Détermination de la concentration protéique par spectrophotométrie

Détermination de la concentration d’une protéine dans les échantillons est une étape fondamentale dans nombreuses épreuves biochimiques. Détermination photométrique peut être faite avec la petite taille des échantillons. Plus un échantillon contient des substances absorbant la lumière, moins la lumière transmettra à travers elle. Ceci fournit une mesure quantitative des substances absorbantes. Ces concepts sont si essentielle à la science que les articles qui introduit deux des techniques sont dans le trois plus cité dans les documents de tous les temps. Cette vidéo va montrer les concepts derrière certains de la protéine photométrique plus commune des techniques de dosage, comment ils sont effectués, et comment les données recueillies sont analysées.

Détermination des protéines photométrique est basée sur la relation entre la concentration et la capacité d’absorption lumineuse. Ceci est connu comme la Loi de Beer-Lambert, qui stipule que la concentration d’une espèce absorbant la lumière est proportionnelle à son absorbance.

Ce principe sous-tend toutes les méthodes de détermination photométrique de protéine.

Pour l’analyse de l’absorption directe, les valeurs d’absorbance des échantillons de protéines non altérées sont mesurés. En raison de leur chaîne latérale aromatique, résidus de tryptophane et de la tyrosine donnent les plus hautes mesures d’absorbance à une longueur d’onde de 280 nm.

Toutefois, ces acides aminés, qui sont deux des protéines-sont moins fréquemment trouvé dans présents en quantités différentes dans chaque protéine, donc chaque dosage est unique. Pour surmonter cette limitation, les dosages plus complexes-qui ne sont pas dépendants de ces acides aminés-ont été développés.

Un exemple est l’analyse de Bradford, où colorant coloré est ajouté à l’échantillon. Le colorant appelé bleu de Coomassie, répond proportionnellement le plus de protéines présentes, les liaison des événements plus avec le colorant.

Ensuite, la concentration de protéines est déterminée en mesurant l’absorbance du colorant bleu de Coomassie lié, qui absorbe la lumière à 594 nm. Toutefois, l’analyse de Bradford est linéaire sur un court intervalle de concentrations, donc dilutions sont souvent nécessaires avant l’analyse.

La méthode de Lowry combine le réactif du Biuret, une solution alcaline d’ions de cuivre qui réagissent avec les liaisons peptidiques et le réactif de Folin-Ciocâlteu, qui oxyde les résidus protéiques aromatiques. Le changement de la couleur résultante de l’échantillon est proportionnel à la concentration de protéine.

L’absorbance du réactif de Folin réduit peut être déterminée à 750 nm. Comme l’absorption directe, chaque protéine a une réponse unique et doit être étalonné pour la protéine d’intérêt. Maintenant que nous avons passé en revue les principes fondamentaux derrière certaines des analyses plus courantes, nous allons étudier comment direct d’absorption et de l’analyse de Bradford sont effectuées.

Pour commencer une analyse directe de l’absorption, le spectrophotomètre est calibré avec un blanc pour déterminer le zéro d’absorbance. Solutions étalons sont préparées à utiliser pour la création de la courbe d’étalonnage. Ensuite, une partie aliquote de la première norme est ajoutée à une cuvette et placée dans le spectrophotomètre.

La valeur d’absorbance à 280 nm est alors enregistrée. Ce processus est répété pour chaque norme, à l’aide d’une cuvette propre de chaque série. Une fois terminé, une courbe d’étalonnage est créée en traçant l’absorbance versus la concentration. La pente de cette droite est le coefficient d’atténuation molaire, qui concerne l’absorbance à la concentration.

Ensuite, l’échantillon inconnu est ajouté à une cuvette, et la valeur de l’absorbance est enregistrée. Comme l’analyse des données pour les méthodes de détermination photométrique différente est similaire, nous allons couvrir qui après que nous regarder l’analyse de Bradford.

Ici, l’analyse de protéine de Bradford est réalisée avec une norme de BSA sur une plaque à 96 puits. Pour commencer, BSA solutions mères sont préparées.

Les solutions inconnues sont diluées avec de l’eau déionisée pour s’assurer que les concentrations sont à portée de l’essai. Selon le kit, le colorant bleu de Coomassie peut également exiger dilution. Ensuite, la courbe d’étalonnage est mises en place en ajoutant les normes de BSA à la plaque à 96 puits.

L’eau déminéralisée est ajouté pour atteindre la concentration nécessaire pour générer une courbe d’étalonnage. L’échantillon inconnu s’ajouteront à la plaque en réanalysés pour assurer qu'une mesure précise est prise ; Colorant bleu de Coomassie est ensuite ajouté à chaque puits, mélanger à l’aide de la pipette.

L’eau déminéralisée est ajouté à un puits vide comme un blanc, pour mesurer l’absorbance. Après avoir attendu 5 min pour le colorant lier, l’absorbance est mesurée dans un lecteur de plaque à 590 nm.

Maintenant que nous avons effectué quelques tests, regardons comment analyser les données. Chaque méthode de détermination photométrique de protéine est issu de la Loi de Beer-Lambert.

L’absorbance mesurée des normes est utilisé pour créer une courbe d’étalonnage, qui est ensuite utilisée pour déterminer la concentration des échantillons inconnus. Cette courbe peut être tracée manuellement, même si les plus récents outils spectrophotométriques créera la courbe d’étalonnage, une fois que tous les standards ont été mesurées. Ces systèmes calculera également la concentration de protéines comme échantillons inconnus sont analysés.

Maintenant que nous avons examiné comment analyser des données de détermination photométrique de protéine, regardons quelques-unes des façons que ces procédures sont utilisées.

Les principes de détermination photométrique protéine permet également de mesurer directement la concentration de l’acide nucléique. Le spectrophotomètre nanodrop accepte des échantillons de très petit volume sur un piédestal optiquement actif. L’absorbance est alors mesurée, et le système détermine automatiquement la concentration de l’acide nucléique. Parce que les protéines et autres sources peuvent interférer avec les mesures, pureté de l’échantillon est déterminée en analysant les 260 à 280 nm et ratios absorbance de 260 à 230 nm. Acides nucléiques purs donnent généralement ratios d’environ 1,8 et environ 2,0 pour ADN et d’ARN, respectivement.

Détermination photométrique de protéine peut également servir dans la production de matériaux biomimétiques, qui s’inspirent de la nature pour provoquer des réponses cellulaires spécifiques. Adhésines recombinantes sont tenus de billes de polystyrène pour simuler l’attachement des bactéries aux cellules hôtes. L’analyse de Bradford est utilisée pour déterminer l’efficacité du couplage de l’adhérence recombinant aux billes dans la production des matériaux biomimétiques.

Dosages de protéines photométrique alternative peuvent être utilisés dans la détection et la caractérisation d’antimicrobiens de protéine. Remazol brillant R des bleu covalente aux bactéries tuées par la chaleur. La protéine antimicrobienne est incubée dans la solution teinte. Puis, l’échantillon est centrifugée et l’absorption du liquide surnageant à 595 nm est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre microplaques. Absorbance accrue, de colorant soluble libéré dans le surnageant de la bactérie étiquetée, est une mesure quantitative de l’activité enzymatique.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur détermination photométrique de protéine. Cette vidéo décrit les principes qui sous-tendent la détermination photométrique, passe des procédures générales pour certains tests communs et couverts de quelques nouveaux progrès dans les techniques. Merci de regarder !