Summary
Denne protokol har til formål at opnå overflade teknik af pancreas Holme ved hjælp af heparin-indarbejdet starPEG nanocoating via pseudo-bioorthogonal kemi mellem N- hydroxysuccinimide grupper af nanocoating og amine grupper af holmen cellens membran.
Abstract
Celle overflade teknik kan beskytte implanterede celler fra værten immun angreb. Det kan også omforme cellular landskab for at forbedre graft funktion og overlevelse efter transplantation. Denne protokol har til formål at opnå overflade teknik af pancreas Holme ved hjælp af en ultratynde heparin-indarbejdet starPEG (Hep-PLØK) nanocoating. For at generere Hep-PIND nanocoating til pancreas islet overflade teknik, heparin succinimidyl succinat (Heparin-NHS) blev først syntetiseret af ændring af de carboxylat grupper ved hjælp af N-(3-dimethylamino propyl) -N'-ethyl carbodiimide hydrochlorid (EDC) og N- hydroxysuccinimide (NHS). Hep-PIND blandingen blev derefter dannet af crosslinking af amino ende-functionalized otte-bevæbnet starPEG (starPEG-(NH2)8) og Heparin-NHS. For Holmen overfladebehandling blev mus Holme isoleret via collagenase fordøjelse og gradient rensning ved hjælp af Histopaque. Isolerede øer blev derefter behandlet med is kold Hep-PIND løsning i 10 min at tillade kovalent binding mellem NHS og amine grupper af islet celle membran. Nanocoating med Hep-PIND pådrager minimal ændring til Holmen størrelse og volumen og heparinization af Holme med Hep-PIND kan også reducere instant blod-medieret inflammatorisk reaktion under islet transplantation. Denne "let-til-at vedtage" tilgang er mild nok til overflade teknik af levende celler uden at kompromittere cellernes levedygtighed. I betragtning af at heparin har vist bindende affinitet til flere cytokiner, Hep-PIND nanocoating også giver en åben platform, der giver mulighed for indarbejdelse af ubegrænset funktionelle biologiske mæglere og multi-lag overflader for levende celle overflade bioteknologi.
Introduction
Den terapeutiske virkning af celle-baseret terapier er begrænset af lav celle fastholdelse og dårlig overlevelse1,2. For at forbedre resultatet af celle terapier, cellens overflade teknik via enzymatisk manipulation, har peptid konjugering, bioorthogonal kemi og fysisk indkapsling med biomaterialer været udbyttede3,4, 5,6,7,8,9,10. Den nuværende protokol har til formål at opnå overflade teknik af levende celler ved hjælp af en "let-til-at vedtage" metode ved at anvende en ultratynde heparin-indarbejdet starPEG (heparin-PLØK) nanocoating til cellens overflade. Overflade teknik af pancreas Holme blev præsenteret her som eksempel på grund af de heterogene karakter af Holme af Langerhanske og de nedsættende udfald af aktuelle kliniske islet transplantation.
Faktisk, kliniske islet transplantation er i øjeblikket udføres af direkte indsprøjtning af isolerede småøer i leverens portåren og denne procedure er kun tilgængelig for udvalgte patienter på grund af knapheden på donorer materialer og lav terapeutiske virkning 11. konventionelt, natriumalginat har været den mest almindeligt anvendte biomateriale til Holmen indkapsling og overflade ændring, selv om det er mindre end ideelt på grund af den kemisk ustabilitet af natriumalginat og inflammatoriske-relaterede fibrose12, 13. Desuden, i forhold til den fysiske størrelse af Holme svinger mellem 100-200 µm, natriumalginat-Holmen mikrokapsler er større, lige mellem 400 og 800 µm, der overstiger den fysiologiske spreder afstand af ilt. Conformal Holmen indkapsling, dvs., indkapsling Holme uden væsentlige ændringer af holmen volumen, blev derefter udviklet. Således aflejring af nanomembranes består af PIND, tetrafluorethylen, silicium membran eller multi-lag nanocoating (også kendt som "lag-på-lag" [LBL] teknik) er blevet rapporteret, hvilket resulterer i forbedrede in vitro- Holmen overlevelse14 ,15,16,17,18, selvom LBL tilgang ofte kræver omfattende Holme aflevering periode for deposition af flere lag, der kan kompromittere islet levedygtighed . Derudover rejser ustabilitet i nanomembranes, der bygger på elektrostatisk eller kovalent interaktioner mellem biomembrane lag eller hydrofobe interaktioner mellem nanomembranes og Holmen overflade også bekymringer9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
En anden begrænsende faktor, som besværliggør det terapeutiske resultat af intraportal Holmen transplantation er den instant blod-medieret inflammatorisk reaktion (IBMIR) forårsaget af direkte kontakt mellem implanterede Holme med blod, resulterer i trombocytaggregation, koagulation og negativ immun virkning eller uønskede cellulære aktivering9. For at løse disse problemer, var en ultra-tynd nanocoating sammensat af stjerne-formede polyethylen glycol (starPEG) forberedt på sin etablerede biokompatibilitet og alsidighed som islet boliger materiale. Heparin, et højt sulfateret glykosaminoglykan, var også indarbejdet i starPEG nanocoating for sine anti-inflammatoriske, antikoagulerende egenskaber og evne til at lette vascularization ved at rekruttere pro-angiogene vækstfaktorer22, 23.
Protocol
1. fabrikation af Heparin-indarbejdet Starpeg Nanocoating
-
Syntese af heparin succinimidyl succinat (Heparin-NHS)
- 0,69 g af heparin der afvejes og opløses i 2,0 mL iskold deioniseret vand.
- 0,23 g af NHS der afvejes og opløses i 0,5 mL iskold deioniseret vand i en runde-bunden kolbe.
- 0,77 g EDC der afvejes og opløses i 0,5 mL iskold deioniseret vand i en runde-bunden kolbe.
- Mix NHS og EDC løsninger i en runde-bunden kolbe. Forlade den blandede løsning på bænken ved stuetemperatur i 30 min. ved stuetemperatur.
- Der centrifugeres EDC NHS blandingen på 5.031 x g i 10 min. til at fjerne overskydende EDC og NHS.
- Der tilsættes 30 mL koldt ethanol til blandingen løsning og centrifugeres ved 5.031 x g i 10 min.
- Gentag to gange.
-
Forberedelse af starPEG-heparin nanocoating
- Tilføje 1,0 mL 10% (w/v) starPEG-(NH2)8 til en runde-bunden kolbe.
- Samme runde-bunden Kolben tilsaettes 0,67 mL 10% (w/v) heparin-NHS.
- Placer den blandede opløsning af starPEG-(NH2)8 og heparin-NHS i en inkubator ved 25 ° C i 20 min. til at opnå en klar løsning med viskositet.
Bemærk: For eksperimenter, hvor der krævedes fluorescently mærket heparin (FAM-heparin), fabrikation fremgangsmåden er den samme bortset fra at den stjerne - PIND-(NH2)8 blev opløst i ionbyttet vand suppleret med 5, stk. 6- carboxyfluorescein N- succinimidyl ester 0,1% (molære forhold) starPEG-(NH2)8. )
-
Karakterisering af heparin-PIND nanocoating af Fourier Transform infrarødspektroskopi (FT-IR)
- Før du starter, skal du skylle agat mørtel, pistil og pelleringsmidler enhed (lille diske med diameter 13 mm) med acetone og deioniseret vand. Tørre glas i ovnen før brug.
- Mix ca 0,1-1% heparin-PIND prøve med 200 – 250 mg af fine KBr pulver.
- Placer heparin-PIND og KBr blanding i agat mørtel og fint pulverisere til små pellets med diametre på 2 µm.
- Overfør blandingen til en pelleting enhed. Gælde høj kompression kraft (8 T/cm2) i et vakuum for 1-2 min til at danne gennemsigtig pellets.
- Træk forsigtigt prøve træpiller fra den pelleting enhed. Vær omhyggelig med ikke at trække alt for hårdt for ikke at pådrage sig revner.
- Overføre prøven pellets meget omhyggeligt til en Fourier Transform infrarød spektroskopet at bestemme prøve kemiske struktur.
-
Undersøgelse af de interne porøse strukturer af heparin-PIND nanocoating af scannede elektronmikroskopi (SEM)
- For de følgende procedurer, forberede standard 48-godt celle kultur plade og pipetter.
- Der afpipetteres heparin-PIND copolymer løsning i wells af en 48-godt kultur plade.
- Fryse plade på-80 ° C i 24 timer.
- Lypophilize prøver på-50 ° C i vakuum miljø (0,1 Pa) i 24 timer.
- Fordelt prøver på en aluminium stub sticky overflade.
- Pels prøver med guld og observere under scannede elektron mikroskop til at iagttage indre porøse strukturer.
-
Undersøgelse af heparin-PIND nanocoating overfladen af atomic force mikroskopi (AFM)
- Ren silica glas dias med piranha løsning (70% H2SO4, 30% H2O2) ved 80 ° C i 40 min.
- Der sonikeres dias i methanol i 10 min og derefter i toluen i 10 min.
- Tørre dias af vakuum tørring.
- Vask dias med masser 3-aminopropyl-triethoxysilane løsning (2% i toluen), Ryst forsigtigt.
- Der sonikeres dias i methanol i 10 min. derefter i toluen i 10 min.
- Plads 100 µL af 3% heparin-PIND løsning hen over overfladen af dias ved hjælp af en standard pipette.
- Undersøge overfladen af heparin-PEG under en atomic force mikroskop (en resonant frekvens på 50 – 80 kHz, tvinge konstant af 0.350 N m 21, tip radius af 600 nm).
2. mus Islet overflade teknik med Heparin-PIND Nanocoating
-
Musen islet overfladebehandling med heparin-PIND nanocoating
- Uddrag mus Holme af collagenase fordøjelse og histopaque gradient rensning som tidligere rapporteret i JoVE19.
- Håndplukke 200 Holme under en dissektion mikroskop til en 1,5 mL tube.
- Tilsæt 500 µL af PBS til Holme og centrifugeres ved 503 x g i 1 min.
- Tage supernatanten og tilføje 250 µL af opløsningen heparin-PIND og holde blandingen i isbad i 10 min. pipetteres op og ned for at tillade Holme at blande godt med heparin-PIND løsning.
- Der centrifugeres ved 503 x g i 1 min.
- Fjern supernatanten og tilsæt 500 µL af PBS. Pipetteres op og ned for at blande godt.
- Der centrifugeres ved 503 x g i 1 min og Fjern supernatanten og holde Holme til yderligere brug. Inspektion af musen Holme belagt med heparin-PEG, blev FAM-heparin-PIND brugt til Holmen belægning følgende fremgangsmåde.
-
Undersøgelse af mus Holme belagt med FAM-heparin-PIND nanocoating
- Tilføje 1-2 mL af RPMI 1640 suppleret med 10% føtal bovint serum til de coatede Holme og overføre disse Holme til en ikke-opkrævet sterile bakteriekulturen parabol.
- Observere morfologi og fluorescens signalerne fra FAM-heparin-PIND nanocoating-belagt Holme under en inverteret fluorescens mikroskop.
3. funktion af Heparin-PIND belagt mus Holme i forhold til ikke-belagt Holme
-
Levedygtighed af heparin-PIND belagt mus Holme
- Håndplukke 20 af heparin-PIND belagt mus Holme og placere dem i en brønd på en 96-brønd celle kultur plade.
- Fyld ialt 10 brønde med 20 heparin-PIND belagt mus Holme til hver brønd.
- Håndplukke 20 af noncoated kontrol Holme og placere dem i et godt af den samme 96-brønd celle kultur plade.
- Fyld ialt 10 brønde med 20 noncoated kontrol Holme til hver brønd.
- Sætte 200 µL af RPMI 1640 suppleret med 10% føtal bovint serum i hver brønd i 96-brønd-pladen som indeholder Holme og vedligeholde i kultur i 14 dage.
- Erstatte islet Kulturmedier hver 2 dage.
- Behandle holmene med en live/døde farvning kit for enden af 14 dage i kultur og observeret under en inverteret fluorescens mikroskop.
- Tælle PI+ (rød) celler inden for hver Holmen i en inverteret fluorescens mikroskop.
-
Revaskularisering af heparin-PIND belagt mus Holme in vitro
- Pre-afkøle alle eksperimentelle plast herunder kultur plade og pipette tips mindst 12 timer før brug.
- Placer en 24-godt sted på en afkøling pad. Tilsæt 250 µL af is kold vækstfaktor-reduceret Matrigel i hver brønd med en 24-godt celle kultur plade. Coatede 24-godt pladen anbringes ved 4 ° C i mindst 30 min.
- Mens matrix løsningen er indstillingen i køleskabet, trypsinize mus i bugspytkirtlen islet Mile Sven 1 (MS1) endotelceller.
- Fjern alle medier fra vævskultur kolben. Skyl kolben med 5 mL PBS.
- Fjerne PBS og tilsættes 3 mL trypsin-EDTA. Der inkuberes ved 37 ° C i 3 min i en standard inkubator.
- Tryk let på bunden af kolben til at frigøre cellerne og tilsættes 5 mL serum-suppleret medier.
- Indsamle cellerne i en 15 mL centrifugeglas, og der centrifugeres ved 1.000 x g i 5 min.
- Tage supernatanten og tilsættes 5 mL PBS. Pipetteres op og ned for at blande godt.
- Der centrifugeres ved 1.000 x g i 5 min og tage af supernatanten.
- Tilføje serum-suppleret DMEM medier ind i røret og frø 50.000 celler i hver brønd i matrix-løsning-belagt 24-godt plade.
- Tilføj 5 heparin-PIND belagt Holme eller noncoated kontrol Holme i hver brønd.
- Tilføje serum-suppleret DMEM medier i hver brønd på ialt 500 µL pr. brønd.
- Observere tube dannelsen efter 4 og 24 h inkubation under et lysmikroskop.
-
Glucose-stimuleret insulinsekretion af heparin-PIND belagt Holme
Bemærk: For at vurdere, om nanocoating ville påvirke funktionen af musen Holme, glucose-stimuleret insulinsekretion af heparin-PIND belagt og noncoated Holme blev vurderet.- Håndplukke 30 heparin-PIND belagt Holme eller noncoated kontrol Holme til en 1,5 mL tube. Forberede ialt 10 rør til belagt Holme og noncoated Holme.
- Der tilsættes 1 mL af fysiologiske saltopløsning suppleret med 2 mmol/L glukose20 og inkuberes ved 37 ° C i 2 timer.
Bemærk: For opskriften af den fysiologiske saltopløsning, henvises til tabel 1. Holde hætten af rør løs under inkubation i rugemaskinen. - Fjern så meget løsning som muligt.
- Stimulere Holme ved at tilføje 600 µL af fysiologiske saltopløsning suppleret med 20 mmol/L glucose ved 37 ° C i 30 min.
- Indsamle 200 µL af supernatanten fra hver tube for insulin ELISA kvantificering ved hjælp af en kommerciel insulin ELISA kit.
Representative Results
Heparin-PIND nanocoating blev syntetiseret ved konjugering af starPEG-(NH2)8 og heparin ved hjælp af EDC og NHS som kobling agenter (figur 1). Kemiske struktur af heparin-PIND nanocoating blev undersøgt af FT-IR og som vist i figur 2, karakteristiske toppene af heparin kunne observeres på 3.300-3.600 cm-1, svarende til hydroxylgrupper af heparin (figur 2 rød). Faldet i amplitude af peak på 3.300-3.600 cm-1 (figur 2 blå) repræsenterer konjugation mellem starPEG-(NH2)8 akrylamid grupper og heparin carbonyl gruppe. Amplituden af peak 1.650 cm-1 svarer til akrylamid carbonyl stretching vibrationer var også reduceret, der angiver tilstrækkelig reaktion mellem grupperne carboxylat af heparin med succinimidyl succinat og Amin af starPEG-(NH2) 8. overfladestruktur af heparin-PIND nanocoating blev undersøgt af atomic force mikroskopi og det er vist fra Lou et al., nanocoating var ca 30 nm i højde og 2 µm i bredden med små porøse funktioner (mørke pletter) spænder mellem 100-200 nm i diameter10. Data indhentet fra scannede elektroniske mikroskopi bekræfter også den yderst sammenkoblede porøse struktur af heparin-PEG (figur 3), tyder på, at det kunne være egnet til celle overlevelse under in vivo levering.
Overfladebehandling af isolerede mus Holme blev undersøgt og som præsenteret i figur 4, tynde lag af nanocoating, vist af grønne fluorescens jævnt blev deponeret hen over overfladen af belagt Holme uden forårsager indlysende ændringer på Holmen diskenhedsstørrelse. Under belægning anbefales det at holde Holme på isen for at bevare deres levedygtighed. På samme måde, perioden belægning 10 min i dette tilfælde var også optimeret til at tillade vedligeholdelse af Holme levedygtighed. Det er værd at bemærke, at for bedre observation af nanocoating, elektronmikroskopi, der undersøger tværsnit af belagt Holme som tidligere rapporteret9,16 ville være mere passende, selv om dataene, der vil blive genereret fra faste og integrerede Holme i stedet for levende Holme i kultur.
Med hensyn til overlevelse og belagt Holme, Holmen revaskularisering og funktioner i funktion har været vurderet in vitro. I betragtning af de gavnlige egenskaber af heparin, kunne heparin functionalization på Holmen overflade lette islet revaskularisering i kultur og dermed dens overlevelse. Vi har observeret, at heparin-PIND belagt mus Holme udstillet robust islet levedygtighed i kultur (figur 5). Betydeligt mere avancerede vaskulære dannelse var også tydeligt fra Holmen endothelial celler (MS1), der blev co kulturperler med heparin-PIND belagt Holme, angivet med aflange microvessel-lignende strukturer og netværk-lignende vaskulære strukturer (figur 6 ).
Nanocoating proces er afholdt ingen virkning glucose-stimulerede insulin sekretoriske evne af heparin-PIND belagt Holme. Lavt niveau af insulinsekretion blev observeret i alle behandlingsgrupper, når Holme var perfunderet med fysiologiske saltopløsning suppleret med sub-stimulatory niveau af glukose (2 mmol/L; Figur 7). Når Holme blev stimuleret med en supra-fysiologiske niveau af glukose (20 mmol/L glukose), konstateredes stigende insulinsekretion i alle behandlingsgrupper.
Figur 1: Kemiske struktur af Hep-PIND nanocoating til pancreas islet overflade teknik. Holmen belægning blev opnået ved kovalente crosslinking mellem heparin-NHS og primære aminer i cellemembranen og stjerne - PIND-(NH2)8. Hver heparin molekylet besidder flere carboxyl grupper, som blev ændret til at have en NHS gruppe hver. NHS-aktiveret carboxyl grupper vil reagere med primære aminer protein til form akrylamid forbindelser, via hvilket nanocoating Hep-PIND og holme er stabiliseret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : IR-spektrum stjerne - PIND-(NH2)8, heparin og Hep-PIND nanocoating i tørret tilstand. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Scannes elektroniske mikroskopi billeder af Hep-PIND i tørret tilstand. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative billeder af heparin-PIND belagt Holme under fluorescens mikroskop.
Heparin var forud mærket med FAM (vist med grønt). Billeder er repræsentant for 100 Holme. Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Heparin-PIND belagt Holme udstillet robust islet levedygtighed. (A) Data præsenteres som mean± standardfejl for midler, n = 50 Holme pr. gruppe. (B) levende celler blev vist i grøn og døde celler i rød. Skalalinjen = 100 µm. billeder er repræsentant for 50 Holme. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Heparin-PIND nanocoating letter samhandelen-Holmen revascularisation. Matrigel tube dannelsen af MS1 celler Co kulturperler med heparin-PIND belagt Holme og noncoated kontrol Holme. Billeder blev taget på 4 og 24 h. skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Heparin-PIND nanocoating medfører ingen ændring på Holmen insulin udskillelsen funktion. Heparin-PIND belagt Holme og noncoated kontrol Holme (30 hver) blev udsat for 2 mmol/L (hvid kolonne) eller 20 mmol/L (sort bar) glukose i 30 min. insulinsekretion i respons til 20 mmol/L glucose var sammenlignelig mellem de coatede og styre Holme. Data er vist som gennemsnit ± standardafvigelse af midler, n = 10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
I denne artikel vil vi vise en "let-til-at vedtage" tilgang til levende celle overflade teknik en heparin-indarbejdet starPEG nanocoating via pseudo-bioorthogonal kemi mellem N- hydroxysuccinimide grupper af nanocoating og den amine grupper af pancreas islet overflade membran. Faktisk de amino grupper inden for cellemembraner er meget reaktive, og som et resultat, tidligere undersøgelser har rapporteret interaktioner mellem primære amino grupper med aktiveret N- hydroxysuccinimidyl (NHS) ester fysiologiske betingelser14 ,16,21. Derudover har omfattende forskning rapporteret, at indarbejdelsen af heparin, et højt sulfateret glykosaminoglykan og vigtig del af den ekstracellulære matrix, under islet indkapsling, kunne føre til forbedret efter transplantation revaskularisering og reduceret IBMIR22,23. I betragtning af biokompatibilitet af PIND og multivalent egenskaber af heparin brugte vi 8-bevæbnet PIND for maksimal heparin indlæses under fabrikation af nanocoating. Heparin blev ændret med -NHS, der efterfølgende ville reagere med -NH2 grupper på islet celle membran. Ved at aktivere den kovalente bånd dannelse mellem -NH2 (af cellemembranen) og -NHS af Hep-PEG, holmene ville være let "belagt" af heparin-indarbejdet PIND, som danner en nano-tynde lag (nanocoating) på den ydre overflade af den i bugspytkirtlen Holme.
Den nuværende fremgangsmåde er forskellig fra tidligere udgivne metoder, som også har valgt PIND som den store polymer til Holmen mikroindkapsling i denne pseudo-bioorthogonal kemi mellem -NHS (af nanocoating) og -NH2 islet celle membranen blev brugt. I betragtning af at stabilitet af holmen/celle belægning, især i et komplekst miljø som plasma, er afgørende for efter transplantation revaskularisering og overlevelse, dannelse mellem -NHS og -NH2 ville være mere stabil i forhold til hydrofobe interaktion mellem PIND og cellemembranen24, elektrostatiske interaktion9,15,24,25,26 eller biologiske koblingen mellem biotin streptavidin14.
Desuden, i modsætning til Holmen kræver belægning tilgang, der bygger på LBL tilgang med udvidet islet håndtering periode for multi-lag deposition14,16,25, den nuværende teknik også minimal forarbejdning og meget korte belægning periode af de isolerede småøer. Begge disse faktorer er afgørende for efter transplantation islet overlevelse, da Holme levedygtighed er ofte allerede kompromitteret følgende islet isolation på grund af beskadigede ECM under Enzymatisk nedbrydning. En begrænsning af den nuværende tilgang er imidlertid, at i modsætning til LBL, via som tykkelsen af den ydre belægning kan kontrolleres ved at øge eller reducere antallet af lag deposition, tykkelse af Hep-PIND nanocoating ikke kan skræddersys for tiden.
Desuden, på grund af den milde tilstand, hvor kemiske reaktion mellem -NHS og -NH2 finder sted, den nuværende fremgangsmåde er gældende for levende celle overflade teknik ikke begrænset til pancreas Holme, men de fleste celleterapi. Derudover overvejer at heparin er kendt for at interagere med en vifte af cytokiner og biologisk aktive molekyler, Hep-PIND nanocoating også præsenterer en åben platform, der har potentiale til indbygning af ubegrænset biologiske mæglere samt grænseflader til mere komplekse celle overflade teknik.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for den finansielle støtte af de nationale naturvidenskab midler i Kina (31770968) og Tianjin Research Program af ansøgningen Foundation og avanceret teknologi (17JCZDJC33400).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| PBS | Hyclone | AAJ207798 | |
| Streptozototin | Sigma | S0130 | |
| Histopaque | Sigma | 10831 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 31800022 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Cell Dissociation Solution | GIBCO, by Life Technologies | 13150-016 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12800017 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644 | |
| 488 phalloidin | Sigma | A12379 | |
| CFSE | Sigma | 21888-25mg-F | |
| Annexin V/PI apoptosis kit | Dojindo | AD10 | |
| DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Collagenase from Clostridium, Type XI | Sigma | C7657 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| NHS | Sigma-Aldrich | 56480 | |
| EDC | Sigma-Aldrich | 3449 | |
| 8-armed PEG | J&K Scientific Ltd | 1685176 | |
| FAM | Sigma-Aldrich | M041100 | |
| 5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21888 | |
| KBr | J&K Scientific Ltd | 32036 | |
| 3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| toluene | J&K Scientific Ltd | S-15497-20X | |
| Live/dead staining kit | Biovision, US | K501 | |
| BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reduced | BD Bioscience | 354230 | |
| Sodium chloride, 99.5% | J&K Scientific Ltd | 105864 | |
| Potassium chloride, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 991468 | |
| Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 988639 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 182158 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 128839 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis | J&K Scientific Ltd | 119370 | |
| Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2 | J&K Scientific Ltd | 21114 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | V900933 | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA kit | Millipore-linco | EZRMI-13K |
References
- Ke, T., et al. Netrin-1 ameliorates myocardial infarction-induced myocardial injury: mechanisms of action in rats and diabetic mice. Hum Gene Ther. 25 (9), 787-797 (2014).
- Ke, T., et al. Co-transplantation of skin-derived precursors and collagen sponge facilitates diabetic wound healing by promoting local vascular regeneration. Cell Physiol Biochem. 37 (5), 1725-1737 (2015).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287 (5460), 2007-2010 (2000).
- Sarkar, D., et al. Engineered cell homing. Blood. 118 (25), 184-191 (2011).
- Kato, M., Mrksich, M. Rewiring cell adhesion. J Am Chem Soc. 126 (21), 6504-6505 (2004).
- Cheng, H., et al. Stem cell membrane engineering for cell rolling using peptide conjugation and tuning of cell-selectin interaction kinetics. Biomaterials. 33 (20), 5004-5012 (2012).
- Merzaban, J. S., et al. Cell surface glycan engineering of neural stem cells augments neurotropism and improves recovery in a murine model of multiple sclerosis. Glycobiology. 25 (12), 1392-1409 (2015).
- Silvescu, C. I., Sackstein, R. G-CSF induces membrane expression of a myeloperoxidase glycvariant that operates as an E-selectin ligand on human myeloid cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10696-10701 (2014).
- Zhi, Z. L., et al. Assembly of bioactive multilayered nanocoatings on pancreatic islet cells: incorporation of alpha1-antitrypsin into the coatings. Chem Commun (Camb). 51 (53), 10652-10655 (2015).
- Lou, S., et al. Pancreatic islet surface bioengineering with a heparin-incorporated starPEG nanofilm. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 78, 24-31 (2017).
- Orlando, G., et al. Cell replacement strategies aimed at reconstitution of the beta-cell compartment in type 1 diabetes. Diabetes. 63 (5), 1433-1444 (2014).
- Kollmer, M., et al. Long-term function of alginate-encapsulated islets. Tissue Eng Part B Rev. 22 (1), 34-36 (2015).
- Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. J Diabetes Complications. 29 (5), 737-743 (2015).
- Kizilel, S., et al. Encapsulation of pancreatic islets with nano-thin functional polyethylene glycol coatings for enhanced insulin secretion. Tissue Eng. Part A. 16, 2217-2228 (2010).
- Zhi, Z. L., et al. Nano-scale encapsulation enhances allograft survival and function of islets transplanted in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 55, 1081-1090 (2012).
- Gattas-Asfura, K. M., Stabler, C. L. Layer-by-layer deposition of antifouling coatings on stainless steel via catechol-amine reaction. ACS Appl. Mater. Interfaces. 5, 9964-9974 (2013).
- Kollmer, M., et al. Long-term function of alginate-encapsulated islets. Tissue Eng. Part B Rev. 22 (1), 34-46 (2015).
- Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. J. Diabetes Complicat. 29, 737-747 (2015).
- Zmuda, E. J., et al. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Gey, G. O., Gey, M. K. The maintenance of human normal cells and tumor cells in continuous culture. I. Preliminary report: Cultivation of mesoblastic tumors and normal tissue and notes on methods of cultivation. Am. J. Cancer. 27, 45-76 (1936).
- Chen, X., et al. Site-selective azide incorporation into endogenous RNase A via a "chemistry" approach. Org. Biomol. Chem. 11, 353-361 (2013).
- Cabric, S., et al. Anchoring of vascular endothelial growth factor to surface-immobilized heparin on pancreatic islets: implications for stimulating islet angiogenesis. Tissue Eng. Part A. 16, 961-970 (2010).
- Cabric, S., et al. Islet surface heparinization prevents the instant blood-mediated inflammatory reaction in islet transplantation. Diabetes. 56, 2008-2015 (2007).
- Asif, S., et al. Heparinization of cell surfaces with short peptide-conjugated PEG-lipid regulates thromboinflammation in transplantation of human MSCs and hepatocytes. Acta Biomater. 35, 194-205 (2016).
- Teramura, Y., et al. Microencapsulation of cells, including islets, within stable ultra-thin membrane of maleimide-conjugated PEG-lipid with multifunctional crosslinkers. Biomaterials. 34 (11), 2683-2893 (2013).
- Zhi, Z., et al. Multilayer nanoencapsulation: A nanomedicine technology for diabetes research and management. Diabetes Res. Clin. Pract. 100, 162-169 (2013).
