Summary
同源基因是调节基因, 通常与成人生物中的肿瘤有关。我们通过免疫组织化学和实时 pcr 分析, 在正常和炎症性鼻黏膜和鼻窦肿瘤中研究了它们的比较表达, 以便将它们作为可能的诊断和治疗靶点。
Abstract
otx同源 (hb) 基因在胚胎形态发生过程中和成人生物嗅觉上皮发育过程中被表达。这些基因中发生的突变通常与人类肿瘤的发生有关。目前还没有关于otx基因与鼻腔肿瘤之间可能存在的相关性的数据。这项工作的目的是了解是否 otx1和otx2 可以被认为是鼻腔肿瘤发展中的分子标记。我们选择鼻窦腺癌通过免疫组织化学和实时 pcr 分析来研究otx1和otx2基因的表达。所有的肠型腺癌 (itac) 样本中都没有otx1和otx2 。只有在非肠型腺癌 (nitc) 中发现了 otx1 mrna, 而otx2 mrna 仅在嗅觉神经母细胞 (ont) 中表达。我们已经证明,不同基因表达的 otx1和otx2基因可能是一个有用的分子标记, 以区分不同类型的鼻窦肿瘤。
Introduction
otxhb 基因是果蝇正畸基因 (otd) 的脊椎动物同源体, 它们编码了通常在胚胎形态发生过程中表达的转录因子, 但它们也可以在具有不同功能的成虫体内表达.在胚胎发育过程中, 它们控制着细胞的特性、细胞分化和身体轴的定位。otx家族包括显示不同功能的 otx1和otx2基因。otx1参与大脑和感觉器官的发育。在成虫体内, 它在感觉器官中表达, 并在垂体2的前叶中在低水平转录;它在造血中也有一定的作用, 表达于造血多能和祖细胞3。otx2参与了根头的发育, 它的转化蛋白起到了语素的作用, 因为它产生了一个梯度, 通过梯度激活或抑制其他基因以时空的方式被激活或抑制, 从而对细胞做出贡献增殖和分化。在成虫体内, otx2 只存在于脉络丛和松果体4中。
otx基因的突变通常与人类先天、身体或代谢缺陷的出现有关。otx基因的得失突变如果不能正确控制细胞生长和分化, 就会促进肿瘤的发生.在白血病和淋巴瘤以及许多实体瘤 (例如,髓母细胞瘤 6、攻击性非霍奇金淋巴瘤2、乳腺癌7、结直肠癌8和视网膜母细胞瘤 9),otx hb 基因的放松表达有据可查的 10。此外, 由于 otx2 基因在控制眼睛发育方面的关键作用, 在眼邻症和微孔瘤11的病例中已经显示出otx2突变。
在固体肿瘤的背景下, 分子和表型标记的发现是诊断、分类和治疗几种类型的肿瘤11的一个重要挑战, 包括那些源于鼻腔和鼻窦的肿瘤鼻窦。事实上, 尽管这些区域只占一个适度的解剖空间, 粘膜上皮, 腺体, 软组织, 骨骼, 软骨或神经外皮, 和造血细胞往往可以是复杂和组织学不同的起源的网站组的肿瘤。涉及窦冬道的不同类型的肿瘤呈现了各种特征, 克服了通常在上空气消化道甚至在身体大部分部位看到的特征12。鼻窦恶性肿瘤是罕见的, 每年的发病率为全世界1:10000 居民, 因此, 这妨碍了有关肿瘤发生的途径的研究和替代治疗策略的测试。尽管如此, 成像技术、手术方法和放射治疗的进步改善了鼻窦癌的临床管理。此外, 细胞系的发展以及动物模型和癌症基因分析目前构成了未来有针对性的抗癌疗法13的基础。到目前为止, 还没有关于otx1和/或otx2在鼻腔肿瘤、鼻窦和鼻咽的报告。由于我们之前观察到otx1和otx2 参与了乳腺癌7, 我们想知道这些基因是否不仅存在于正常的鼻黏膜中, 也存在于鼻腔肿瘤中。为了达到这一目标, 我们从病理学系获得了1985年至2012年收集并根据世界卫生组织 (世卫组织) 分类的正常黏膜、鼻和鼻窦腺癌的 varese 样本中的 "osedale di circolo"头颈部肿瘤的分类。我们选择通过实时 pcr 和免疫组织化学分析对它们进行分析, 并评估otx1和otx2的表达, 以确定它们是否可以被视为这些类型肿瘤的分子标记。
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Protocol
所有这些研究都是根据《赫尔辛基宣言》 (1975年) 在书面知情同意的情况下进行的, 并得到了瓦雷塞的因苏里亚邦大学道德委员会的批准。
1. 样品的收集
- 根据世卫组织对头颈部肿瘤的分类, 收集和将所有人类福尔马林固定石蜡包埋物 (ffpe) 样本分成不同的亚群。
请注意:在这里, 我们使用了以下样品: 正常的鼻窦黏膜作为对照 (10个样品);倒置状瘤 ( ip , icd - o 代码 812 / 1 ) ;sinonasal itac (icd-o 代码 814n", 32个样本);nitac (icd-o 代码 8140", 12个示例);腺样体囊性癌 (acc, icd-o 代码 8200);多形性腺瘤 (pa, icd-o 代码 8945%);on (icd-o 代码 9522 +, 13个示例);分化不良的神经内分泌癌 (pdnec, icd-o 代码 804培养基, 19个样本);神经内分泌肿瘤 (net, icd-o 代码 804-5)。
2. 免疫化学
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部分的去黑塞哥维那和补液
- 将样品在60°c 的烤箱中加热 30分钟, 并使用酒精系列将3微米厚的 ffpe 部分再加提水。
- 在二甲苯中简单清洗滑块 10分钟, 然后重复此步骤;用100% 酒精清洗幻灯片 5分钟, 并连续使用95%、85% 和75% 的酒精重复此步骤。用蒸馏水冲洗滑梯5分钟。
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阻止内生活动
- 将滑块放入3% 的过氧化氢水中 12分钟, 阻断内源性活动。
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抗原回收
- 在微波治疗中, 用 10 mm 柠檬酸缓冲器 (ph 6) 进行10分钟的抗原回收。
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与原代抗体的培养
- 清洗 tbs 缓冲液中的切片 (ph 值 7.4), 然后加入阻塞溶液10分钟。
- 清洗 tbs 缓冲液中的切片 (ph 值 7.4), 然后加入0.2% 的 triton x。
- 用山羊抗人 otx2 抗体稀释1:100 在4°c 下过夜。
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用二级抗体进行培养
- 用生物素化兔抗山羊二级抗体稀释 1:200, 然后是 abc-过氧化物酶复合物 (见材料表), 在室温下将切片加氢1小时。
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开发免疫反应
- 利用 3, 3 '-二胺苯胺四盐酸盐和哈里斯血红素对抗核的免疫反应。
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安装和成像
- 使用新月醇刻度使切片脱水, 并使用三烯来源的清除物质对其进行澄清 (见材料表)。将切片嵌入安装介质中, 将切片放置在显微镜幻灯片上, 并通过光学显微镜观察切片。
3. rna 提取和反向转录
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rna 提取
- 通过执行免疫沉淀协议的第一步 (见第2.1 节), 从各部分中提取 rna, 并将幻灯片保存在蒸馏水中。将未染色的部分与相应的血红素-eosin 染色部分重叠, 以识别感兴趣的片段。
- 使用 ffpe 样品的商业 rna 提取试剂盒 (参见材料表) 并按照制造商的说明进行 rna 提取。
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rna 逆转录酶
- 使用商业试剂盒将 rna 逆转录酶追溯到 cdna 中 (见材料表)。逆转录酶至少 1, 000 纳克的总 rna 进行了几项分析。
4. 实时 pcr 和数据分析
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实时 pcr
- 使用基于原的技术 (见材料表) 和热循环器进行定量实时 pcr 分析 (qrt-pcr)。
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pcr 反应混合物的制备
- 使用12.5 μl 的探针主混合物、0.25μl 的 otx1、otx2 和 actb 探针 (见材料表)、50 ng 的 cdna 和高达最大为最大体积25μl 的无核酸水制备 pcr 反应混合物。
- 利用 actb 基因作为内源性对照, 进行三式三份的所有反应, 使基因表达水平正常化。
- 将板材以 1, 109 x克离心 3分钟, 并将板保存在4°c 时不受光线照射, 直到实验结束。
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设置热循环器
- 将热循环曲线设置为在50°c 下的初始热启动周期为 2分钟, 95°c 为 10分钟, 然后在95°c 下进行40次循环, 在15秒内, 最终循环在60°c 下, 以1分钟。
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基因表达水平分析
- 利用 actb 基因作为内源对照, 通过比较周期阈值 (ct) 方法对基因表达水平进行归一化。
- 利用2-ct方法评估基因表达水平, 并绘制结果图。
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统计分析
- 使用学生t-测试进行统计分析, 考虑到有统计学意义的结果和p < 0.05。
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Representative Results
在正常粘膜中, 我们观察到 otx 基因的强核反应性, 无论是在纤毛假分层型呼吸上皮和粘膜下腺体细胞 (图 1a)。我们在所有 nitac 样本中都发现了 otx1 的核表达 (图 1 b), 而在 itac 中, 免疫反应很少或不存在 (图 1B)。所有的只能存在强烈的免疫反应性 (图 1d);在 pdnec 中, otx 表达在阳性细胞的强度和百分比上各不相同 (图 1e)。用 chi square 和/或 fisher 的精确测试进行的免疫组化统计分析表明, itac 样本中缺乏 otx 基因具有统计学意义 (n = 23, p < 0.01)。
实时 pcr 分析证实了 otx1 和 otx2 基因在对照样本中的表达 (图 2a-b);nitac 样本中表达了 otx1 但不表示 otx2, 这两个基因在 itac 中都被完全下调 (图 2a-b)。在 on 样本中, 我们只发现了 otx2 基因的表达, 而 otx1 被下调, 在 pdnec 样本中, 这两个基因的表达各不相同 (图 2a-b)。
学生在实时 pcr 上进行的t 测试证实, otx1在对照组与 itac (n = 9, p < 0.05)、对照组与 on (n = 6, p < 0.05)、对照组与 pdnec (n = 8, p < 0.05) 中的 otx1 具有统计学意义的数据。对于otx2 的控制与 nitac (n = 5, p < 0.05), 对照与 itac (n = 9, p < 0.05), 对照与 on (n = 6, p < 0.05), 对照与 pdnec (n = 8, p < 0.05)。
图 1: otx免疫组织化学表达在对照和肿瘤组织中的代表性图像.过氧化物酶结合二级抗体产生的反应显示, 正常鼻窦黏膜 (a) 的5个控制 ffpe 部分、7例非肠型腺癌 (nitas) 中可见信号 (深棕色) (b)、7例11例嗅觉神经母细胞瘤 (d), 11 例分化不良的神经内分泌癌 (pdnec) (e), 23 例肠型腺癌 (itac) 确诊 (c) 组未检出免疫反应.dob-血红素;原始放大倍率: 200x, 刻度杆 = 100μm。
图 2: 对正常和肿瘤鼻腔组织中的 otx1 (a) 和otx2 (b) mrna 表达进行实时 pcr 分析.用于实时 pcr 分析, 使用了以下样本: 控制正常黏膜的 5个 ffpe 部分、5例非肠型腺癌 (nitas)、9例肠型腺癌 (itas)、6例嗅觉神经母细胞瘤 (ont)、8例分化不良的神经内分泌癌 (pdnec) 病例。在 x 轴上报告样本的类型, 而 y 轴表示 2-ct值。通过学生 t 检验获得了对照与肿瘤之间的统计重要数据 (p < 0.05 ), 并用星号突出显示。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
本研究首次表明 , 根据 mrna 水平 , hb 基因 otx1 和 otx2 在正常鼻窦黏膜和粘膜下腺体、炎症息肉、鼻窦施奈德里安状瘤以及不同的上皮和神经外皮中表达肿瘤, 包括鳞状癌、非肠型鼻窦腺癌、唾液腺型肿瘤、神经内分泌肿瘤和国家统计局。
修改和故障排除:
为了避免 rna 降解, 我们在病理学实验室执行了分离协议。在我们划破滑梯后, 所有的样品都被迅速冷却并储存在干冰中, 直到进一步使用。我们在层流安全罩中使用一组带有无菌吸头的专用移液器进行了所有后续分析, 以保持无菌实验条件并避免 rna 污染。
该技术的局限性:
该技术的主要局限性取决于样本的可用性, 因为鼻窦腔肿瘤往往是罕见的。提取的 rna 量是另一个重要问题, 因为从 ffpe 样本中提取的 rna 会导致 rna 碎片化, 很难对其进行分析。
对现有方法的意义:
鼻腔肿瘤的诊断通常包括 x 线检查、鼻腔内窥镜检查、ct 扫描、磁共振 (rmn) 和活检。近年来, 外科器械的发展和影像学技术的进步导致内镜手术作为鼻窦肿瘤的首选策略。值得注意的是, 据报道, 这种技术对于不同类型的恶性或恶性鼻窦肿瘤是可行的。我们基于 qrt-pcr 的技术可以识别分子生物标志物, 这可以区分不同肿瘤的样本: 事实上, 我们提供的证据表明, 在 itac 中没有两个 hb 基因可以作为分子标记肿瘤类型以及在 nitac 中缺乏 otx2。此外, 这种技术可以在活检后立即应用, 并可以在医院报告所需的天数或周内, 在不到6小时的时间内得出确切的结果。
未来应用:
我们未来的研究包括使用实时 pcr 分析、西方印迹和免疫荧光分析, 并使用特异性抗体分析 otx1 和 otx2 基因的基因和蛋白表达水平, 不仅检测 otx1 和 otx2, 而且检测 p53 家族表达水平。由于我们之前证明了 otx1 的表达是由 p53 调节乳腺癌 7, 它将是有趣的理解, 如果这样的调节也存在于鼻腔肿瘤。免疫荧光法和染色质免疫沉淀 (chip) 法可以分别揭示 p53 和 otx 之间的蛋白质蛋白和 dna-蛋白质相互作用。如果发现这种联系, p53 (以及家庭成员, 第63和73页) 的有针对性的沉默将揭示 otx 基因的过度表达或下调是否依赖于 p53。
p53 功能丧失, 通过 p53 本身的突变或 p53 信号信号通路的扰动, 是大多数人类癌症的共同特征16。大部分 p53 突变群在 dna 结合域内;因此, dna 结合活性是改变的关键功能, 这表明转录基因的变化可能是突变 p53 活性16的关键。p53 突变被报道为鼻窦癌的一个共同特征, 总频率为 77%, 它们与腺癌和木尘暴露有联系17。因此, 在我们的样本中, 评估 mrna 和蛋白质水平 (通过 qr-pcr 和 west blot 分析) 并对该基因进行测序, 以识别或排除活性突变的存在将是一件有趣的事情。最后, 如果发现肿瘤类型特异性突变, 它将是值得注意的, 产生工程细胞和小鼠 (与一个突变等位基因), 窝藏这种突变, 并检查突变是否可以重述疾病。
关键步骤:
这项研究的关键步骤包括获取储存良好的样本, 或者作为储存在 rna 保护缓冲液中的活检或至少8微米厚的 ffpe 样本, 以及提取至少 200 ng 的 rna 进行 qrt-pcr 分析。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了 grandi strumenti 大学中心、fondazione comunitaria del varesotto、monte di lombardia 基金会和 fondazione anna villa e felice rusconi 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation | Applied Biosystem | AM1975 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystem | 4368814 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystem | 4326614 | |
| ABI Prism 7000 | Applied Biosystem | 270001857 | |
| ACTB probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX1 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX2 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| Acqueous Hydrogen Peroxide | Merk | 1072090250 | |
| Citrate Buffer | Sigma-Aldrich | 20276292 | |
| Triton | Sigma-Aldrich | 101473728 | |
| Tris | Merk | 108382 | |
| NaCl | Merk | 106404 | |
| Goat Anti-OTX2 Antibody | Vector Laboratories | Out of production. Catalog number not available | |
| Rabbit Anti-Goat Antibody | Vector Laboratories | BA5000 | |
| ABC-Peroxidase Complex | Vector Laboratories | PK6100 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB) | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Harris Hematoxylin | Bioptica | 0506004/L | |
| Pertek | Kaltek SRL | 1560 | |
| BioClear | Bioptica | W01030799 |
References
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