Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הנדסה משטח של לנגרהנס עם StarPEG Nanocoating Heparinized

Published: June 23, 2018 doi: 10.3791/56879
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Tianjin Key Laboratory of Biomaterial Research, Institute of Biomedical Engineering, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College

Summary

פרוטוקול זה שואף להשיג הנדסה משטח של לנגרהנס באמצעות nanocoating starPEG שולבו הפארין באמצעות פסאודו-bioorthogonal כימיה בין הקבוצות - hydroxysuccinimide Nשל nanocoating הקבוצות אמין של איון קרום התא.

Abstract

הנדסה פני שטח התא יכול להגן על התאים מושתל מפני התקפות מערכת החיסון המארח. זה יכול לשנות את צורתו גם נוף הסלולר כדי לשפר את תפקוד שתל והישרדות שלאחר השתלת. פרוטוקול זה שואף להשיג הנדסה משטח של לנגרהנס באמצעות nanocoating של starPEG שולבו הפארין זגוגית (Hep-PEG). כדי להפיק את nanocoating Hep-יתד הנדסה משטח הלבלב איון, הפארין succinimidyl succinate (הפארין-NHS) סונתז לראשונה על ידי שינוי של קבוצות carboxylate שלה באמצעות N-(3-dimethylamino propyl) -N'-אתיל carbodiimide הידרוכלוריד (EDC), N- hydroxysuccinimide (NHS). התערובת Hep-יתד ואז נוצרה על ידי crosslinking של אמינו functionalized-סוף ושמונה starPEG (starPEG-(NH2)8), הפארין-NHS. לציפוי השטח איון, העכבר איונים היו מבודדים באמצעות collagenase לעיכול, טיהור מעבר צבע באמצעות Histopaque. איים מבודדים טופלו אז הקרח פתרון Hep-יתד קרים למשך 10 דקות לאפשר קוולנטיות מחייב בין הקבוצות אמין של קרום התא איון NHS. Nanocoating עם המקל-Hep כרוך שינוי מינימלי לגודל איון, ונפח heparinization של איים עם Hep-יתד גם עשוי להפחית מיידית בתיווך דם תגובה דלקתית במהלך השתלת איון. גישה זו "קל-כדי-לאמץ" הוא מתון מספיק עבור הנדסה משטח של תאים חיים מבלי להתפשר על התא הכדאיות. בהתחשב הפארין הוכיח זיקה מחייבת כדי ציטוקינים מרובים, nanocoating Hep-יתד גם מספק פלטפורמה פתוחה המאפשרת התאגדות של מגשרים ביולוגי ללא הגבלה תפקודית ומשטחים רב שכבתית לחיים תא השטח בביו-הנדסה.

Introduction

יעילות טיפולית של טיפולים מבוססי תאים הוא מוגבל על ידי שימור תא נמוך של הישרדות המסכן1,2. על מנת לשפר את התוצאה של טיפולים התא, התא הנדסה השטח באמצעות מניפולציה אנזימטיות, ההטיה פפטיד, כימיה bioorthogonal, כימוס פיזי עם biomaterials כבר מנוצלת3,4, 5,6,7,8,9,10. בפרוטוקול הנוכחי שואפת להשיג הנדסה משטח של תאים חיים באמצעות שיטת "קל-כדי-לאמץ" על-ידי החלת nanocoating starPEG שולבו הפארין זגוגית (הפארין-PEG) של פני השטח של התא. הנדסה משטח של לנגרהנס הוצג כאן כדוגמה בשל אופיו הטרוגנית של איי לנגרהנס ולתוצאות המשפיל של השתלת איון קליני הנוכחי.

אכן, השתלת איון קליני מבוצעת כיום על ידי הזרקה ישירה של איים מבודדים לתוך וריד שער, הליך זה זמין רק עבור חולים סלקטיבי בגלל המחסור התורם חומרים והיעילות הטיפולית נמוך 11. כמקובל, alginate כבר biomaterial הנפוץ ביותר עבור איון כימוס והסבת השטח, למרות שהוא פחות אידיאלי עקב חוסר היציבות הכימית של קילוף פלסטיצידיות, הקשורות דלקתי פיברוזיס12, 13. יתר על כן, בהשוואה לגודל טבעי של איים קטנים הנע בין 100-200 מיקרומטר, מהמיקרו קפסולות alginate-איון הם גדולים, הנעים בין 400 ל-800 מיקרומטר, אשר עולה על המרחק באמצעי פיזיולוגיים של חמצן. איון קונפורמיים כימוס, כלומר. לבצע איונים ללא שינוי משמעותי של איון נפח, פותחה לאחר מכן. כך, הפקדת nanomembranes המורכב פג, tetrafluoroethylene, ממברנות הסיליקון או דווחה nanocoating רב שכבתית (המכונה גם השיטה "--שכבה על" [LBL]), וכתוצאה מכך שיפור במבחנה איון הישרדות14 ,15,16,17,18, למרות LBL הגישה בדרך כלל דורש איונים נרחב מוסר נקודה עבור התצהיר שכבות מרובות, אשר עלול לסכן את הכדאיות איון . יתר על כן, חוסר היציבות של nanomembranes המסתמך על האינטראקציות אלקטרוסטטית או קוולנטיות בין שכבות biomembrane או אינטראקציות הידרופוביות בין nanomembranes לבין השטח איון מעלה גם חששות9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.

גורם מגביל נוסף encumbers את התוצאה הטיפולית של השתלת איון intraportal הוא מיידית בתיווך דם דלקתיות התגובה (IBMIR) הנגרמת על ידי מגע ישיר של איים מושתל עם דם, והתוצאה היא הצטברות של טסיות דם, קרישה החיסון השפעה שלילית או בלתי רצויה ההפעלה הסלולרית9. כדי לטפל בבעיות אלו, nanocoating דקים מורכב בצורת כוכב פוליאתילן גליקול (starPEG) הוכן שלה הביו הוקמה ואת הרב-גוניות כמו איון דיור חומר. הפארין, גליקוזאמינוגליקן sulphated מאוד, גם התאגדה בשנת nanocoating starPEG תכונות אנטי דלקתיות, אנטי מקריש, היכולת להקל על vascularization על-ידי גיוס pro-אנגיוגנזה גורמי גדילה22, 23.

Protocol

1. ייצור של שילב-הפרין Starpeg Nanocoating

  1. סינתזה של הפארין succinimidyl succinate (הפארין-NHS)
    1. שוקלים לצאת 0.69 גר' הפארין, להמיס 2.0 מ של קרח מים יונים.
    2. שוקלים לצאת 0.23 גרם NHS, מתמוסס ב- 0.5 מ של קרח מים יונים בבקבוקון סיבוב המדרגה.
    3. שוקלים לצאת 0.77 גר' EDC, מתמוסס ב- 0.5 מ של קרח מים יונים בבקבוקון סיבוב המדרגה.
    4. מיקס בקופת חולים ופתרונות EDC בבקבוקון סיבוב המדרגה. להשאיר את הפתרון מעורבים על הספסל בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. Centrifuge את התערובת EDC NHS ב x 5,031 g 10 דקות להסיר את עודף EDC NHS.
    6. להוסיף 30 מ של אתנול קר תערובת פתרון, צנטריפוגה ב 5,031 x g למשך 10 דקות.
      1. חזור על פעמיים.
  2. הכנת nanocoating starPEG-הפרין
    1. להוסיף 1.0 מ"ל של 10% (w/v) starPEG-(NH2)8 בקבוקון סיבוב המדרגה.
    2. להוסיף 0.67 מיליליטר 10% (w/v) הפארין-NHS. הבקבוק באותו סיבוב המדרגה.
    3. למקם את הפתרון מעורבות של starPEG-(NH2)8 , הפארין-NHS באינקובטור 25 ° c במשך 20 דקות להשיג פתרון ברור עם צמיגות.
      הערה: עבור ניסויים שבהם נדרשה fluorescently שכותרתו הפרין (FAM-הפרין), בהליך ייצור זהה חוץ מזה (NH2) - יתד - כוכב8 היה מומס במים יונים בתוספת 5(6)- carboxyfluorescein N- succinimidyl אסתר 0.1% (היחס טוחנת) starPEG-(NH2)8. )
  3. אפיון של הפארין-יתד nanocoating על ידי פורייה להפוך ספקטרוסקופית אינפרא אדום (FT-IR)
    1. לפני שמתחילים, לשטוף אגת פצצות מרגמה, כמוה, pelleting המכשיר (קטן דיסקים בקוטר של 13 מ מ) עם אצטון ומים יונים. יבש את הזכוכית בתנור לפני השימוש.
    2. מיקס כ 0.1 – 1% מדגם הפארין-יתד עם 200 – 250 מ"ג KBr אבקה.
    3. מניחים את הפארין-יתד ואת תערובת KBr המליטה אגת, pulverize דק לתוך כדורי פלסטיק קטנים עם קטרים של 2 מיקרומטר.
    4. להעביר את התערובת לתוך מכשיר pelleting. הפעלת כוח דחיסה גבוהה (8 T/cm2) בריק למשך 1-2 דקות ליצור כדורי שקוף.
    5. משוך בעדינות את כדורי דגימה מן המכשיר pelleting. יש להיזהר לא תמשכי חזק מדי, אז לא כרוכות סדקים.
    6. העבר את כדורי מדגם בזהירות רבה פורייה להפוך אינפרא-אדום ספקטרוסקופ לקביעת מבנה כימי מדגם.
  4. בחינת נקבובי המבנים הפנימיים של הפארין-יתד nanocoating על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים סרוקים (SEM)
    1. ההליכים הבאים, להכין צלחת תרבות תא 48-ובכן תקן פיפטות.
    2. Pipette הפתרון קופולימר הפארין-יתד לתוך הבארות של צלחת התרבות 48-. טוב.
    3. להקפיא את הצלחת ב-80 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
    4. Lypophilize הדגימות ב-50 ° C בסביבת ואקום (0.1 הרשות הפלסטינית) במשך 24 שעות ביממה.
    5. להפיץ דוגמאות על פני דביק stub אלומיניום.
    6. מעיל הדגימות עם זהב, להתבונן במיקרוסקופ אלקטרונים סרוקים להתבונן במבנים נקבובי.
  5. בחינת השטח nanocoating הפארין-יתד על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM)
    1. לנקות סיליקה שקופיות זכוכית עם פתרון פיראניה (70% H2אז4, 30% H2O2) ב 80 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.
    2. Sonicate השקופיות ב מתנול למשך 10 דקות ולאחר מכן טולואן למשך 10 דקות.
    3. יבש את השקופיות על-ידי ייבוש ואקום.
    4. לשטוף את השקופיות עם שפע פתרון 3-aminopropyl-triethoxysilane (2% בטולואן), לנער בעדינות.
    5. Sonicate השקופיות מתנול עבור 10 דקות ואז טולואן למשך 10 דקות.
    6. µL מקום 100 בפתרון הפארין-יתד 3% על פני-השטח של השקופיות באמצעות פיפטה סטנדרטי.
    7. לבחון את פני השטח של הפארין-יתד תחת מיקרוסקופ כוח אטומי (תדר התהודה של 50-80 kHz, כוח קבוע של m N 0.350 21, עצה ברדיוס של 600 ננומטר).

2. העכבר איון הנדסה משטח עם הפרין-יתד Nanocoating

  1. ציפוי פני השטח של איון עכבר עם הפרין-יתד nanocoating
    1. לחלץ איונים עכבר על-ידי collagenase עיכול histopaque מעבר צבע וטיהור דיווח כאמור יופיטר19.
    2. לבחור. לאישתך איונים 200 תחת מיקרוסקופ לנתיחה על צינור 1.5 מ.
    3. להוסיף 500 µL ל- PBS איונים, צנטריפוגה ב 503 x g עבור 1 דקות.
    4. . תוריד את תגובת שיקוע, להוסיף 250 µL של הפתרון הפארין-יתד ולהשאיר את התערובת על קרח במשך 10 דקות פיפטה למעלה ולמטה כדי לאפשר את איונים לערבב היטב עם הפתרון הפארין-יתד.
    5. צנטריפוגה ב 503 x g עבור 1 דקות.
    6. הסר את תגובת שיקוע והוסף µL 500 ל- PBS. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב.
    7. צנטריפוגה ב x 503 g עבור 1 דקות, להסיר את תגובת שיקוע ולשמור על איונים לשימוש נוסף. בחינת איונים העכבר מצופה של הפארין-יתד, FAM-הפרין-יתד שימשה לציפוי איון, בצע את הפעולות הבאות.
  2. בחינה של העכבר איונים מצופה את nanocoating FAM-הפרין-יתד
    1. להוסיף 1-2 מ ל RPMI 1640 בתוספת 10% לנסיוב שור העובר איונים מצופה ולהעביר איים אלה לתוך תבשיל שאינו טעון התרבות חיידקי סטרילי.
    2. לבחון את האותות פלורסצנטיות ומורפולוגיה של איים מצופים nanocoating FAM-הפרין-יתד תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה.

3. הפונקציה של הפארין-יתד מצופה איונים העכבר לעומת איים קטנים שאינם מצופים

  1. הכדאיות של הפארין-יתד מצופה העכבר איונים
    1. לבחור. לאישתך-20 איונים העכבר הפארין-יתד מצופה ולמקם אותם לתוך אחד טוב של צלחת תרבות תא 96-ובכן.
    2. למלא סך של בארות 10 20 איונים העכבר הפארין-יתד מצופה במשך כל.
    3. לבחור. לאישתך 20 של שליטה noncoated איים קטנים ולמקם אותם לתוך באר אחת של תרבות 96-ובכן תא באותה הצלחת.
    4. למלא סך של בארות 10 20 איונים שליטה noncoated במשך כל.
    5. לשים 200 µL של RPMI 1640 בתוספת 10% סרום שור עוברית לבאר כל צלחת 96-ובכן המכיל איונים ולתחזק בתרבות למשך 14 ימים.
    6. החלף איון תרבות המדיה כל יומיים.
    7. פנקו את איים קטנים עם חי/מת מכתים ערכת בסוף 14 ימים בתרבות והנצפית תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה.
    8. לספור תאים PI+ (אדום) בתוך כל איון תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה.
  2. Revascularization של הפארין-יתדות מצופה העכבר איים קטנים בתוך חוץ גופית
    1. מראש מגניב כל פלסטיק ניסיוני כולל צלחת תרבות וטיפים פיפטה לפחות 12 שעות לפני השימוש.
    2. במקום מקום 24-טוב על משטח קירור. להוסיף 250 µL של קרח קר Matrigel פקטורי גדילה-מופחתת לתוך כל טוב של צלחת התרבות התא 24-. טוב. מקם את הצלחת 24-ובכן מצופה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות.
    3. בעוד הפתרון מטריקס היא הגדרת במקרר, trypsinize הלבלב איון העכבר אנדותל התאים מייל סוון 1 (MS1).
      1. הסר כל תרבות המדיה הבקבוקון תרביות רקמה. יש לשטוף את הבקבוק עם 5 מ של PBS.
      2. להסיר את PBS ולהוסיף 3 מ"ל של טריפסין-EDTA. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות חממה סטנדרטי.
      3. בקלילות הקש על החלק התחתון של הבקבוק כדי לנתק את התאים ולהוסיף 5 מ ל בתוספת-סרום מדיה.
    4. לאסוף את התאים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל צנטריפוגה ב x 1000 g למשך 5 דקות.
    5. . תוריד את תגובת שיקוע והוסף 5 מ של PBS. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב.
    6. צנטריפוגה ב x 1000 g למשך 5 דקות, להוריד את תגובת שיקוע.
    7. להוסיף סרום-בתוספת DMEM מדיה לתוך הצינור, זרע 50,000 תאים לבאר כל צלחת 24-ובכן מטריקס פתרון-מצופים.
    8. להוסיף 5 איים הפארין-יתד מצופה או שליטה noncoated איונים כל טוב.
    9. להוסיף סרום-בתוספת מדיה DMEM לבאר כל סך של 500 µL לכל טוב.
    10. להתבונן היווצרות שפופרת לאחר אינקובציה 4 שעות ו- 24 h תחת מיקרוסקופ אור.
  3. הפרשת אינסולין הגלוקוז מגורה הפארין-יתד מצופה איונים
    הערה: כדי להעריך אם nanocoating ישפיע על הפונקציה של העכבר איונים, הפרשת אינסולין הגלוקוז מגורה הפארין-יתד מצופה ושל noncoated נאמד.
    1. לבחור. לאישתך 30 איים הפארין-יתד מצופה או שליטה noncoated איים קטנים לתוך צינור 1.5 מ ל אחד. להכין סך של צינורות 10 עבור מצופה איים איים noncoated כל.
    2. להוסיף 1 מ"ל של תמיסת מלח פיזיולוגית, בתוספת mmol/L 2 גלוקוז20 , דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
      הערה: על המתכון של הפתרון מלח פיזיולוגית, עיין טבלה 1. שמור את הכובע של צינורות חופשי במהלך הדגירה בחממה.
    3. הסרת פתרון רב ככל האפשר.
    4. לעורר איים על-ידי הוספת 600 µL של תמיסת מלח פיזיולוגית בתוספת גלוקוז mmol/L 20 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    5. לאסוף µL 200 של תגובת שיקוע כל שפופרת לאינסולין כימות אליסה באמצעות אינסולין מסחרי אליסה קיט.

Representative Results

Nanocoating הפארין-יתד היה מסונתז על ידי ההטיה של starPEG-(NH2)8 , הפארין באמצעות EDC NHS כמו מצמד סוכנים (איור 1). המבנה הכימי של nanocoating הפארין-יתד נבדק על ידי FT-IR, כפי שמוצג באיור2, פסגות האופיינית של הפארין יכול להיות שנצפו ב- 3,300 – 3,600 ס מ-1, התואם קבוצות הידרוקסיל של הפארין (איור 2 אדום). הירידה משרעת השיא-3,300 – 3,600 ס מ-1 (באיור 2 כחול) מייצג את ההטיה בין starPEG - קבוצות אמיד8 של (NH2) לבין קבוצת קרבוניל; הפארין. משרעת השיא 1,650 ס מ-1 מקביל אמיד קרבוניל מתיחה רטט צומצם גם, המציין תגובה מספקת בין הקבוצות carboxylate של הפארין עם succinimidyl succinate אמין של starPEG-(NH2) 8. מבנה פני השטח nanocoating הפארין-יתד נבדק על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי, שהיא מוצגת מ לו. et al., nanocoating היה כ 30 nm, גובה ו 2 מיקרומטר רוחב עם תכונות קטנים מוצרים נקבובי (כתמים כהים) החל בין 100 ל 200 ננומטר בקוטר10. והנתונים שהתקבלו מיקרוסקופיה אלקטרונית סרוקים לאשר גם את מבנה נקבובי מאוד מחוברים של הפארין-יתד (איור 3), רומז כי ייתכן מתאימים להישרדות תא במהלך הלידה אין ויוו.

ציפוי פני השטח של איים מבודדים העכבר נבחנה, כפי שהוצג באיור4, שכבה דקה של nanocoating, המוצגת על-ידי קרינה פלואורסצנטית ירוק היה אחיד שהופקדו על פני איים מצופה ללא גרימת שינויים ניכר על איון/גודל אמצעי האחסון. במהלך ציפוי, מומלץ לשמור את איים על קרח כדי לשמור על יכולת הקיום שלהם. בדומה לכך, תקופת ציפוי, 10 דקות במקרה זה, היה גם אופטימיזציה כדי לאפשר תחזוקה של הכדאיות איונים. ראוי לציין כי התבוננות טובה יותר nanocoating, מיקרוסקופ אלקטרונים זה בוחן את חתכי רוחב של איים מצופה כפי שדווחה בעבר9,16 יהיה מתאים יותר, למרות הנתונים תופק מ איונים קבוע ומוטבעים במקום המגורים איונים בתרבות.

לגבי ההישרדות והתפקוד של איים מצופה, איון revascularization ובפונקציות כבר המוערך ב חוץ גופית. בהתחשב המועילות של הפארין, הפארין functionalization על גבי המשטח איון יכול להקל על איון revascularization בתרבות, וכתוצאה מכך את הישרדותה. הבחנו כי איים העכבר הפארין-יתד מצופה הציג הכדאיות איון חזקים בתרבות (איור 5). מתקדמת יותר באופן משמעותי היווצרות כלי דם הייתה ניכרת גם איון אנדותל תאים (MS1) היו תרבותי משותף עם הפרין-יתד מצופה איונים, המצוין על-ידי מבנים דמויי-microvessel מוארך ומבנים דמויי רשת כלי הדם (איור 6 ).

תהליך nanocoating שנצברו ללא אפקט גירוי גלוקוז לאינסולין יכולת הפרשה של איים קטנים הפארין-יתד מצופה. רמה נמוכה של הפרשת האינסולין נצפתה בכל קבוצות טיפול כאשר איים קטנים היו perfused עם תמיסת מלח פיזיולוגית, בתוספת sub-stimulatory רמת הגלוקוז (2 mmol/L; איור 7). כאשר איים קטנים היו מגורה ברמה העל-פיזיולוגיים של גלוקוז (גלוקוז mmol/L 20), נצפתה עלייה הפרשת האינסולין בכל קבוצות הטיפול.

Figure 1
איור 1: המבנה הכימי של Hep-יתד nanocoating הנדסה משטח הלבלב איון. איון ציפוי הושגה על ידי crosslinking קוולנטיות בין הפרין-NHS אמינים העיקרי בתוך קרום התא, כוכב - יתד - (NH2)8. כל מולקולה הפרין בעל מספר קבוצות carboxyl, אשר שונו יש את קבוצת NHS בכל. הקבוצות carboxyl מופעל NHS יגיבו אמינים העיקרי של חלבון ל טופס אמיד קישורים, דרך אשר התייצב nanocoating Hep-יתד, איונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : ספקטרום אינפרא-אדום של כוכב - יתד - (NH2)8, הפארין ו- Hep-יתד nanocoating ב מיובשים המדינה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: לסרוק תמונות מיקרוסקופיה אלקטרונית של Hep-יתד במצב מיובש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: להחליפן בתמונות של הפארין-יתד מצופה איונים במיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית.
הפארין היה מראש שכותרתה סיפרתי (מוצג בצבע ירוק). התמונות הן נציג של-100 איים קטנים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: הפארין-יתד מצופה איונים הציג הכדאיות איון חזקים. (א) נתונים שהוצגו כמו mean± שגיאת תקן של אמצעים, n = 50 איים קטנים לכל קבוצה. (B) מתאים חיים הוצגו תאים מתים וירוק באדום. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. התמונות הן נציג של 50 איים קטנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: הפארין-יתד nanocoating מקלה אינטרה-איון revascularisation. Matrigel צינור היווצרות של תאים MS1 תרבותי משותף עם הפרין-יתד מצופה איונים ושל שליטה noncoated. התמונות צולמו בבר סולם ה 4 ו- 24 = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: Nanocoating הפארין-יתד כרוך ללא שינוי על תפקוד הפרשת אינסולין איון. הפארין-יתד איונים מצופה, שליטה noncoated איים קטנים (30 כל) נחשפו 2 mmol/L (בר לבן) או גלוקוז 20 mmol/L (פס שחור) במשך 30 דקות הפרשת האינסולין בתגובה גלוקוז mmol/L 20 היה דומה בין מצופה ולשלוט איונים. הנתונים מוצגים זאת אומרת ± שגיאת תקן של אמצעים, n = 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

במאמר זה נדגים "קל-כדי-לאימוץ" גישה לחיים תא השטח הנדסה nanocoating starPEG שולבו הפארין באמצעות פסאודו-bioorthogonal כימיה בין הקבוצות - hydroxysuccinimide Nnanocoating ו אמין קבוצות של הלבלב איון על פני השטח ממברנה. אכן, הקבוצות אמינו בתוך קרום התא הן מאוד תגובתי, כתוצאה מכך, מחקרים מוקדמים יותר דיווחו על אינטראקציות בין קבוצות אמינו ראשי עם אסתר - hydroxysuccinimidyl (NHS) Nשהופעל בתנאים פיסיולוגיים14 16, ,21. יתר על כן, מחקר מקיף דיווחה כי התאגדות של הפארין, גליקוזאמינוגליקן מאוד sulphated, רכיב חשוב מטריצה חוץ-תאית, במהלך איון כימוס, יכול להוביל משופרת שלאחר השתלת revascularization ו- IBMIR מופחת22,23. בהתחשב את התאימות של פג, המאפיינים multivalent של הפארין, השתמשנו פג חמוש 8 עבור הפארין מקסימלי טוען במהלך ייצור של nanocoating. הפארין שונה עם -NHS, אשר לאחר מכן יגיב עם קבוצות2 -NH על קרום התא איון. בכך שהוא מאפשר היווצרות קשר קוולנטי בין -NH2 (של קרום התא) ו- NHS של Hep-פג, איים קטנים להיות ברצון "מצופה" מאת יתדות שולבו הפארין, ובכך יוצרים שכבה ננו-דק (nanocoating) על המשטח החיצוני של הלבלב איונים.

הגישה הנוכחית היא שונה בשיטות שפורסמו בעבר גם נבחר פג הפולימר העיקריים של איון microencapsulation בכימיה פסאודו-bioorthogonal הזה בין -NHS (של nanocoating) -NH2 של תא איון ממברנה שימש. בהתחשב את היציבות של תא איון ציפוי, במיוחד בסביבה מורכבת כמו הפלזמה, הוא חיוני כדי שלאחר השתלת revascularization, הישרדות, היווצרות בין -NHS -NH2 יהיה יותר יציב בהשוואה הידרופוביות האינטראקציה בין פג, קרום התא24, אלקטרוסטאטיות9,15,24,25,26 או הצמדה ביולוגי בין ביוטין streptavidin14.

בנוסף, בניגוד איון גישה ציפוי המסתמך על הגישה LBL עם איון המורחבת תקופת טיפול רב-שכבתית התצהיר14,16,25, הטכניקה נוכח גם דורשת מינימלי עיבוד וקצר מאוד ציפוי פרק איים מבודדים. שני הגורמים הללו חיוניים להישרדות שלאחר השתלת איון, שכן הכדאיות איונים הוא לעיתים קרובות כבר פרוץ הבאים בידוד איון עקב ECM פגום במהלך עיכול אנזימטי. מגבלה אחת של הגישה נוכח זאת, כי, בניגוד LBL, דרך אשר עובי הציפוי החיצוני יכול להיות נשלט על ידי הגדלת או הקטנת מספר שכבה התצהיר, עובי nanocoating Hep-יתד לא יהיה מותאם לעת עתה.

יתר על כן, בשל מצבו מתון איפה ישימה עבור תא חי תגובה כימית בין -NHS ו- NH2 מתקיים, הגישה נוכח פני הנדסה לא מוגבל לנגרהנס, אבל רוב טיפול בתאי. בנוסף, בהתחשב בעובדה כי הפארין ידועה אינטראקציה עם מגוון של ציטוקינים, מולקולות פעילים ביולוגית, nanocoating Hep-יתד גם מציג פלטפורמה פתוחה בעלת הפוטנציאל של התאגדות של מגשרים ביולוגי ללא הגבלה וכן ממשקים עבור תא מורכב יותר על פני השטח הנדסה.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

. אנחנו אסירי תודה על התמיכה הכלכלית של הלאומי מדעי הטבע קרנות של סין (31770968) ואת טיינג'ין תוכנית של יישום קרן מחקר טכנולוגיה מתקדמת (17JCZDJC33400).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
PBS Hyclone AAJ207798
Streptozototin Sigma S0130
Histopaque Sigma 10831
RPMI 1640 GIBCO, by Life Technologies 31800022
Fetal Bovine Serum GIBCO, by Life Technologies 16000-044
Penicillin Streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140
Cell Dissociation Solution GIBCO, by Life Technologies 13150-016
DMEM GIBCO, by Life Technologies 12800017
D-(+)-Glucose solution Sigma G8644
488 phalloidin Sigma A12379
CFSE Sigma 21888-25mg-F
Annexin V/PI apoptosis kit Dojindo AD10
DAPI Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20
Collagenase from Clostridium, Type XI Sigma C7657
Heparin Sigma-Aldrich H3149
NHS Sigma-Aldrich 56480
EDC Sigma-Aldrich 3449
8-armed PEG J&K Scientific Ltd 1685176
FAM Sigma-Aldrich M041100
5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester Sigma-Aldrich 21888
KBr J&K Scientific Ltd 32036
3-aminopropyl-triethoxysilane  Sigma-Aldrich A3648
toluene J&K Scientific Ltd S-15497-20X
Live/dead staining kit Biovision, US K501
BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reduced BD Bioscience 354230
Sodium chloride, 99.5% J&K Scientific Ltd 105864
Potassium chloride, 99%, extra pure J&K Scientific Ltd 991468
Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent J&K Scientific Ltd 988639
Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent J&K Scientific Ltd 182158
Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure J&K Scientific Ltd 128839
Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis J&K Scientific Ltd 119370
Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2 J&K Scientific Ltd 21114
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich V900933
Rat/Mouse Insulin ELISA kit Millipore-linco EZRMI-13K

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ke, T., et al. Netrin-1 ameliorates myocardial infarction-induced myocardial injury: mechanisms of action in rats and diabetic mice. Hum Gene Ther. 25 (9), 787-797 (2014).
  2. Ke, T., et al. Co-transplantation of skin-derived precursors and collagen sponge facilitates diabetic wound healing by promoting local vascular regeneration. Cell Physiol Biochem. 37 (5), 1725-1737 (2015).
  3. Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287 (5460), 2007-2010 (2000).
  4. Sarkar, D., et al. Engineered cell homing. Blood. 118 (25), 184-191 (2011).
  5. Kato, M., Mrksich, M. Rewiring cell adhesion. J Am Chem Soc. 126 (21), 6504-6505 (2004).
  6. Cheng, H., et al. Stem cell membrane engineering for cell rolling using peptide conjugation and tuning of cell-selectin interaction kinetics. Biomaterials. 33 (20), 5004-5012 (2012).
  7. Merzaban, J. S., et al. Cell surface glycan engineering of neural stem cells augments neurotropism and improves recovery in a murine model of multiple sclerosis. Glycobiology. 25 (12), 1392-1409 (2015).
  8. Silvescu, C. I., Sackstein, R. G-CSF induces membrane expression of a myeloperoxidase glycvariant that operates as an E-selectin ligand on human myeloid cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10696-10701 (2014).
  9. Zhi, Z. L., et al. Assembly of bioactive multilayered nanocoatings on pancreatic islet cells: incorporation of alpha1-antitrypsin into the coatings. Chem Commun (Camb). 51 (53), 10652-10655 (2015).
  10. Lou, S., et al. Pancreatic islet surface bioengineering with a heparin-incorporated starPEG nanofilm. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 78, 24-31 (2017).
  11. Orlando, G., et al. Cell replacement strategies aimed at reconstitution of the beta-cell compartment in type 1 diabetes. Diabetes. 63 (5), 1433-1444 (2014).
  12. Kollmer, M., et al. Long-term function of alginate-encapsulated islets. Tissue Eng Part B Rev. 22 (1), 34-36 (2015).
  13. Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. J Diabetes Complications. 29 (5), 737-743 (2015).
  14. Kizilel, S., et al. Encapsulation of pancreatic islets with nano-thin functional polyethylene glycol coatings for enhanced insulin secretion. Tissue Eng. Part A. 16, 2217-2228 (2010).
  15. Zhi, Z. L., et al. Nano-scale encapsulation enhances allograft survival and function of islets transplanted in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 55, 1081-1090 (2012).
  16. Gattas-Asfura, K. M., Stabler, C. L. Layer-by-layer deposition of antifouling coatings on stainless steel via catechol-amine reaction. ACS Appl. Mater. Interfaces. 5, 9964-9974 (2013).
  17. Kollmer, M., et al. Long-term function of alginate-encapsulated islets. Tissue Eng. Part B Rev. 22 (1), 34-46 (2015).
  18. Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. J. Diabetes Complicat. 29, 737-747 (2015).
  19. Zmuda, E. J., et al. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
  20. Gey, G. O., Gey, M. K. The maintenance of human normal cells and tumor cells in continuous culture. I. Preliminary report: Cultivation of mesoblastic tumors and normal tissue and notes on methods of cultivation. Am. J. Cancer. 27, 45-76 (1936).
  21. Chen, X., et al. Site-selective azide incorporation into endogenous RNase A via a "chemistry" approach. Org. Biomol. Chem. 11, 353-361 (2013).
  22. Cabric, S., et al. Anchoring of vascular endothelial growth factor to surface-immobilized heparin on pancreatic islets: implications for stimulating islet angiogenesis. Tissue Eng. Part A. 16, 961-970 (2010).
  23. Cabric, S., et al. Islet surface heparinization prevents the instant blood-mediated inflammatory reaction in islet transplantation. Diabetes. 56, 2008-2015 (2007).
  24. Asif, S., et al. Heparinization of cell surfaces with short peptide-conjugated PEG-lipid regulates thromboinflammation in transplantation of human MSCs and hepatocytes. Acta Biomater. 35, 194-205 (2016).
  25. Teramura, Y., et al. Microencapsulation of cells, including islets, within stable ultra-thin membrane of maleimide-conjugated PEG-lipid with multifunctional crosslinkers. Biomaterials. 34 (11), 2683-2893 (2013).
  26. Zhi, Z., et al. Multilayer nanoencapsulation: A nanomedicine technology for diabetes research and management. Diabetes Res. Clin. Pract. 100, 162-169 (2013).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 136 איי לנגרהנס Nanocoating משטח הנדסה כימיה Bioorthogonal
הנדסה משטח של לנגרהנס עם StarPEG Nanocoating Heparinized
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, J., Lou, S., Kong, D., Li, C.… More

Yang, J., Lou, S., Kong, D., Li, C. Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating. J. Vis. Exp. (136), e56879, doi:10.3791/56879 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter