23,24,25,26。
門脈内の膵島移植の治療成績を妨げる別の要因は、インスタント血液を介した炎症反応 (IBMIR) 血、血小板凝集の結果で移植膵島の直接的接触によるもの凝固、免疫悪影響または望ましくない細胞活性9。これらの問題に対処するため星形ポリエチレン ・ グリコール (starPEG) から成る超薄型ナノコーティングは確立された生体適合性と汎用性膵島ハウジングの材質として準備されました。高硫酸化グリコサミノグリカン、ヘパリンは抗炎症、抗凝固剤のプロパティのプロ血管新生増殖因子22を勧誘することによって血管新生を促進する能力 starPEG ナノコーティングでも設立 23。
Protocol
1. ヘパリン含有 Starpeg ナノコーティングの作製
-
ヘパリン染色コハク酸 (ヘパリン-NHS) の合成
- ヘパリンの 0.69 g を量り、2.0 mL の冷たい脱イオン水に溶解します。
- NHS の 0.23 g を量り、0.5 mL の丸底フラスコに冷たい脱イオン水に溶解します。
- EDC の 0.77 g を量り、0.5 mL の丸底フラスコに冷たい脱イオン水に溶解します。
- 丸底フラスコの NHS と EDC ソリューションをミックスします。室温で 30 分間室温でベンチに混合液を残します。
- EDC と NHS の過剰を削除する 10 分間 5,031 x gで EDC NHS の混合物を遠心分離機します。
- 混合液と 5,031 x gで 10 分間遠心する冷たいエタノール 30 mL を追加します。
- 2 回繰り返します。
-
StarPEG ヘパリン ナノコーティングの準備
- 丸底フラスコに 1.0 mL の 10% (w/v) starPEG-(NH2)8を追加します。
- 同じ丸底フラスコに 10% (w/v) ヘパリン NHS の 0.67 mL を追加します。
- 粘度の明確な解を得るために 20 分間の 25 ° c の定温器に starPEG-(NH2)8とヘパリン NHS の混合液を配置します。
注: 蛍光に分類されたヘパリン (FAM ヘパリン) が必要でした、実験の作製手順は同じ星 - ペグ-(NH2)8は 5(6) - を添加した脱イオン水に溶解したことを除いてcarboxyfluorescein N- 染色エステル 0.1% (モル比) starPEG-(NH2)8の。)
-
フーリエ変換の赤外分光法 (FT-IR) によるヘパリン ペグ ナノコーティングのキャラクタリゼーション
- 始める前に、アセトンと脱イオン水瑪瑙臼・杵・ ペレット化装置 (直径 13 mm の小さなディスク) をすすいでください。使用前にオーブンでガラス製品を乾燥させます。
- ミックス約 0.1-1% ヘパリン ペグ サンプル KBr の微粉の 200-250 mg。
- めのう乳鉢でヘパリン ペグと KBr の混合物を配置し、2 μ m の直径を持つ小さなペレットに細かく粉砕します。
- ペレット化装置に混合物を転送します。透明ペレットを形成するために 1-2 分のための真空の高圧縮力 (8 T/cm2) を適用します。
- ペレット化デバイスからサンプル ペレットを軽く引いてください。ひび割れが発生しないようにあまりにもハードを引っ張らないように注意してください。
- サンプルの化学構造を決定するフーリエ変換赤外分光にサンプル ペレットを非常に慎重に転送します。
-
スキャンの電子顕微鏡 (SEM) によるヘパリン ペグ ナノコーティングの内部の多孔質構造の検討
- 次の手順では、標準の 48 ウェルの細胞培養プレートとピペットを準備します。
- 48 ウェル培養プレートのウェルに、ヘパリン PEG 溶液をピペットします。
- 24 時間-80 ° C でプレートを固定します。
- Lypophilize 真空環境下で-50 ° C でサンプル (0.1 Pa) 24 時間。
- アルミ スタブの粘着面に試料を分散します。
- 金箔サンプルをコートし、内部の多孔質構造を観察するスキャンの電子顕微鏡下で観察。
-
原子間力顕微鏡 (AFM) によるヘパリン ペグ ナノコーティング面の検討
- ピラニア溶液で石英ガラスをきれい (70% H2SO4, 30% H2O2) 40 分 80 ° C で。
- 10 分間トルエン、メタノール 10 分でスライドを超音波照射します。
- 真空乾燥によってスライドを乾燥させます。
- 3-アミノプロピル-プタデカフルオロテトラヒドロデシルトリエトキシシラン ソリューション (2% トルエン溶液)、振盪たっぷりスライドを洗います。
- 超音波照射の 10 分、10 分間トルエン メタノールのスライド
- 標準のピペットを使用してスライドの表面に 3% ヘパリン止め釘の解決の場所 100 μ L。
- 原子間力顕微鏡下でヘパリン ペグの表面を調べる (50-80 kHz の共振周波数力定数の 0.350 N m 21、先端半径 600 nm)。
2. マウス膵島表面工学ヘパリン ペグ ナノコーティング
-
マウス膵島表面被覆ヘパリン ペグ ナノコーティング
- コラゲナーゼ消化と histopaque グラデーション浄化以前にゼウス19の報告によってマウスの膵島を抽出します。
- 1.5 mL チューブに解剖顕微鏡の下で 200 の小島を手で摘みます。
- 500 μ L の PBS を追加すると、島と 503 × gで 1 分間遠心します。
- 上澄みを取るそしてヘパリン止め釘の解決の 250 μ L を追加し、10 分ヘパリン止め釘の解決と混ぜて島を許可するように上下にピペットの氷の混合物を保ちます。
- 503 × gで 1 分間遠心します。
- 上澄みを除去し、500 μ L の PBS を追加します。上下のピペットをよく混ぜます。
- 1 分 503 × gで遠心分離し、上澄みを除去し、さらに使用するため島を維持します。マウス島ヘパリン PEG 被覆の検討、FAM ヘパリン ペグ小島塗装手順を次の使用しています。
-
マウス島 FAM ヘパリン ペグ ナノコーティングでコーティングの検討
- コーティングへ 10% 牛胎児血清添加 RPMI 1640 の 1-2 の mL を追加し、非課金細菌培養皿に膵島を転送します。
- 倒立蛍光顕微鏡下で FAM ヘパリン ペグ ナノコーティング コーティング島の形態と蛍光信号を観察します。
3. ヘパリン ペグの機能コーティング マウス膵島の非コーティングと比較して
-
ヘパリン PEG 被覆マウス島の生存率
- ヘパリン PEG 被覆マウス島の 20 手で摘むし、96 ウェル細胞培養プレートの 1 つのウェルに配置します。
- 各ウェルの 20 ヘパリン PEG 被覆マウス島で合計 10 の井戸を埋めます。
- Noncoated コントロール島の 20 を手で摘むし、同じ 96 ウェルの細胞培養プレートの 1 つのウェルに配置。
- 各ウェルの 20 の noncoated コントロール島で合計 10 井戸を埋めます。
- 島を含む 96 ウェル プレートの各ウェルに 10% 牛胎児血清添加 RPMI 1640 200 μ L を入れて、14 日間培養を維持します。
- 2 日おきの島文化メディアを交換します。
- ライブ/死んで文化で 14 日間の終わりにキットを染色し、倒立蛍光顕微鏡下で観察の小島を扱います。
- 倒立蛍光顕微鏡下で各膵島内の PI+ (赤) のセルをカウントします。
-
ヘパリン ・ ペッグの血行再建被覆マウス島体外
- あらかじめ培養プレートを含む実験のすべてのプラスチックを冷たいやピペット ヒントを使用する前に少なくとも 12 時間。
- 場所 24 ウェル冷却パッド。氷を 250 μ l 添加 24 ウェル細胞培養プレートの各ウェルに冷たい成長因子減少マトリゲル。少なくとも 30 分のための 4 ° C でコーティングされた 24 ウェル プレートを配置します。
- 冷蔵庫の中にマトリックス ソリューションを設定すると、マウスの膵島マイル スヴェン 1 (MS1) 内皮を trypsinize します。
- 組織培養用フラスコから文化のすべてのメディアを削除します。5 ml の PBS のフラスコをすすいでください。
- PBS を取り外して、トリプシン-EDTA の 3 mL を加えます。標準のインキュベーターで 3 分の 37 ° C で孵化させなさい。
- セルをデタッチし、5 mL の血清添加培地を追加に、フラスコの底を軽くたたきます。
- 15 mL 遠心管 1,000 x gで 5 分間遠心し、細胞を収集します。
- 上清を離陸し、5 mL の PBS を追加します。上下のピペットをよく混ぜます。
- 1,000 x gで 5 分遠心し、上清を脱ぐ。
- チューブに血清添加 DMEM メディアを追加し、マトリックスのソリューション コート 24 ウェル プレートの各ウェルに 50,000 細胞を播きます。
- 各ウェルに 5 のヘパリン PEG 被覆島または小島 noncoated コントロールを追加します。
- 各ウェルに血清添加 DMEM メディアを 500 μ L/ウェルの合計に追加します。
- 光学顕微鏡の下で 4 時間および 24 時間培養後のチューブ形成を観察します。
-
ヘパリン PEG 被覆小島のグルコース刺激によるインスリン分泌
注: ナノコーティング マウス膵の機能に影響を与えるかどうかを評価するためにヘパリン PEG 被覆と noncoated 島のグルコース刺激によるインスリン分泌を評価しました。- 30 ヘパリン PEG 被覆島または小島 noncoated コントロール 1 つ 1.5 mL チューブに手で摘みます。コーティングされた小島の 10 管の合計と noncoated 島の各を準備します。
- 2 ミリ モル/L ブドウ糖20を添加した生理食塩水 1 mL を追加し、37 ° C 2 時間インキュベートします。
注: 生理的食塩水のレシピ、表 1を参照してください。インキュベーターで孵化中に緩んでチューブのキャップをしてください。 - 可能な限りのソリューションを削除します。
- 30 分の 37 ° C で 20 ミリ モル/L のグルコースを添加した生理的食塩水の 600 μ L を追加することによって島を刺激します。
- 商業インシュリン ELISA を用いた ELISA 定量キット インスリン各管からの上清 200 μ L を収集します。
Representative Results
ヘパリン ペグ ナノコーティングは starPEG-(NH2)8と EDC と NHS カップリング剤 (図 1) として使用してヘパリンの抱合によって合成されました。FT-IR によるヘパリン ペグ ナノコーティングの化学構造を調べたし、3,300-3,600 cm-1ヘパリン (図 2 の水酸基に対応するヘパリンの特徴的なピークが観察される可能性が図 2のように、赤)。3,300-3,600 cm-1 (図 2 青) でピークの振幅の減少は、starPEG-(NH2)8アミド基とヘパリン カルボニル基と共役を表します。アミドに対応する振幅ピーク 1,650 cm-1のカルボニルの伸縮振動も減少しました、ヘパリンを染色コハク酸のカルボキシル基とアミンの starPEG-(NH2) 十分な反応を示す8. ヘパリン ペグ ナノコーティングの表面構造を原子間力顕微鏡で調べた、ルーらを示し、ナノコーティングされた約 30 nm まで小さな多孔性機能 (黒い斑点) が幅 2 μ m と高さ100 に 200 の間で直径10nm。スキャンの電子顕微鏡検査から得られたデータはまた、生体内で配信中に細胞の生存に適したことを示唆しているヘパリン ・ ペッグ (図 3) の高い相互接続された多孔質の構造を確認します。
マウス単離膵島の表面塗装を調べたし、緑の蛍光性によって示されているナノコーティングの薄層だった小島ボリューム/サイズで明らかに変化を引き起こすことがなく均等に堆積コーティングされた島の表面に図 4に示されるように。コーティングの中には、小島、生存を維持するために氷の上を維持することをお勧めします。同様に、コーティング期間 10 分この場合、また最適化された膵性の保守を実現します。それは、ナノコーティングのよりよい観察のため電子顕微鏡として以前に報告された9,16コート小島の断面を検査するだろうとより適切なデータが生成されますが注目に値する文化で生きている島ではなく固定と埋め込まれた島。
についての生存と機能コーティング島、小島血行再建術との機能のin vitro評価をされています。ヘパリンの有益な特性を考慮した膵島表面にヘパリン化は文化とその生存の膵島を血行再建術を促進できます。我々 は、堅牢な膵島文化 (図 5) で生存をヘパリン PEG 被覆マウス島に展示を観察しました。血管形成を大幅に高度なヘパリン ペグと共培養した膵島内皮細胞 (MS1) からも明らかコーティングした細長い微小血管のような構造とネットワークのような血管構造 (図 6 で示された島).
ナノコーティング プロセスはヘパリン PEG 被覆小島の効果グルコース刺激によるインスリン分泌能力を発生しません。ブドウ糖 (2 ミリ モル/L; の sub-stimulatory レベルを添加した生理食塩水で灌流膵インスリン分泌の低下がみられたすべての治療群で図 7)。小島にグルコース (血糖値 20 mmol/L) の超生理的レベルで刺激されたときインスリン分泌の増加はすべての治療群で観察されました。
図 1:膵島表面工学 Hep ペグ ナノコーティングの化学構造。小島塗料は、ヘパリン NHS と細胞膜と星 - ペグ-(NH2)8内第一級アミンと共有結合で架橋によって達成されました。各ヘパリン分子では、NHS グループ各に変更された複数のカルボキシル基のグループを所有しています。NHS 活性化カルボキシル基がフォーム アミド結合、Hep ペグと島のナノコーティングが安定しており、タンパク質の第一アミンと反応します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:スター - ペグ-(NH2)8ヘパリンで Hep ペグ ナノコーティングの赤外線スペクトルは乾燥状態です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:乾燥状態で Hep ペグの電子顕微鏡画像をスキャンします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:ヘパリン ペグの代表的な画像被覆蛍光顕微鏡下で小島。
ヘパリンは、FAM (緑色で表示) と事前ラベルでした。イメージは、100 の島の代表です。スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5:ヘパリン PEG 被覆島展示堅牢なアイレット生存します。Nの手段の mean± 標準エラーとして表示される(A)データ = グループあたり 50 の島。(B)生きている細胞は赤で緑と死んだ細胞で示されていた。スケールバー = 100 μ m の範囲の画像が 50 の島の代表。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6:ヘパリン ペグ ナノコーティング内小島血行再建術が容易になります。ヘパリン PEG 被覆島と noncoated コントロール小島 MS1 細胞のマトリゲル管形成。4、24 h. スケール バーで撮影を行った = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7:ヘパリン ペグ ナノコーティングは膵インスリン分泌機能の変化を生じません。ヘパリン-PEG 被覆島と noncoated コントロール島 (30) が 2 ミリ モル/L (白いバー) にさらされたまたは 30 分 20 ミリ モル/L ブドウ糖にインスリン分泌 20 mmol/L (黒いバー) ブドウ糖は、コーティング間で比較した島を制御し、。データは、 nの手段の平均 ± 標準誤差として表示されます = 10。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
この記事での生活のための"簡単-導入するため「アプローチを示す細胞表層工学ナノコーティングのN-グループ間の擬似 bioorthogonal 化学を介してヘパリン含有 starPEG ナノコーティングと膵島表面膜のアミン グループ。確かに、細胞膜内のアミノ基は非常に反応性とその結果、以前の研究は14 の生理学的条件下で活性化のN- hydroxysuccinimidyl (NHS) エステルの第一アミノ基間の相互作用を報告しています。 ,16,21。さらに、広範な研究は、カプセル化膵島の中にヘパリン、高硫酸化グリコサミノグリカンおよび細胞外のマトリックスの重要なコンポーネントの結合が強化された移植後につながることを報告しています。血行再建術と減らされた IBMIR22,23。ペグの生体適合性とヘパリンの多価の特性を考えた、ナノコーティングの作製中に読み込む最大のヘパリンの 8 武装ペグを使いました。ヘパリン -NHS、その後 -NH2基と反応が膵島細胞膜上で変更されました。ヘパリン法人 PEG によって共有結合形成 (細胞膜) の NH の2と - Hep ペグの NHS の間小島は容易に「コーティングする」を有効にすれば、このように膵の外側の表面にナノ薄層 (ナノコーティング) を形成小島。
現在のアプローチはまた擬似 bioorthogonal 化学 -NHS (のナノコーティング) と -NH2膵島細胞の間に島をマイクロ カプセル化の主要な高分子として PEG を選択以前に公開されたメソッドから別膜が使用されました。膵島細胞の安定性を考慮したコーティング、プラズマなどの複雑な環境では特には血行再建後の移植することが重要であり生存、NHS - と -NH2間の地層より安定したに比べてペグと細胞膜24、静電相互作用9,15,24,25,26またはビオチン間生物学的連結間の疎水性相互作用ストレプトアビジン14。
さらに、膵島と対照をなしても多層蒸着14,16,25, 本手法の拡張膵島取扱い期間で LBL のアプローチに依存しているコーティング方法必要最小限です。膵島のコーティングの期間の処理および非常に短いこれらの要因の両方は、島の生存率は頻繁に既に酵素消化中に破損した ECM による侵害の次膵島分離膵島移植後生存に不可欠です。しかし、現在のアプローチの 1 つの制限は、これを介して外のコーティングの厚さを増やすまたは層堆積の数を減らすことによって制御できる LBL とは異なり Hep ペグ ナノコーティングの厚さを当分の間合わせて調整することはできません、です。
さらに、-NHS と -NH2行われる、現在のアプローチ間の化学反応は細胞の軽度の状態により表面ない工学は膵島、しかしほとんどの細胞療法に限る。さらに、ヘパリンはサイトカイン ・生理活性分子の範囲との対話を知られていることを考えると、Hep ペグ ナノコーティング述べる無制限生物調停の成立の可能性があるオープンなプラットフォームと同様複雑な細胞表層工学のためのインターフェイス。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
中国の国家自然科学基金 (31770968) と天津研究プログラムのアプリケーション基盤と高度な技術 (17JCZDJC33400) の支援に感謝しております。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| PBS | Hyclone | AAJ207798 | |
| Streptozototin | Sigma | S0130 | |
| Histopaque | Sigma | 10831 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 31800022 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Cell Dissociation Solution | GIBCO, by Life Technologies | 13150-016 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12800017 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644 | |
| 488 phalloidin | Sigma | A12379 | |
| CFSE | Sigma | 21888-25mg-F | |
| Annexin V/PI apoptosis kit | Dojindo | AD10 | |
| DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Collagenase from Clostridium, Type XI | Sigma | C7657 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| NHS | Sigma-Aldrich | 56480 | |
| EDC | Sigma-Aldrich | 3449 | |
| 8-armed PEG | J&K Scientific Ltd | 1685176 | |
| FAM | Sigma-Aldrich | M041100 | |
| 5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21888 | |
| KBr | J&K Scientific Ltd | 32036 | |
| 3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| toluene | J&K Scientific Ltd | S-15497-20X | |
| Live/dead staining kit | Biovision, US | K501 | |
| BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reduced | BD Bioscience | 354230 | |
| Sodium chloride, 99.5% | J&K Scientific Ltd | 105864 | |
| Potassium chloride, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 991468 | |
| Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 988639 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 182158 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 128839 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis | J&K Scientific Ltd | 119370 | |
| Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2 | J&K Scientific Ltd | 21114 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | V900933 | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA kit | Millipore-linco | EZRMI-13K |
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