Summary
Detta protokoll syftar till att uppnå yta konstruktion av Langerhanska använder ett heparin-införlivade starPEG nanocoating via pseudo-bioorthogonal kemi mellan grupperna N- hydroxysuccinimide av nanocoating och amine grupperna av holme cellmembranet.
Abstract
Cellen ytbehandlar teknik kan skydda implanterade cellerna från värd immun attack. Det kan också omforma cellulära landskap för att förbättra transplantatfunktion och överlevnaden efter transplantation. Detta protokoll syftar till ytan engineering av Langerhanska använder en ultrathin heparin-införlivade starPEG (Hep-PEG) nanocoating. För att generera den Hep-PEG nanocoating för bukspottskörteln holme ytan engineering, heparin succinimidyl succinat (Heparin-NHS) syntetiserades första gången genom ändring av dess bildas grupper använder N-(3-dimethylamino propyl) -N'-etyl carbodiimide hydroklorid (EDC) och N- hydroxysuccinimide (NHS). Hep-PEG blandningen bildades sedan av crosslinking av amino slutet-functionalized åttaarmad starPEG (starPEG-(NH2)8) och Heparin-NHS. För Holmen ytbeläggning isolerades mus holmar via kollagenas matsmältningen och gradient rening med hjälp av Histopaque. Isolerade Langerhanska behandlades sedan med is kall Hep-PEG lösning för 10 min att tillåta kovalent bindning mellan NHS och amine grupper av islet cell membran. Nanocoating med Hep-PEG medför minimal förändring till islet storlek och volym och heparinization av kobbar och skär med Hep-PEG kan också minska instant blod-medierad inflammatorisk reaktion under ö-transplantation. ”Lätt att anta” är mild nog för surface engineering av levande celler utan att kompromissa med cellernas viabilitet. Med tanke på att heparin har visat affinitet till flera cytokiner, den Hep-PEG nanocoating ger också en öppen plattform som möjliggör införlivandet av obegränsad funktionella biologiska medlare och flera lager ytor för levande cellens yta bioteknik.
Introduction
Den terapeutiska effekten av cellbaserade terapier begränsas av lågt retention och dålig överlevnad1,2. För att förbättra resultatet av cellterapi, cell surface engineering via enzymatiska manipulation, har peptid konjugation, bioorthogonal kemi och fysiska inkapsling med biomaterial varit exploaterade3,4, 5,6,7,8,9,10. Det nuvarande protokollet syftar till ytan engineering av levande celler med en ”lätt att anta” metod genom att tillämpa en ultrathin heparin-införlivade starPEG (heparin-PEG) nanocoating på cellytan. Yta konstruktion av Langerhanska presenterades här som ett exempel på grund av hur heterogena Langerhanska öar och nedvärderande resultaten av nuvarande klinisk ö-transplantation.
Faktiskt, klinisk ö-transplantation utförs för närvarande av direktinsprutning av isolerade öar i nedsatt portalen ven och proceduren är endast tillgänglig för selektiv patienter på grund av knappa givaren material och låga terapeutiska effekt 11. konventionellt, alginat har varit den vanligaste biomaterial för holme inkapsling och ytmodifiering, även om det är mindre än idealisk på grund av kemisk instabilitet av alginat och inflammatoriska-relaterade fibros12, 13. Jämfört med naturliga storleken på holmar som varierar mellan 100 till 200 µm, är alginat-holme mikrokapslarna dessutom större, mellan 400 och 800 µm, som överstiger fysiologiska diffuserande distansera av syre. Conformal holme inkapsling, dvs., encapsulating holmar utan signifikant förändrad holme volym, utvecklades sedan. Således, nedfall av nanomembranes består av PEG, tetrafluoreten, kisel membran eller flerskiktad nanocoating (även känd som den ”lager-för-lager” [LBL] tekniken) har rapporterats, vilket resulterar i förbättrad in vitro- holme överlevnad14 ,15,16,17,18, även om LBL närma ofta kräver omfattande holmar dela period för nedfall av flera skikt, som kan äventyra holme livskraft . Dessutom väcker instabilitet av nanomembranes som bygger på elektrostatisk eller kovalenta interaktioner mellan biomembrane lager eller hydrofoba interaktioner mellan nanomembranes och holme ytan också oro9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
En annan begränsande faktor som försvårar terapeutiska resultatet av intraportal ötransplantation är omedelbar blod-medierad inflammatorisk reaktion (IBMIR) orsakad av direkt kontakt av implanterade holmar med blod, vilket resulterar i trombocytaggregation koagulation och immun biverkning eller oönskad cellulär aktivering9. För att lösa dessa problem, var en ultra-tunn nanocoating består av stjärnformade polyetylenglykol (starPEG) förberedd för dess etablerade biokompatibilitet och mångsidighet som holme Kapslingsmaterial. Heparin, ett starkt sulfaterade glykosaminoglykan, inkorporerades också i den starPEG nanocoating för dess antiinflammatoriska, antikoagulantia egenskaper och förmåga att underlätta vaskularisering av rekrytera proangiogena tillväxtfaktorer22, 23.
Protocol
1. tillverkning av Heparin-införlivade Starpeg Nanocoating
-
Syntesen av heparin succinimidyl succinat (Heparin-NHS)
- Väg upp 0.69 g av heparin och lös i 2,0 mL iskallt avjoniserat vatten.
- Väg in 0,23 g av NHS och lös i 0.5 mL iskallt avjoniserat vatten i en runda-botten kolv.
- Väg in 0.77 g av EDC och lös i 0.5 mL iskallt avjoniserat vatten i en runda-botten kolv.
- Blanda NHS EDC lösningar i en runda-botten kolv. Lämna den blanda lösningen på bänken i rumstemperatur i 30 min i rumstemperatur.
- Centrifugera EDC NHS blandningen vid 5,031 x g i 10 min att ta bort överflödig EDC och NHS.
- Tillsätt 30 mL kall etanol till blandningen lösning och centrifugera vid 5,031 x g under 10 minuter.
- Upprepa två gånger.
-
Beredning av starPEG-heparin nanocoating
- Tillsätt 1,0 mL 10% (w/v) starPEG-(NH2)8 i en runda-botten kolv.
- Tillsätt 0,67 mL 10% (w/v) heparin-NHS till samma runda-botten kolven.
- Placera den blanda lösningen av starPEG-(NH2)8 och heparin-NHS i en inkubator vid 25 ° C i 20 min att få en klar lösning med viskositet.
Obs: För experiment där fluorescently märkt heparin (FAM-heparin) krävdes, fabrication förfarandet är samma förutom att den star - PEG-(NH2)8 upplöstes i avjoniserat vatten kompletteras med 5.6- carboxyfluorescein N- succinimidyl ester 0,1% (molar förhållandet) av starPEG-(NH2)8. )
-
Karakterisering av heparin-PEG nanocoating av Fourier Transform infraröd spektroskopi (FT-IR)
- Innan du börjar, skölj agat murbruk, mortel och pelletering enheten (små diskar med diameter 13 mm) med aceton och avjoniserat vatten. Torka av glas i ugn innan användning.
- Mixa ca 0,1 – 1% heparin-PEG prov med 200 – 250 mg fina KBr pulver.
- Placera av heparin-PEG och KBr blandningen i agat mortel och fint pulverisera till små pellets med en diameter av 2 µm.
- Över blandningen till en pelleting enhet. Tillämpa hög komprimering kraft (8 T/cm2) i ett vakuum för 1 – 2 min att bilda transparent pellets.
- Dra försiktigt provet pellets från pelleting enheten. Var noga med att inte dra för hårt så att inte ådra sig sprickor.
- Överför provet pellets mycket noga till en Fourier Transform infraröd spektroskopet att bestämma provets kemiska struktur.
-
Undersökning av det inre porösa strukturerar av heparin-PEG nanocoating av skannade elektronmikroskopi (SEM)
- För följande, förbereda standard 48-väl cell kultur plattan och pipetter.
- Pipettera heparin-PEG sampolymer lösningen i brunnar på en 48-väl kultur-platta.
- Frysa plattan vid-80 ° C under 24 h.
- Lypophilize proverna vid-50 ° C i vakuum miljö (0,1 Pa) för 24 h.
- Spritt den klibbiga ytan av en aluminium påbörjad prover.
- Päls av prov med guld och observera under skannade elektronmikroskopet att observera inre porösa strukturer.
-
Undersökning av heparin-PEG nanocoating ytan av atomic force microscopy (AFM)
- Ren kiseldioxid glasskivor med piranha lösning (70% H2SO4, 30% H2O2) vid 80 ° C i 40 min.
- Sonikera bilderna i metanol i 10 min och sedan i toluen i 10 min.
- Torka bilderna av vakuumtorkning.
- Tvätta i bilderna med gott 3-aminopropyl-triethoxysilane lösning (2% i toluen), skaka försiktigt.
- Sonikera bilder i metanol för 10 min sedan i toluen i 10 min.
- Plats 100 µL 3% heparin-PEG lösning över ytan på bilderna med standard pipett.
- Undersök ytan på heparin-PEG under ett mikroskop för atomic force (en resonant frekvens på 50 – 80 kHz, tvinga konstant på 0.350 N m 21, spets radie av 600 nm).
2. mus Islet ytan Engineering med Heparin-PEG Nanocoating
-
Mus holme ytbeläggning med heparin-PEG nanocoating
- Extrahera mus holmar kollagenas matsmältningen och histopaque lutning rening som tidigare rapporterats i JoVE19.
- Handplocka 200 holmar i dissektion Mikroskop till ett 1,5 mL rör.
- Tillsätt 500 µL av PBS till kobbar och centrifugera vid 503 x g i 1 min.
- Ta bort supernatanten och tillsätt 250 µL av heparin-PEG lösningen och hålla blandningen på is för 10 min. pipett upp och ned för att tillåta holmarna att blanda väl med heparin-PEG lösningen.
- Centrifugera vid 503 x g i 1 min.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 500 µL av PBS. Pipettera upp och ner för att blanda väl.
- Centrifugera vid 503 x g i 1 min och avlägsna supernatanten och hålla kobbar och skär för vidare användning. För granskning av mus holmar belagd med heparin-PEG, användes FAM-heparin-PEG för holme beläggning följande steg.
-
Undersökning av mus holmar belagda med den FAM-heparin-PEG nanocoating
- Tillsätt 1 – 2 mL RPMI 1640 kompletteras med 10% fetalt bovint serum till belagda holmar och överföra dessa holmar i en icke-laddade sterila bakterieodling maträtt.
- Iaktta morfologi och fluorescens signaler av FAM-heparin-PEG nanocoating-belagd holmar en inverterad fluorescens Mikroskop.
3. funktion av Heparin-PEG belagda mus holmar jämfört med icke-belagda skär
-
Lönsamhet av heparin-PEG belagda mus holmar
- Handplocka 20 av heparin-PEG belagda mus holmarna och placera dem i en väl av en platta med 96 brunnar cell i kultur.
- Fyll sammanlagt 10 borrningar med 20 heparin-PEG belagda mus holmar för varje brunn.
- Handplocka 20 av noncoated kontroll holmar och placera dem i en väl av samma 96 brunnar cell kultur plattan.
- Fyll sammanlagt 10 borrningar med 20 noncoated kontroll holmar för varje brunn.
- Satte 200 µL RPMI 1640 kompletteras med 10% fetalt bovint serum i varje brunn av den plattan med 96 brunnar som innehåller holmar och underhålla i kultur i 14 dagar.
- Ersätta holme kulturmassmedia varje 2 dagar.
- Behandla kobbar och skär med en live/dead färgning kit i slutet av 14 dagar i kultur och observerade under en inverterad fluorescens Mikroskop.
- Räknas PI+ (röd) celler inom varje holme under en inverterad fluorescens Mikroskop.
-
Revaskularisering av heparin-PEG belagda mus holmar in vitro
- Pre cool alla experimentella plast inklusive kultur plattan och pipett tips i minst 12 timmar före användning.
- Placera en 24-bra plats på en värmeskyddet. Tillsätt 250 µL av is kallt tillväxtfaktor-reducerad Matrigel i varje brunn 24-väl cell kultur platta. Placera belagda 24-väl plattan vid 4 ° C i minst 30 min.
- Medan modellösning är inställningen i kylen, trypsinize mus bukspottskörteln holme Mile Sven 1 (MS1) endotelceller.
- Ta bort alla kultur media från vävnadsodling kolven. Skölj kolven med 5 mL PBS.
- Ta bort PBS och tillsätt 3 mL av trypsin-EDTA. Inkubera vid 37 ° C i 3 min i en standard inkubator.
- Tryck lätt på botten av kolven så att lossa cellerna och tillsätt 5 mL serum-kompletteras media.
- Samla in cellerna i en 15 mL centrifugrör och centrifugera vid 1 000 x g i 5 min.
- Ta bort supernatanten och tillsätt 5 mL PBS. Pipettera upp och ner för att blanda väl.
- Centrifugera vid 1 000 x g i 5 min och ta bort supernatanten.
- Lägg till serum-kompletteras DMEM media i röret och utsäde 50.000 celler i varje brunn Skyltens matrix-lösning-coated 24 brunnar.
- Tillsätt 5 heparin-PEG belagda holmar eller noncoated kontroll holmar i varje brunn.
- Lägga till serum-kompletteras DMEM media i varje brunn till totalt 500 µL per brunn.
- Iaktta tube bildandet efter 4h och 24 h inkubation under ett ljusmikroskop.
-
Glukos-stimulerad insulinsekretion av heparin-PEG belagda holmar
Obs: För att bedöma om nanocoating skulle påverka funktionen av mus holmar, bedömdes glukos-stimulerad insulinsekretion av heparin-PEG belagda och noncoated holmar.- Handplocka 30 heparin-PEG belagda holmar eller noncoated kontroll holmar i en 1,5 mL tub. Förbered varje sammanlagt 10 tuber för bestruket holmar och noncoated holmar.
- Tillsätt 1 mL fysiologisk saltlösning kompletteras med 2 mmol/L glukos20 och inkubera vid 37 ° C i 2 h.
Obs: För receptet av de fysiologisk saltlösningen, se tabell 1. Förvara locket av rör lös under inkubation i inkubatorn. - Ta bort så mycket lösning som möjligt.
- Stimulera holmar genom att lägga till 600 µL av fysiologisk saltlösning kompletteras med 20 mmol/L glukos vid 37 ° C i 30 min.
- Samla in 200 µL av supernatanten från varje tub för insulin ELISA kvantifiering använder en kommersiell insulin ELISA kit.
Representative Results
Det heparin-PEG nanocoating var syntetiseras av Konjugation av starPEG-(NH2)8 och heparin med EDC och NHS som koppling agenter (figur 1). Kemiska strukturen hos den heparin-PEG nanocoating undersöktes av FT-IR och som visas i figur 2, karakteristiska toppar av heparin kunde observeras på 3,300 – 3 600 cm-1motsvarar hydroxylgrupperna av heparin (figur 2 röd). Minskningen av amplituden av toppen vid 3 300 – 3 600 cm-1 (figur 2 blå) representerar konjugation mellan starPEG-(NH2)8 Amid grupper och heparin karbonyl gruppen. Amplituden av peak 1,650 cm-1 motsvarar amiden karbonyl stretching vibrationer minskade också, som indikerar tillräcklig reaktion mellan grupperna bildas av heparin med succinimidyl succinat och amine starPEG-(NH2) 8. ytstruktur av den heparin-PEG nanocoating undersöktes av atomic force microscopy och det visas från Lou et al., nanocoating var cirka 30 nm i höjd och 2 µm i bredd med små porösa funktioner (mörka fläckar) allt mellan 100 till 200 nm i diameter10. Data som erhållits från skannad elektronisk microscopy bekräftar också starkt sammankopplade porösa struktur heparin-PEG (figur 3), vilket tyder på att det kunde vara lämplig för cellöverlevnad under invivo leverans.
Ytbeläggning av isolerade mus holmar undersöktes och som presenteras i figur 4, tunt lager av nanocoating, visas av grön fluorescens deponerades jämnt över ytan på bestruket holmar utan orsakar uppenbar förändringar på islet volym/storlek. Under beläggning rekommenderas att hålla kobbar och skär på isen att bibehålla sin livskraft. Likaså var perioden beläggning, 10 min i det här fallet också optimerad för att möjliggöra underhåll av holmar livskraft. Det är värt att notera att elektronmikroskopi som undersöker tvärsnitt av belagda holmar som tidigare rapporterats9,16 för bättre observation av nanocoating, skulle vara mer lämpligt, även om uppgifterna skulle genereras från fasta och inbäddade holmar i stället för levande holmar i kultur.
När det gäller överlevnad och funktion belagda holmar, holme revaskularisering och funktioner i har varit bedömda in vitro. Med tanke på de välgörande egenskaperna av heparin, kunde heparin funktionalisering på islet ytan underlätta holme revaskularisering i kultur och därmed dess överlevnad. Vi har observerat att heparin-PEG belagda mus holmarna uppvisade robust holme livskraft i kultur (figur 5). Betydligt mer avancerade vaskulär bildandet var också uppenbart från islet endotelceller (MS1) som odlades tillsammans med heparin-PEG belagda holmar, indikeras av avlånga microvessel-liknande strukturer och nätverk-liknande vaskulära strukturer (figur 6 ).
Nanocoating processen uppkommer ingen effekt glukos-stimulerad insulin sekretoriska förmåga av heparin-PEG belagda kobbar och skär. Låg nivå av insulinsekretionen observerades i alla behandlingsgrupper när holmar var perfusion med fysiologisk saltlösning kompletteras med sub-stimulatory nivå av glukos (2 mmol/L; (Se figur 7). När holmar stimuleras med en suprafysiologiska nivå av glukos (20 mmol/L glukos), observerades ökad insulininsöndring i alla behandlingsgrupper.
Figur 1: Kemiska struktur av Hep-PEG nanocoating för bukspottskörteln holme ytan engineering. Islet beläggning uppnåddes genom kovalent crosslinking mellan heparin-NHS och primära aminer i cellmembranet och star - PEG-(NH2)8. Varje heparin molekyl äger flera karboxylgrupp-grupper, som ändrades till har en NHS-grupp på varje. NHS-aktiverat carboxyl grupperna kommer att reagera med primära aminer protein till formuläret amidbindningar, via vilken nanocoating Hep-PEG och holmar är stabiliserad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Infraröda spektrumet av star - PEG-(NH2)8, heparin och Hep-PEG nanocoating i torkat tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Skannade elektronisk microscopy bilder av Hep-PEG i torkat tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa bilder av heparin-PEG belagda holmar fluorescens Mikroskop.
Heparin var pre märkta med FAM (visas i grönt). Bilder är representativa för 100 holmar. Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: Heparin-PEG belagda holmar uppvisade robust holme livskraft. (A) Data presenteras som medelvärde ± medelfel av medel, n = 50 holmar per grupp. (B) levande celler visades i grönt och döda celler i rött. Skalstapeln = 100 µm. bilder är representativa för 50 holmar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Heparin-PEG nanocoating underlättar intra-holme revaskularisering. Matrigel tube bildandet av MS1 celler tillsammans odlade med heparin-PEG belagda holmar och noncoated kontroll holmar. Bilder togs på 4 och 24 h. skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 7: Heparin-PEG nanocoating medför ingen förändring på islet sekretion insulinfunktion. Heparin-PEG belagda holmar och noncoated kontroll holmar (30 varje) exponerades till 2 mmol/L (vit stapel) eller 20 mmol/L (svart fält) glukos för 30 min. insulinutsöndringen i svar på 20 mmol/L-glukos var jämförbar mellan de belagda och styra holmar. Data visas som medelvärde ± medelfel av medel, n = 10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
I denna artikel, vi visar en ”lätt att anta” strategi för levande cellens yta iscensätta ett heparin-införlivade starPEG nanocoating via pseudo-bioorthogonal kemi mellan N- hydroxysuccinimide grupperna av nanocoating och Amin grupper av bukspottskörteln holme ytan membran. I själva verket de amino grupperna inom cellmembran är mycket reaktiva och därmed tidigare studier har rapporterat interaktioner mellan primära aminogrupper med aktiverade N- hydroxysuccinimidyl (NHS) ester under fysiologiska betingelser14 ,16,21. Dessutom har omfattande forskning rapporterat att införlivandet av heparin, starkt sulfaterade glykosaminoglykan och en viktig komponent i den extracellulära matrixen, under holme inkapsling, kan leda till förbättrad efter transplantation revaskularisering och minskad IBMIR22,23. Med tanke på biokompatibiliteten av PEG och multivalenta egenskaper av heparin använde vi 8-beväpnade PEG för maximal heparin lastning under tillverkning av nanocoating. Heparin ändrades med -NHS, som därefter skulle reagera med -NH2 grupper på islet cell membran. Genom att aktivera kovalent bindning bildas mellan -NH2 (av cellmembranet) och -NHS av Hep-PEG, holmarna skulle vara lätt ”coated” av heparin-införlivas PEG, således bildar ett nano-tunna lager (nanocoating) på den yttre ytan av den pankreas holmar.
Den nuvarande metoden skiljer sig från tidigare publicerade metoder som också valt PEG som stora polymeren för holme microencapsulation däri pseudo-bioorthogonal kemi mellan -NHS (av nanocoating) och -NH2 av cellen holme membran användes. Med tanke på att stabilitet av holme deponicell beläggning, särskilt i en komplex miljö såsom plasma, är avgörande för efter transplantation revaskularisering och överlevnad, bildandet mellan -NHS och -NH2 skulle bli stabilare jämfört hydrofob interaktion mellan PEG och cellmembranet24, elektrostatiska interaktioner9,15,24,25,26 eller biologiska kopplingen mellan biotin streptividin14.
Dessutom i motsats till islet kräver beläggning tillvägagångssätt som bygger på metoden LBL med utökade holme hantering period för multi-layer nedfall14,16,25, den nuvarande tekniken också minimal bearbetning och mycket kort beläggning under isolerade kobbar och skär. Båda dessa faktorer är avgörande för efter transplantation holme överlevnad eftersom holmar livskraft är ofta redan komprometterad följande ö-isolering på grund av skadade ECM under enzymatisk nedbrytning. En begränsning av den nuvarande metoden är dock att, till skillnad från LBL, via vilken tjocklek av yttre beläggningen kunde kontrolleras genom att öka eller minska antalet lager nedfall, tjockleken på den Hep-PEG nanocoating inte kan skräddarsys för tillfället.
Dessutom på grund av den milda tillstånd där kemisk reaktion mellan -NHS och -NH2 äger rum, den nuvarande metoden är tillämplig för levande cellen ytbehandlar engineering inte begränsad till Langerhanska, men de flesta cellterapi. Dessutom, med tanke på att heparin är kända för att interagera med en rad cytokiner och biologiskt aktiva molekyler, den Hep-PEG nanocoating presenterar också en öppen plattform som har potential för inkorporering av obegränsad biologiska mediatorer som gränssnitt för mer komplexa cell ytbehandlingsteknik.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för ekonomiskt stöd från den nationella naturvetenskapliga medel i Kina (31770968) och Tianjin forskning Program av Application Foundation och Advanced Technology (17JCZDJC33400).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| PBS | Hyclone | AAJ207798 | |
| Streptozototin | Sigma | S0130 | |
| Histopaque | Sigma | 10831 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 31800022 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Cell Dissociation Solution | GIBCO, by Life Technologies | 13150-016 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12800017 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644 | |
| 488 phalloidin | Sigma | A12379 | |
| CFSE | Sigma | 21888-25mg-F | |
| Annexin V/PI apoptosis kit | Dojindo | AD10 | |
| DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Collagenase from Clostridium, Type XI | Sigma | C7657 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| NHS | Sigma-Aldrich | 56480 | |
| EDC | Sigma-Aldrich | 3449 | |
| 8-armed PEG | J&K Scientific Ltd | 1685176 | |
| FAM | Sigma-Aldrich | M041100 | |
| 5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21888 | |
| KBr | J&K Scientific Ltd | 32036 | |
| 3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| toluene | J&K Scientific Ltd | S-15497-20X | |
| Live/dead staining kit | Biovision, US | K501 | |
| BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reduced | BD Bioscience | 354230 | |
| Sodium chloride, 99.5% | J&K Scientific Ltd | 105864 | |
| Potassium chloride, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 991468 | |
| Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 988639 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 182158 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 128839 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis | J&K Scientific Ltd | 119370 | |
| Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2 | J&K Scientific Ltd | 21114 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | V900933 | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA kit | Millipore-linco | EZRMI-13K |
References
- Ke, T., et al. Netrin-1 ameliorates myocardial infarction-induced myocardial injury: mechanisms of action in rats and diabetic mice. Hum Gene Ther. 25 (9), 787-797 (2014).
- Ke, T., et al. Co-transplantation of skin-derived precursors and collagen sponge facilitates diabetic wound healing by promoting local vascular regeneration. Cell Physiol Biochem. 37 (5), 1725-1737 (2015).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287 (5460), 2007-2010 (2000).
- Sarkar, D., et al. Engineered cell homing. Blood. 118 (25), 184-191 (2011).
- Kato, M., Mrksich, M. Rewiring cell adhesion. J Am Chem Soc. 126 (21), 6504-6505 (2004).
- Cheng, H., et al. Stem cell membrane engineering for cell rolling using peptide conjugation and tuning of cell-selectin interaction kinetics. Biomaterials. 33 (20), 5004-5012 (2012).
- Merzaban, J. S., et al. Cell surface glycan engineering of neural stem cells augments neurotropism and improves recovery in a murine model of multiple sclerosis. Glycobiology. 25 (12), 1392-1409 (2015).
- Silvescu, C. I., Sackstein, R. G-CSF induces membrane expression of a myeloperoxidase glycvariant that operates as an E-selectin ligand on human myeloid cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10696-10701 (2014).
- Zhi, Z. L., et al. Assembly of bioactive multilayered nanocoatings on pancreatic islet cells: incorporation of alpha1-antitrypsin into the coatings. Chem Commun (Camb). 51 (53), 10652-10655 (2015).
- Lou, S., et al. Pancreatic islet surface bioengineering with a heparin-incorporated starPEG nanofilm. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 78, 24-31 (2017).
- Orlando, G., et al. Cell replacement strategies aimed at reconstitution of the beta-cell compartment in type 1 diabetes. Diabetes. 63 (5), 1433-1444 (2014).
- Kollmer, M., et al. Long-term function of alginate-encapsulated islets. Tissue Eng Part B Rev. 22 (1), 34-36 (2015).
- Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. J Diabetes Complications. 29 (5), 737-743 (2015).
- Kizilel, S., et al. Encapsulation of pancreatic islets with nano-thin functional polyethylene glycol coatings for enhanced insulin secretion. Tissue Eng. Part A. 16, 2217-2228 (2010).
- Zhi, Z. L., et al. Nano-scale encapsulation enhances allograft survival and function of islets transplanted in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 55, 1081-1090 (2012).
- Gattas-Asfura, K. M., Stabler, C. L. Layer-by-layer deposition of antifouling coatings on stainless steel via catechol-amine reaction. ACS Appl. Mater. Interfaces. 5, 9964-9974 (2013).
- Kollmer, M., et al. Long-term function of alginate-encapsulated islets. Tissue Eng. Part B Rev. 22 (1), 34-46 (2015).
- Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. J. Diabetes Complicat. 29, 737-747 (2015).
- Zmuda, E. J., et al. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Gey, G. O., Gey, M. K. The maintenance of human normal cells and tumor cells in continuous culture. I. Preliminary report: Cultivation of mesoblastic tumors and normal tissue and notes on methods of cultivation. Am. J. Cancer. 27, 45-76 (1936).
- Chen, X., et al. Site-selective azide incorporation into endogenous RNase A via a "chemistry" approach. Org. Biomol. Chem. 11, 353-361 (2013).
- Cabric, S., et al. Anchoring of vascular endothelial growth factor to surface-immobilized heparin on pancreatic islets: implications for stimulating islet angiogenesis. Tissue Eng. Part A. 16, 961-970 (2010).
- Cabric, S., et al. Islet surface heparinization prevents the instant blood-mediated inflammatory reaction in islet transplantation. Diabetes. 56, 2008-2015 (2007).
- Asif, S., et al. Heparinization of cell surfaces with short peptide-conjugated PEG-lipid regulates thromboinflammation in transplantation of human MSCs and hepatocytes. Acta Biomater. 35, 194-205 (2016).
- Teramura, Y., et al. Microencapsulation of cells, including islets, within stable ultra-thin membrane of maleimide-conjugated PEG-lipid with multifunctional crosslinkers. Biomaterials. 34 (11), 2683-2893 (2013).
- Zhi, Z., et al. Multilayer nanoencapsulation: A nanomedicine technology for diabetes research and management. Diabetes Res. Clin. Pract. 100, 162-169 (2013).
