Summary
이 프로토콜은 nanocoating의 N-hydroxysuccinimide 그룹 및 섬의 아민 그룹 사이의 의사 bioorthogonal 화학을 통해 헤 파 린 통합 starPEG nanocoating를 사용 하 여 췌 장 독도의 표면 공학 달성을 목표로합니다 세포 막입니다.
Abstract
세포 표면 공학 호스트 면역 공격에서 이식된 세포를 보호할 수 있습니다. 그것은 또한 이식 기능을 개선 하기 위해 셀룰러 가로 바꿀 수와 생존 후 이식. 이 프로토콜은 표면 공학 ultrathin 덤플링을 통합 starPEG (형 간염-PEG) nanocoating를 사용 하 여 췌 장 독도의 달성을 목표로 한다. 췌 장 섬 표면 공학에 대 한 형 간염 페그 nanocoating를 생성 하려면 덤플링을 succinimidyl 호박 (헤 파 린-보 건국) 처음 사용 하 여 N-(3-dimethylamino propyl)-그것의 카복실산 그룹의 수정에 의해 합성 되었다N'-에틸 carbodiimide 염 산 염 (EDC) 및 N-hydroxysuccinimide (NHS). 형 간염 페그 혼합물 다음 아미노 끝 기능성된 8-무장 한 starPEG (starPEG-(NH2)8) 및 헤 파 린-보 건국의 가교에 의해 형성 되었다. 섬 표면 코팅, 마우스 독도 콜라 소화 및 Histopaque를 사용 하 여 그라데이션 정화를 통해 격리 했다. 격리 된 독도 다음 NHS와 작은 섬 세포 막의 아민 그룹 사이의 공유 바인딩 수 있도록 10 분 동안 얼음 감기 형 간염 페그 솔루션으로 치료 했다. Nanocoating 형 간염 페그와 부딪히는 섬 크기에 최소한의 변경 하 고 볼륨 및 형 간염 페그와 독도의 heparinization 또한 섬 이식 하는 동안 인스턴트 혈액 중재 염증 반응을 줄일 수 있습니다. "쉬운-을 채택" 이렇게 세포 생존 능력을 타협 하지 않고 충분히 살아있는 세포의 표면 공학에 대 한 가벼운입니다. 형 간염 페그 nanocoating 또한 무제한 기능 생물학 중재자 및 생활에 대 한 다층된 표면 관 수 있도록 개방형 플랫폼 제공 고려 덤플링을 여러 cytokines에 바인딩 선호도 보이고 있다, 세포 표면 생명 공학입니다.
Introduction
세포 기반 요법의 치료 효능은 낮은 세포 보존 및 가난한 생존1,2에 의해 제한 됩니다. 세포 치료의 결과 개선, 효소 조작 통해 표면 공학, 주문 펩 티 드 활용, bioorthogonal 화학 및 생체 재료와 물리적 캡슐화 되었습니다 악용된3,4, 5,6,7,8,,910. 현재 프로토콜 표면 공학 ultrathin 덤플링을 통합 starPEG (헤 파 린-PEG) nanocoating 세포 표면에 적용 하 여 "쉬운-을 채택" 방법을 사용 하는 살아있는 세포의 달성을 목표로 한다. 췌 장 독도의 표면 공학 제시 했다 독도 Langerhans과 현재 임상 작은 섬 이식의 비방 결과의 질적 특성으로 인해 예를 들어 여기.
실제로, 임상 작은 섬 이식 현재 격리 된 독도의 간 문맥으로 직접 주입 하 여 수행 되며이 절차만에 사용할 수 선택적 환자 기증자 재료와 낮은 치료 효능의 부족 때문에 11. 통상, alginate 되었습니다 섬 캡슐화 및 표면 수정에 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 소재 alginate과 관련 된 염증 성 섬유 증12, 화학 불안정성 때문 이상적 미만 이더라도 13. 또한, 100 ~ 200 µ m 사이 배열 하는 독도의 자연 크기에 비해, alginate 섬 microcapsules는 400와 800 µ m 사이 배열 하는 더 큰 산소의 생리 적 확산 거리를 초과 하는 있는. 등각 섬 캡슐화, 즉., 독도 섬 볼륨의 중요 한 변경 없이 캡슐화, 다음 개발 되었다. 따라서, nanomembranes의 페그, tetrafluoroethylene, 실리콘 막의 구성 또는 다층된 nanocoating (일컬어 "레이어-의해-레이어" [LBL] 기술) 향상 된 생체 외에서 섬 생존14 결과 보고 되었습니다. ,,1516,,1718, 비록는 LBL 자주 접근 필요 합니다 광범위 한 독도 섬 생존을 손상 될 수 있는 여러 층의 증 착에 대 한 기간 전달 . 또한, biomembrane 레이어 또는 nanomembranes 및 섬 표면 사이의 소수 성 상호 작용 사이 정전기 또는 공유 상호 작용에 의존 하는 nanomembranes의 불안정성 또한 우려9,14 제기 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
Encumbers intraportal 섬 이식의 치료 결과 또 다른 제한 요소는 즉시 혈액 중재 염증 반응 (IBMIR) 이식된 독도 혈액, 혈소판, 결과와 직접 접촉에 의해 발생 응고 및 면역 부작용 또는 원치 않는 세포 활성화9. 이러한 문제를 해결 하기 위해 별 모양의 폴 리 에틸렌 글리콜 (starPEG)의 구성 하는 울트라 얇은 nanocoating 설립된 생체 적합성과 섬 소재 주택으로 다 준비 되었다. 헤 파 린, 매우 sulphated glycosaminoglycan, 또한 그것의 항 염증 제, 항 응고 제 속성과 vascularization 프로 신생 성장 인자22, 모집 하 여 촉진 수에 대 한 starPEG nanocoating에 통합 되었다 23.
Protocol
1. 헤 파 린 통합 Starpeg Nanocoating의 제조
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헤 파 린 succinimidyl 호박 (헤 파 린-보 건국)의 합성
- 얼음 처럼 차가운 이온된 수의 2.0 mL에 용 해 및 헤 파 린의 0.69 g 밖으로 무게.
- 둥근 바닥 플라스 크에 얼음 처럼 차가운 이온된 수의 0.5 mL에 용 해 및 보 건국의 0.23 g으로 무게.
- 0.5 ml 둥근 바닥 플라스 크에 얼음 처럼 차가운 이온된 수의 분해 및 EDC의 0.77 g을 무게.
- 둥근 바닥 플라스 크에 NHS 및 EDC 솔루션을 믹스. 실 온에서 30 분 동안 실 온에서 벤치에 혼합된 솔루션을 떠나.
- 10 분 초과 EDC와 보 건국 제거 5,031 x g 에 EDC NHS 혼합물 원심
- 혼합 솔루션을 10 분 동안 5,031 x g 에서 원심 분리기의 냉 에탄올 30 mL를 추가 합니다.
- 두 번 반복 합니다.
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StarPEG-헤 파 린 nanocoating의 준비
- 둥근 바닥 플라스 크에 10% (w/v) starPEG-(NH2)8 의 1.0 mL를 추가 합니다.
- 같은 둥근 바닥 플라스 크에 10% (w/v) 헤 파 린-NHS의 0.67 mL를 추가 합니다.
- 점도와 명확한 솔루션을 얻기 위해 20 분에 25 ° C에서 인큐베이터에 starPEG-(NH2)8 및 헤 파 린-보 건국의 혼합된 솔루션을 배치 합니다.
참고: 실험 붙일 레이블된 덤플링을 (FAM-헤 파 린) 필요 했다, 제작 절차는 같은 스타-말뚝-(NH2)8 은 물속에에서 녹아 있는 이온 5(6)-보충 carboxyfluorescein N-succinimidyl 에스테 르 0.1% (어 금 니 비율) starPEG-(NH2)8. )
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푸리에 변환 적외선 분광학 (IR FT)에 의해 헤 파 린 못 nanocoating의 특성
- 시작 하기 전에, 아세톤 및 이온된 수 옥수 박격포와 유 봉 산 장치 (작은 디스크 직경 13 m m)를 씻어. 사용 하기 전에 오븐에서 유리를 건조.
- 좋은 KBr 분말의 200-250 mg와 혼합 약 0.1-1% 덤플링을 못 샘플.
- 옥수 박격포에는 헤 파 린-고 케이시 혼합물을 배치 하 고 2 µ m의 직경을 가진 작은 알 약으로 정밀 하 게 격파.
- Pelleting 장치에 혼합물을 전송 합니다. 투명 한 펠 릿을 형성 하기 위하여 1-2 분 동안 진공에서 높은 압축 힘 (8 T/c m2)를 적용 합니다.
- 부드럽게 당겨 pelleting 장치에서 샘플 펠 릿. 균열 발생을 하지 너무 하드 하지를 주의 해야 합니다.
- 매우 신중 하 게는 푸리에 변환 적외선 분 광 기 샘플 화학 구조를 결정 하는 샘플 펠 릿 전송.
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스캔 한 전자 현미경 (SEM) 의해 덤플링을 못 nanocoating의 내부 다공성 구조 시험
- 다음 절차에 대 한 표준 48-잘 셀 문화 접시와 펫을 준비 합니다.
- 48-잘 문화 접시의 우물에 헤 파 린 못 코 폴리머 솔루션을 플라스틱.
- 24 h-80 ° C에서 플레이트를 고정 합니다.
- Lypophilize 진공 환경에서-50 ° C에서 샘플 (0.1 Pa) 24 h에 대 한.
- 샘플 한 알루미늄 스텁의 스티커 표면에 걸쳐 확산.
- 골드 샘플 코트 그리고 스캔 한 전자 현미경 내부 다공성 구조를 관찰 하 라.
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원자 힘 현미경 (AFM)에 의해 헤 파 린 못 nanocoating 표면 검사
- 실리 카 유리 슬라이드 피 솔루션을 청소 (70% H2이렇게4, 30% H2O2) 40 분 동안 80 ° C에서.
- 10 분 동안 메탄올 그리고 10 분 동안 톨루엔에 슬라이드 sonicate
- 진공 건조 하 여 슬라이드를 건조.
- 3-aminopropyl-triethoxysilane 솔루션 (톨루엔에 2%), 부드럽게 흔들어 많은 슬라이드를 씻어.
- 메탄올 톨루엔 10 분에서 10 분 동안에 슬라이드 sonicate
- 표준 피 펫을 사용 하 여 슬라이드의 표면에 걸쳐 3% 덤플링을 못 솔루션의 장소 100 µ L.
- 헤 파 린-못 된 원자 힘 현미경의 표면 검사 (50-80 kHz의 공 진 주파수 강제 0.350 N m 21, 600의 팁 반경 일정 nm).
2. 마우스 섬 표면 공학 덤플링을 못 Nanocoating
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헤 파 린 못 nanocoating와 마우스 섬 표면 코팅
- 콜라 소화와 histopaque 그라데이션 정화 이전 정돈19에 보고에 의해 마우스 독도 추출 합니다.
- 1.5 mL 튜브에 해 부 현미경 200 독도 따
- 독도를 1 분 동안 503 x g 에서 원심 분리기 PBS의 500 µ L를 추가 합니다.
- 상쾌한 떨어져가지고 가십시오 덤플링을 못 솔루션의 250 µ L을 추가 하 고 10 분 아래로 덤플링을 못 솔루션와 잘 섞어 독도 수 있도록 피 펫에 대 한 얼음에 혼합물을 유지.
- 1 분 동안 503 x g 에서 원심 분리기.
- 제거는 상쾌한 고 PBS의 500 µ L를 추가 합니다. 여기저기 잘 혼합 플라스틱.
- 1 분 동안 503 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 하 고 추가 사용 하기 위해 독도 유지. 마우스 독도 덤플링을 말뚝 코팅의 시험, FAM-헤 파 린-못 섬 코팅 다음 단계에 사용 되었습니다.
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마우스 독도 식구 들-헤 파 린-말뚝 nanocoating 코팅의 시험
- 보충 코팅된 독도 10% 태아 둔감 한 혈 청 RPMI 1640의 1-2 mL을 추가 하 고 이러한 독도 청구 비 살 균 세균성 문화 접시에 전송.
- 거꾸로 형광 현미경 nanocoating 코팅 독도 식구 들-헤 파 린-못의 형태 및 형광 신호를 관찰 합니다.
3. 헤 파 린-말뚝의 기능 코팅 비 코팅 독도에 비해 마우스 독도
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헤 파 린-나무 못 코팅 마우스 독도의 생존
- 헤 파 린-나무 못 코팅 마우스 독도의 20를 따 고 그들 셀 96 잘 문화 접시의 한 잘 합니다.
- 10 웰 스의 총 각 잘 20 헤 파 린-나무 못 코팅 마우스 독도 채우십시오.
- Noncoated 제어 독도의 20를 따 고 그들 같은 셀 96 잘 문화 접시의 한 잘 합니다.
- 10 웰 스의 총 각 잘 20 noncoated 제어 독도 채우십시오.
- 독도 포함 하는 96 잘 접시의 각 음에 10% 태아 둔감 한 혈 청으로 보충 RPMI 1640의 200 µ L를 넣어 고 14 일에 대 한 문화에서 유지 합니다.
- 섬 문화 미디어 2 일 마다 교체 합니다.
- 라이브/죽은 문화에서 14 일의 끝에 키트를 얼룩이 지 고 거꾸로 형광 현미경 관찰로 독도 취급 합니다.
- 거꾸로 형광 현미경 각 섬 내의 PI+ (적색) 셀을 계산 합니다.
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헤 파 린-말뚝의 revascularization 코팅 마우스 독도 체 외
- 전 문화 접시를 포함 하 여 모든 실험 플라스틱을 냉각 하 고 피 펫 팁 사용 하기 전에 적어도 12 h.
- 냉각 패드에 24-잘 장소를 놓습니다. 추가 250 µ L 얼음의 차가운 증가율 감소 Matrigel 24 잘 셀 문화 접시의 각 음에. 적어도 30 분 동안 4 ° C에서 코팅된 24-잘 접시를 놓습니다.
- 냉장고에서 매트릭스 솔루션을 설정 하는 동안 마우스 췌 장 섬 내 피 마일 스벤 1 (MS1) 세포 trypsinize.
- 조직 배양 플라스 크에서 모든 문화 매체를 제거 합니다. PBS의 5 mL로 플라스 크를 씻어.
- PBS를 제거 하 고 트립 신-EDTA의 3 mL를 추가 합니다. 표준 인큐베이터에서 3 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 가볍게 셀을 분리 하 여 혈 청 보충 미디어의 5 mL을 추가 플라스 크의 아래쪽을 누릅니다.
- 15 mL 원심 분리기 튜브를 5 분 동안 1000 x g 에서 원심 분리기로 세포를 수집 합니다.
- 오프는 상쾌한 고 PBS의 5 mL을 추가. 여기저기 잘 혼합 플라스틱.
- 5 분 동안 1000 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 이륙.
- 튜브에 혈 청 보충 DMEM 미디어를 추가 하 고 행렬 솔루션 코팅 24-잘 접시의 각 음에 50000 셀 씨.
- 각 우물에 5 헤 파 린-나무 못 코팅 독도 또는 noncoated 제어 독도 추가 합니다.
- 잘 당 500 µ L의 총 각 잘에 혈 청 보충 DMEM 미디어를 추가 합니다.
- 가벼운 현미경 4 h 및 24 시간 보육 후 관 형성을 관찰 합니다.
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헤 파 린-나무 못 코팅 독도의 포도 당 자극 인슐린 분 비
참고:을 nanocoating 마우스 독도의 기능에 영향을 미칠 것 이라고, 헤 파 린-코팅 고 noncoated 독도의 포도 당 자극 인슐린 분 비는 평가 됩니다.- 한 1.5 mL 튜브에 30 헤 파 린-나무 못 코팅 독도 또는 noncoated 제어 독도 따. 10 튜브 코팅된 독도 대 한 총 및 noncoated 독도 준비 합니다.
- 생리 적 소금물 2 mmol/L 포도 당20 보충의 1 mL을 추가 하 고 2 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
참고: 생리 적 소금물 제조 법에 대 한 참조 하십시오 표1. 느슨한 인큐베이터에서 부 화 하는 동안 튜브의 뚜껑을 유지. - 가능한 많은 솔루션을 제거 합니다.
- 30 분 동안 37 ° C에서 20 mmol/L 포도 당으로 보충 하는 생리 적 소금물의 600 µ L을 추가 하 여 독도 자극.
- ELISA 정량화 상업 인슐린 ELISA를 사용 하 여 키트 인슐린에 대 한 각 관에서 상쾌한의 200 µ L를 수집 합니다.
Representative Results
헤 파 린 못 nanocoating starPEG-(NH2)8 , EDC와 보 건국 커플링 에이전트 (그림 1)으로 사용 하는 헤 파 린의 활용에 의해 합성 되었다. 헤 파 린 못 nanocoating의 화학 구조에 의해 FT-적외선 조사 되었다 그리고 그림 2에서 같이, 헤 파 린의 특성 피크 3300-3600 c m-1, 헤 파 린 (그림 2 의 수 산 기 그룹에 해당에서 관찰 될 수 있었다 빨간). (그림 2 블루) 3300-3600 c m-1 에서 피크의 진폭에 있는 감소는 starPEG-(NH2)8 아 미드 그룹 및 헤 파 린 생성 그룹 사이 활용을 나타냅니다. 아 미드에 해당 하는 피크 1650 c m-1 의 carbonyl 진동 스트레칭 또한 succinimidyl 호박으로 덤플링의 카복실산 그룹 및 starPEG-(NH2)의 아민 사이 충분 한 반응을 나타내는 감소 되었다 8. 헤 파 린 못 nanocoating의 표면 구조는 원자 힘 현미경 검사 법에 의해 시험 되었다 루 외에서 표시 하는는 nanocoating 약 30 nm 높이에 이르기까지 작은 다공성 기능 (검 버섯) 폭에서 2 µ m 100 ~ 200 사이 직경10nm. 스캔 한 전자 현미경 검사 법에서 얻은 데이터는 또한 vivo에서 전달 중 세포 생존에 적합 될 수 제안 덤플링을 페그 (그림 3)의 높은 상호 다공성 구조를 확인 합니다.
격리 된 마우스 독도의 표면 코팅 시험 되었다 고 그림 4에 제시 된으로 녹색 형광으로 표시 하는 nanocoating의 얇은 레이어 코팅된 독도의 표면에 걸쳐 섬 볼륨/크기에 분명 변화를 유발 하지 않고 예금은 균등 하 게. 코팅, 동안 그들의 생존을 유지 하기 위해 얼음에 독도 유지 하는 것이 좋습니다. 마찬가지로, 코팅 기간 10 분이 경우에 최적화 되었다 독도 생존 능력의 유지 관리를 허용 하도록. 그것은 그는 nanocoating의 더 나은 관측을 위해 이전에 보고 된9,16 코팅된 독도의 횡단면을 검사 전자 현미경 검사 법 더 적절할 것, 비록 데이터 생성 협조할 문화에서 생활 독도 대신 열 한 고정 및 임베디드 대에서
에 관한 생존 및 코팅된 독도, 섬 revascularization 및 기능의 기능 평가 체 외되었습니다. 헤 파 린의 유익한 속성을 고려 하면 섬 표면 덤플링을 기능화 수 문화에 따라서 생존 섬 revascularization 용이 하 게. 우리는 헤 파 린-나무 못 코팅 마우스 독도 전시 문화 (그림 5)에서 강력한 섬 생존을 관찰 했습니다. 훨씬 더 고급 혈관 형성은 헤 파 린-페그와 공동 경작 했다 섬 내 피 세포 (MS1)에서 또한 분명 코팅 독도, 길쭉한 microvessel 같은 구조와 같은 네트워크 혈관 구조 (그림 6에 표시 된 ).
Nanocoating 프로세스 덤플링을 말뚝 코팅 독도의 효과 포도 당 자극 인슐린 분 비 능력을 발생합니다. 인슐린 분 비의 낮은 수준 때 독도 생리 적 소금물 포도 (2 mmol/L;의 sub-stimulatory 수준으로 보충을 끼얹는다 했다 모든 치료 그룹에서 관찰 되었다 그림 7)입니다. 독도 포도 당 (20 mmol/L 포도 당)의 위에 생리 적 수준으로 자극 했다, 인슐린 분 비의 증가 모든 치료 그룹에서 관찰 되었다.
그림 1: 형 간염 페그 nanocoating 췌 장 섬 표면 공학의 화학 구조. 섬 코팅 덤플링을 NHS 및 세포 막 및 스타-말뚝-(NH2)8주 아민 사이 화학식 가교에 의해 달성 되었다. 각 헤 파 린 분자는 각 NHS 그룹을 수정 하는 여러 carboxyl 그룹을 소유한 다. NHS 활성화 carboxyl 그룹 폼 아 미드 결합를 통해 nanocoating 형 간염-고 독도의 안정화는 단백질의 1 차 아민과 반응 것 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 스타-말뚝-(NH2)8, 헤 파 린에 형 간염 페그 nanocoating의 적외선 스펙트럼의 건조 상태. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 형 간염-못 말린된 상태에서의 전자 현미경 이미지를 스캔. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 헤 파 린-말뚝의 대표 이미지 코팅 형광 현미경 독도.
헤 파 린 식구 들 (녹색에서 표시)와 함께 사전 이라는 했다. 이미지는 100 독도의 대표. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 헤 파 린-나무 못 코팅 독도 전시 강력한 섬 생존. (A) 데이터의 의미, n mean± 표준 오류로 그룹당 50 독도 =. (B) 살아있는 세포는 빨강에서 녹색 및 죽은 세포에 표시 했다. 눈금 막대 = 100 µ m 이미지는 50 독도의 대표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 헤 파 린 못 nanocoating 용이 내 섬 revascularisation. MS1 셀 헤 파 린-나무 못 코팅 독도와 noncoated 제어 독도 공동 경작의 Matrigel 튜브 형성. 이미지 4와 24 h. 규모 바에서 찍은 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 헤 파 린 못 nanocoating 섬 인슐린 분 비 기능에 변화를 발생 시킵니다. 헤 파 린-나무 못 코팅된 독도 및 noncoated 제어 독도 (각 30) 2 mmol/L (흰색 막대)에 노출 됐다 또는 30 분 응답 20 mmol/L 포도 당으로 인슐린 분 비에 대 한 20 mmol/L (검은 막대) 포도 코팅 사이 비교 했다 고 독도 제어. 데이터의 의미, n 평균 ± 표준 오차 표시 됩니다 = 10. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 문서에서 설명 하는 생활을 위한 "쉬운-을 채택" 접근 세포 표면 덤플링을 통합 starPEG nanocoating는 nanocoating의 N-hydroxysuccinimide 그룹 간의 의사 bioorthogonal 화학을 통해 엔지니어링 및 췌 장 섬 표면 막의 아민 그룹입니다. 실제로, 세포 막 내에서 아미노 그룹은 반응성이 매우 높은, 그리고 그 결과, 이전 연구 보고가 생리 조건14에서 활성화 된 N-hydroxysuccinimidyl (NHS) 에스테 르 주 아미노 그룹 사이 상호 작용 ,,1621. 또한, 광범위 한 연구는 섬 캡슐화 동안 덤플링을 매우 sulphated glycosaminoglycan, 세포 외 매트릭스의 중요 한 분 대의 설립 향상 된 후 이식 이어질 수 보고 revascularization 그리고 감소 IBMIR22,23. 말뚝의 생체 적합성 및 헤 파 린의 multivalent 속성을 고려 하면 우리는 nanocoating의 제조 동안 로드 최대한 덤플링을 8 무장 못 사용. 헤 파 린-보 건국, 작은 섬 세포 막에-NH2 그룹과 반응 이후에 수정 되었다. 헤 파 린 통합 말뚝에 의해 공유 결합 형성 (세포 막)의-NH2 -NHS 형 간염-못의 사이 독도 것 쉽게 "코팅"을 함으로써 따라서는 췌장암의 외부 표면에 나노 얇은 레이어 (nanocoating)를 형성 독도입니다.
현재 방식은 다른 섬 미소-보 건국 (nanocoating)의 작은 섬 세포의-NH2 사이 그 의사 bioorthogonal 화학에 대 한 주요 폴리머로 못 선택 이전에 게시 방법 막 사용 되었다. 섬/셀의 그 안정성을 고려 하면 코팅, 플라즈마, 같은 복잡 한 환경에서 특히 중요 포스트 이식 revascularization 이며 생존, 보 건국-와-NH2 사이 형성 될 것 이라고 더 안정적인에 비해 세포 막이 고24, 정전기 상호 작용9,15,,2425,26 또는 생물 학적 연동 biotin 사이의 소수 성 상호 작용 streptavidin14.
또한, 섬 달리 코팅 접근 또한 멀티 레이어 증 착14,,1625, 현재 기술에 대 한 확장된 섬 처리 기간으로 LBL 방식을 사용 하는 필요 최소한의 처리 하 고 매우 짧은 코팅의 고립 된 독도의 기간. 이러한 요소 둘 다 이기 때문에 독도 생존 종종 이미 손상 된 다음 섬 고립 때문에 손상 된 ECM 효소 소화 하는 동안 후 이식 섬 생존을 위해 필수적입니다. 그러나, 현재 접근에의 한 제한, LBL을 통해 외부 코팅의 두께 증가 또는 층 증 착의 수를 감소에 의해 제어 수 달리 형 간염 페그 nanocoating의 두께 수 없습니다 맞출 시간이 되 고 이다.
또한, 보 건국-와-NH2 장소, 현재 접근 사이 화학 반응은 살아있는 세포에 대 한 적용 온화한 조건 때문 표면 하지 엔지니어링 췌 장의 작은 섬, 하지만 대부분 세포 치료 제한. 또한, 헤 파 린에 대 한 다양 한 cytokines 및 생물 학적 활성 분자와 상호 작용 알려져 고려, 형 간염 페그 nanocoating도 선물 잠재력이 무제한 생물 중재자의 설립에 대 한 오픈 플랫폼 뿐만 아니라 더 복잡 한 세포 표면 공학에 대 한 인터페이스입니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 국립 자연 과학 중국 펀드 (31770968)와 천진 연구 프로그램의 응용 프로그램 기초 및 고급 기술 (17JCZDJC33400)의 재정 지원에 대 한 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| PBS | Hyclone | AAJ207798 | |
| Streptozototin | Sigma | S0130 | |
| Histopaque | Sigma | 10831 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 31800022 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Cell Dissociation Solution | GIBCO, by Life Technologies | 13150-016 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12800017 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644 | |
| 488 phalloidin | Sigma | A12379 | |
| CFSE | Sigma | 21888-25mg-F | |
| Annexin V/PI apoptosis kit | Dojindo | AD10 | |
| DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Collagenase from Clostridium, Type XI | Sigma | C7657 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| NHS | Sigma-Aldrich | 56480 | |
| EDC | Sigma-Aldrich | 3449 | |
| 8-armed PEG | J&K Scientific Ltd | 1685176 | |
| FAM | Sigma-Aldrich | M041100 | |
| 5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21888 | |
| KBr | J&K Scientific Ltd | 32036 | |
| 3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| toluene | J&K Scientific Ltd | S-15497-20X | |
| Live/dead staining kit | Biovision, US | K501 | |
| BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reduced | BD Bioscience | 354230 | |
| Sodium chloride, 99.5% | J&K Scientific Ltd | 105864 | |
| Potassium chloride, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 991468 | |
| Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 988639 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 182158 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 128839 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis | J&K Scientific Ltd | 119370 | |
| Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2 | J&K Scientific Ltd | 21114 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | V900933 | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA kit | Millipore-linco | EZRMI-13K |
References
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